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Actividades del año 2009
Peste equina Africana
Concepción Gómez-Tejedor(1) y J.M. Sánchez-Vizcaíno(2)
(1)Laboratorio Central de Veterinaria
Ctra. De Algete km , 28110 Algete (Madrid)
Tel.: (34-91) 347.9277, Fax: (34-91) 629.0598
[email protected]
(2). Centro VISAVET. Universidad Complutense de Madrid (UCM)
Avda. Puerta de Hierro s/n
28140 Madrid, Spain
Tel.: (34-91) 394.4082; Fax: (34-91) 394.3908
[email protected]
Resumen de las actividades generales relacionadas con la enfermedad
1.
Prueba(s) que se usa(n)/o disponible(s) para la enfermedad especificada, en su laboratorio
1.1.
LCV:
Prueba
Para
Especificidad
Total
ELISA
Anticuerpo
Grupo
357
ELISA
Antígeno
Grupo
0
NV
Anticuerpo
Tipo
24
Cultivo de células BHK-21
Aislamiento del virus
RT-PCR
Genoma viral
Grupo
FC
Anticuerpo
Grupo
1.2.
0
39
UCM:
- Una PCR desarrollada y estandarizada en nuestro laboratorio (Rodriguez-Sanchez et al., 2008) que permite la
detección de los nueve serotipos de Peste Equina Africana usando los mismos pares de primers. Estos primers han
sido validados tanto para PCR convencional como real time-PCR. Este último caso, puede ser utilizada usando
SYBR-Green o mediante prueba TaqMan. Esta técnica aumenta la especificidad del ensayo.
- La Taqman MGB real-time PCR desarrollada por Fernández-Pinero et al. (2009) es usada también de rutina en
nuestro laboratorio. Permite la detección de los nueve serotipos de PEA aumentando la estabilidad de la unión de
la muestra y la sonda. Publicada en Research in Veterinary Science 86, 353-358.
- ELISA para la detección de anticuerpos usando como antígeno un recombinante de VP7y NS3, tal y como se
describe en el Manual de Técnicas de diagnóstico y vacunas para los animales terrestres.
Informes anuales de los Laboratorios de Referencia y Centros Colaboradores de la OIE, 2009
1
Peste equina Africana
2.
Prueba
Para
Especificidad
Total
ELISA
Anticuerpo
Grupo
1800
RT-PCR (convencional)
Detección viral
Grupo
30
RT-PCR (SYBR-GREEN)
Detección viral
Grupo
40
RT-PCR (Taqman)
Detección viral
Grupo
50
RT-PCR (Taqman MGB)
Detección viral
Grupo
60
Producción y distribución de reactivos de diagnóstico

Producción de virus vivo en células BHK de todos los serotipos

Producción de antisuero frente al virus de serotipo 7 en cobayas y en ovejas

¿Qué cantidad ha suministrado a nivel nacional (incluyendo la que ha usado su laboratorio)?
1 ml de virus de los serotipos de referencia 2, 4 y 9 enviados a laboratorios FortDodge
20 ml de virus de los serotipos 2, 3 y 8 empleados en la preparación del ensayo de intercomparación
40 ml de virus del serotipo 7 empleados para la producción de antisueros en ovejas y cobayas
Actividades específicamente relacionadas con el mandato
de los Laboratorios de Referencia de la OIE
3.
Armonización y normalización internacional de los métodos para las pruebas de diagnóstico o
la producción y el análisis de vacunas
3.1) LCV. El Laboratorio Central Veterinario ha organizado un ensayo de intercomparación de aptitud para la
evaluación de los métodos de diagnóstico (detección de anticuerpos y genoma viral) entre los países miembros de
la Unión Europea así como con otros países que no son miembros de la Unión, pero que pertenecen a la OIE
(Suiza y Turquía). Se ha facilitado una hoja para la remisión de resultados en la que se piden datos acerca del
método empleado para el análisis de presencia de anticuerpos mediante ELISA (nombre del fabricante del kit
utilizado, valores de D.O. de los controles positivos y negativos y del punto de corte), o para la detección de
genoma viral mediante RT-PCR (procedimiento de extracción de ácidos nucleicos, referencia de primers/sonda,
descripción de los reactivos de RT-PCR, etc.). Esto ha permitido obtener datos comparados de sensibilidad y
especificidad de los distintos métodos de ELISA y RT-PCR empleados, que han sido presentados y puestos en
conocimiento de todos los laboratorios participantes en la reunión anual celebrada en Bruselas el 1 de diciembre
de 2009.
