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DIAGNÓSTICO PRENATAL
NO INVASIVO
MªLirios Juliá Sanchis
Laboratorio Análisis Clínicos.
Hospital Virgen de Los Lirios. Alcoy
Introducción
 Se define ADN circulante como el ADN que
encontramos en plasma o suero, no unido a células,
circulando por el torrente sanguíneo.
 Éste puede provenir:
 necrosis o apoptosis celular.
 ADN
sintetizado
de
novo
y
espontáneamente liberado, pudiendo entrar
en otras células, donde podría modificar
biológicamente las células receptoras
(transmisión horizontal).
Introducción
 El descubrimiento de ácidos nucléicos circulantes
libres, no unidos a células, en el plasma o suero
(CNAPS) humano fue descrito por primera vez por
Mandel y Metais en 1948.
 En torno a los años 60, Anker y Stroun realizaron una
serie de experimentos con injertos en plantas de
distinta variedad dentro de una misma especie de
berenjenas (Solanum melangena).
Introducción
 Los resultados de estos experimentos sugerían que la
información genética se había transmitido desde el
injerto a la planta base.
 Anker y Stroun postulan que el ADN portador de
información genética puede circular y entrar en las
células somáticas y reproductivas, y permanecer activo.
 En 1975 demostraron la secreción activa de ácidos
nucleicos por células vivas en cultivo.
Introducción
 En 1977 se demostró su aplicación potencial en el
diagnóstico y pronóstico del cáncer:
• Existían altos niveles de ADN circulante en el
suero de los pacientes diagnosticados de cáncer.
• Estos niveles descendían cuando los pacientes
respondían favorablemente a la radioterapia.
Introducción
 En 1989 se demostró que el ADN que circula en los
pacientes con
cáncer tenía las
características
específicas del tejido canceroso, detectándose en el
ADN libre en plasma o suero, las mutaciones
oncogénicas características de diversos tipos de cáncer.
 Se disparan los estudios utilizando CNAPS para
diagnóstico,
pronóstico
y
monitorización
tratamientos en pacientes con cáncer.
de
Introducción
 Paralelamente se abre una importante línea de
aplicación en el diagnóstico prenatal no invasivo
para el feto.
 Esto fue posible a partir de 1997 tras el éxito obtenido
en la detección de secuencias de ADN pertenecientes
al cromosoma Y en el plasma y suero de gestantes con
feto varón.
Introducción
Características del ADN circulante
 El
ADN
circulante
compartimentos
está
presente
extracelulares:
en
sangre,
diversos
saliva,
orina, líquido cefalorraquídeo.
 Puede estar circulando de forma libre (free-DNA): es
más lábil y en ocasiones transportado por proteínas
plasmáticas (argonautas).
 ADN o ARN asociado a partículas: micropartículas,
cuerpos apoptóticos, exosomas y virtosomas.
Características del ADN circulante
Características del ADN circulante
Micropartículas y cuerpos apoptóticos:
 Durante la apoptosis, las células liberan cierto número
de micropartículas.
 Cuando los contenidos celulares están completamente
fragmentados, se dispersan tanto en forma de
micropartículas o de cuerpos apoptóticos.
 Estos últimos son los que contienen la mayor parte del
ADN degradado durante el proceso de apoptosis.
Características del ADN circulante
Exosomas:
 Provienen de endosomas que van aumentando de
vesículas
intraluminales
procedentes
de
la
invaginación de la membrana.
 Contienen principalmente proteínas, ARNm y miARN.
 Los exosomas o bien, se funden con lisosomas y son
degradados, o son secretados al exterior de la célula
(funciones de comunicación intercelular).
Características del ADN circulante
Exosomas:
 Estas partículas pueden contener ADN.
 La señalización mediada por el exosoma se consigue
mediante la fusión con otras células, liberando su
contenido en la célula receptora.
 La cantidad de ADN en circulación procedente de
exosomas es insignificante en relación con los niveles
de ADN debidos a procesos de apoptosis y necrosis.
Características del ADN circulante
Virtosomas:
 Complejo formado por ADN, ARN y lipoproteínas
sintetizado de novo por células vivas y liberado
espontáneamente.
 Esta partícula puede liberarse tanto de células en
división como de células ya diferenciadas.
 La fracción proteica incluye además polimerasas de
ADN y ARN.
Características del ADN circulante
Virtosomas:
