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DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO MªLirios Juliá Sanchis Laboratorio Análisis Clínicos. Hospital Virgen de Los Lirios. Alcoy Introducción Se define ADN circulante como el ADN que encontramos en plasma o suero, no unido a células, circulando por el torrente sanguíneo. Éste puede provenir: necrosis o apoptosis celular. ADN sintetizado de novo y espontáneamente liberado, pudiendo entrar en otras células, donde podría modificar biológicamente las células receptoras (transmisión horizontal). Introducción El descubrimiento de ácidos nucléicos circulantes libres, no unidos a células, en el plasma o suero (CNAPS) humano fue descrito por primera vez por Mandel y Metais en 1948. En torno a los años 60, Anker y Stroun realizaron una serie de experimentos con injertos en plantas de distinta variedad dentro de una misma especie de berenjenas (Solanum melangena). Introducción Los resultados de estos experimentos sugerían que la información genética se había transmitido desde el injerto a la planta base. Anker y Stroun postulan que el ADN portador de información genética puede circular y entrar en las células somáticas y reproductivas, y permanecer activo. En 1975 demostraron la secreción activa de ácidos nucleicos por células vivas en cultivo. Introducción En 1977 se demostró su aplicación potencial en el diagnóstico y pronóstico del cáncer: • Existían altos niveles de ADN circulante en el suero de los pacientes diagnosticados de cáncer. • Estos niveles descendían cuando los pacientes respondían favorablemente a la radioterapia. Introducción En 1989 se demostró que el ADN que circula en los pacientes con cáncer tenía las características específicas del tejido canceroso, detectándose en el ADN libre en plasma o suero, las mutaciones oncogénicas características de diversos tipos de cáncer. Se disparan los estudios utilizando CNAPS para diagnóstico, pronóstico y monitorización tratamientos en pacientes con cáncer. de Introducción Paralelamente se abre una importante línea de aplicación en el diagnóstico prenatal no invasivo para el feto. Esto fue posible a partir de 1997 tras el éxito obtenido en la detección de secuencias de ADN pertenecientes al cromosoma Y en el plasma y suero de gestantes con feto varón. Introducción Características del ADN circulante El ADN circulante compartimentos está presente extracelulares: en sangre, diversos saliva, orina, líquido cefalorraquídeo. Puede estar circulando de forma libre (free-DNA): es más lábil y en ocasiones transportado por proteínas plasmáticas (argonautas). ADN o ARN asociado a partículas: micropartículas, cuerpos apoptóticos, exosomas y virtosomas. Características del ADN circulante Características del ADN circulante Micropartículas y cuerpos apoptóticos: Durante la apoptosis, las células liberan cierto número de micropartículas. Cuando los contenidos celulares están completamente fragmentados, se dispersan tanto en forma de micropartículas o de cuerpos apoptóticos. Estos últimos son los que contienen la mayor parte del ADN degradado durante el proceso de apoptosis. Características del ADN circulante Exosomas: Provienen de endosomas que van aumentando de vesículas intraluminales procedentes de la invaginación de la membrana. Contienen principalmente proteínas, ARNm y miARN. Los exosomas o bien, se funden con lisosomas y son degradados, o son secretados al exterior de la célula (funciones de comunicación intercelular). Características del ADN circulante Exosomas: Estas partículas pueden contener ADN. La señalización mediada por el exosoma se consigue mediante la fusión con otras células, liberando su contenido en la célula receptora. La cantidad de ADN en circulación procedente de exosomas es insignificante en relación con los niveles de ADN debidos a procesos de apoptosis y necrosis. Características del ADN circulante Virtosomas: Complejo formado por ADN, ARN y lipoproteínas sintetizado de novo por células vivas y liberado espontáneamente. Esta partícula puede liberarse tanto de células en división como de células ya diferenciadas. La fracción proteica incluye además polimerasas de ADN y ARN. Características del ADN circulante Virtosomas: Este complejo puede entrar fácilmente en otras células tanto in vitro como in vivo, donde, es capaz de modificar biológicamente a las células receptoras (alteraciones inmunológicas; transformación a células cancerosas). El mecanismo de captación: el complejo puede pasar al interior celular evitando la digestión lisosomal. Características del ADN circulante Virtosomas: Algunas características parecen ser compartidas entre los virtosomas y ciertos virus o los exosomas. Tanto ADN como ARN están presentes a la vez. La liberación de los virtosomas no causa perjuicio a la célula que lo libera. La fracción lipoprotéica es recién sintetizada por la célula y no deriva de lipoproteínas de membrana. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal El descubrimiento de CNAPS procedentes del feto (fCNAPS) circulando en el plasma materno, ha permitido el desarrollo de técnicas de Diagnóstico Prenatal No Invasivo (NIPD) Objetivo: sustituir por completo a las pruebas diagnósticas en líquido amniótico. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal Las técnicas de secuenciación masiva para la detección de aneuploidías fetales en suero materno aún no alcanzan la especificidad suficiente para ser consideradas diagnósticas. Test Prenatal No Invasivo (NIPT). Los casos considerados positivos deben ser confirmados en líquido amniótico. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal Se ha demostrado la existencia tanto de ADN como ARN fetal en la circulación materna. El ADN y ARN fetal están constituídos por fragmentos cortos (150 pares de bases). Origen: apoptótico de células fetales o de la placenta Relación directa entre la cantidad de ADN fetal circulante y un mayor recambio celular de la placenta. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal Los fCNAPS son indetectables en el plasma materno a las 48h tras el parto, siendo eliminados en su mayoría en las 2 primeras horas postparto. No se podría detectar ADN de un embarazo anterior. Esto hace posible amplificar genes en el plasma de la gestante que si están ausentes en la madre, inequívocamente pertenecen al feto. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal El ADN circulante de origen fetal puede ser detectado mediante PCR a partir del día 18 de gestación. El ADN fetal está representado de manera completa en el plasma materno. Su concentración aumenta de manera paralela a la edad gestacional. El ADN fetal libre comprende sólo del 3 al 10% del ADN circulante de la madre. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal Principales métodos de cuantificación enriquecimiento del ADN fetal en el plasma materno: o Secuenciación masiva en paralelo shotgun (s-MPS). o Secuenciación masiva en paralelo dirigida (t-MPS). o Técnicas basadas en el ADN metilado. o Técnicas basadas en polimorfismos de un nucleótido (SNP). o PCR digital. o Pruebas basadas en el ARN. y Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal o Secuenciación masiva en paralelo shotgun (s-MPS): - Permite secuenciar simultáneamente millones de fragmentos tanto de ADN fetal como materno. - Si existe una aneuploidía fetal debe encontrarse un exceso o déficit relativo del cromosoma en cuestión. - La fracción fetal debe ser apreciable. Los recuentos deben ser comparados con casos euploides. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal o Secuenciación masiva en paralelo dirigida (t-MPS): - Variante de la anterior. Amplificar selectivamente sólo aquellas regiones cromosómicas de interés (por ejemplo, los cromosomas 21, 18 y 13). - Determinar si hay algún caso fuera de la euploidía, basándose en el número relativo de fragmentos de ADN para este subgrupo de cromosomas. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 1. Detección del RhD y el sexo fetal: - La incompatibilidad del grupo sanguíneo Rhesus D (RhD) entre madre y feto puede resultar en aloinmunización materna, donde los anticuerpos anti-D producidos, cruzan la barrera placentaria y atacan a los glóbulos rojos fetales provocando la enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 1. Detección del RhD y el sexo fetal: - Esta inmunización de la madre contra la proteína de membrana hemática RhD del feto, ocurre generalmente tras el nacimiento del primer bebé RhD positivo al término del embarazo. - El embarazo en el cual se produce la aloinmunización puede no afectar al niño. Mayor riesgo en posteriores. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 1. Detección del RhD y el sexo fetal: - Cuando la madre no expresa el antígeno RhD en sus eritrocitos (RhD-), es esencial evitar una posible enfermedad hemolítica en el recién nacido. - La prevención: administración vía IM de gamma- globulina anti-D humana en la semana 28 de gestación. Si el recién nacido es RhD+, segunda dosis postparto. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 1. Detección del RhD y el sexo fetal: - El 40% de las mujeres gestantes RhD-, portan un feto RhD- y no necesitarían ser expuestas a este tratamiento si el estatus del RhD fetal es diagnosticado antes de la semana 28 de gestación. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 1. Detección del RhD y el sexo fetal: - Cuando la secuencia fetal de interés no tiene una contrapartida materna (ej: ADN del cromosoma Y para feto varón, o el gen RhD cuando la madre es RhD-), ha sido posible obtener excelentes resultados en la detección y cuantificación de estos genes mediante RT-PCR. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 1. Detección del RhD y el sexo fetal: - El uso del ADN fetal circulante en el plasma materno hace posible detectar el estatus del RhD fetal a partir de la 8-10 semana de gestación. - De especial interés cuando la gestante está sensibilizada permitiéndole una gestación normal si el feto es RhD- o, tenerla bajo vigilancia adecuada si el feto es RhD+. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 1. Detección del RhD y el sexo fetal: - El diagnóstico del RhD fetal en suero materno tiene una sensibilidad cercana al 100%. - Instaurado en numerosos hospitales europeos y concretamente, en el HUVR de Sevilla donde está en la cartera de servicios desde el año 2009 para todas las gestantes RhD-. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 1. Detección del RhD y el sexo fetal: - Numerosos estudios concluyen que la implementación del NIPD del RhD fetal es una estrategia costo-efectiva para el manejo de la incompatibilidad materno-fetal del factor RhD, recomendándose la implantación nacional en Alemania, Suecia y Holanda. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 1. Detección del RhD y el sexo fetal: - El NIPD del sexo fetal tiene utilidad clínica en el manejo de las enfermedades ligadas al cromosoma X, como es el caso de las hemofilias, donde una amniocentesis puede ser evitada si se descarta que el feto sea varón. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 2. Detección de patologías fetales asociadas a un solo gen: - Posibilidad de detectar mutaciones autosómicas dominantes heredadas del padre. • Analizar la presencia de la mutación del gen c-RET mediante NIPD en pacientes MEN2A en gestantes sanas cuyas parejas padecen la enfermedad. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 2. Detección de patologías fetales asociadas a un solo gen: Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 2. Detección de patologías fetales asociadas a un solo gen: - Posibilidad de detectar mutaciones recesivas. Han de existir en el genoma materno y paterno para que el feto herede dicha mutación en homocigosis. - Para detectar si el feto porta la mutación, se ha de calcular la cantidad relativa de los alelos mutados respecto a los sanos, “Relative Mutation Dosage”. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 2. Detección de patologías fetales asociadas a un solo gen: - Si el feto posee la mutación en homocigosis, se detecta una sobreexpresión del alelo mutado respecto al ADN de un control con la mutación en heterocigosis. - Esta aproximación se ha utilizado para el NIPD en la beta-talasemia, la hemofilia y la anemia falciforme. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 3. NIPD en incompatibilidad plaquetaria materno-fetal: - En la superficie de la membrana plaquetaria se encuentran los llamados Antígenos Plaquetarios Humanos (HPA). - Durante el embarazo, por herencia paterna, los HPA fetales pueden ser distintos a los de la madre y ocasionar la aloinmunización materna. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 3. NIPD en incompatibilidad plaquetaria materno-fetal: - Este fenómeno es lo que se conoce como trombocitopenia fetal y neonatal aloinmune (FNAIT). - Incidencia: 1/1000 nacidos vivos. - 0,9% de prevalencia en población general. Causa más frecuente de trombocitopenia aislada en fetos y recién nacidos. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 3. NIPD en incompatibilidad plaquetaria materno-fetal: - En caucásicos, al antígeno HPA-1 es el implicado con más frecuencia en FNAIT. - De herencia bialélica, el 80% de las incompatibilidades se deben a embarazos de fetos HPA-1a en mujeres HPA1b homocigotas. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 3. NIPD en incompatibilidad plaquetaria materno-fetal: - Sólo el 2% de la población es HPA-1a negativa, es decir, homocigota para el HPA-1b, y tan solo el 10% creará finalmente anticuerpos. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 3. NIPD en incompatibilidad plaquetaria materno-fetal: - El objetivo fundamental del desarrollo de un NIPD para esta enfermedad es reducir la morbilidad y mortalidad que lleva asociadas, previniendo la HIC. - Scheffer et al (2011), Toriellec et al (2013). - Vacuna anti-HPA-1a, formada por Acs que se unirían a los Ag fetales para evitar la aloinmunización materna. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas: - Aneuploidía: existencia de un cambio en el número de cromosomas dentro de una célula. La causa suele ser una disfunción de la meiosis durante la formación de los gametos. - Se cree que es relativamente frecuente en los embriones en desarrollo, pero la mayoría conllevan un aborto. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas: - Las aneuploidías más compatibles con la vida: trisomías del cromosoma 13, el 18 y el 21. - La trisomía 21 es la más común de las aneuploidías que afecta 1 de cada 700 nacidos vivos. - La opción más extendida de NIPD que determina el riesgo de padecer s. de Down es el triple “screening”. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas: - En los últimos 5 años se han desarrollado varias técnicas que tratan de conseguir un NIPD para las trisomías de los cromosomas 13, 18 y 21 utilizando los ácidos nucleicos fetales que circulan en la madre. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas: - La técnica más prometedora en el diagnóstico clínico es la basada en la secuenciación masiva en paralelo, capaz de establecer porcentajes entre miles de secuencias existentes en el ADN circulante, consiguiendo alta sensibilidad y especificidad para diferentes aneuploidías. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas: Sensibilidad Especificidad Trisomía 21 99,1% – 100% 99,7% - 100% Trisomía 18 97,2% - 100% 99,7% - 100% Trisomía 13 78,6% - 91,7% 99,1% - 100% Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas: - Estudio multicéntrico MELISA (MatErnal BLood IS Source to Accurately diagnose fetal aneuploidy) en 532 muestras de gestantes estudiando su genoma por secuenciación masiva en paralelo. - 100% trisomía 21; altas sensibilidades para trisomías 18, 13 e incluso 20 y 16, así como un caso de monosomía X. Utilidad del ADN circulante en el diagnóstico prenatal 4. Diagnóstico de aneuploidías cromosómicas: - Las técnicas de secuenciación masiva para la detección de aneuploidías fetales en el suero materno aún no alcanzan la especificidad suficiente para ser consideradas diagnósticas y los casos considerados positivos deben ser confirmados en líquido amniótico. Limitaciones actuales del NIPT Las técnicas disponibles actualmente en los laboratorios son específicas para trisomías 21, 18 y 13. Las anormalidades cromosómicas como las translocaciones no balanceadas, las delecciones y las duplicaciones no se detectan por NIPT El NIPT no puede distinguir las formas específicas de la aneuploidía. NIPT no detecta mutaciones de un solo gen. El NIPT puede verse afectado cuando se reduce la cantidad de ADN fetal circulante en el plasma/suero materno (IMC elevado en la gestante; extracciones de muestras antes de la semana 10 de gestación). Limitaciones actuales del NIPT El NIPT no informa de la existencia en defectos de la formación del tubo neural, por lo que no excluye la realización del cribado bioquímico del segundo trimestre cuando proceda. El NIPT tampoco excluye la utilidad de realizar el cribado combinado del primer trimestre donde la ecografía es necesaria para determinar la edad gestacional, la posible existencia de distintas anomalías cromosómicas, la identificación de embarazos gemelares y la detección de embarazos de riesgo por otros valores como la placentación anormal. El NIPT tiene una menor sensibilidad en el caso de embarazos gemelares. No tiene capacidad predictiva de las complicaciones en la gestación avanzada. Recomendaciones Las recomendaciones más recientes de la United Healthcare (Medical Polici number 2014T0560E) abogando por un uso racional del NIPT aconsejan su realización en las siguientes circunstancias: Mujeres gestantes >35 años en el momento del parto. Cuando existan signos en la ecografía que hagan sospechar la existencia de una aneuploidía. Cuando la embarazada ha tenido una gestación anterior de un feto con trisomía. Cuando los cribados de primer o segundo trimestre den un riesgo positivo. Cuando alguno de los padres padece una translocación Robertsoniana balanceada con un mayor riesgo de trisomía fetal. Un NIPT debe ser siempre en el contexto del consejo genético antes y después de la realización de la prueba. Un test positivo debe de confirmarse mediante amniocentesis. Consideraciones éticas en el NIPT Desde el 2011 existe la posibilidad de solicitar a empresas privadas de diagnóstico clínico el NIPT en suero materno para la detección de aneuploidías cromosómicas desde la décima semana de gestación. Al ser considerada una técnica no diagnóstica, aunque altamente fiable, debe realizarse en el contexto del consejo genético que conlleva un consentimiento informado. El cariotipo actualmente puede detectar con más seguridad patologías cromosómicas como las translocaciones no balanceadas, delecciones o duplicaciones parciales, mosaicismos. Tampoco es posible detectar mediante NIPT defectos de la formación del tubo neural. NIPT aún no es suficientemente sensible en los casos de gestaciones gemelares o múltiples. Consideraciones éticas en el NIPT En al año 2013 el American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) publicó sus recomendaciones para la realización de estas pruebas y sus limitaciones. La ACMG recomienda que se solicite a las pacientes la información precisa acerca de lo que quieren que sea estudiado, dado que la secuenciación masiva puede encontrar anomalías que no son objeto de estudio o atipias sin explicación actualmente generando ansiedad e inseguridad innecesariamente. En esta guía recomiendan que los casos que dan positivo, se proporcione de nuevo un consejo clínico donde se oferte la amniocentesis para confirmación del diagnóstico. En los casos que se confirme que el feto tiene una aneuploidía cromosómica, es importante ofrecer a los padres las posibilidades de actuación o preparación.