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ESCUELA POLITECNICA DEL EJÉRCITO
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
“IDENTIFICACIÓN DE REARREGLOS CROMOSÓMICOS ASOCIADOS
CON TUMORES SÓLIDOS A PARTIR DE MUESTRAS DE TEJIDOS
EMBEBIDOS EN PARAFINA (FFPE) Y DE TEJIDOS EN CONGELACIÓN
(TOC), MEDIANTE LA APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN
IN SITU CON FLUORESCENCIA (FISH)”.
Previa a la obtención de Grado Académico o Título de:
INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA
ELABORADO POR:
SULLY ESTEFANÍA MÁRQUEZ AGUILAR
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
MATERIALES Y METODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
AGRADECIMIENTOS
INTRODUCCIÓN
Control fisiológico
en la proliferación
celular
Caretakers
MLH1 (Lynch
syndrome)
Gatekeepers
PTEN
Landscapers
Activación
oncogénica
Mecanismos de
inactivación:
• Metilación del
ADN y sellado
genómico
• Inestabilidad
cromosómica
(CIN).
Fuente. http://www.kmle.co.kr/search.php?Search=Oncogene.&Page=4
Fuente: http://www.scq.ubc.ca/how-to-catch-a-cancer/
INTRODUCCIÓN
Cuatro tipos principales:
1. Carcinomas (mama)
2. Sarcomas (tejido
conectivo )
3. Leucemias
4. Linfomas
Crecimiento anormal
(alteraciones ADN )
INICIACIÓN
PROMOCIÓN
Alteración de procesos
celulares fuertemente
regulados: D, P, MCP
PROGRESIÓN
Fuente: http://cancerhelp.cancerresearchuk.org/aboutcancer/what-is-cancer/cells/the-cancer-cell
Dividirse rápidamente
Benigno
Maligno
PROPIEDADES
•
•
•
•
•
Indiferenciación
Habilidades proliferativas
Checkpoints
Reparación del ADN
Inmortalidad, angiogénesis, metabolismo
alterado, inestabilidad genómica
• Señalización anormal
• Movimiento
INVASIÓN Y
METÁSTASIS
Fuente: http://www.tree.com/health/breastcancer-stages.aspx
INTRODUCCIÓN
TIPO DE TUMOR
SÓLIDO
Sarcoma
de Ewing
CARACT.
Familia (ESFT)
REARREGLO
CROMOS.
t(11;22) EWS/FL1
Células redondas
pequeño tamaño
con
mínima
diferenciación.
Cáncer de Mama
Familia (EGFR)
Linfoma
de Burkitt
Células B
t(8;14)
se infiltran tejidos C-MYC/IgH
nodales
(patrón
difuso).
OTROS
ERG t(21;22)
ETV1 t(7; 22)
EIA t(17;22)
Amplificación
Her2/neu
t(8;22), t(2;8)
INTRODUCCIÓN
TIPO DE TUMOR
CARACT.
REARREGLO
CROMOS.
OTROS
Neuroblastoma
2do más frecuente Amplificación
en niños < a 1 año N-MYC (20%)
de edad.
Células pequeñas
redondas y azules.
Delec. en el brazo
p cromos. 1
Ganancia en el
brazo q cromos. 17
Linfoma
Anaplásico
ALK (quinasa de t(2;5) ALK/NPM
linfoma anaplásico)
y
proteínas
citotóxicas.
inv(2)(p23;q15)
t(1;2)(q25;p23)
INTRODUCCIÓN
•
•
•
Etapas
Híbrido (la citogenética y la biología
molecular).
Detección de secuencias concretas de
ácidos nucleicos (ADN o ARN)→ el
empleo
de
sondas
específicas
marcadas con un fluorocromo.
4.Contratinción
y visualización
del ADN
Los 2 componentes principales :
Sonda de ADN
marcada con
fluorescencia
•
1.Pretratamiento 2.Hibridación
Secuencia
diana
Determinación de anormalidades
recurrentes y rearreglos (diagnóstico y
pronóstico).