 Este complejo puede entrar fácilmente en otras células
tanto in vitro como in vivo, donde, es capaz de
modificar biológicamente a las células receptoras
(alteraciones inmunológicas; transformación a células
cancerosas).
 El mecanismo de captación: el complejo puede pasar al
interior celular evitando la digestión lisosomal.
Características del ADN circulante
Virtosomas:
 Algunas características parecen ser compartidas entre
los virtosomas y ciertos virus o los exosomas.
 Tanto ADN como ARN están presentes a la vez.
 La liberación de los virtosomas no causa perjuicio a la
célula que lo libera.
 La fracción lipoprotéica es recién sintetizada por la
célula y no deriva de lipoproteínas de membrana.
Utilidad del ADN circulante en el
diagnóstico prenatal
 El descubrimiento de CNAPS procedentes del feto
(fCNAPS) circulando en el plasma materno, ha
permitido el desarrollo de técnicas de Diagnóstico
Prenatal No Invasivo (NIPD)
 Objetivo: sustituir por completo a las pruebas
diagnósticas en líquido amniótico.
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diagnóstico prenatal
 Las técnicas de secuenciación masiva para la detección
de aneuploidías fetales en suero materno aún no
alcanzan
la
especificidad
suficiente
para
ser
consideradas diagnósticas.
 Test Prenatal No Invasivo (NIPT). Los casos
considerados positivos deben ser confirmados en
líquido amniótico.
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diagnóstico prenatal
 Se ha demostrado la existencia tanto de ADN como
ARN fetal en la circulación materna.
 El ADN y ARN fetal están constituídos por fragmentos
cortos (150 pares de bases).
 Origen: apoptótico de células fetales o de la placenta
 Relación directa entre la cantidad de ADN fetal
circulante y un mayor recambio celular de la placenta.
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diagnóstico prenatal
 Los fCNAPS son indetectables en el plasma materno
a las 48h tras el parto, siendo eliminados en su
mayoría en las 2 primeras horas postparto.
 No se podría detectar ADN de un embarazo anterior.
 Esto hace posible amplificar genes en el plasma de la
gestante que si están ausentes en la madre,
inequívocamente pertenecen al feto.
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diagnóstico prenatal
 El ADN circulante de origen fetal puede ser detectado
mediante PCR a partir del día 18 de gestación.
 El ADN fetal está representado de manera completa en
el plasma materno. Su concentración aumenta de
manera paralela a la edad gestacional.
 El ADN fetal libre comprende sólo del 3 al 10% del
ADN circulante de la madre.
Utilidad del ADN circulante en el
diagnóstico prenatal
Utilidad del ADN circulante en el
diagnóstico prenatal
 Principales
métodos
de
cuantificación
enriquecimiento del ADN fetal en el plasma materno:
o Secuenciación masiva en paralelo shotgun (s-MPS).
o Secuenciación masiva en paralelo dirigida (t-MPS).
o Técnicas basadas en el ADN metilado.
o Técnicas basadas en polimorfismos de un nucleótido (SNP).
o PCR digital.
o Pruebas basadas en el ARN.
y
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o Secuenciación masiva en paralelo shotgun (s-MPS):
- Permite secuenciar simultáneamente millones de
fragmentos tanto de ADN fetal como materno.
- Si existe una aneuploidía fetal debe encontrarse un
exceso o déficit relativo del cromosoma en cuestión.
- La fracción fetal debe ser apreciable. Los recuentos
deben ser comparados con casos euploides.
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o Secuenciación masiva en paralelo dirigida (t-MPS):
- Variante de la anterior. Amplificar selectivamente sólo
aquellas regiones cromosómicas de interés (por
ejemplo, los cromosomas 21, 18 y 13).
- Determinar si hay algún caso fuera de la euploidía,
basándose en el número relativo de fragmentos de
ADN para este subgrupo de cromosomas.
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diagnóstico prenatal
1. Detección del RhD y el sexo fetal:
- La incompatibilidad del grupo sanguíneo Rhesus D
(RhD)
entre
madre
y
feto
puede
resultar
en
aloinmunización materna, donde los anticuerpos anti-D
producidos, cruzan la barrera placentaria y atacan a los
glóbulos rojos fetales provocando la enfermedad
hemolítica del feto y del recién nacido.
