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Biol 3019 Biología del Desarrollo Universidad de Puerto Rico-Aguadilla JA Cardé, PhD Expresión Diferencial del Genoma en el Desarrollo - II Objetivos Repasar los conceptos de equivalencia genómica y de expresión diferencial del genoma. Repasar la anatomía de un gen y del mRNA Promotores, enhancers, TF y silencers Explicar los mecanismos de transcripción diferencial Discutir el procesamiento diferencial del mRNA Resumir los mecanismos de controlde expresión genética: transcripcional, traduccional, postraduccional; y sus implicaciones en el desarrollo. Mecanismos de Transcripción diferencial TF: Ya se sabe quienes son, pero no se sabía su rol? ChIP-Seq Technique: Aislar y crosslink la cromatina Cortar el DNA (sonicación/enzimas) Incubar con AB vs la proteína de interés Precipitar complejo AB-ProtDNA Separar el DNA, PCR y secuenciar Mecanismos de Transcripción diferencial ChIP-Seq, identifica dos tipos de promotores High CpG content promoters Default ON, DNA no metilado activo; para inactivarlo metilar las histonas En genes de control del desarrollo temprano Regulan la síntesis de TF y otras proteínas reguladoras Low CpG content promotors proteínas características de etapas tardías, células maduras Defaults OFF: DNA metilado inactivo, hay que demetilar y esto permite modificar las histonas y la RNA pol II entra. Ejs: estados de cromatina en promotores HCP vs LCP - Activos, Bivalente, Inactivo DNA. Histonas, Otros Transcripción diferencial: mecanismos Metilación del DNA: ON/OFF switch Histonas metiladas … y el DNA? En las citosinas del promotor 5 Metil-Cit (5ta base) estabiliza nucleosomas y previene transcripción Presente en 5% de las C (siempre seguidas por G) luego de la replicación Regulación transcripcional en vertebrados Metilación del DNA, promotores Bloquea la unión de TF a enhancers con C metilada Facilita reclutamiento de metilasas y deacetilasas, estabilizando el nuclesoma para evitar transcripción (MeCP2) Transcripción diferencial: mecanismos Metilación del DNA: ON/OFF switch Gen de Globina -Promotor demetilado en RBC vs otras células -Developmentally Regulated Genes Transcripción diferencial: mecanismos Metilación del DNA: ON/OFF switch Metilación: como bloquea la transcripción? - TF se pueden unirse a enhancers no metilados - No pueden unirse a enhancers metilados Metilación: como bloquea la transcripción? - Reclutando proteínas que a su vez alteran el nivel de metilación o de acetilación - EJ: MeCP2 – liga las Citosinas metiladas - Esta a su vez recluta deacetilasas y metiltransferasas - Remueven acetilaciones - Sustituyen por metilaciones - Reclutan a H1 Metilación: Patrones heredables: DNMT3DNMT1 DNA CpG | | DNMT3 (de novo) | | DNMT1 (forever) 3 estados de los promotores Activado – Reprimido – Intermedio Bivalente, estado Intermedio: permite una respuesta rápida a señales de desarrollo Característico de promotores High CpG (HPC); genes de control Escasamente metilados, RNA pol II y nRNAs presentes incompletos, nucleosomas estado intermedio o bivalente con: H3K4me3, activos H3K27me3, inactiva Paso limitante para HPC es alargamiento de los nRNAs Para los LPC, es iniciación RNA Procesamiento Diferencial: Clave para diferenciación: síntesis de diferentes proteínas en diferentes tipos de células Control en Procariota : transcripción, traducción y postraducción Control en Eucariota: uno mas; procesamiento y transporte Splicing isoforms: proteínas distintas del mismo gen: familia En humanos 90% de los genes lo usan Genoma: 20,000 genes < Proteoma: 20,000 proteínas Genes Cells Proteins C elegans 20,000 959 ~20000 H sapiens 20,000 100,000 bil ~100,000 Alternative Splicing Variants Alternative Splicing Variants Bcl-XS vs Bcl-XL: - large Bcl = inhibe apoptosis - short Bcl = induce apoptosis en tumores cual predomina? Spliceosome Factores de splicing - Expresados diferencialmente -snRNA U1 y SF2 en 5’ -U2AF en 3’ RNAProcesamiento Diferencial: ER-Drosophila Dscam gene38,000 proteínas Altenative Splicing: FGF IIIb vs IIIc - Ambos en entre ex 7 y 10 - mesenq IIIC: mesodermo - epitelio IIIB ectodermo - Metilaciones marcan splicing - H3K36me3 excluye el B - PPTB Splicing enhancers y recognition factors Splicing enhancer (cis) sequences (SES) Cerca de sitios de splicing Promueven el ensamblaje del spliceosome Recognition factors (trans) proteins Reconocen las SES y reclutan el splicesoma Polypirimidine track binding - proteínas (PPT) reprimen la formación del spliceosoma Aplicación clínica Mutaciones en splicing sites: Resultan en proteínas NO funcionales Distrofina: mutación en un “splicing site” causa que se salte el exón Miostatin gene: mutación induce personas mas “fuertes” Su proteína es un regulador negativo de división celular muscular Hipertrofia muscular – si miostatina no está, el músculo se sigue dividiendo hasta mas tarde: músculos mas grandes Hipertrofia Muscular Myostatin Knockout Control: Nivel