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Trabajo Práctico Nº 4: PCR en
Tiempo Real
Bqca. Mariana Ferramola
2011
PCR en Tiempo Real: Componentes de la
mezcla de reacción.
ADN molde
Primers
Taq polimerasa
dNTPs
MgCl2
Buffer
Fluorocromo
PCR en Tiempo Real vs. PCR convencional.
PCR en Tiempo Real
PCR convencional
Amplificación y detección de
productos en una misma etapa.
Amplificación y detección de
productos en 2 etapas separadas.
Rango dinámico de detección
amplio.
Rango dinámico de detección
estrecho.
Detección durante la fase
exponencial temprana (máxima
eficiencia de reacción).
Detección durante la fase
exponencial.
Mayor sensibilidad.
Menor sensibilidad.
Mayor especificidad con el uso de
sondas.
Menor especificidad.
Requerimiento de equipamiento y Requerimiento de equipamiento y
reactivos muy costosos.
reactivos de bajo costo.
PCR en Tiempo Real vs. PCR convencional.
PCR en Tiempo Real.
PCR convencional.
PCR en Tiempo Real: ventajas.
Sensibilidad
Cuantificación
Monitoreo de todo el procedimiento
Disminución del riesgo de contaminación
Automatización
Amplicones pequeños
Amplio rango dinámico
Transcripción reversa
PCR en Tiempo Real: Fases de la curva de
amplificación
Donde: ΔRn es la intensidad de emisión de fluorescencia y se calcula
como la diferencia en laemisión de fluorescencia normalizada (Rn) de
la muestra y de un control sin templado (control negativo).
Etapas de la PCR en Tiempo Real.
Los pasos de PCR y detección de productos son llevados a
cabo por el equipo de PCR en Tiempo Real.
PCR en Tiempo Real: preparación de la muestra.
PCR en Tiempo Real en
un paso:
La retrotranscripción y amplificación
ocurren en el mismo tubo. Ventajas: se
minimizan
las
variaciones
experimentales y la posibilidad de
contaminaciones. Desventajas: El ADNc
generado sirve solo para una
amplificación y se ha reportado que es
menos sensible.
PCR en Tiempo Real en
dos pasos
La retrotranscripción y amplificación
ocurren
separadamente.
Ventajas:
permite corroborar la eficiencia de la
retrotranscripción y mayor sensibilidad.
Desventajas: Mayor probabilidad de
contaminación de la muestra.
PCR en Tiempo Real: instrumentación.
Composición del equipo:
 Termociclador.
Conforman el
mismo
 Lector de
instrumento.
fluorescencia.
 Recolector de datos.
Energía de
excitación.
Canales de
lectura.
PCR en Tiempo Real: instrumentación.
Tipos de emisores de
energía disponibles:
 Lámparas (de halógeno o
cuarzo).
 Diodos emisores de luz (LEDs).
 Láseres.
La mayoría de los equipos presentan lectores de
fluorescencia que permiten leer múltiples longitudes de
onda simultáneamente. Esto posibilita el desarrollo de
reacciones multiplex.
PCR en Tiempo Real: instrumentación.
PCR en Tiempo Real: consideraciones de amplificación.
El buffer de reacción contiene: MgCl2, KCl, dNTPs y Taq
polimerasa. En caso de usarse un colorante de unión al ADN
para cuatificación, este también viene incluído.
En el caso del uso de sondas fluorescentes, estas se agregan a la
mezcla de reacción por el operador
La longitud óptima del amplicón es <100 pb. Sin embargo, se
amplifican bien fragmentos de hasta 200 pb.
La concentración de ADN inicial está entre 1-100 ng.
En el caso del uso de sondas, estas deben tener un Tm 10ºC
mayor que el de los primers..
PCR en Tiempo Real: definición de ciclo umbral.
En la fase exponencial temprana, la intensidad de fluorescencia
alcanza un umbral que es significativamente mayor que la la
fluorescencia de fondo. El ciclo en que esto ocurre se denomina Ct
(threshold cycle).
PCR en Tiempo Real: definición de ciclo umbral.
Muestra
Rn
ΔRn
Threshold
Control Negativo
Basal
Ct
Número de ciclos
PCR en Tiempo Real: definición de ciclo umbral.
El umbral de fluorescencia es un parámetro modificable. Este
valor debe elegirse teniendo en cuenta que la reacción sea
cuantificada en la fase exponencial temprana.
Bajo condiciones ideales, se cumple que:
log[ADNi]= 1/Ct
A mayor producto de
amplificación mayor
fluorescencia!!!!
PCR en Tiempo Real: definición de ciclo umbral.
PCR en Tiempo Real: Expresión del nivel de
fluorescencia.
Rn: intensidad de la señal emitida por el reporter
normalizada por la emisión del colorante utilizado como
referencia pasiva (ROX) medido en el NTC.
ΔRn: magnitud de fluorescencia generada durante la PCR.
Threshold: umbral en el que se produce un cambio
significativo en la fluorescencia.
