Download Clase 23 Ingeniería metabólica

Agrobiotecnología.
Clase 23: Ingeniería metabólica
Factores relevantes en ingeniería metabólica
Transparencias 3-6
Para poder encarar un desarrollo en la ingeniería metabólica es necesario conocer las
rutas metabólicas involucradas, la regulación de las enzimas implicadas, la
disponibilidad de sustratos y las afinidades enzimáticas para con los mismos, los
efectos fisiológicos que se producen al alterar un vía, los efectos producidos por la
compartimentación subcelular de los productos y los efectos de su expresión en
determinados tejidos u órganos.
La ingeniería genética dispone hoy de varias estrategias para modificar rutas
metabólicas (transparencias 5 y 6). Básicamente, éstas permiten efectuar procesos
tales como: a) completar rutas metabólicas mediante inserción de genes heterólogos;
b) amplificar rutas normales; c) bloquear rutas alternativas; d) bloquear rutas normales;
e) modificar la regulación de rutas normales; f) minimizar la aparición de respuestas en
cascada. Las técnicas disponibles permiten prolongar, ramificar y bloquear rutas
metabólicas. El flujo metabólico puede también incrementarse por expresión
constitutiva de enzimas clave o por neutralización de los mecanismos de
retroalimentación por acumulación de producto. Alternativamente, el flujo a través de
una ruta determinada puede incrementarse por sobrexpresión de los factores de
transcripción que intervienen en la regulación de la misma.
Modificaciones en las rutas de síntesis de hidratos de carbono
Transparencias 7-22
Los hidratos de carbono son utilizados para la obtención de una gran diversidad de
productos en distintas ramas industriales. La transparencia 7 enumera algunos
ejemplos de estos productos. La tabla inferior muestra los valores globales de la
producción estimada de los principales carbohidratos. La transparencia 8 resume las
principales áreas de trabajo en que se ha concentrado la investigación en este campo
El almidón está formado por dos polímeros distintos, la amilosa y la amilopectina
(transparencia 9). La amilosa es un polisacárido no ramificado de unos 1.000 residuos
de glucosa. En cambio, las moléculas de amilopectina poseen cadenas líneales y
ramificaciones (aproximadamente, una cada 20 residuos de glucosa) y comprenden de
104 a 105 residuos de glucosa. Existen dos clases de enzimas que intervienen en la
síntesis del almidón. Las que realizan uniones (14) pueden estar bajo una forma
soluble (sintetasa soluble del almidón; SSS) localizada en el estroma de los
amiloplastos, bajo una forma unida a los gránulos de almidón (sintetasa unida al
gránulo del almidón; GBSS). La enzima que produce uniones (16) realiza las
ramificaciones de la amilopectina (enzima ramificante del almidón; BE) y está también
localizada en los amiloplastos. La proporción de amilosa en el almidón varía
normalmente entre 20 y 30%, y la de amilopectina entre 70 y 80%. Las diferentes
proporciones entre ambos componentes determinan las diferentes propiedades
fisicoquímicas de los almidones. En la imagen inferior de la transparencia 9 se
muestran las estructuras de los gránulos de almidón de maíz, papa y mandioca. A
pesar de que el almidón se produce por la misma ruta metabólica en las tres plantas,
la forma y las características de los gránulos de almidón son específicas para cada
especie.
El uso del almidón depende de la estructura de los gránulos, así como también en su
composición de amilosa, amilopectina y otros componentes menores (lípidos,
proteínas y fosfatos). La relación entre amilosa y amilopectina, y la distribución de los
glucanos de bajo peso molecular afectan propiedades tales como la temperatura de
gelatinización, la retrogradación y la viscosidad. Los almidones con más del 90% de
amilosa son más adecuados para la producción de películas. Para la confección de
adhesivos se utilizan almidones con distintas proporciones de amilosa y amilopectina,
dependiendo de las aplicaciones específicas. Las aplicaciones industriales del almidón
dependen de su composición química particular, lo cual está principalmente
determinado por el genotipo del cultivo de origen. Los programas de cruzamiento para
alterar la composición del almidón resultan frecuentemente en líneas con rendimientos
agronómicos reducidos, por lo que son poco competitivas en el mercado. Por esta
razón, existe gran interés en explorar las posibilidades de mejoramiento de la calidad
del almidón por técnicas de ingeniería genética.
La transparencia 11 muestra un esquema de las rutas de síntesis y degradación de
algunos hidratos de carbono. La sobrexpresión o la supresión de los genes que
participan de esta vía permiten favorecer la formación de algunos productos con
decrecimiento de otros. Por ejemplo, cuando se disminuye la expresión de la enzima
ramificante del almidón (BE), se produce almidón con un mayor contenido de amilosa.
El incremento en la acumulación de almidón puede lograrse sobrexpresando enzimas
heterólogas que no son reguladas por los mecanismos endógenos de la planta. Para
modificar el balance amilosa/amilopectina, se puede reducir la expresión de las
enzimas involucradas expresando transcriptos antisentido o induciendo el
silenciamiento génico postranscripcional del gen correspondiente.