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diagnóstico prenatal
1. Detección del RhD y el sexo fetal:
- Esta inmunización de la madre contra la proteína de
membrana hemática RhD del feto, ocurre generalmente
tras el nacimiento del primer bebé RhD positivo al
término del embarazo.
- El embarazo en el cual se produce la aloinmunización
puede no afectar al niño. Mayor riesgo en posteriores.
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1. Detección del RhD y el sexo fetal:
- Cuando la madre no expresa el antígeno RhD en sus
eritrocitos (RhD-), es esencial evitar una posible
enfermedad hemolítica en el recién nacido.
- La prevención: administración vía IM de gamma-
globulina anti-D humana en la semana 28 de gestación.
Si el recién nacido es RhD+, segunda dosis postparto.
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1. Detección del RhD y el sexo fetal:
- El 40% de las mujeres gestantes RhD-, portan un feto
RhD- y no necesitarían ser expuestas a este tratamiento
si el estatus del RhD fetal es diagnosticado antes de la
semana 28 de gestación.
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1. Detección del RhD y el sexo fetal:
- Cuando la secuencia fetal de interés no tiene una
contrapartida materna (ej: ADN del cromosoma Y para
feto varón, o el gen RhD cuando la madre es RhD-), ha
sido posible obtener excelentes resultados en la
detección y cuantificación de estos genes mediante
RT-PCR.
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1. Detección del RhD y el sexo fetal:
- El uso del ADN fetal circulante en el plasma materno
hace posible detectar el estatus del RhD fetal a partir de
la 8-10 semana de gestación.
- De especial interés cuando la gestante está sensibilizada
permitiéndole una gestación normal si el feto es RhD- o,
tenerla bajo vigilancia adecuada si el feto es RhD+.
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1. Detección del RhD y el sexo fetal:
- El diagnóstico del RhD fetal en suero materno tiene una
sensibilidad cercana al 100%.
- Instaurado
en numerosos hospitales europeos y
concretamente, en el HUVR de Sevilla donde está en la
cartera de servicios desde el año 2009 para todas las
gestantes RhD-.
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diagnóstico prenatal
1. Detección del RhD y el sexo fetal:
- Numerosos estudios concluyen que la implementación
del NIPD del RhD fetal es una estrategia costo-efectiva
para el manejo de la incompatibilidad materno-fetal del
factor RhD, recomendándose la implantación nacional
en Alemania, Suecia y Holanda.
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diagnóstico prenatal
1. Detección del RhD y el sexo fetal:
- El NIPD del sexo fetal tiene utilidad clínica en el manejo
de las enfermedades ligadas al cromosoma X, como es el
caso de las hemofilias, donde una amniocentesis puede
ser evitada si se descarta que el feto sea varón.
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2. Detección de patologías fetales asociadas a un solo gen:
- Posibilidad
de
detectar
mutaciones
autosómicas
dominantes heredadas del padre.
• Analizar la presencia de la mutación del gen c-RET
mediante NIPD en pacientes MEN2A en gestantes
sanas cuyas parejas padecen la enfermedad.
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2. Detección de patologías fetales asociadas a un solo gen:
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2. Detección de patologías fetales asociadas a un solo gen:
- Posibilidad de detectar mutaciones recesivas. Han de
existir en el genoma materno y paterno para que el feto
herede dicha mutación en homocigosis.
- Para detectar si el feto porta la mutación, se ha de
calcular la cantidad relativa de los alelos mutados
respecto a los sanos, “Relative Mutation Dosage”.
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2. Detección de patologías fetales asociadas a un solo gen:
- Si el feto posee la mutación en homocigosis, se detecta
una sobreexpresión del alelo mutado respecto al ADN
de un control con la mutación en heterocigosis.
- Esta aproximación se ha utilizado para el NIPD en la
beta-talasemia, la hemofilia y la anemia falciforme.
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3. NIPD en incompatibilidad plaquetaria materno-fetal:
- En la superficie de la membrana plaquetaria se
encuentran
los
llamados
Antígenos
Plaquetarios
Humanos (HPA).
- Durante el embarazo, por herencia paterna, los HPA
fetales pueden ser distintos a los de la madre y ocasionar
la aloinmunización materna.
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3. NIPD en incompatibilidad plaquetaria materno-fetal:
- Este
fenómeno
es
lo
que
se
conoce
como
trombocitopenia fetal y neonatal aloinmune (FNAIT).
- Incidencia: 1/1000 nacidos vivos.
- 0,9% de prevalencia en población general. Causa más
frecuente de trombocitopenia aislada en fetos y recién
nacidos.
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3. NIPD en incompatibilidad plaquetaria materno-fetal:
- En caucásicos, al antígeno HPA-1 es el implicado con
más frecuencia en FNAIT.
- De herencia bialélica, el 80% de las incompatibilidades
se deben a embarazos de fetos HPA-1a en mujeres HPA1b homocigotas.
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3. NIPD en incompatibilidad plaquetaria materno-fetal:
- Sólo el 2% de la población es HPA-1a negativa, es decir,
homocigota para el HPA-1b, y tan solo el 10% creará
finalmente anticuerpos.
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diagnóstico prenatal
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3. NIPD en incompatibilidad plaquetaria materno-fetal:
- El objetivo fundamental del desarrollo de un NIPD para
esta enfermedad es reducir la morbilidad y mortalidad
que lleva asociadas, previniendo la HIC.
- Scheffer et al (2011), Toriellec et al (2013).
- Vacuna anti-HPA-1a, formada por Acs que se unirían a
los Ag fetales para evitar la aloinmunización materna.
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4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas:
- Aneuploidía: existencia de un cambio en el número de
cromosomas dentro de una célula. La causa suele ser
una disfunción de la meiosis durante la formación de los
gametos.
- Se cree que es relativamente frecuente en los embriones
en desarrollo, pero la mayoría conllevan un aborto.
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4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas:
- Las
aneuploidías más compatibles con la vida:
trisomías del cromosoma 13, el 18 y el 21.
- La trisomía 21 es la más común de las aneuploidías que
afecta 1 de cada 700 nacidos vivos.
- La opción más extendida de NIPD que determina el
riesgo de padecer s. de Down es el triple “screening”.
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4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas:
- En los últimos 5 años se han desarrollado varias técnicas
que tratan de conseguir un NIPD para las trisomías
de los cromosomas 13, 18 y 21 utilizando los ácidos
nucleicos fetales que circulan en la madre.
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4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas:
- La técnica más prometedora en el diagnóstico clínico es
la basada en la secuenciación masiva en paralelo,
capaz de establecer porcentajes entre miles de
secuencias
existentes
en
el
ADN
circulante,
consiguiendo alta sensibilidad y especificidad para
diferentes aneuploidías.
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4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas:
Sensibilidad
Especificidad
Trisomía 21
99,1% – 100%
99,7% - 100%
Trisomía 18
97,2% - 100%
99,7% - 100%
Trisomía 13
78,6% - 91,7%
99,1% - 100%
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4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas:
- Estudio multicéntrico MELISA (MatErnal BLood IS
Source to Accurately diagnose fetal aneuploidy) en 532
muestras de gestantes estudiando su genoma por
secuenciación masiva en paralelo.
- 100% trisomía 21; altas sensibilidades para trisomías 18,
13 e incluso 20 y 16, así como un caso de monosomía X.
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4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas:
- Las técnicas de secuenciación masiva para la
detección de aneuploidías fetales en el suero materno
aún no alcanzan la especificidad suficiente para ser
consideradas diagnósticas y los casos considerados
positivos deben ser confirmados en líquido
amniótico.
Limitaciones actuales del NIPT