Basal: ciclos iniciales de la PCR (3-15) en los cuales hay
cambios mínimos en la emisión de fluorescencia.
Ct: número de ciclo en el cual la fluorescencia emitida
supera el threshold. Está inversamente correlacionado con
el log. del núm. inicial de copias.
PCR en Tiempo Real: Expresión del nivel de
fluorescencia.
Sistemas de detección utilizados en la PCR en Tiempo
Real.
Sist. de Detección
Colorantes de unión
al ADN
Oligonucleótidos
específicos
Primers
fluorescentes
Sondas
fluorescentes
Sistemas de detección utilizados en la PCR en Tiempo
Real.
Colorantes de unión al ADN
(SYBR Green).
Las tecnologías fluorescentes
utilizadas incluyen:
Sondas que fluorescen
luego de su hidrólisis
(sondas taqman).
Sondas de hibridación.
Sondas
pegadas.
fluorescentes
Un fluoróforo es una molécula que absorbe radiación a una
longitud de onda determinada y luego emite la energía
absorbida en forma de luz a una longitud de onda diferente.
PCR en Tiempo Real: detección mediante SYBR Green.
El SYBR Green es un colorante de unión al ADN, por lo que emite
fluorescencia cuando se intercala en la doble hélice del mismo.
Con los sucesivos
ciclos, se va
acumulando
producto
de
reacción, en el
cual se intercala
el
colorante,
aumentando la
fluorescencia
emitida en cada
ciclo.
PCR en Tiempo Real: detección mediante SYBR Green.
Ventajas
El mismo colorante puede
usarse para diferentes blancos
de amplificación.
Relativamente económico.
Fácil optimización de las
condiciones de reacción.
Desventajas
La presencia de dímeros de
primers y amplificaciones
inespecíficas generan falsos
positivos.
No agrega especificidad a la
reacción. Necesidad de realizar
una curva de disociación.
No permite realizar PCR
multiplex.
PCR en Tiempo Real: realización de curvas de
disociación.
Representa la medición de la/s temperatura/s de fusión de
el/los producto/s amplificado/s
• Contenido de
GC.
• Tamaño del
amplicón.
PCR en Tiempo Real: realización de curvas de
disociación.
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de
hidrólisis.
Se lleva a cabo mediante la
hibridación con una sonda
complementaria a una región
interna de la secuencia blanco,
previamente a la amplificación. Tm
sonda debe ser 10ºC > que el de los
cebadores, de modo que hibride
antes que los mismos.
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de
hidrólisis.
A través del fenómeno de
transferencia de energía
fluorescente
mediante
resonancia
(FRET),
el
fluoróforo
quencher
absorbe
la
energía
fluorescente emitida por el
fluoróforo
reporter,
cuando ambos están muy
próximos entre si. La
degradación de la sonda
elimina este fenómeno,
con lo que puede medirse
la emisión del reporter.
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de
hidrólisis.
Ventajas
Desventajas
Incrementa la especificidad
de la reacción.
Debe diseñarse una sonda
diferente para cada blanco a
estudiar.
Permite la realización de PCR Relativamente más costoso.
multiplex.
Permite realizar
discriminación alélica
mediante el uso de sondas
ASO
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de
hibridación.
Uso de 4 oligonucleótidos.
Dador
Aceptor
El método utiliza dos
primers (F y R) y dos
sondas marcadas con
fluorocromos, las
cuales hibridan
adyacentemente.
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de
hibridación.
La sonda que hibrida corriente arriba tiene un fluoróforo dador
en 3’, y la sonda que hibrida corriente abajo tiene un fluoróforo
aceptor en 5’. El espectro de absorción del último se solapa con
el espectro de emisión del primero. Esto resulta en emisión de
fluorescencia por el fluoróforo aceptor, cuando ambas sondas
están juntas.
La transferencia de energía también se da mediante fenómeno
FRET.
La sonda que hibrida corriente abajo debe tener bloqueado su
extremo 3’, para no poder ser amplificada por la polimerasa.
En la reacción que usa 3 oligonucleótidos el fundamento es el
mismo, pero la sonda que se une corriente arriba es
reemplazada por un primer marcado con el fluorocrómo dador.
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de
hibridación.
Ventajas
Desventajas
Incrementa la especificidad
de la reacción.
Debe diseñarse una sonda
diferente para cada blanco a
estudiar.
Permite la realización de PCR
multiplex.
Relativamente más costoso.
Permite realizar
discriminación alélica
mediante el uso de sondas
ASO
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas
fluorescentes plegadas (hairpin probes)
Balizas moleculares
Región secuencia
específica
Repeticiones
invertidas
Fluoróforo reportero
Fluoróforo quencher
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas
fluorescentes plegadas (hairpin probes)
PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas
fluorescentes plegadas (hairpin probes)
Ventajas
Desventajas
Incrementa la especificidad
de la reacción, aun más que
las demás sondas.
Debe diseñarse una sonda
diferente para cada blanco a
estudiar.
