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Introducción a las variables involucradas en la cuantificación de ARN
por la técnica de la RT-qPCR
Luis Veggi
Diseño, ejecución y reporte de experimentos de retrotranscripción seguida de
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
La qPCR, cuantificando la intensidad
de fluorescencia
Seguir la cinética de una reacción química midiendo la cantidad de producto
El output de la qPCR: el perfil cinético de la reacción PCR
la curva sigmoidea de amplificación
Los pasos de la reacción de la polimerasa
La qPCR: el termociclador
La reacción en cadena
Ecuación
Nro. moléculas =2n
Las fases del perfil cinético de amplificación
La cuantificación se realiza en base al ajuste sobre la
fase de crecimiento exponencial de la ecuación
Qn ciclos = Qini x 2n ciclos
Ecuación
Nro. moléculas =2n
Grafico de cinética de amplificación
Qn ciclos = Qini x 2n ciclos
Log Qn ciclos = log Qini + log 2 x n ciclos
Identifico la zona
de crecimiento
exponencial por la
observación una
zona recta con la
duplicación de un
valor cte de punto
a punto, si hay
varias muestras
las curvas deben
ser paralelas
intensidad fluorescencia vs nro ciclo
log intensidad fluorescencia vs nro ciclo
La eficiencia de la amplificación
Qn ciclos = Qini x 2n ciclos Eficiencia en % =100 % ???
Qn ciclos = Qini x (Ef)n ciclos
Cq
el valor de referencia para cuantificar la cantidad inicial
valor arbitrario
QCq = Qini x (Ef)Cq
Grafico de cinética de amplificación
QCq = Qini x (Ef)Cq
Log QCq = log Qini + log (Ef) x Cq
Línea de cuantificación
Cq
Línea de cuantificación
Cq
intensidad fluorescencia vs nro ciclo
log intensidad fluorescencia vs nro ciclo
Como realizo la cuantificación de la
cantidad inicial de ADN de un gen de
interés (GOI)?
Muestra 1
QCq1 = Qini1 x (Ef)Cq1
Qini1 = QCq1 / (Ef)Cq1
En esta ecuación Cq1 lo obtengo del resultado de la medición de la
muestra, la eficiencia lo obtengo de la curva estándar, entonces necesito
el valor de QCq1.
Cual es la diferencia de hacer una cuantificación
relativa o una cuantificación absoluta?
La diferencia esta en la estrategia que se utiliza para superar
la situación de desconocer el valor de cantidad ADN en el
sitio de cruce de la curve de amplificación y la línea de
cuantificación.
Cuantificación absoluta
Se obtienen valores de la cantidad absoluta (numero de copias, mg etc)
en base una curva de calibración que permite obtener el valor de la
cantidad de ADN en la línea de cuantificación
Cuantificación relativa
Los valores de concentración se obtienen dándole un valor arbitrario al
valor QCq a todos los valores de las muestras que fueron procesadas y
medidas en las mismas condiciones y con una misma línea de base y
de cuantificación.
Para la muestra 1, muestra 2, muestra 3, muestra 4, etc.
QCq1 = QCq2 = QCq3 = QCq4 = QCqn
Qini1 x (Ef)Cq1 = Qini2 x (Ef)Cq2 = Qini3 x (Ef)Cq3 = Qini4 x (Ef)Cq4
Calibrador (estándar calibrador) es la muestra que se utiliza para superar esta situación
Qini1 x (Ef)Cq1 = Qini2 x (Ef)Cq2 = Qini3 x (Ef)Cq3 = Qini4 x (Ef)Cq4 = Qinical x (Ef)Cqcal
Cuantificación absoluta
Muestra de cantidad conocida del gen que permite
dar un valor a QCqcal
Cuantificación Relativa
Muestra sobre la cual se relacionan
(dividen o relativizan) todas las muestras
Cuantificación absoluta del gen de interés (GOI)
Curva de calibración
QCq = Qini x (Ef)Cq
QCq = constante
Transformación logarítmica
Log Qcq = Log Qini + Log(Ef) x Cq
Cq = (Log Qcq /(Ef)) – (1/(Log(Ef)) Log Qini
(Ef)= 10-1/pte
Cuantificación absoluta
Condiciones que debe tener una curva de calibración para ser utilizada con
una determinada muestra
Condiciones
•Misma línea de base y de cuantificación
•Misma corrida de qPCR
•Mismo lote de RT
•Presencia de inhibidores, implica mismo procedimiento
extracción, mismo tipo de muestra Los calibradores tienen
que ser muestras muy similares a las de estudio
En general se mide en la misma corrida que la misma muestra
QCqcal = Qinical x (Ef)Cq1
QCqcal = QCq1
Qini1 = QCq1 / (Ef)Cq1
Variación aleatoria del
instrumento PCR block,
lámpara, filtro, detector,
etc).