3.2) UCM. Se ha armonizado y normalizado la nueva Taqman MGB real-time PCR (Fernández-Pinero et al. 2009)
desarrollada. Ha sido probada frente a los nueve serotipos de Peste Equina Africana, un aislado de cada serotipo y
cuatro aislados diferentes del serotipo 4, obteniéndose resultados satisfactorios. Los virus fueron cultivaron en
células para obtener su RNA. Esta prueba también fue testada frente a otros Orbivirus como la Lengua Azul y
otras enfermedades que afectan a los caballos, sin amplificar ningún fragmento.
4.
Preparación y suministro de estándares internacionales de referencia para las pruebas de
diagnóstico o las vacunas
3 sueros de referencia positivos en ELISA enviados al LNR de Portugal (1ml/cada suero)
3 sueros de referencia positivos en ELISA enviados al LNR de Polonia (1ml/cada suero)
2
Informes anuales de los Laboratorios de Referencia y Centros Colaboradores de la OIE, 2009
Peste equina Africana
5.
Investigación y desarrollo de nuevos procedimientos para el diagnóstico y el control
El LCV realizó en el año 2008 un estudio de comparación de la sensibilidad de las RT-PCR específicas de serotipo
(Sailleau et al, 2000) con la del método de RT-PCR en tiempo real general para VPEA (Agüero et al; 2008),
habitualmente empleado en el laboratorio para el diagnóstico de PEA. Los resultados revelaron que la sensibilidad
obtenida con las diferentes RT-PCRs específicas de serotipo era inferior (10-10.000 veces, dependiendo del
serotipo) a la que proporcionaba el método de detección general de VPEA, lo que podía significar que en muestras
con una baja concentración del virus éste no pudiera ser tipado por estos métodos moleculares. Por ello, el
laboratorio ha iniciado los trabajos encaminados al desarrollo de métodos de RT-PCR en tiempo real específicos
para cada serotipo del virus, que proporcionen una sensibilidad suficiente para garantizar el tipado molecular del
virus en muestras clínicas, incluso en aquéllas conteniendo una baja carga viral.
Durante el año 2009, en el LCV se han desarrollado métodos de RT-PCR en tiempo real para la detección
específica de VPEA de los serotipos 4 y 9. Para lo cual, se ha secuenciado parcialmente el segmento 2 (S2) del
genoma viral, que codifica la principal proteína (VP2) determinante del serotipo, de los VPEA de referencia para
los serotipos 1-9, y del virus del serotipo 4 causante del brote ocurrido en España 1987-1990, y se han diseñado
primers y sondas capaces de amplificar específicamente un fragmento del S2 del serotipo viral frente al que se han
seleccionado. La especificidad de estos ensayos se ha determinado tanto frente a todos los serotipos del VPEA,
como frente a otros orbivirus y virus equinos relacionados. Además, se ha comprobado que la sensibilidad de estos
métodos es al menos equivalente a la del ensayo general empleado para la detección de VPEA, lo que garantiza la
posibilidad de tipar con estos métodos todas aquellas muestras, conteniendo virus de los serotipos 4 o 9, que
pudieran ser detectadas como positivas en el análisis de detección general de VPEA.
El objetivo del LCV para el período 2010-11 es desarrollar RT-PCRs en tiempo real específicas para los restantes
serotipos del virus, para poder realizar el tipado de VPEA de forma rápida en cualquier muestra clínica positiva.
Además, en el año 2009, el LCV ha llevado a cabo un estudio de comparación de distintos métodos de
inactivación del VPEA
En la UCM durante el 2009 y en colaboración con el CISA ha sido desarrollada una nueva técnica de diagnóstico
de real time-PCR (Fernández-Pinero et al. 2009) mediante el uso de una sonda Taqman-MGB que permite la
detección de los nueve serotipos de PEA. El rango sensibilidad de la prueba varia de 0.001 a 0.15 TCID(50) por
reacción, dependiendo del serotipo viral. El desarrollo de esta nueva prueba de diagnóstico molecular ha sido
financiado por el proyecto del INIA OT01-002 financiado por el gobierno español y el proyecto europeo LABON-SITE (SSPE-CT2004-513645).