Permite la realización de PCR
multiplex.
Relativamente más costoso.
Permite realizar
discriminación alélica
mediante el uso de sondas
ASO
PCR en Tiempo Real: Tipos de cuantificación
Absoluta: Necesita del uso de patrones,
que deben ser incluidos en cada PCR
realizada.
Tipos de
cuantificación
Relativa: Da idea de los cambios
generados en el nivel de un gen de
interés, en comparación con un gen
control que no varía con el tratamiento
realizado.
Sin importar que método de cuantificación se utilice, es
importante que la eficiencia de la reacción de amplificación
sea cercana a 100%.
PCR en Tiempo Real: cálculo de la eficiencia de
reacción.
Se realiza a partir de los datos recolectados de una
curva estándar, aplicándose la siguiente fórmula:
Eficiencia = [10 (-1/pendiente)] – 1
Realizar diluciones
seriada de una muestra
o patrones.
Se grafica Ct vs log de la
concentración inicial de
templado (o vs concentración
de DNA en la muestra)
Si la eficiencia de reacción fue del 100%, se obtendrá una
recta cuya pendiente es de-3,32
PCR en Tiempo Real: cuantificación absoluta.
Utiliza diluciones seriadas de estándares de
concentraciones conocidas para construir una curva
estándar.
A partir de la curva se establece una relación lineal
entre el Ct y la cantidad inicial de templado de ADN.
La cuantificación absoluta asume que todos los
estándares y las muestras tienen la misma eficiencia
de amplificación.
PCR en Tiempo Real: cuantificación absoluta.
Eficiencia cercana
al 100%.
PCR en Tiempo Real: cuantificación relativa.
Mide cambios en el nivel de un gen de interés, en relación al nivel
de un gen control que no varía con las condiciones ensayadas.
Método de la comparación de Ct .
Se puede llevar a cabo a
través de dos métodos.
Método de la curva estándar para
cuantificación relativa.
PCR en Tiempo Real: cuantificación relativa por el
método de la comparación de Ct (2-ΔΔCt).
Es el método más comúnmente utilizado. Se basa en un modelo
matemático que calcula cambios en la expresión génica como
diferencias relativas entre la muestra experimental y un calibrador
(controles en los que hay expresión segura de los genes).
ΔCt T= CtGi T – CtGe T
ΔCt Calibrador= CtGi Co –
CtGe Co
ΔΔCt T= ΔCt T – ΔCt
Calibrador
ΔΔCt= 2
2-ΔΔCt= 0,25
PCR en Tiempo Real: cuantificación relativa por el
método de la comparación de Ct (2-ΔΔCt).
El método de comparación de Ct permite una
cuantificación relativa: la muestra tratada es x
veces a la muestra del control.
PCR en Tiempo Real: Normalización.
Los resultados de la PCR en Tiempo Real son normalizados frente
a genes controles, que pueden servir a la vez cómo controles
positivos.
Se asume que la expresión de un gen endógeno es:
Similar en todas las muestras, en un estudio dado.
Resistente a variaciones experimentales.
Conducida en todos los pasos de PCR con la misma cinética que
el gen de interés.
Para cada experimento debe seleccionarse un gen
control cuya expresión no varíe en las condiciones
experimentales a ensayar.
PCR en Tiempo Real: Normalización.
Ejemplos de genes usados como
controles endógenos:
β-Actina
rARN 18S
GAPDH
β2-microglobulina
Ej. Cuantificación Relativa (SYBR Green) mediante
el método del 2 -(ΔΔCt)
Objetivo: medir la expresión de TRalfa en leucocitos PMN de
ratas controles e hipotiroideas. Endógeno: beta-actina.
Tejido calibrador: hígado de rata.
Curva de Rango Dinámico TRalfa
Curva de Rango Dinámico Beta Actina
Cuantificación relativa de TRalfa mediante el
método del 2 -(ΔΔCt).
Concentración de primers.
Se debe poner a
punto:
Concentración de cDNA.
Target: TRalfa (muestra y
calibrador).
Se realizan 2
master mix:
Endógeno: βactina (muestra y
calibrador).
No se debe olvidar en los cálculos los NTC.
Cuantificación relativa de TRalfa mediante el
método del 2 -(ΔΔCt).
Cuantificación relativa de Tralfa: curvas de
amplificación.
Cuantificación relativa de TRalfa : Curvas de
amplificación.
Cuantificación relativa de Tralfa: Curva de
disociación.
Cuantificación relativa de TRalfa mediante el
método del 2 -(ΔΔCt): expresión de resultados.
Ej. Discriminación Alélica mediante uso de sondas
Taqman.
Objetivo: determinar genotipo homocigota o
heterocigota para un determinado polimorfismo en
gen de PPARγ2.
Alelos:
Ala12
Pro12
Sonda 1
(FAM)
Alelo 1
Sonda 2
(VIC)
Alelo 2
Match
Match
Mismatch
Mismatch
• Homocigota alelo 1:
• Heterocigota:
• Homocigota alelo 2: