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Biología 3051 L
Laboratorio
12
Laboratorio No. 12
Biología
molecular
Biología molecular
Instructora Andrea Arias Garcia
Andrea Arias Garcia
El Núcleo
El núcleo es un
organelo
característico de las
células eucariotas.
El material genético
de la célula se
encuentra dentro del
núcleo en forma de
cromatina
Cromatina y cromosoma
Un cromosoma es una
molécula muy larga de ADN
que contiene una serie de
genes.
Un cromosoma está formado
por dos cromátidas. En cada
una de ellas hay un filamento
de ADN replegado idéntico en
ambas cromátidas.
El ADN
La molécula de ADN
está constituída por
dos largas cadenas
de nucleótidos unidas
entre sí formando una
doble hélice.
Los nucleótidos
Un nucleótido es una molécula compuesta por :
Una pentosa
– ribosa
– desoxirribosa
Ácido fosfórico
Una base nitrogenada, que puede ser :
– adenina
– guanina
– citosina
– timina
– uracilo
Partes de un nucleótido
Estructura del ADN
La estructura del ADN
está definida por la
"secuencia" de las
bases nitrogenadas.
Este orden
constituye las
instrucciones del
programa genético de
los organismos.
Las bases nitrogenadas
La unión de las bases se
realiza mediante puentes
de hidrógeno
Este apareamiento está
condicionado
químicamente de forma
que la adenina (A) sólo
se puede unir con la
Timina (T) y la Guanina
(G) con la Citosina (C).
MÓdelo del ADN
Watson y Crick (1953)
Biología molecular
La biología molecular es una herramienta para
estudiar las relaciones evolutivas entre los
organismos.
Estudia el ADN y los genes que contiene.
Todas las células contienen ADN que
caracteriza a los organismos vivos. Por cambios
y mutaciones en el ADN tenemos organismos
compuestos por pocos cientos de bases hasta
organismos mas complejos.
Enzimas de restricción y
electroforesis de ADN
Enzimas de restricción
También conocidas como endonucleasas. Son
extraídas de organismos procariotas (bacterias)
donde actúan como un mecanismo de defensa
para degradar ADN exógeno.
Su nombre esta dado según el genero y la
especie de la bacteria de donde se aisló. Ej:
Eco RI E genero Escherichia
co especie coli
R cepa RV 13
I primera endonucleasa aislada
Enzimas de restricción
Son enzimas que cortan los enlaces
fosfodiester del material genético a partir
de una secuencia que reconocen.
Permiten cortar ADN de hebra doble,
donde reconocen secuencias
palindrómicas (secuencias que se leen
igual en ambas direcciones)
Enzimas de restricción
Al cortar el ADN las
enzimas de restricción
pueden producir dos tipos
de cortes: cohesivos y
abruptos.
Abruptos: cortan las
hebras ADN en la misma
posición
AATATT
TTATAA
Cohesivos: cortan la
doble hebra de ADN de
manera escalonada.
Factores que afectan la actividad
de las enzimas de restricción
Pureza del ADN: la presencia de contaminantes
como proteínas, cloroformo, etanol etc. inhiben
la endonucleasa.
Temperatura y pH: pueden afectar la estabilidad
y la actividad de las endonucleasas.
Amortiguador (buffer) adecuado: este provee el
ambiente que necesita la enzima para trabajar
en condiciones optimas.
Electroforesis
La electroforesis es un método que permite el
desplazamiento de una molécula dentro de un campo
eléctrico. La molécula con carga se mueve en dirección
al electrodo con signo opuesto.
En la electroforesis se aplica un campo eléctrico a lo
largo de un soporte físico, generalmente geles de agar,
agarosa, almidón, acrilamida, también se pueden usar
otros soportes como las tiras de acetato de celulosa.
Las moléculas que posean una carga neta (proteínas y
ácidos nucleicos) se moverán dentro del campo
eléctrico, separándose a medida que pasa el tiempo.
