Download Transferencia de material genético

I N D U C C I Ó N D E P R OT E Í N A
RECOMBINANTE
Á LVA R E Z H E R R E R A M A R C E L I N O
CASAS VENTURA ROCIO
COYOL CAMPOS ANA PAULINA
PÉREZ JIMÉNEZ AIDEÉ GUADALUPE
OBJETIVOS
•
Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas
recombinantes de E. coli
•
Realizar la inducción de una proteína recombinante (β-lactamasa)
•
Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante
•
Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas
recombinantes
Inducción de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes son aquellas que obtenemos a
partir de una especie o una línea celular distinta a la célula
original.
 La proteína se obtiene por la expresión de un gen clonado en
esa línea celular que nos interesa.
ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias:
fácil de cultivar
fácil de modificar genéticamente
trabajo rápido
alto rendimiento 80%
Utilización de sistemas bacterianos
Tiempo corto
Fácilmente
manipulables
genéticamente
Ventajas
Automatización
en proyectos de
producción a
gran escala
Económicos
Vectores de expresión proteica
Vector de clonación: Sistema que permite introducir en una
célula hospedera el fragmento de ADN que se pretende
clonar; en esta célula hospedera el vector se replica y se
expresa.
Vector de expresión: Tiene mucho de los atributos que un
vector de clonación, como el origen de replicación, un sitio
de clonación múltiple y por lo menos un marcador
seleccionable.
Vectores
de expresión
proteica
VECTORES
DE EXPRESIÓN
PROTEICA
Además debe ser capaz de ser transcrito por la
maquinaria genética dentro de la cual se transforma.
 Debe tener un promotor para la ARN polimerasa y el
ARN transcrito debe de tener un sitio de enlace
ribosomal para que pueda ser traducido.
 Debe de tener una secuencia de terminación de la
transcripción; de lo contrario, todo el plásmido será
transcrito en vez de solamente el gen insertado.
Vector pET
Sistemas pET
Plásmidos son clonados bajo las señales de expresión
fuerte del promotor del bacteriofago T7, quien controla la
alta expresión de la RNA polimerasa T7.
Cuentan con una copia del gen cromosomal de la RNA
polimerasa T7 bajo el control
Todo bajo el control de un sistema que semeja al operón
lac
operón lac
Centro de
control
La
secuencia
del
operador
Al unirse la proteína represora a
la secuencia operadora se inhibe
la transcripción
Expresión de la RNA polimerasa T7
La RNA polimerasa lleva a cabo la transcripción del
gen de interés, siempre y cuando el operador no este
impidiendo su unión a la secuencia promotora del
gen.
Para lograrlo se tiene que introducir lactosa o un
análogo de ésta, el más utilizado es el isopropil β-D
tiogalactosido (IPTG), análogo no hidrolizable que
sirve como inductor artificial del operón de la lactosa
Como funciona el IPTG en la expresión de proteínas por
el operon lac
Lac I codifica para una proteína represora
Proteína represora
IPTG
Proteína
represora
La proteína represora entonces se une al IPTG y
o a la secuencia operadora,
esto permite la transcripción del gen
INDUCCIÓN:
El efecto del IPTG de liberar de la represión del gen, por lo
que el IPTG es llamado inductor.
El gen que codifica para la proteína represora se
encuentra incluido en el vector, LacI, y su transcripción
ocurre a la par que todos los genes incluidos en el
vector. Así a pocas horas de inducción, la formación
de la proteína deseada, puede llegar a ser más del
50% de la proteína total en la célula.
EL VECTOR PET TIENE LA SECUENCIA DENOMINADA OPERADOR EN
LA QUE OCURRE LA UNIÓN DE LA PROTEÍNA OPERADORA. LO QUE
POR IMPEDIMENTO ESTÉRICO NO PERMITE LA UNIÓN DE LA
POLIMERASA T7 Y ENTONCES NO SE TRANSCRIBE EL GEN
Experimento
1.
Medio saturado
2.
Inocular una alícuota
en medio nuevo
3.
Alcanzar la
absorbancia en donde
las células se
encuentren en la fase
log
4.
Añadir el inductor
5.
Tomar alicuotas (curso
temporal de indución
de proteína
recombinante
6.
Separación y
visualización en un gel
de poliacrilamida-SDS
7.
Determinación del
tiempo óptimo de
inducción