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Inducción de proteína recombinante
b-Lactamasa
Inducción de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes son aquellas que se obtienen a partir de una especie
o una línea celular distinta a la célula original.
Se obtiene al expresar un gen clonado en la línea celular de interés.
Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias:
fácil de cultivar
fácil de modificar genéticamente
trabajo rápido
alto rendimiento 80%
Expresar un gen de eucariontes en bacteria.....
conformación
modificaciones postraduccionales
.... depende de la complejidad de la proteína
Sistemas biológicos de producción de PR
• Bacterias
– E. coli
– B. subtilis
• Células eucariontes
– Hongos
• Levaduras
– Saccharomyces cerevisiae
– Pichia pastoris y otros metilotrófos
• Hongos filamentosos
– Células animales en cultivo
– Células de insecto en cultivo
– Plantas
Maximizar la expresión
de proteínas
codificadas por genes
clonados
Tecnología de DNA recombinante: Herramientas
1 Aislamiento del gen
2. Clonación y
expresión
Producción de la
proteína
Transcriptasa reversa
Enzimas de restricción
Célula huésped
DNA polimerasa
Ligasa
Clones
Sonda de DNA
Véctor
Medio de cultivo
Clonación del
DNA
•DNA foráneo (secuencia
que se desea clonar)
•Vector de clonación
(vehículo)
•Organismo huésped
(E. coli)
5
Vector de clonación pET-24a(+)
7200 bp
• Un gene siempre
tiene que ir
flanqueado por una
zona promotora y
otra terminadora de
la transcripción
El sistema de expresión también debe tener las
siguientes características:
Cromosoma de Escherichia coli
• El inductor del operón lac que utilizaremos
será el isopropiltiogalactósido (IPTG).
Análogos de la lactosa
Procedimiento general de clonación
NEB Cutter
Diseño de primers u oligos
Ligación
DH5 Alfa
BL21
Purificación de la proteína recombinante
Procedimiento de proteína
recombinante
• Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con
vector, añadir a 15 mL de LB
• Incubar con agitación a 37 ͦC hasta OD600 0.6-0.8
• Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final)
• Seguir incubando y tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min
por 2 h.
• Cada vez que se tome una alícuota centrifugar y
quedarse con el sobrenadante
• Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC, desnaturalizar
y correr en SDS-PAGE.
Peculiaridades de la construcción:
• En el vector pET-TEM se insertaron los genes
que codifican para dos proteínas:
• 1) β-lactamasa
• 2) OmpA Proteína de tránsito que se inserta
en la membrana externa de las bacterias. (Pag
43 del manual)
• Por lo tanto: no se requiere la extracción de la
β-lactamasa, esta será secretada al medio
RESULTADOS DEL ALGUN SEMESTRE EN
EL PASADO
30
60 90 120
30
60
90 120 min