Cámara de electroforesis
La agarosa
La agarosa es un polisacárido de galactosa
(originalmente obtenido de algas, como el agar-agar,
pero de composición más homogénea), cuyas
disoluciones (típicamente de 0,5 a 2%) poseen la
propiedad de permanecer líquidas por encima de aprox.
50ºC y formar un gel, semisólido, al enfriarse.
Este gel está constituido por una matriz o trama
tridimensional de fibras polimericas, embebida en gran
cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las
moléculas de ácido nucleico a su través, en mayor
medida cuanto más grandes sean éstas.
Preparación del gel
Factores que inciden en la
electroforesis
La carga eléctrica de las moléculas
El pH del medio.
El tamaño de las moléculas: Las moléculas de DNA y
RNA son en general demasiado grandes para que
avancen a una velocidad razonable por los geles, por lo
que lo habitual es fragmentarlas antes de someterlas a
electroforesis.
Para servir la muestra
Al preparar el gel
enfriando la agarosa en
un molde adecuado, se
dejan en él unos huecos
o pocillos para poder
introducir luego en ellos
la muestra, y que así ésta
se vea obligada a
introducirse en el seno
del gel cuando
apliquemos el campo
eléctrico
Procedimiento
Para preparar TBE 1X:
Si se usa TBE 20X, para preparar 100 ml: echar en
probeta 5 ml de TBE 20X y echar agua destilada hasta
llegar a 100 ml.
Si se usa TBE 10X: 10 ml de TBE 10X y echar agua
destilada hasta llegar a 100 ml.
Procedimiento
Elaboración de agarosa:
2 microtubos (1 gramo) de agarosa más 100 ml
de TBE 1X
Mezclar en erlenmeyer LIMPIO y poner en hot
plate USAR GUANTE DE CALOR y agitar
girando la mezcla hasta que hierva y se vean
las burbujas en la superficie.
Saque de hot plate y deje enfriar(50C)
Vertir en bandeja empezando en una esquina
Coloque la peinilla
Deje que solidifique.
Activación del DNA
El DNA se prepara añadiendo 100 microlitros de agua
destilada y dejando a temp ambiente por 5 minutos y
agitar luego. Colocar en hielo o nevera luego mientras
se usa.
+ 100 uL de Agua destilada
DNA
Incubar por 5 min. a temperara ambiente
Utilización de Enzimas de
restricción
2 microlitros de DNA y 18 de agua destilada (con la
punta de micropipeta, agitar) y colocar a 37° C por 20-30
minutos. LA TEMPERATURA ES CRITICA, no dejen
que suba!!! Luego ponga tubos en hielo mientras se
preparan muestras.
+ 2 uL de DNA +18 de agua destilada
Tubo pqñ
Con enz.
Incubar por 30 min. a 37° C y luego colocar en
Hielo
Para preparar muestras para
corrida
DNA sin cortar:
2 microlitros de DNA
8 de agua destilada
2 de loading dye
Para DNA cortado
(restricciones):
10 microlitros de
digestión
2 de loading dye
Para correr gel
Coloque un papel blanco debajo de la cámara
Ponga bandeja en la cámara, de manera que las fosas
queden en el lado negativo (negro),
Asegúrese de que el buffer cubra el gel
Quite CON CUIDADO la peinilla.
Añada muestras a las fosas. NO MUEVA CAMARA!!!!
Ponga tapa y prenda voltímetro. Se correra a 80 voltios
Deje que corra el gel hasta llegar aprox. a media
pulgada del extremo positivo.
Teñir
Poner el gel en bandeja y cubrir con tinte.
Dejar por media hora, agitar de vez en cuando.
Sacar gel (usen guantes!!!) y poner en agua a lavar
hasta que destiña bastante. Ver en iluminador.
Fotografía electroforesis de ADN
ADN + enzimas de restricción
Fragmentos de ADN
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