Download BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADA A LA HEMATOLOGÍA

CITOGENÉTICA Y
BIOLOGÍA MOLECULAR
APLICADA A LA
HEMATOLOGÍA
Bqco. Gonzalo Ojeda
Cátedra Hematología Clínica
Fa.C.E.N.A – U.N.N.E
2013
TECNICAS HABITUALES
• ANÁLISIS CROMOSÓMICO
(CARIOTIPO, BANDEO G, FISH,
MULTI FISH, ETC)
• BIOLOGIA MOLECULAR (PCR, RTPCR, REAL TIME PCR, PCR
MULTIPLEX, NESTED PCR, RFLP,
ETC.)
UTILIDAD
• DIAGNÓTSTICO
• TIPIFICACIÓN
• SEGUIMIENTO (ERM)
• ELECCIÓN
TERAPÉUTICA??
Análisis cromosómico (cariotipo)
-Método inmediato o directo: los tejidos que en estado
natural presentan mitosis activas (médula ósea, tumores,
placenta), pueden tratarse directamente con una solución
hipotónica, tinciones y cariotipo inmediato.
-Método a corto plazo: el índice mitótico puede aumentarse
por incubación de estos tejidos en presencia de colchicina
durante 4-6 hs antes del tratamiento hipotónico.
-Método a largo plazo: otros tejidos se cultivan hasta que
presenten mitosis activas (generalmente 72 hs). La sangre
periférica es el tejido utilizado más a menudo. También se
utiliza líquido amniótico (generalmente 10 días).
Análisis cromosómico (cariotipo)
Obtención de las muestras:
-Sangre periférica y MO: 3-4 ml anticoagulados con
heparina.
-Tumores, placenta: biopsias en solución fisiológica ó
medio de cultivo.
-Líquido amniótico: amniocentesis en medio de cultivo
estéril.
Análisis cromosómico (cariotipo)
Realización del cariotipo
Recorrer el extendido bandeado en microscopio con menor
aumento y al detectar una metafase, pasar al objetivo de
inmersión. Realizar el recuento cromosómico y proceder a
su clasificación.
El centrómero divide al cromosoma en brazos cortos (p) y
brazos largos (q).
La técnica de bandeo permite identificar regiones y
bandas en los brazos que se numeran desde el
centrómero.
Análisis cromosómico (cariotipo)
Idiograma de un cariotipo masculino normal
Análisis cromosómico (cariotipo)
Metafase con bandeo G
Análisis cromosómico (cariotipo)
Metafase con bandeo G
Citogenética en leucemia mieloblástica aguda (M1)
-7,+8, del(5q), t(9;22)(q34;q11), +21
Citogenética en leucemia mieloblástica aguda (M2)
t(8;21)(q22;q22)
-Y,-7,+8, del(5q)
Citogenética en leucemia promielocítica aguda (M3)
t(15;17)(q22;q21)
+8
-Dos cromosomas recombinanates
-15q22: PML (promyelocites)
-17q21: RAR
-15q+: PML/RAR (inhibidor de la
diferenciación celular y
de la apoptosis)
-Pronóstico: bueno
Citogenética en leucemia mieloide crónica
Translocación recíproca t(9;22)(q34;q11) (Rowley, 1973)
La traslocación Ph se observa en:
- el 90-95% de los pacientes con
LMC
- el 35% de LLA del adulto
- el 5% de LLA del niño
- el 3% de LMA
En LMC al momento del diagnóstico
todas las células de la médula ósea
son Ph +
LLC: citogenética molecular
LLC con trisomía 12. Tres señales rojas están presentes en
los núcleos trisómicos.
LLC: citogenética molecular
LLC con deleción bialélica 13q14. Dos de los cuatro núcleos no
muestran hibridización con el color rojo.
LLC: citogenética molecular
LLC con deleción monoalélica de p53. La señal roja identifica
el gen p53 y la señal verde el centrómero del cromosoma 17.
SKY FISH
HGC FISH
MULTIBANDYNG FISH
ESTUDIO CITOGENÉTICO
Especificidad: muy alta
Sensibilidad/diagnóstico: depende del tamaño del clon
Sensibilidad para EMR: muy baja
Requerimiento: células en división
Fracaso: falta de células en división
Ventaja: revela alteraciones adicionales
BIOLOGIA MOLECULAR
• Electroforesis de ADN SSCP
(Conformacional)
• PCR ( Real Time, Nested, RFLP, etc)
• RT PCR
• Southern, Western y Northern Blot
• MICROARRAYS
SSCP : Single Strand
Conformational Polymorphism
• Los fragmentos migran
en función de su carga
• Se utilizan geles NO
desnaturalizantes
• A medida que aumenta
el tamaño del fragmento
disminuyes la
sensibilidad
• Puede detectar
mutaciones puntuales
NESTED PCR
Se realizan 2 ciclos de
PCR
Los primeros primers
amplifican una secuencia mayor
El segundo par de
primers se utiliza para
secuenciar una secuencia interna de la
región previamente
amplificada
Detection of sickle cell disease
by polymerase chain reaction
(PCR). After two rounds of
amplification (nest-PCR) of
DNA from a single blastomere,
a 364-base pair DNA fragment
is produced, which is then
digested with a restriction
enzyme (DdeI). DNA fragments
are separated by
electrophoresis on a 10%
polyacrylamide gel. DNA size
makers are shown in lane 1.