2.Denaturación
3.Lavados
posthibridación
Fuente: http://filebox.vt.edu/users/chagedor/biol_4684/Methods/FISH.html
INTRODUCCIÓN
Sondas Centroméricas
Sondas Pintado Cromosómico
Sondas de Fusión
Sondas Teloméricas
Sondas Dual Color Dual Fusión
Sondas de Locus Específico
Sondas de Separación o Split
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
MATERIALES Y METODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
AGRADECIMIENTOS
OBJETIVOS
•
Identificar rearreglos cromosómicos asociados con tumores sólidos en tejidos embebidos
en parafina y en tejidos en congelación mediante la aplicación de la técnica de hibridación
in situ con fluorescencia (FISH).
•
Analizar muestras de tumores sólidos, recolectadas desde marzo del 2011 hasta marzo
del 2012, aplicando la técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) en tejidos en
congelación y en tejidos embebidos en parafina.
•
Identificar los rearreglos cromosómicos asociados a tumores específicos en cada
neoplasia en estudio mediante la valoración de sus núcleos.
•
Cuantificar la correlación entre los tumores en estudio con las variables sexo, edad,
localización del tumor.
•
Comparar el diagnóstico por FISH con el histológico.
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
AGRADECIMIENTOS
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
200 núcleos
Núcleos no
sobrelapado
s
HER2/neu se
evaluaron 20 núcleos
MATERIALES Y MÉTODOS
TUMOR
SÓLIDO
SONDA
REARREGLO
CROMOS
Sarcoma de
Ewing
Sonda
Vysis
LSI
EWSR1 Dual Color
Break Apart
t(11;22)
Neuroblastoma
Sonda Vysis LSI
N-MYC
(2p24)
spectrum green /CEP
2 spectrum orange.
Amplificación
N-MYC
Linfoma de
Burkitt
Sonda
Vysis
LSI
IGH/MYC dual-Color
Dual Fusion
t(8;14)
POSITIVO
NEGATIVO
MATERIALES Y MÉTODOS
TUMOR
SÓLIDO
SONDA
REARREGLO
CROMOS
Cáncer de
Mama
Sonda HER2 /neu
CEP17 PathVysion
Amplificación
HER2/neu
Linfoma
Anaplásico
Sonda Vysis LSI ALK
Dual Color, Break
Apart
Rearrangement.
t(2;5)
POSITIVO
NEGATIVO
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
AGRADECIMIENTOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 3.1. Fotografía de núcleos en interfase de una
muestra de fémur con translocación 22q12 positiva en
Sarcoma de Ewing (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA,
2011).
Figura 3.2. Fotografía de núcleos en interfase de una
muestra de origen retroperitoneal con translocación
22q12 positiva en Sarcoma de Ewing (FFPE)
Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011).
• Diagnóstico definitivo , EWSR1/FL1(mejor pronóstico )
• RT-PCR y FISH 5 (Berková et al. (2008))18 Qian et al. 16 Yamaguchi et al. (2005),
nuevas sondas 90%.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 3.3. Fotografía de núcleos en interfase de una
muestra de ganglio inguinal con translocación 8q14
negativa en Linfoma de Burkitt (FFPE)Cytovision v
7.2 (SOLCA, 2011).
Figura 3.4. Fotografía de núcleos en interfase de una
muestra de ganglio con translocación 8q14 positiva
en Linfoma de Burkitt (TOC)Cytovision v 7.2 (SOLCA,
2011).
Gen C-MYC (iniciación de un proceso tumoral), t(8;14) pacientes adultos, revaloración
(resultado desfavorable) Belaud-Rotureau et al. (2002), 4 t(11;14)(q13;q32)LCM 3
t(8;14)(q24;q32)LB, Moon et al. (2008) translocación doble del cromosoma 14
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 3.5. Fotografía de núcleos en interfase de una
muestra de mama con amplificación positiva para el
gen HER2/neu en Cáncer de Mama (FFPE) Cytovision
v 7.2 (SOLCA, 2011).
Figura 3.6. Fotografía de núcleos en interfase de
una muestra de mama con amplificación negativa
para el gen HER2/neu en Cáncer de Mama (FFPE).
Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011).
Tumor agresivo, con mayor resistencia a los tratamientos t< supervivencia
Prevenir efectos cardiotóxicos .
