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INDUCCIÓN DE
PROTEÍNA
RECOMBINANTE
EQUIPO 4
Recombinación Genética
 Es
un proceso que lleva a la obtención de un
nuevo genotipo a través del intercambio de
material genético entre secuencias homologas
de ADN de dos orígenes diferentes.
 Las secuencias homologas de ADN tienen la
misma secuencia o casi la misma.
 Para que aparezcan nuevos genotipos como
consecuencia de la recombinación es esencial
que las dos secuencias homologas sean
genéticamente diferentes.
En células procariotas solo existe un cromosoma por lo
que antes de la recombinación, un cromosoma
homologo debe de ser transferido de una bacteria
donadora a una receptora.
La recombinación ocurre después de la transferencia y
ocurre en cualquiera de los siguientes tres procesos:
Transformación
Transducción
Conjugación
ADN Recombinante
 Las
moléculas de ADN producidas mediante
la unión de dos o mas fragmentos de ADN se
denominan Moléculas de ADN Recombinante.
 El desarrollo de la tecnología de DNA
Recombinante permite la producción de
proteínas nativas o modificadas con nuevas y
mejores propiedades
Proteína Recombinante
 Es
aquella proteína cuya síntesis se realiza
en un organismo distinto al organismo
nativo, se logra mediante la inserción del
gen que expresa la proteína de interés en
un organismo diferente.
 Es posible obtener altas cantidades de
proteína con bajos costos de producción
y altas purezas de una o varias proteínas
de interés.
Sistemas de
expresión
 Organismo
hospedero.
 Vector de expresión o fragmentos de DNA que
poseen elementos génicos necesarios para
realizar los procesos de transcripción y
traducción en el hospedero, recibe las
moléculas de DNA recombinante.
Los sistemas bacterianos, los
más utilizados para producir
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
VENTAJAS
+ Fácilmente manipulables genéticamente.
+ Se propagan rápidamente.
+ Económicos.
+ Requieren entrenamiento mínimo.
+ Permiten su automatización
DESVENTAJAS
1. Las proteínas de eucariontes o de
membrana
generalmente
no
se
expresan o no son funcionales.
2. El carácter químico del citoplasma de
las bacterias, de sus chaperonas y las
enzimas
encargadas
de
las
modificaciones post-traduccionales son
muy diferentes entre los organismos
eucariontes.
3. Pueden agregarse en el citoplasma en
llamados CUERPOS DE INCLUSIÓN
Vectores de expresión como el pET son
usados comúnmente para la expresión de
proteínas heterólogas en E. coli.


Los plásmidos son clonados bajo las señales
de expresión fuerte del promotor del
bacteriófago T7 (controla la alta expresión de
la RNA polimerasa T7).
Los sistemas pET cuentan además con una
copia del gen cromosomal de la RNA
polimerasa T7 bajo el control del operador de
la lactosa (Para que se exprese la RNA
polimerasa T7 se debe introducir lactosa o un
análogo de ésta: isopropil β-D tiogalactosido
(IPTG)).
IPTG se une a la proteína represora
Le impide unirse al DNA, ya que al
unirse, impide la transcripción del gen
para la RNA polimerasa T7 y la
transcripción del
transgene.
IPTG es llamado inductor ya que
el efecto de liberar la represión
del gen se denomina inducción.
El gen de la proteína represora,
se codifica en el vector Lac
Producción de proteína
recombinante en organismo
no relacionado
Proteína no funcional
La proteína no
presenta las
modificaciones
posttraduccionales
necesarias
La proteína no se plegó
adecuadamente (aglomeración,
CUERPOS DE INCLUSIÓN)
Formación de cuerpos cetónicos
(solo solubilizables en detegentes)
Aumento en costos de producción
o recuperación de proteína
APLICACIONES
BIOTECNOLÓGICAS
¿Para qué?
Para el aislamiento de un gen de un organismo
para introducirlo en otro
 ¿Cómo?

¿Para qué tipo de
proteínas?
 Se
puede producir de todo tipo de
proteínas
 Proteína
Selección
Tipo de vector
Obtención y clonación de
Gen de interés
OBJETIVO
Realizar el monitoreo de la inducción de
la
PROTEÍNA RECOMBINANTE
(OMP-beta-lactamasa) en células de E.
coli BL21 (células especializadas en
producir proteína) transformadas con el
vector pET-TEM-1-ompA beta-lactamasa .
MATERIALES
 Medio
LB Kanamicina (El vector contenía un
gen de resistencia a kanamicina)
 IPTG (inductor)
 CULTIVO DE CÉLULAS
TRANSFORMANTES (crecimiento de
toda la noche)
 8 mL LB
METODOLOGÍA
 Leer
la absorbancia al inicio y cada media
hora contra un blanco de medio luria
METODOLOGÍA
Cultivo
entre 0.6
y 0.8 Abs
MATERIALES Y REACTIVOS
 GELES
DE POLIACRILAMIDA SDS 1 POR
EQUIPO
 AMORTIGUADOR DE CORRIDA
 AMORTIGUADOR DE MUESTRA
 SOLUCIÓN TEÑIDORA
 SOLUCIÓN DESTEÑIDORA
 ESTÁNDAR DE PESO MOLECULAR
CORRIMIENTO ELECTROFORÉTICO DE
LAS MUESTRAS DE PROTEÍNA
METODOLOGÍA
Curva
temporal de
inducción de
proteína
recombinante