Lane 2 and 3 are DNA from a
heterozygous carrier before
and after enzyme digestion,
respectively; lanes 4 and 5 are
DNA from a homozygous normal
DNA before and after
digestion, respectively; and
lanes 6 and 7 are DNA from a
homozygous affected, before
and after digestion,
respectively. Different patterns
with various numbers of bands
represent different genotypes
RFLP
(Genotyping of Kell, Duffy, Kidd and RHD in patients with b
Thalassemia-Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia
Print version ISSN 1516-8484 Rev. Bras. Hematol. Hemoter. vol.22 no.2 São
José do Rio Preto May/Aug. 2000)
• Polymerase chain reaction (PCR) amplification:The PCR analysis
for the presence of RHD was performed in two genomic regions,
intron 4 and exon 10. For intron 4, 3 primers (RHI41, RHI42 and
RHI43) yielded a product of 115 bp for RHD and 236 bp for
RHCE. For exon 10, a common 5'primer (EX10F) was used for
both RHD and RHCE. When paired with the RHD-specific 3'untranslated region (UT) primer (RHD3UT), it produced a
product of 245 bp, and when paired with the RHCE-specific 3'UTR (RHCE3UT), it yielded a product of 160 bp
• RFLP analysis:. The enzymes Bsm I, Mnl I and Ban I were used to
determine, respectively KEL 1/KEL 2 (698C>T), JK A/JK B
(838A>G) and FY A/ FY B (125 G>A) Furthermore, the Sty I
enzyme was used to distinguish between normal and mutated
GATA-1 binding motif (-33T>C), because the GATA-1 binding
site is critical for expression of Fyb protein in the red cell
membrane
EL GEN
QUIMERICO
BCR/ABL
t(9;22)(q34;q11)
• En el cromosoma 22 se encuentra la
región BCR (Breakpoint Cluster Region),
denominada también gen BCR
• En el cromosoma 9 se encuentra el gen
ABL que normalmente codifica una
proteína de 145 kd, con actividad
tirosincinasa que juega un rol crítico en
el control y proliferación celular.
PROMUEVE LA DIMERIZACION
El producto principal es la oncoproteina p 210
La oncoproteína afecta enormemente la transducción de señales
Patologías Oncohematológicas
asociadas al reoredenamiento
BCR/ABL
• LMC (95%)
• LLA ( 3-5 % en niños y 20-30% en
adultos)
• LMA ( 2%)
• LMC Ph(-) : t(8;22) (p11;q11)BCR-FGFR1
• CRISIS BLASTICA DE LMC
( coexpresión de p210 y p190)
COMO PODEMOS DETECTAR LA
EXPRESION DEL GEN BCR/ABL
• PCR del gen BCR/ABL
• RT – PCR del mRNA ( 190, 210, 230)
• FISH
Utilidad de la detección
• Clasificación de LMC no clásicas
• Clasificación de LLA Ph +
• Factor predictivo ( grado de
expresión de p190)
• Control de tratamiento
MICROARRAYS
• SIRVEN PARA EVALUAR EL GRADO
DE EXPRESION DE DIFERENTES
GENES
• PUEDEN ANALIZAR HASTA 400.00
FRAGMENTOS EN FORMA
SIMULTANEA
USOS
• DETECCION DE MUTACIONES Y
POLIMORFISMOS
• DETECCION DE EXPRESION GENICA EN
DISTINTOS TEJIDOS (EN CONDICIONES
NORMALES O PATOLOGICAS)
• SECUENCIAMIENTO DE ADN Y
GENOTIPIFICACION
• EN LEUCEMIAS: EXPRESION DE PROTEINAS
DE RESISTENCIA AL TRATAMIENTO
Enfermedad Residual Mínima en
enfermedades hematológicas
Remisión completa: menos de 5% de células neoplásicas
detectables por microscopía óptica.
Enfermedad Residual Mínima (ERM): persistencia de un
bajo número de células malignas que son indetectables por
técnicas citomorfológicas convencionales.
Se necesitan varias técnicas sensibles para conocer la
efectividad del tratamiento que permitan una evaluación
más precisa de la masa tumoral y predecir recaídas antes
de la manifestación clínica.
Enfermedad Residual Mínima en
enfermedades hematológicas
La eficacia de las diferentes técnicas disponibles para
detectar ERM están basadas en:
• Especificidad (para discriminar células malignas
normales, sin resultados falsos positivos o negativos);
de
• Sensibilidad (límite de detección);
• Reproducibilidad y aplicabilidad (fácil standardización y
velocidad en la obtención de resultados para su aplicación
clínica).
Enfermedad Residual Mínima en
enfermedades hematológicas
Las técnicas para detectar ERM pueden clasificarse según
la estructura celular identificada:
• Caracterísiticas generales de las células neoplásicas
como la morfología y el crecimiento de colonias “in vitro”;
• Características citogenéticas evaluadas por análisis
cromosómico convencional o por hibridización fluorescente
in situ (FISH);
• Inmunofenotipo antigénico de las células neoplásicas por
medio de la citometría de flujo;
• Contenido de DNA detectado por citometría de flujo
(aneuploidía) y
• Estructura del DNA analizada por PCR.
Enfermedad Residual Mínima en
enfermedades hematológicas
Límite de detección (sensibilidad):
- morfología: de 1-5%, lo que es equivalente a una masa
residual de 1010 –1011 de células malignas.
- citogenética: está dentro del rango anterior o algo
superior.
- FISH: La sensibilidad varía entre 10-2 y 10-4.
- Citometría de flujo: permite la detección de fenotipos
aberrantes para la distinción entre células leucémicas y
normales con una sensibilidad de 10-3 a 10-5.
- PCR es la prueba mas sensible en la detección de ERM
con una sensibilidad de 10-5 a 10-6 (regiones de fusión
pueden ser usadas como targets para detectar ERM).