Download efectos del cloruro de cobalto en el hipocampo

2do Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas.
2da Jornada Científica Virtual de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal.
EFECTOS DEL CLORURO DE COBALTO EN EL HIPOCAMPO
SOBRE UN MODELO MURINO DE HIPOXIA-ISQUEMIA
Tamara Logica Tornatore1, Juan Ignacio Romero 1, Mariana Inés Holoubiec1, Veronica
Campanille1, Gustavo Ezequiel Saraceno1, Rodolfo Kölliker-Frers1, Francisco CApani1, Rocío
Castilla1
1
Instituto de Investigaciones Cardiológicas, “Prof. Dr. Alberto Taquini”, ININCA UBACONICET, Argentina.
[email protected]
RESUMEN
La asfixia perinatal (AP) es una complicación obstétrica asociada a una alta tasa de
morbimortalidad, con una incidencia de 1-5/1000 nacidos vivos. Es además un
importante factor de riesgo para diversos trastornos del neurodesarrollo. Se ha
observado que una serie repetitiva de pequeños eventos isquémicos aplicados tras
un evento hipóxico-isquemico principal (postcondicionamento) activa diferentes
mecanismos neuroprotectores que favorecen la supervivencia neuronal y se
preservan los procesos de memoria y aprendizaje alterados por la AP. El Cloruro de
Cobalto (CoCl2) podría funcionar como post-condicionante ya que en condiciones de
normoxia gatilla cambios transcripcionales que mimetizan la respuesta del
organismo ante un evento hipóxico. Por ello estudiamos este compuesto como
posible terapia neuroprotectora. Con ese fin, ratas Sprague Dawley machos de siete
días fueron sometidas a un modelo de hipoxia-isquemia por ligadura de la arteria
carótida común derecha y una posterior asfixia aguda por sometimiento a una
atmósfera de N2 al 100% durante 3 min. A las 24 hs se les administró
subcutáneamente 60mg/kg de CoCl 2.
El daño neuronal hipocampal a los 30 días causado por la AP se vió revertido al ser
evaluado por inmunohistoquímica de GFAP y NeuN en las áreas CA1 y CA3. Esto se
vió reflejado también a nivel neuroconductual observándose mejorías mejorías
significativas a los 12 y 15 días en pruebas de reflejo de marcha y geotaxis
negativa indicadoras de neurodesarrollo.
INTRODUCCIÓN
Un evento hipóxico-isquémico perinatal, también denominado asfixia perinatal
(AP), resulta de una disminución del flujo sanguíneo (isquemia) en conjunto con
una reducción de la presión de oxígeno (hipoxia) entre la vigésima séptima semana
de gestación y el séptimo día postparto. El daño cerebral derivado de este tipo de
injuria lo convierte en una de las principales causas de muerte y discapacidades
mentales en niños y recién nacidos. Entre las complicaciones más comunes de la AP
se encuentran la parálisis cerebral, el retardo mental, la epilepsia y la ceguera[1-4].
La incidencia de la AP se estima en 1/1000 nacidos vivos en países desarrollados,
siendo 5 a 10 veces mayor en países en vías de desarrollo[5]. Este cuadro clínico
ha sido extensamente reproducido en un modelo murino mediante la ligadura de la
arteria carótida común seguido de una exposición a un ambiente sin oxígeno y rico
en nitrógeno a los 7 días postnatales [1, 6-9]. En este momento del desarrollo, el
cerebro de la rata muestra un estado madurativo similar al de un feto humano o
infante recién nacido de 32 a 34 semanas de gestación. A esta altura, se han
completado las capas neuronales corticales, la matriz germinal esta involucionando
y la materia blanca ha experimentado poca mielinización[10].
El patrón de injurias resultado de un evento hipóxico- isquémico de este tipo no
suele manifestarse de manera uniforme, al contrario, existen diversas zonas que
presentan mayor vulnerabilidad. [11-12]. Una de ellas es el hipocampo, el cual se
encuentra involucrado en la memoria espacial, declarativa y contextual. Más
específicamente la zona CA1 del hipocampo es, a su vez, selectivamente vulnerable
a injurias isquémicas, manifestadas en muerte neuronal tardía [11-13].