FISH vs Inmuno 50 Sui et al, 2009). 41 Su et al, (2011)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 3.7. Fotografía de núcleos en interfase de
una muestra de origen retroperitoneal con
amplificación negativa del gen N-MYC en
Neuroblastoma (FFPE) Cytovision v 7.2 (SOLCA,
2011).
Figura 3.8. Fotografía de núcleos en interfase de
una muestra de origen retroperitoneal con
amplificación negativa del gen N-MYC en
Neuroblastoma (TOC) Cytovision v 7.2 (SOLCA,
2011).
Gen N-MYC (altamente agresivo) Presencia de metástasis y un pronóstico pobre.
Sartelet et al. (2002)97 FISH vs SB/PCR amplificación heterogénea , Abdalla et al. (2009)
30, diagnosticado en todos los casos de tumores neuroblasticos periféricos ≠s
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 3.9. Fotografía de núcleos en interfase de
una muestra de ganglio retroperitoneal con
translocación 2p23 ALK negativa en Linfoma No
Hodking de células pequeñas (TOC) Cytovision v 7.2
(SOLCA, 2011).
Figura 3.10. Fotografía de núcleos en interfase de
una muestra retroocular con translocación 2p23 ALK
negativa en Retinoblastoma (TOC) Cytovision v 7.2
(SOLCA, 2011).
Gen ALK se asocia con el linfoma anaplásico de células grandes.
ALK+(quimioterapia) y ALK− no muy favorable.
Li et al 22 FISH vs Imnumo 100% concordancia, Shin et al. (2003), 9 FISH
(aspirados)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.1 Información y resultados del análisis de las diferentes muestras de tumores sólidos empleados en el estudio (N° de muestra, edad y sexo del paciente, diagnóstico médico, técnica histopatológica, técnica de FISH, tipo de tejido, tiempo de almacenamiento,
localización topográfica y los resultados) obtenidos desde Marzo 2011 hasta Enero 2012.
N° de muestra
Sexo
Edad
Localización
topográfica
Diagnóstico
Resultado
histopatológico
Tipo de Tejido
(TOC y FFPE)
Tiempo de
almacenamiento
Translocación o
amplificación esperada
Result.
FISH
1
M
21
Fémur
+
TOC
0
22q12
+
2
M
65
Ganglio Inguinal
Sarcoma Ewing
PEANUT
Linfoma Burkitt
+
FFPE
15 días
3
F
12
Tibia
+
TOC
4
F
56
Mama
Sarcoma Ewing
PEANUT
Carcinoma Ductal
+
FFPE
8q14
-
22q12
+
301 días
Her2-neu/CEP17
+
5
F
1
Suprarrenal
Neuroblastoma
+
FFPE
19 días
N-MYC
-
6
M
17
Retroperitoneal
Neuroblastoma
+
FFPE
7 días
N-MYC
-
7
F
57
Mama
carcinoma Mutifocal
+
FFPE
20 días
Her2-neu/CEP17
+
8
M
2
Suprarrenal
Neuroblastoma
+
TOC
0
N-MYC
-
9
F
2
Retroperitoneal
+
FFPE
30 días
22q12
+
10
F
73
Paratoroides
Sarcoma Ewing
PEANUT
Linfoma No Hodgkin
-
TOC
2p23 ALK
-
0
11
F
2
Retroocular
Linfoma No Hodking
-
TOC
0
2p23 ALK
-
12
M
14
Ganglio
Linfoma No Hodking
-
TOC
0
2p23 ALK
-
13
M
14
Ganglio
Linfoma Burkitt
+
TOC
0
8q14
+
14
F
34
Ganglio Retroperitoneal
Linfoma No Hodking
-
TOC
0
2p23 ALK
-
15
M
7
Retroperitoneal
Neuroblastoma
+
TOC
0
N-MYC
-
16
F
68
Mama
+
FFPE
30 días
Her2-neu/CEP17
-
17
F
47
Mama
Carcinoma ductal
infiltrante mod.