Variación en el seteo del
análisis de resultados,
corrección de la línea de
base y la línea de
cuantificación, reactivos
(polimerasa, fluoróforos
etc) y propiedades
ópticas de los plásticos
Cuantificación relativa del GOI
La cantidad de ADN formada en el cruce de la curva cinética de
amplificación y la línea de cuantificación es la misma
Para la muestra 1, muestra 2, muestra 3,
muestra 4, etc.
QCq1 = QCq2 = QCq3 = QCq4 = QCqn
Condiciones
•Misma línea de base y línea cuantificación
•Misma corrida de qPCR
•Mismo lote de RT
•Presencia de inhibidores, implica mismo procedimiento
extracción, mismo tipo de muestra
Cuantificación relativa del GOI (RQ)
Se asigna un valor arbitrario cómo calibrador
Para la muestra 1, muestra 2, muestra 3,
muestra 4, etc.
QCq1 = QCq2 = QCq3 = QCq4 = QCqn
QCq1 = Qini1 x (Ef)Cq1
QCq2 = Qini2 x (Ef)Cq2
QCq3 = Qini3 x (Ef)Cq3
QCq4 = Qini4 x (Ef)Cq4
Qini1 x (Ef)Cq1 = Qini2 x (Ef)Cq2 = Qini3 x (Ef)Cq3 = Qini4 x (Ef)Cq4
Para poder tener un valor de las relaciones entre ellos podemos relativizarlos a todas respecto a un
mismo valor de Qini y expresión al que denominamos a esta muestra calibrador
De esta manera matemáticamente se cancela de las ecuaciones el QCq
Qini1 = QCq1 / (Ef)Cq1 Qini2 = QCq2 / (Ef)Cq2 Qini3 = QCq3 / (Ef)Cq3
Se dividen, se relativizan al valor de una muestra arbitraria denominada calibrador
Qinical = QCqcal / (Ef)Cqcal
Ejemplo para muestra 1
Qini1 / Qinical = (Ef)Cqcal / (Ef)Cq1 entonces RQ1 = (Ef)Cqcal / (Ef)Cq1
Cuantificación relativa: elección del calibrador
Muestra calibrador
-Muestra real o imaginaria
-la relación entre las muestras es siempre las mismas mas allá del valor del calibrador
Se usa frecuentemente como calibrador la muestra con mayor Cq o menor Cq o el
valor promedio de los Cq de las muestras controles
La elección del calibrador o el valor del ciclo no influencia los resultados de la cuantificación relativa; los
números pueden ser diferentes pero las diferencia de la relación de la cantidad del GOI en las muestras es
idéntica, los resultados son equivalentes nada mas son reescalados. Si embargo la elección del calibrador es
importante en el error final de las cantidades relativas si el error estimado para la eficiencia de amplificación
es tenido en cuenta en el proceso de propagación de errores. Por la tanto para minimizar este error se
recomienda el uso del valor promedio.
Lo optimo es usar como calibrador el valor promedio de todos los Cq de las
muestras evaluadas.