traduccional: longevidad diferencial Longevidad diferencial del mRNA : media vida del mRNA Mientras mas estable mas dura y mas copias de la proteína Longitud del poli A, secuencias en el 3’UTR para mayor longevidad Estabilización de ciertos mRNA en ciertos momentos en ciertas células mRNA caseína : 1.1 hr en tejido mamario vs 28.5 hrs en lactancia (prolactina) HuD – grupo de proteinas que estabiliza dos grupos de RNAS -Proteinas que detienen division celular en neuronas -Proteinas que inician diferenciacion neuronal Control: Nivel traduccional: Inhibición selectiva de mRNAs Ovocito: fabrica y almacena los mRNAs que se usarán solamente luego de fecundación. Se mantienen en estado durmiente hasta que llegue la señal: cambo de polaridad / iones (Ca2+) Ej de mRNAs en el huevo: histonas, actina/tubulina, ciclinas Drosophila: bicoid, caudal, nanos (homeobox) Regulación traduccional “negativa”: inhibidores Control: Nivel traduccional: Inhibición selectiva de mRNAs 5’Cap, 3’ Poly A ; si no están no traducción Circularización de mRNA - 5’ cerca de 3’ -eIF4E + -eiF4A (helic) -eiF4G (scaf) -poliABP -Maskin -CPEB (3’UTR) (uuuuau) -eIF4E -Fosforilacion de CP y Maskin activa Control: Nivel traduccional: Inhibición selectiva de mRNAs Ovocito de Drosphila – Bicoid Puede ser TF activador –hunchbak Puedes se TF inhibidor - caudal Bicoid: --Reconoce un BRE en 3’UTR del mRNA de caudal --Liga a d4EHP --Previene unión de eIF4E --Sin este eIF4G no se puede pegar e iniciar la traducción Control: Nivel traduccional - Tienen favoritismos los ribosomas? NO! - a favor: mRNAs de Euc son traducidos por ribosomas de Proc - sistema reticuloendotelial: traducción por excelencia SI: Selectividad ribosomal – Ribosomas tienen proteinas distintas dependiendo del tejido Observación de un gen que causaba deformidades en esqueleto axial Encuentran la mutación NO en el gen sino en Rpl38 Traducción Diferencial por Rpl38 Control: Nivel traduccional Rpl 38 – mutada podía traducir muchos mRNAs No podia traducir los mRNAs para los genes Hox Proteína 38 del ribosoma en las somitas, controla expresion de Hox Especifican el tipo de vértebra a lo largo de la columna Deficiencia de Rpl38 causa que las celulas de las vertebras inician traduccion es los Hox PLT deformidad vertebral Control: Nivel traduccional puede el RNA, como las proteinas unirse a un acido nucleico y bloquearlo? SI microRNAs – forma eficiente y específica de regular la traducción de un mRNA Pequeños, complementarios a mRNA o parte de el Antisense RNA, primera vez en C. elegans Gen lin-4 produce un RNA de 21 ncltd que se pega a varios puntos de un 3’UTR del mRNA de lin 14 Control: Nivel traduccional puede el RNA como las proteinas unirse a un acido nucleico y bloquearlo? SI lin14 usado en larva temprana, luego inactivado, no es necesario lin 4 inactiva la sintesis de LIN-14 miRNAs – sobre 1000 en humanos, regulan 50% de nuestros genes estructurales miRNA: ~ 22 ncltds, lejos o en intrones de los genes Se fabrica a partir de precursores mas gdes Control: Nivel traduccional miRNAs - Conservado - El precursor tiene varios repeats, cada uno forma un loop - Estos loops son procesados por Drosha y Dicer (RNAsas) - Estas lo hacen SS RNA - Empacado en RISC- Argonauta - Se unen al 3’UTR - Inhiben traducción - Perfect Prim-DroshaPremDicermicroAgo microRNAs miR1- controla el balance entre crecimiento ventricular y diferenciación miR181 – esencial para la determinación de células progenitoras en celulas B miR430 – operación limpieza de mRNAs maternales el ovocito una vez traducidos (zebra fish), de los primeros en ser expresados en el embrión Fine tuning de Nodal: determinacion de ectodermo/endodermo Son de 22 ncltds, pero con region “seed” de 5ncltd en el 5’ mRNA con 3’UTR mutado y micro RNA no lo reconoce? Texel sheep: myostatin – error de splicing miostatina G A en 3’UTR, mir1 y mir 206, degradan el mRNA del miostatina Control de expresión de RNA: localización citoplásmica Se regula el timing y la localizacion de la expresión 3’UTR – represión selectiva y localización selectiva 3 mecanismos de localización Difusion y anclaje por proteinas activadoras (nanos) Proteccion por localizacion (hsp83) Libre difusion como nanos pero no es degradada en unas zonas especificas (polo posterior) Transporte activo (mecanismo mas usado) Proteinas motoras ligan el 3’UTR y lo transportan Son ATPAsas (Dineina y kinesina, osar y bicoid) • Difusión y anclaje por proteinas activadoras (nanos); se difunde se concentran en el polo posterior • Protección Localizada • Hsp38 – se difunde, se degradas excepto polo posterior • Transporte activo por el citoesqueleto • 3’UTR anclados a motores celulares • Dineina • Kinesina Regulación Postraduccional Digestion enzimatica – zimogenos/insulina Compartamentalizacion – mitocondria, lisosomas, nucleo, golgi Dimerizacion, polimerizacion Hgb, Tubulina, actina Cofactores Ca2+. Mg+2 Modificaciones covalentes Fosforilacions, Acetilaciones, Metilaciones