Diferenciado
Carcinoma ductal in situ
extenso de alto grado
+
FFPE
180 días
Her2-neu/CEP17
-
18
F
58
Mama
+
FFPE
120 días
Her2-neu/CEP17
+
19
F
40
Mama
+
FFPE
30 días
Her2-neu/CEP17
-
20
F
37
Mama
Carcinoma ductal
infiltrante mod.
Diferenciado
Carcinoma ductal
infiltrante mod.
Diferenciado
Carcinoma ductal
infiltrante mod.
Diferenciado
+
FFPE
66 días
Her2-neu/CEP17
+
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
• Heterogeneidad celular. González et al. (2010).
Tumor Sólido • Escasa disponibilidad . González et al. (2010).
• La evolución de la enfermedad.
• La valoración de la respuesta al tratamiento.
Rearreglos
cromosómicos • FISH →mejorar el diagnóstico y monitoreo.
Ventaja
• Tejidos (congelación,parafinados).
• La digestión PASO CLAVE. Tojo (2009).
• Tejido en congelación (100% )y parafinado (80%).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.7 Características operativas de la técnica de FISH comparada
con la de Histopatología (gold standard) para los tumores sólidos
mediante el software estadístico EPIDAT v3.1 (2012).
CARACTERÍSTICA
OPERATIVA
VALOR
IC (95%)
Sensibilidad (%)
100,00
93,75
100,00
Especificidad (%)
33,33
2,49
64,17
Valor predictivo positivo (%)
50,00
22,38
77,62
Valor predictivo negativo (%)
100,00
87,50
100,00
Índice de Youden
0,33
0,07
0,60
Figura 3.16. Curva de ROC de FISH vs. Histopatología
(gold standard), obtenido mediante el software estadístico
EPIDAT v3.1 (2012).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
SENSIBILIDAD (100%)
• FISH (capacidad muy
alta de detección,
hibridación).
• Identifica 
VPN(100%)
• No tiene el rearreglo
específico.
ESPECIFICIDAD
(33,33%)
• Técnica histopatológica
(análisis morfología).
• Técnica de FISH (locus
específico).
• Variante
VPP(50%)
• Técnica tendría poco
poder definir la
probabilidad.
ÍNDICE DE
YOUDEN(0,33)
• Baja especificidad.
CURVA DE ROC (0,667)
• Capacidad
discriminatoria menor.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 3.8 Resultados obtenidos mediante la Histopatología
y la técnica de FISH.
McNemar
• P=0,0075
• Sí hubo
diferencias en
los resultados
Chi Cuadrado de
independencia
Índice de
Kappa
• P=0.068
• Independiente
de la técnica
histopatológica.
• κ=0,286
• Concordancia
baja
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
 Estudio de células en interfase y tiene
alta sensibilidad.
 No cultivo de tumores y Confirmación
 Disponibilidad de sondas comerciales
 Perspectiva médica
 Diagnóstico pronóstico de una
enfermedad genética
 Investigación
 Mapeo genético
 Identificación de nuevos oncogenes
 FISH multiplex
 Decisión del tipo de tratamiento para
combatir el cáncer
Fotografía de una muestra de médula ósea en metafase con inv 16 negativa
en leucemia mieloide aguda Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
 Su uso depende de la disponibilidad
de sondas.
 Aporta
información
dependiendo del tipo
utilizada (screening).
concreta
de sonda
 Alto coste económico.
 No en tejidos necróticos.
 No se pueden detectar
alteraciones simultáneamente
varias
Fotografía de una muestra de neuroblastoma en interfase con amplificación
N-MYC negativa. Cytovision v 7.2 (SOLCA, 2011).
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
AGRADECIMIENTOS
CONCLUSIONES
•
Se realizó análisis de 20 tumores sólidos aplicando FISH sondas de locus específico
(rearreglos cromosómicos específicos).
•
FISH permitió una adecuada identificación rearreglos cromosómicos esperados en
TOC. Se evidenció en 3 SE, en 2 LB, en 4 NB, en 7 CM y 4 otros tumores sólidos
(LNH).
•
La comparación entre las técnicas, sesgo → histopatología (screening) mientras que
FISH (locus específico) influyendo →cálculo de las caract. Oper. FISH sensibilidad
del 100%, de especificidad 33,33%, VPP del 50%, VPN del 100% y un IJ de 0,33.