Las técnicas disponibles actualmente en los laboratorios son específicas
para trisomías 21, 18 y 13.

Las anormalidades cromosómicas como las translocaciones no
balanceadas, las delecciones y las duplicaciones no se detectan por NIPT

El NIPT no puede distinguir las formas específicas de la aneuploidía.

NIPT no detecta mutaciones de un solo gen.

El NIPT puede verse afectado cuando se reduce la cantidad de ADN fetal
circulante en el plasma/suero materno (IMC elevado en la gestante;
extracciones de muestras antes de la semana 10 de gestación).
Limitaciones actuales del NIPT

El NIPT no informa de la existencia en defectos de la formación del tubo
neural, por lo que no excluye la realización del cribado bioquímico del
segundo trimestre cuando proceda.

El NIPT tampoco excluye la utilidad de realizar el cribado combinado del
primer trimestre donde la ecografía es necesaria para determinar la edad
gestacional, la posible existencia de distintas anomalías cromosómicas, la
identificación de embarazos gemelares y la detección de embarazos de
riesgo por otros valores como la placentación anormal.

El NIPT tiene una menor sensibilidad en el caso de embarazos gemelares.

No tiene capacidad predictiva de las complicaciones en la gestación
avanzada.
Recomendaciones

Las recomendaciones más recientes de la United Healthcare (Medical
Polici number 2014T0560E) abogando por un uso racional del NIPT
aconsejan su realización en las siguientes circunstancias:







Mujeres gestantes >35 años en el momento del parto.
Cuando existan signos en la ecografía que hagan sospechar la
existencia de una aneuploidía.
Cuando la embarazada ha tenido una gestación anterior de un
feto con trisomía.
Cuando los cribados de primer o segundo trimestre den un
riesgo positivo.
Cuando alguno de los padres padece una translocación
Robertsoniana balanceada con un mayor riesgo de trisomía fetal.
Un NIPT debe ser siempre en el contexto del consejo genético
antes y después de la realización de la prueba.
Un test positivo debe de confirmarse mediante amniocentesis.
Consideraciones éticas en el NIPT

Desde el 2011 existe la posibilidad de solicitar a empresas privadas de
diagnóstico clínico el NIPT en suero materno para la detección de
aneuploidías cromosómicas desde la décima semana de gestación.

Al ser considerada una técnica no diagnóstica, aunque altamente fiable,
debe realizarse en el contexto del consejo genético que conlleva un
consentimiento informado.

El cariotipo actualmente puede detectar con más seguridad patologías
cromosómicas como las translocaciones no balanceadas, delecciones o
duplicaciones parciales, mosaicismos.

Tampoco es posible detectar mediante NIPT defectos de la formación del
tubo neural. NIPT aún no es suficientemente sensible en los casos de
gestaciones gemelares o múltiples.
Consideraciones éticas en el NIPT

En al año 2013 el American College of Medical Genetics and Genomics
(ACMG) publicó sus recomendaciones para la realización de estas
pruebas y sus limitaciones.

La ACMG recomienda que se solicite a las pacientes la información
precisa acerca de lo que quieren que sea estudiado, dado que la
secuenciación masiva puede encontrar anomalías que no son objeto de
estudio o atipias sin explicación actualmente generando ansiedad e
inseguridad innecesariamente.

En esta guía recomiendan que los casos que dan positivo, se proporcione
de nuevo un consejo clínico donde se oferte la amniocentesis para
confirmación del diagnóstico.

En los casos que se confirme que el feto tiene una aneuploidía
cromosómica, es importante ofrecer a los padres las posibilidades de
actuación o preparación.