qBase relative quantification framework and software for management
and automated analysis of real-time quantitative PCR
data;Jan Hellemans, Geert Mortier, Anne De Paepe, Frank Speleman
and Jo Vandesompele
Genome Biology 2007, 8:R19 (doi:10.1186/gb-2007-8-2-r19)
Cuantificación relativa del GOI (RQ)
Cant gen A (Q) en muestra 1 sobre cantidad (real o imaginaria) del gen usado
como calibrador
Muestra 1
Muestra Calibrador (cal)
Cq calibrador es el Cq promedio de
todas las muestras evaluadas
QCq1 = Qini1 x (Ef1)Cq1
QCqcal = Qinical x (Efcal)Cqcal
QCq1 = Qcqcal
Cantidad establecida arbitrariamente al establecer la línea de cuantificación
Cociente de las dos cantidades
Qini1 /Qinical = (Efcal)Cqcal / (Ef1)Cq1
si las eficiencias son iguales Ef1= Efcal en ambos perfiles de amplificación e igual a 2
Qini1 /Qinical = (2)-(Cq1-Cqcal)
RQGOI = (2)-deltaCq
Elementos a tener en cuenta para una correcta
cuantificación utilizando la curva cinética de
amplificación de la qPCR
•Estimación de la línea de base
•Establecimiento de la línea de cuantificación
•Determinación de la eficiencia de la
amplificación
El comienzo del fase de crecimiento exponencial
La línea de base
En todos los tubos hay una fluorescencia de base o de fondo, que se denomina
en ingles background fluorescence que se debe a:
•Colorante libre
•Auto fluorescencia de la muestra
Es una característica normal de la PCR, por lo tanto los equipos lo que hacen es
realizar una cuantificación del background y restarle este valor a los valores
crudos (R) de fluorescencia de todas las mediciones.
ΔR o dR = R – línea de base de la fluorescencia
El background es mas evidente y se mide en la primer etapa de la reacción de
PCR, donde la cantidad de producto es indetectable y solo se mide background.
Durante esta primer etapa entonces se establece la línea de base de la
fluorescencia que se obtiene a partir de un algoritmo propio del equipo (o puede
poseer varios) y que luego es aplicado a todos los valores de medición de
fluorescencia en todos los ciclos de la PCR.
Errores en la estimación de la línea de base
Una línea de base errónea provoca:
1. Alteración en la orientación de la curva cinética de amplificación
2. Alteración en los cálculos de eficiencia
3. valor absoluto alto de background
Caso 2
Caso 1
En el caso de la eficiencia, se produce por el hecho que un
mal calculo de la línea de base por ejemplo en defecto
produce la suma de una valor constante que disminuye el
valor de eficiencia
Caso 3
Valores alto de background generan un valor alto de la
línea de base que puede producir la perdida de valores
de la fase de crecimiento exponencial
Para evitar este error se debe tener en cuenta el intervalo de
ciclos que esta seteado en el programa para evaluar a línea
de base
Primero ciclos de dan comportamientos anómalos
Últimos ciclos chequear que no se superpone con Cq de un
gen de alta expresión
la línea de cuantificación
Ubicada en fase crecimiento exponencial
Línea de cuantificación
Línea de cuantificación
Cq
Qn ciclos = Qini x (Ef)Cq
Log Qn ciclos = log Qini + log (Ef) x Cq
La línea de cuantificación
Diferentes métodos de establecerla
La condición de la línea de cuantificación es
que se ubique en la zona de amplificación
exponencial
Nosotros utilizaremos el método fit
point que es un método manual donde
se chequea en la curva logarítmica
que la línea de cuantificación se
ubique en la zona de crecimiento
exponencial
Es importante en el caso que se
evalúen varios genes juntos en los
cuales no pueden caer para un gene
en la zona de crecimiento exponencial
y otro no.
La eficiencia de amplificación
Qn ciclos = Qini x (Ef)Cq
Diferentes corridas
diferentes eficiencias
Maximización por
gen
RQGOI = (Ef)-deltaCq
Run layout
Determinación de la eficiencia de la qPCR
Determinación en cada reacción de cada muestra:
medición sobre cada curva de amplificación
Problemas para determinar la eficiencia en cada perfil de amplificación
Realizar la curva estándar:
(Ef)= 10-1/pte
Escala logarítmica dilución de cDNA cantidad relativa
Realizar diluciones de cDNA (pool), 1/1, 1/10,
1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/200
Cálculos de cantidades relativas con
eficiencia erróneas
Medimos la expresión de un GOI y un RG en una
muestra y en una dilución de la misma muestra
considerando que la eficiencia de ambos son iguales
calculando las cantidades relativas normalizadas
(NRQ)
Problemas de usar
Delta delta Cq