•
Con la prueba Chi cuadrado de independencia (P=0,068), FISH independiente
histopatológica pero al obtenerse una curva de ROC con un área 0,667 capacidad
discriminatoria menor, (complemento) →un mejor diagnóstico de los rearreglos
cromosómicos en tumores.
CONCLUSIONES
•
Se obtuvo un valor de κ=0,286, (baja concordancia) FISH con respecto al estándar
de oro, y prueba de McNemar P=0,0075, ≠s resultados. Sin embargo en aquellas
muestras en las que se obtuvo un resultado (-) para el rearreglo cromosómico
mediante la técnica en estudio, no significa que el diagnóstico histopatológico esté
equivocado (otro tipo de alteración genética).
•
La técnica FISH es la más utilizada para el estudio de tumores sólidos sobre todo
cuando existe un diagnóstico indeterminado. Además la identificación de los
rearreglos cromosómicos específicos en las neoplasias en estudio (pronóstico,
tratamiento y monitoreo)→ gran importancia a nivel clínico.
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
AGRADECIMIENTOS
RECOMENDACIONES
•
Para la comparación de técnicas se recomienda comparar a la técnica de FISH con
sonda de locus específico con PCR o inmunohistoquímica (precisa).
•
Se recomienda para futuras investigaciones aplicar la técnica RT-PCR en las
muestras de tumores sólidos en estudio para complementar el diagnóstico (resultado
negativo).
•
Se recomienda utilizar la técnica FISH en aquellos casos en los que el cultivo de
tumores presente dificultades (metafases, cariotipo y contaminación de las
muestras).
•
Se recomienda utilizar FISH para la detección de rearreglos asociados a tumores
que pueden ser muy difíciles de diagnosticar únicamente por su morfología.
•
Se recomienda utilizar FISH cuando el diagnóstico inmunohistoquímico
indeterminado o equívoco (gen HER2/neu) en el cáncer de mama (paciente es
positiva o negativa).
RECOMENDACIONES
•
Utilizar FISH, para tomar la decisión (tratamiento) predecir la respuesta de los
tumores a drogas usadas actualmente en la quimioterapia.
•
Citogénetica convencional →cariotipo post tratamiento MO, (monitorear al paciente
durante y después de la terapia)
•
Protocolo (corte de tejido adecuado, respetar las temperaturas y una buena digestión
con proteasa)
•
Para mejorar la aplicación de la técnica FISH (desarrollar nuevas sondas) que
detecten genes candidatos →desarrollo y progresión del tumor (otros tipos de
tumores sólidos).
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
AGRADECIMIENTOS
BIBLIOGRAFÍA
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
ACS. (2012). American Cancer Society. Extraído el 3 de Marzo de 2012, desde
http://www.cancer.org.
Bown, N. (2001). Neuroblastoma Tumour Genetics: Clinical and Biological aspects.
JClin Pathol, 54,897-910.
González N., Leonel A., Aristizábal B., y Beatriz H. (2010). Evaluación de tres
métodos moleculares para el rastreo e identificación de HER2/neu. Medicina UPB,
29,17-40.
Haschek, W. (2009). Fundamentals of Toxicologic Pathology. Londres: Academic
Press.
Hurria, A. (2010). Practical Geriatric Oncology. USA: Cambridge University Press
Iwamoto, Y. (2007). Diagnosis and Treatment of Ewing’s Sarcoma. Jpn J Clin Oncol,
37, 79–89.
Khosravi, P., Pérez, G. (2006). Linfoma B difuso de células grandes. Med Clin , 127,
17-21.
Manzitti,J., Mansilla, M. (2010). Cuál es su diagnóstico? Descripción del caso
presentado en número anterior: Retinoblastoma. Arch.Argent.Pediatr.,108 , 255-257.
NCI. (2010). Instituto Nacional del Cáncer. Extraído el 25 de Enero de 2012, desde
http://www.cancer.gov.
Papaioannou, G., McHugh, K. (2005). Neuroblastoma in childhood:Review and
Radiological findings. Cancer Imaging, 5, 116-127.
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
“La confianza en uno mismo es el primer paso para el
éxito"
Anónimo