Este mismo año, ha comenzado el proyecto europeo “Development of multivalent vaccines for BTV, EHDV
and AHS” (FP7-KBBE-2009-3). Este proyecto permitirá conocer nuevos aspectos inmunológicos de la
enfermedad, así como desarrollar vacunas de nueva generación (recombinantes multivalentes) y técnicas de
diagnóstico que permitan la diferenciación de animales vacunados e infectados.
6.
Recopilación, análisis y difusión de datos epizootiológicos concernientes a la lucha
internacional contra las enfermedades
Estudio para analizar y caracterizar el papel epidemiológico de las redes sociales de equino en la transmisión de
enfermedades, especialmente en Peste Equina Africana. Teniendo actualmente en aceptado en Preventive
Veterinary Medicine”Social network and spatial analyses of horse movements with application to disease
prevention in Spain” Martínez-López, B., Perez, A.M., Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2009).
7.
Facilitación de pericia por expertos a la OIE o a los Miembros de la OIE
–
8.
Suministro de formación científica y técnica al personal de otros Miembros de la OIE
-Seminario de Patología Equina en Berlín: Sánchez-Vizcaíno, JM (2009). “African Horse Sickness: Distribution,
reservoir and strategies of suppression”. Pferdeheilkunde, Forum 2009, Academie der Wissenschaften, Berlin, 1114 Junio.
- Seminario en el Institute of Virology and Immunoprophylaxis (IVI) en Berna: Sánchez-Vizcaíno, JM (2009)
“African Horse Sickness: Control and eradication”. Suiza Marzo 2009.
Informes anuales de los Laboratorios de Referencia y Centros Colaboradores de la OIE, 2009
3
Peste equina Africana
- Curso de enfermedades exóticas en Plum Island Animal Disease Center: Sánchez-Vizcaíno, JM (2009). “African
Horse Sickness”. Plum Island, New York Septiembre 2009.
Suministro de servicios para las pruebas de diagnóstico a otros Miembros de la OIE
9.
Durante el año 2009 se ha llevado a cabo un seguimiento conjunto con los Servicios Veterinarios del Reino de
Marruecos con el fin de estudiar y caracterizar una serología detectada en un grupo de animales. Este estudio se
había iniciado en el año 2008 y se completó a finales del año 2009.
10. Organización de reuniones científicas internacionales en nombre de la OIE o de otros
organismos internacionales
El Laboratorio Central de Veterinaria (LCV) ha organizado, como Laboratorio de Referencia Europeo para la
Peste Equina Africana, la reunión anual de Laboratorios Nacionales de Referencia para esta enfermedad. La
reunión se celebró el 1 de diciembre de 2009 en Bruselas (Centre Borchette, rue Froissart 36), Bélgica, con la
asistencia de 40 participantes pertenecientes a 22 países miembros de la Unión Europea, más representantes de
Suiza , Rusia y Marruecos, y con la participación del responsable de la Comisión Europea para esta enfermedad
(Dr. Alf Fuessel). El programa de la reunión incluyó la exposición de los resultados del ensayo de
intercomparación interlaboratorial 2009 por parte del LCV; así como diferentes presentaciones relacionadas con
avances en métodos de inactivación viral, métodos de diagnóstico de la enfermedad, y con la transmisión y
epidemiología de la misma a nivel mundial.
La UCM ha participado en las reuniones científicas internacionales para desarrollar el tema de la Peste Equina
Africana: seminario de patología equina desarrollado en Berlín en Junio de 2009, seminario en el Institute of
Virology and Immunoprophylaxis (IVI) presentado en Berna en Marzo de 2009 y el curso de enfermedades
exóticas impartido en Plum Island en Septiembre de 2009.
11. Participación en estudios científicos internacionales colaborativos
La UCM participa en el Proyecto europeo “Development of multivalent vaccines for BTV, EHDV and AHS”
(FP7-KBBE-2009-3). Los objetivos específicos de este proyecto son: Conocer nuevos aspectos inmunológicos de
la enfermedad, así como desarrollar vacunas de nueva generación (recombinantes multivalentes) y técnicas de
diagnóstico que permitan la diferenciación de animales vacunados e infectados. Además de nuestro laboratorio
participan los siguientes investigadores e Instituciones:
Participant
no.
Participant organisation name
Country
1 (coordinator)
Polly Roy, London School of Hygiene and Tropical Medicine
United Kingdom
2
Stéphan Zientara, Laboratorie d'Etudes et de Recherches sur les Patholgies Animales
et Zoonoses, AFSSA
José Manuel Sánchez-Vizcaíno, Animal Health Department, Veterinary School,
Universidad Complutense de Madrid
Catherine Cetre-Sossah, Groupe Virologie, CIRAD – Département Systèmes
Biologiques
Jean-Christophe Audonnet, Merial SAS
Joan Plana, Fort Dodge Vetinaria, S.A.
