Download PCR en tiempo real

Otras PCR: PCR en tiempo
real (cuantitativa)
Curso PCR
2007-08
Inma Martín Burriel
Curso PCR 2007-08
Programa:
• Miércoles 23 de enero (11h):
– PCR en Tiempo Real (teoría)
– PCR en Tiempo Real (video)
– Ventajas e inconvenientes de los distintos
tipos de PCR-TR.
• Miércoles 23 de enero (15h):
– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:
• Diagnóstico, expresión génica, análisis
mutaciones.
Curso PCR 2007-08
Programa:
• Jueves 24 de enero (9:30h):
– Protocolo experimental:
• Diseño de primers y sonda (Primer express).
• Validación de primers.
• Optimización de la reacción:
– Matriz de primers
– Matriz de sonda
• Curva standard.
– Práctica
Curso PCR 2007-08
Programa:
• Miércoles 23 de enero (11h):
– PCR en Tiempo Real (teoría)
– PCR en Tiempo Real (video)
– Ventajas e inconvenientes de los distintos
tipos de PCR-TR.
• Miércoles 23 de enero (15h):
– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:
• Diagnóstico, expresión génica, análisis
mutaciones.
Curso PCR 2007-08
PCR clásico
• La cantidad de producto
no está relacionada con
la cantidad de DNA inicial
• Herramienta cualitativa
(presencia o ausencia)
• El bromuro de etidio es
poco sensible, cuando se
detecta ya se ha
sobrepasado la fase
exponencial
Curso PCR 2007-08
Necesidad de PCR en tiempo real
• Necesidad de cuantificar diferencias de
expresión de un mRNA
• Disponibilidad de muy pequeñas
cantidades de mRNA en algunas prácticas
laboratoriales:
– Células obtenidas de microdisección por láser
– Pequeñas cantidades de tejido
– Biopsias embrionarias
– Especimenes de gran valor
Curso PCR 2007-08
Técnicas de cuantificación
• Northern Blot
Curso PCR 2007-08
PCR Competitivo o PCR “Mimic”
Early expression of p53 responsive genes (24h)
Bax
CD95/Fas
GAPDH
L
C
6
8
10
12
M
Curso PCR 2007-08
PCR Competitivo o PCR “Mimic”
Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers
Bcl-2
Tgf-b1
c-myc
L
C
6
8
10
12
Curso PCR 2007-08
M
PCR Competitivo o PCR “Mimic”
Curso PCR 2007-08
Martín-Burriel et al. Toxicologic Pathology, 32:202–211, 2004
PCR en Tiempo Real
Nuevos químicos
Nuevas plataformas
instrumentales
Detección de productos
PCR en tiempo real
Permite observar la cinética
de la reacción
Curso PCR 2007-08
Fases de la PCR
• Exponencial: En cada ciclo se dobla el
producto.
• Lineal: enlentecimiento, consumo de
componentes, principio de degradación.
• Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de
componentes, degradación de productos.
Curso PCR 2007-08
Fases de la PCR
Logarítmica
Lineal
Curso PCR 2007-08
Detección en la fase exponencial
Curso PCR 2007-08
Detección en la fase de meseta
Problemas de cuantificación
en la fase de meseta
Curso PCR 2007-08
PCR en Tiempo Real
• Toma los datos mientras se producen.
• Cuantificación más exacta sin necesidad
de métodos laboriosos.
• Existe una relación cuantitativa entre la
cantidad inicial y la cantidad de producto
PCR en un ciclo dado.
Curso PCR 2007-08
Programa:
• Miércoles 23 de enero (11h):
– PCR en Tiempo Real (teoría)
– PCR en Tiempo Real (video)
– Ventajas e inconvenientes de los distintos
tipos de PCR-TR.
• Miércoles 23 de enero (15h):
– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:
• Diagnóstico, expresión génica, análisis
mutaciones.
Curso PCR 2007-08
Programa:
• Miércoles 23 de enero (11h):
– PCR en Tiempo Real (teoría)
– PCR en Tiempo Real (video)
– Ventajas e inconvenientes de los distintos
tipos de PCR-TR.
• Miércoles 23 de enero (15h):
– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:
• Diagnóstico, expresión génica, análisis
mutaciones.
Curso PCR 2007-08
Flurocromos: SYBR Green
• Se intercala en el
surco menor del ADN
de doble cadena y
emite fluorescencia.
• No es equimolecular.
• Necesaria curva de
disociación.
Curso PCR 2007-08
Ventajas e inconvenientes
• PCR con SYBR Green:
– Más barato
– Los mismos reactivos sirven para analizar
cualquier fragmento
– La especificidad viene dada únicamente por
los primers
– No es equimolecular
– Se necesita realizar una curva de disociación
Curso PCR 2007-08
Curva de disociación
Curso PCR 2007-08
Curva de disociación
Curso PCR 2007-08
Curva de disociación
Muestras problema
Controles negativos y sin RT
Curso PCR 2007-08
Sondas TaqMan
•
•
•
•
•
Actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa.
Reporter: FAM, VIC.
Quencher: TAMRA.
Importante tªm (~70ºC).
Equimolecular.
Curso PCR 2007-08
Ventajas e inconvenientes
• PCR con Sondas TaqMan:
– Más caro
– Utilización de sondas específicas para cada
fragmento a analizar
– La especificidad viene dada por los primers y
la sonda
– Es equimolecular
– No necesita curva de disociación
Curso PCR 2007-08
Especificidad
Diseño de sondas entre dos exones
Curso PCR 2007-08
Equimolaridad
SYBR Green
TaqMan
Curso PCR 2007-08
Sondas MGB
R
• NFQ:
 Quencher oscuro, no
emite fluorescencia.
MGB
 Disminuye Baseline.
NFQ
 Aumenta sensibilidad.
• MGB:
 Se une al surco pequeño.
 Aumenta la Tªm.
 Aumenta la eficiencia.
Curso PCR 2007-08
Metodología
ryr-1:
CTG TGT TCC CTG TGT GTG TGC AAT GGT GTG GCC GTG
Forward
Sonda 12
Reverse
CAA GAT CTC ATT ACT GAG AAC TTG CTG CCT GGC CGC
GC TCC AAC
FAM
VIC
Protocolo:
Componentes de la reacción
Volumen /
Reacción
(ml)
Final concentración
TaqMan® Universal PCR
Master Mix, No AmpErase®
UNG (2X)
12,5
1X
40X Assay Mix
(Mescla de cebadores y
sondas)
0,625
1X
DNA
2
H2O
9,875
Curso PCR
2007-08
1-20
ng
---
 Pre-lectura:
60ºC
 PCR:
95ºC
92ºC
60ºC
 Post-lectura:
60ºC
1min
10min
15sec
(x50)
1min
1min
Resultados
CT
CC
TT
NTC
Curso PCR 2007-08
Programa:
• Miércoles 23 de enero (11h):
– PCR en Tiempo Real (teoría)
– PCR en Tiempo Real (video)
– Ventajas e inconvenientes de los distintos
tipos de PCR-TR.
• Miércoles 23 de enero (15h):
– Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real:
• Diagnóstico, expresión génica, análisis
mutaciones.
Curso PCR 2007-08
Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2007-08
Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2007-08
Glosario de términos
• Cuantificación:
– Absoluta:
• Resultado final con unidades (carga viral, copias
de mensajero, copias de un gen,...).
• Se necesita una curva patrón absoluta.
– Relativa:
• Resultado sin unidades. Proporciona un
porcentaje de incremento o disminución
(expresión génica).
• Se necesita curva patrón (al menos para prueba
de primers).
Curso PCR 2007-08
Glosario de términos
• Referencia:
– Señal utilizada para normalizar el experimento.
• Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX).
• Activa: endógena (housekeeping) o exógena (construcción).
• Calibrador:
– Muestra que usamos para comparar las demás.
Curso PCR 2007-08
Glosario de términos
• Standard (patrón):
– Muestra de concentración conocida que
nos permite construir la curva de
calibrado.
• Threshold (umbral):
– Ct es el ciclo en el cual se detecta un
incremento significativo de DRn
(fluorescencia). El sistema empieza a
detectar la señal asociada al incremento
exponencial de producto PCR
Curso PCR 2007-08
Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2007-08
Curva estándar
Curso PCR 2007-08
Curva estándar
Curso PCR 2007-08
Curva Patrón
•
•
•
•
y=ax+b. Y=Ct, X=log [DNA].
Relaciona cada concentración con su Ct.
Propia de cada pareja de primers.
La pendiente depende de la eficiencia de los
primers y no debería cambiar entre
experimentos:
–
–
–
–
100% (a=-3.32).
75% (a=-4).
Aceptable:-3 ≤ -4.
a> -3 contaminación por fluorescencia.
Curso PCR 2007-08
Curva Patrón
• Correlación (R2):
–
–
–
–
R2=1 (perfecta).
R2≥0.97.
Seleccionar el umbral donde R2 sea máxima.
Mantener el umbral entre experimentos.
• Nº de réplicas:
– Al menos 2 réplicas por muestra.