Si bien hoy en día existe un mayor entendimiento acerca de los mecanismos de
muerte celular asociados a la AP, hasta el momento no se ha desarrollado ninguna
terapia específica que pueda contrarrestar las alteraciones provocadas por la
misma.
Los fracasos obtenidos por la administración exógena de drogas en ensayos
clínicos, han llevado a la identificación de los mecanismos endógenos que han
evolucionado para contrarrestar el daño inducido por la reducción de flujo
sanguíneo y a la manipulación de tales mecanismos para aprovecharlos como
neuroprotectores. Tal es el rol que juegan el precondicionamiento y el
postcondicionamiento.
El postcondicionamiento consiste en una serie repetitiva de reperfusiones
aplicadas inmediatamente luego de la isquemia. Además de activar diferentes
mecanismos neuroprotectores que favorecen la supervivencia neuronal, el
postcondicionamiento ha demostrado recuperar los procesos de memoria y
aprendizaje alterados por un evento hipóxico-isquémico[14]. Específicamente, se ha
demostrado neuroprotección por postcondicionamiento al someter al SNC a
diferentes ciclos breves de isquemia no perjudiciales aplicados luego de un gran
evento isquémico[15]. Cabe destacar que también se logra proteger a las neuronas
hipocampales CA1 utilizando protocolos en donde el postcondicionamiento se aplica
a las 48 hs del evento isquémico letal (Delayed postconditioning)[16].
Debido a que una hipoxia leve ha demostrado tener un efecto neuroprotector al
ser aplicada previa o posteriormente a una hipoxia severa, se ha utilizado al CoCl 2
como agente neuroprotector ya que en condiciones de normoxia gatilla cambios
transcripcionales que mimetizan una repuesta hipóxica caracterizada por un
incremento en HIF-1 y aumento de la actividad de unión de HIF-1 con el
consecuente aumento en la expresión de sus genes blancos[17-18]. En este
sentido, se ha demostrado que el precondicionamiento a través de CoCl 2, 24 hs
antes del evento hipóxico–isquémico resultó en una tolerancia al daño cerebral aún
mayor al que se llegó por precondicionamiento hipóxico. Las áreas cerebrales
protegidas fueron corteza, estradio dorsal, hipocampo y tálamo[19], aunque un
estudio más profundo fue realizado sólo en corteza[19]. En este trabajo, nos
proponemos analizar los efectos del postcondicionamiento por CoCl2 sobre el
hipocampo así como su posible papel neuroprotector.
Dado que aún no existe un entendimiento acabado de los mecanismos que
subyacen al postcondicionamiento, consideramos que su estudio es de pertinencia
dada la importancia clínica que tiene la comprensión y manipulación de los
mecanismos
que
subyacen
a
las
estrategias
neuroprotectoras
del
postcondicionamiento.
MATERIALES Y MÉTODOS
Modelo de Hipoxia- Isquemia
Ratas Sprague Dawley machos de siete día de edad fueron anestesiadas hasta
pérdida de conciencia para ser luego sometidas a una ligadura de la arteria carótida
común derecha. Una hora y media después de la cirugía, las ratas fueron sometidas
a una asfixia aguda colocándolas en una cámara sellada en un baño térmico a 37
ºC con una atmósfera de N2 al 100% durante 3 minutos. Al finalizar la experiencia
los animales fueron recuperados mediante masajes cardíaco y maniobras de
ventilación para, luego de dos horas, ser retornados a las jaulas con sus madres.
El grupo control (Sham) está compuesto por animales cuya arteria carótida
común fue expuesta sin posterior ligación alguna o sometimiento al ambiente
anóxico[9]. Este protocolo fue autorizado por la Comisión Institucional para el
Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL).
Postcondicionamiento con CoCl2
El protocolo de postcondicionamiento consistió en una inyección subcutánea de
60mg/kg de CoCl2 24hs después del insulto hipóxico–isquémico[16]. La solución de
CoCl2 a inyectar se preparó disolviendo el mismo en solución fisiológica. Los 4
grupos de estudio quedaron conformados de la siguiente forma: (1) H-I + CoCl2:
los animales fueron sometidos a un evento hipóxico–isquémico y a las 24 hs. se los
expuso al protocolo de postcondicionamiento con CoCl2; (2) Sham + Vhi: a estos
animales sólo se les expuso la arteria carótida, sin ser ligada y 24hs más tarde se
les inyectó solución fisiológica (vehículo); (3) H-I + Vhi: pasadas 24hs de la
exposición al evento hipóxico-isquémico se le inyectó a los animales solución
fisiológica; (4) Sham + CoCl2: se aplicó el protocolo de postcondicionamiento con
CoCl2 a animales Sham, 24 horas con posterioridad a la cirugía simulada.