Vicky Fachinger, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
France
Danny Goovaerts, Intervet
Thomas C. Mettenleiter, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Institute for Animal
Health
Piet A. van Rijn, Mammalian Virology, Central Veterinary Institute of Wageningen
Baltus J. Erasmus, Research and Development, Deltamune
Juergen A. Richt, Kansas State University, College of Veterinary Medicine
Netherlands
Germany
13
14
Peter P.C. Mertens, Pirbright Laboratory, Institute for Animal Health,
Kris De Clercq, Department of Virology, Section Epizootic Diseases, CODACERVA-VAR
United Kingdom
Belgium
15
Philippe Pourquier, ID VET
France
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
4
Spain
France
France
Spain
Germany
Netherlands
South Africa
USA
Informes anuales de los Laboratorios de Referencia y Centros Colaboradores de la OIE, 2009
Peste equina Africana
12. Publicación y difusión de información concerniente al trabajo de la OIE (incluidas una lista de
las publicaciones científicas, las actividades de publicación por internet, las presentaciones en
conferencias internacionales)

Presentaciones en conferencias y reuniones internacionales
Villaba, R. Results of the AHS Interlaboratory comparison test 2009. ELISA. Annual meeting of EC National
African Horse Sickness (AHS) Reference labs. Brussels ,Belgium 1st December 2009.
Agüero, M. Results of the AHS Interlaboratory comparison test 2009. RT-PCR. Annual meeting of EC National
African Horse Sickness (AHS) Reference labs. Brussels ,Belgium 1st December 2009.
Muñoz, A. L. et al; Comparison of three inactivation methods to obtain AHSV RNA suitable for RT-PCR
analysis. Annual meeting of EC National African Horse Sickness (AHS) Reference labs. Brussels ,Belgium 1st
December 2009
Tena, C. et al; Development of serotypes 4 and 9 specific real time RT-PCR assays. Annual meeting of EC
National African Horse Sickness (AHS) Reference labs. Brussels ,Belgium 1st December 2009.
Pitarch, L. Quality Assurance according to ISO 17025. Annual meeting of EC National African Horse Sickness
(AHS) Reference labs. Brussels ,Belgium 1st December 2009.
Sánchez-Vizcaíno, JM (2009). “African Horse Sickness: Distribution, reservoir and strategies of suppression”.
Pferdeheilkunde, Forum 2009, Academie der Wissenschaften, Berlin, 11-14 Junio.
Sánchez-Vizcaíno, JM (2009). “ African Horse Sickness: Control and eradication”. Institute of Virology and
Immunoprophylaxis (IVI). Bern, Suiza, September.
Sánchez-Vizcaíno, JM (2009). “African Horse Sickness”. Course on Exotic Diseases. en Plum Island Animal
Disease Center. New York September 2009.

Publicaciones científicas en revistas con examen por pares
Fernández-Pinero, J., Ferández-Pacheco, P., Rodríguez, B., Sotelo, E., Robles, A., Arias, M., Sánchez-Vizcaíno,
JM. (2009). "Rapid and sensitive detection of African horse sickness virus by real-time PCR". Research in
Veterinary Science 86, 353-358.
Martínez-López, B., Perez, A.M., Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2009). ”Social network and spatial analyses of horse
movements with application to disease prevention in Spain” Acepted on Preventive Veterinary Medicine.

Otras comunicaciones
Martínez-López, B., Perez, A.M., Sánchez-Vizcaíno, JM. (2009). "Social Network Analysis. Review of General
Concepts and Use in Preventive Veterinary Medicine". Transboundary and Emerging Diseases, 56(4) : 109-20
13. Inscripción de kits de diagnóstico en el Registro de la OIE
i)
¿Participó usted a grupos de expertos para asesorar kits candidatos a la inscripción en el
Registro de la OIE? Si la respuesta es positiva, ¿cuáles reactivos fueron asesorados?
–
ii)
¿Presentó usted la candidatura de kits para inscripción al Registro de la OIE? Si la
respuesta es positiva, ¿cuáles kits?
–
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Informes anuales de los Laboratorios de Referencia y Centros Colaboradores de la OIE, 2009
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