– Desviación estándar ≤ 0.38
• Muestra:
– Curva absoluta: muestra de [] conocida.
– Diluciones 1/5.
Curso PCR 2007-08
1. Cuantificación Absoluta
• Validación de la curva patrón:
– La precisión de la cuantificación dependerá de la
precisión de los patrones.
– Patrones:
•
•
•
•
DNA plasmídico.
DNA genómico.
Productos PCR.
Grandes oligonucleótidos comerciales.
– Resultado final relativo a una unidad de interés:
•
•
•
•
Copias/ng de RNA
Copias/g tejido, copias/ml sangre.
Copias/genoma.
Copias/ célula.
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ATENCION
DENOMINADOR
1. Cuantificación Absoluta
• Posibles curvas de calibrado (Expresión
génica):
– Productos de RT-PCR u oligonucleótidos:
• Rápido, conocimiento preciso de [DNA].
• Inestable, problemas en la reamplificación.
– DNA recombinante:
• Muy estable, sin problemas de amplificación, talla
similar a transcritos.
• Construcción del DNArec, no tiene en cuenta la
eficacia de la RT.
– RNA recombinante:
• Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir
RNA background).
• Muy inestable, clonación complicado, purificación,
problemas de almacenamiento.
Curso PCR 2007-08
1. Cuantificación Absoluta
• Puntos críticos de la curva patrón:
– DNA o RNA puro y muy concentrado.
– Exactitud en la medida de la concentración
inicial (7 veces).
– Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA
original hasta concentraciones similares a las
muestras biológicas (106-1012).
– Estabilidad de las muestras patrón (RNA).
Curso PCR 2007-08
2. Cuantificación Relativa
• Curva patrón:
– Sencillez en la preparación.
– La cantidad de producto (n veces) se refiere a
la obtenida en el calibrador (1x).
– No hay unidades.
– Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para
la obtención.
Curso PCR 2007-08
2. Cuantificación Relativa
• Puntos críticos de la curva patrón:
– Dilución adecuada del RNA o DNA patrón.
– La utilización de las mismas muestras en
placas distintas permite comparar resultados.
– Se pueden utilizar patrones DNA para análisis
de RNA.
– Se necesitan curvas patrón para el gen de
estudio y el control endógeno.
Curso PCR 2007-08
2. Cuantificación Relativa
• Ejemplo: cuantificación de SPP1 en
cultivos celulares de células
mesenquimales en diferenciación
Curso PCR 2007-08
Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +-
Curso PCR 2007-08
Polimorfismo de SNPs
• Sondas alelo-específicas.
• Utilización de sondas MGB/NFQ: Mayor
discriminación.
• Utilización de oligos alelo-específicos y
SYBR Green.
• Las curvas de disociación discriminan
alelos.
Curso PCR 2007-08
Aplicaciones de la PCR-TR
• Glosario de términos.
• Cuantificación:
– Absoluta
– Relativa
• Determinación de mutaciones.
• Ensayos +/-
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Ensayos +/• Se marca el ensayo con sonda TaqMan o
SYBRGreen.
• Adición de un control interno positivo
(control de amplificación).
Eliminar Falsos Negativos
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Programa:
• Jueves 24 de enero (9:30h):
– Protocolo experimental:
• Diseño de primers y sonda (Primer express).
• Validación de primers.
• Optimización de la reacción:
– Matriz de primers
– Matriz de sonda
• Curva standard.
– Práctica
Curso PCR 2007-08
Diseño primers
•
•
•
•
Tamaño amplicon: 50-150pb
%GC: 20-80%
Máximo 2/5 G o C en el extremo 3’
Longitud: 9-40pb (mejor 20pb, no se
recomiendan longitudes <18pb)
Curso PCR 2007-08
Diseño de primers y sonda (Primer express).