Inmunohistoquímica
A los 30 días de vida, las ratas fueron anestesiadas y a continuación perfundidas
intracardíacamente con paraformaldehído al 4%. El cerebro fue extraído para luego
ser cortado en secciones coronales de 40 µm de espesor que fueron sometidas a
una marcación inmunohistoquímica con NeuN para visualizar los núcleos
neuronales[14] o con GFAP con el objetivo de observar inmunoreactividad,
característica de la astrogliosis.
Pruebas Conductuales
Los animales no fueron evaluados antes de los 14 días puesto que en esta etapa
del desarrollo aún no han sido destetados y es ampliamente conocido que la
deprivación materna afecta diferentes funciones conductuales y parámetros
neuroendócrinos, haciendo difícil la interpretación de los datos[20].
A partir del día 15 postnatal se los separó de sus madre por aproximadamente
30 minutos durante los cuales se los sometió a la evaluación neuroconductual.
Se les tomó un test de Marcha, para evaluar el desarrollo neuroconductual. El
mismo consiste en el registro del tiempo que tarda el animal en alejarse de un área
circular de un diámetro de 13 cm con sus patas traseras. Luego se evaluó la
Geotaxis Negativa, que nos aporta indicadores acerca tanto del desarrollo
neuroconductual como de reflejos. Consiste en evaluar el desempeño de los
animales al ser colocados en una grilla de 30 cm inclinada a 45º. Se registra por un
lado el reflejo de geotaxis que consiste en darse la vuelta al ser colocado boca
abajo, y luego el tiempo que tarda en llegar al extremo superior[21-22].
RESULTADOS
El daño neuronal hipocampal a los 30 días fue evaluado por inmunohistoquímica
para NeuN en la capa CA1 hipocampal de animales H-I observándose una
disminución en el número de neuronas así como una alteración en el patrón de
tinción, efectos que fueron menores en animales a los que se les suministró CoCl2
(Figura 1). En el área CA3 del hipocampo observamos una disminución en el
número de neuronas NeuN+ (p<0,01) en la capa piramidal de los animales
sometidos a H-I así como un aumento en el número de neuronas con alteración en
el patrón de tinción de NeuN (p<0,001) con respecto al grupo control inyectado con
vehículo. Esta disminución fue significativamente menor (p<0,01) en los animales
tratados con CoCl2 (Figura 2).
Estudiamos el efecto del tratamiento sobre los astrocitos en el estrato radiado
del área CA3 hipocampal por inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti
GFAP. Observamos un aumento en el número de astrocitos reactivos en animales
H-I con respecto a los controles (p<0,05). En los animales H-I a los que se les
suministró CoCl2 estos efectos fueron significativamente menores (p<0,05).
Evaluamos también el área reactiva para cada uno de los grupos, no encontrando
entre ninguno de ellos diferencias significativas (Figura 4).
Con el objetivo de corroborar si estos efectos se expresaban también a nivel
conductal se realizaron pruebas neuroconductuales indicadoras de daño en el
neurodesarrollo. Se observaron mejorías significativas en animales sometidos a H-I
tratados con CoCl2 respecto al grupo H-I tratado con vehículo en las pruebas de
reflejo de marcha y de geotaxis negativa. El mejor desempeño conductual se
observó en todos días de testeo (Figura 5).
CONCLUSIONES
Podemos concluir que la administración de CoCl2 produjo una significativa
recuperación a nivel neuronal, astrocitario y conductual. Si bien es necesaria la
realización de otros estudios, estos resultados parecerían indicar que el CoCl 2 es un
buen candidato para tratar las alteraciones producidas por la AP.
En conclusión, la administración de CoCl2 produjo recuperación de los daños estudiados
causados por la AP a nivel hipocampal. De gran importancia clínica sería una posterior
comprensión y manipulación de los mecanismos por los cuales actúa este compuesto.
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ANEXOS