Curso PCR 2007-08
Diseño de primers
• Tm: 58-60ºC
– Tm: Tª en la que el 50% de las cadenas está
unida y el 50% despegada
– Si se pega más del 50%más posibilidad de
inespecificidades
– En tiempo real: Tª=Tm
• Diferencia de Tm entre los dos primers <
2ºC
Curso PCR 2007-08
Diseño de primers
Primer F: Tm 58ºC
Primer R: Tm 60ºC
PCR: 60ºC
[Primer F]
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Matriz de Primers
Primer Forward
Primer Reverse
50nM 300nM 900nM
50nM
2X
2X
2X
300nM
2X
2X
2X
900nM
2X
2X
2X
Curso PCR 2007-08
Matriz de primers
< Ct  > Sensibilidad
> Rn  primers no limitantes
Curso PCR 2007-08
Diseño de sondas
• Tm sonda 10ºC > Tm primers
• Tm 70ºC la sonda se une inmediatamente
antes de la mayor eficiencia de la polimerasa
• GC: 20-80%
• Longitud: 9-40b (si >30b sonda MGB)
• Nunca puede haber G en el extremo 5’
(quencher natural)
• <4G continuas
• Procurar [C]>[G]
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Matriz de sonda
• Se realiza tras la optimización de los
primers (para ello sonda a 250nM)
• Utilizar distintas [sonda]: de 25nM a
225nM
Componentes de la reacción
Volumen / Reacción
(ml)
Final concentración
12,5
1X
Forward
1
900/300/50 nM
Reverse
1
900/300/50 nM
Sonda
1,25
250 nM
H2O
8,25
---
DNA
1
50 ng
Total
25
TaqMan® Universal PCR
Master Mix, No AmpErase®
UNG (2X)
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Matriz de sonda
250 nM
200 nM
150 nM
100 nM
50 nM
Curso PCR 2007-08
< Ct  > Sensibilidad
> Rn  no limitante
Recta patrón Gen Referencia
Nos muestra la eficiencia de los
primers:
Curso PCR 2007-08
Recta Patrón: Gen de estudio
Curso PCR 2007-08
Curso PCR 2007-08
Referencia Activa
Expresión génica:
Muestra 1
Muestra 2
Gen problema
4
8
Control endógeno
2
16
ratio
2
0.5
 Control de la eficiencia de la Retro-transcripción.
 Control de la eficiencia de la extracción de RNA.
 Buscar referencias bibliográficas.
 Utilizar tres endógenos.
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Etapas del análisis de expresión
• Extracción de RNA
• Retrotranscripción
• Análisis de la expresión del gen (genes)
de referencia
• Análisis de la expresión del gen de estudio
• Normalización
• Análisis de los resultados
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Retrotranscripción
• El paso más delicado por la baja eficiencia de la
enzima
• Distintas retrotranscriptasas en función del
experimento:
– Expresión génica (MLMv o modificaciones)
– rTth DNA polimerasa (virus y fragmentos de RNA
difíciles)
• Primers:
– Random Hexamers expresión
– Poly(dT)
– Específico (la eficiencia de la RT dependerá del
primer) virus
Curso PCR 2007-08
Análisis de expresión CON curva
patrón
Gen Referencia: GAPDH
Gen Estudio: SPP1
21.58
27.68
27.36
16.62
-1.92
-0.42
-0.3 -0.2
0.0121
0.38 Cantidad
0.49 0.627 Cantidad
relativa
T0
T7
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relativa
2. Cuantificación Relativa
• Ejemplo: cuantificación de SPP1 en
cultivos celulares de células
mesenquimales en diferenciación
Curso PCR 2007-08
Análisis de expresión SIN curva
patrón
• Método de comparación de Ct
• Se basa en la eficiencia de los primers
• Se refiere a la muestra con mayor cantidad de
gen de estudio (o menor Ct)
• Q = e(menor Ct- Ct muestra)
• e =10-1/pendiente
• Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32=2
Ejemplo
Curso PCR 2007-08
Análisis de expresión SIN curva
patrón
• Método de comparación de Ct= 2-DDCt
DDCt= DCt , muestra-DCt, calibrador
DCt , muestra: Valor de Ct para una muestra
normalizado con el del control endógeno.
DCt , calibrador: Valor de Ct para el calibrador
normalizado con el del control endógeno.
Expresión gen/ Expresión basal del gen
=2-DDCt
Expresión endógeno/ Expresión basal endóg
Curso PCR 2007-08
2. Cuantificación Relativa
La eficiencia de la PCR puede enmascarar resultados.
Curso PCR 2007-08
2. Cuantificación Relativa
• PCR Múltiple:
– Amplificación del gen de interés y el
endógeno en el mismo tubo.
– Reporter: 6-FAM y JOE.
– Evitar competición en la reacción:
• Limitar la concentración de primers del gen más
abundante.
Curso PCR 2007-08
Cuantificación Relativa
• Elección del método:
– Estudio del gen de interés y del endógeno en tubos
distintos y usar curva patrón:
• Rápida optimización y validación.
– Utilización del método 2-DDCt :
• Se necesitan eficiencias de amplificación similares.
• No necesita curva patrón.
• Elimina los errores de dilución de la curva patrón.
– PCR Múltiple:
• Más puesta a punto.
• Mayor rapidez de análisis.
Curso PCR 2007-08