En las transparencias 12 y 13 se muestran los resultados de un trabajo en que se
expresó un gen mutado de ADP-glucosa pirofosforilasa de Escherichia coli (gen
glgC16) en S. tuberosum. Las ADP-glucosa pirofosforilasas vegetales están
compuestas por tetrámeros. La fructosa 1,6-bifosfato y el Pi actúan como efectores
positivo y negativo, respectivamente, de esta enzima. La enzima de E. coli es
monomérica y no responde a los efectores que actúan en el tejido vegetal. Debido a
que en las plantas la biosíntesis de almidón ocurre en los cloroplastos, se agregó una
secuencia que codifica un péptido señal de transporte a cloroplasto (CPT) a la
construcción utilizada para la transformación. La secuencia se puso bajo el control del
promotor de 35S de CaMV. La enzima transgénica se procesó correctamente y resultó
activa en las células vegetales. Se transformaron plantas de Lycopersicon esculentum,
N. tabacum y S. tuberosum vía Agrobacterium tumefaciens. En el caso de Solanum, se
utilizó el promotor del gen de patatina, el que se expresa en forma específica en los
tubérculos. La transparencia 13 muestra el contenido de almidón en extractos de
callos de tabaco transformados con el gen glgC16.. Las líneas 1 a 6 expresan el
transgen; la línea 13 corresponde a una planta control no transformada. En una de las
líneas transgénicas se llegó a obtener 26,9% de almidón mientras que en plantas
controles el nivel fue de 3,4%. En la tabla, se muestran el incremento de la gravedad
específica promedio y del contenido de almidón en tubérculos transgénicos. Como
puede observarse, los tubérculos de las líneas transgénicas contienen un 35% más de
almidón que en controles.
Las transparencias 14 y 15 muestran un ejemplo de modificación de la composición
del almidón. El almidón de alta amilosa tiene gran demanda industrial por sus
propiedades funcionales y existen pocos cultivos que lo producen naturalmente. Por
esta razón, se transformaron plantas de S. tuberosum con una secuencia antisentido
del gen de la enzima ramificante del almidón obtenida de esta especie. Se comprobó
la casi total inhibición de las dos isoformas de la enzima (codificadas por los genes sbe
A y sbe B). La morfología de la planta no resultó alterada; en cambio, los tubérculos
adquirieron una morfología más alargada. El nivel de Pi en el almidón se incrementó
en más de 5 veces. La inhibición simultánea de SBE A y SBE B afectó la estructura del
almidón, así como también a la de los gránulos. Los gránulos de almidón de las
plantas controles fueron ovalados, con bordes suaves, y mostraron birrefringencia bajo
la luz polarizada, un indicador de ordenamiento cristalino (A). La mayoría de los
gránulos de las líneas de alta amilosa exhibieron menos birrefringencia, lo que
indicaba una reducción en la estructura cristalina, y poseían bordes irregulares con
fisuras profundas en el centro del gránulo (B). Los cambios en la estructura y
composición granulares condujeron a alteraciones en las propiedades del almidón. Los
gránulos de almidón control comenzaban a hincharse a 70oC y formaron una pasta
viscosa después de alcanzar los 95oC (C). Los gránulos de alta amilosa mostraron un
incremento en la temperatura de empastamiento acorde a sus niveles de amilosa, pero
la hinchazón del granulo resultó completamente inhibida cuando este nivel fue mayor
del 55% (D).
La transparencia 16 muestra las rutas de biosíntesis que conducen a la formación de
distintos hidratos de carbono. Las rutas normales de las células vegetales se
esquematizan mediante flechas negras, mientras que aquellas modificadas por la
introducción de genes de otros organismos se esquematizan con flechas rojas. La
sacarosa es sintetizada vía UDP-glucosa a partir del depósito de hexosas-fosfato en el
citoplasma y almacenada en la vacuola. En este compartimiento, puede ser
transformada en fructanos por introducción de levano-sacarasas o fructosiltransferasas de distinto origen. La UDP-glucosa y la glucosa 6-fosfato pueden ser
utilizadas como precursores para formar trehalosa por transformación de la planta con
trehalosa sintetasas de otras plantas, hongos, insectos, etc. La glucosa 6-fosfato
puede usarse también como precursor de azúcares-alcoholes (manitol, pinitol)
mediante la transformación con enzimas apropiadas. En las hojas, la triosa-fosfato es
transportada al interior de los cloroplastos, donde es convertida a hexosas-fosfato y
luego a ADP-glucosa para la síntesis del almidón. Las ciclodextrinas no se producen
en las plantas, pero el almidón puede ser usado como sustrato por algunas enzimas
bacterianas involucradas en su síntesis.
Existen muchos hidratos de carbono de interés comercial que son producidos sólo por
algunas plantas (manitol, pinitol) y/o por microorganismos (fructanos, ciclodextrinas).
Los compuestos que se refieren en la transparencia 17 han sido sobrexpresados en
plantas modelo y/o cultivos agronómicos por técnicas de ingeniería genética. Como el
almidón y la sacarosa, los fructanos están naturalmente presentes como reserva de
carbohidratos en muchas plantas (algunas de las cuales comemos). Los fructanos, o
polifructosilsacarosas, son polímeros de fructosa que derivan de la sacarosa. Los
fructanos son producidos por alrededor del 15% de las especies de plantas con flores,
como también por bacterias y hongos. En las pasturas, los fructanos son almacenados
principalmente en la bases de las hojas y usados para el rebrote luego de la
defoliación, mientras que el almidón es almacenado en semillas. En contraste con el
almidón, el que es almacenado en organelas especializados (plástidos), los fructanos
son sintetizados y almacenados en las vacuolas de las células vegetales. En otras
plantas, los fructanos se almacenan en órganos especializados, como por ejemplo en
la raíz principal de achicoria (Cichorium intybus), en los tubérculos de dalia (Dahlia
variabilis), y en los bulbos del tulipán (Tulipa gesneriana) y de la cebolla (Allium cepa).
La transparencia 18 muestra un ejemplo de expresión de fructanos y levanos en
plantas de S. tuberosum. Con este fin, se realizaron construcciones que contenían los
genes sacB de Bacillus subtilis o ftf de Streptococcus mutans fusionados a una
secuencia señal de transporte a vacuola obtenida del gen de la carboxipeptidasa Y de
levadura (cpy). Las construcciones se pusieron bajo la dirección del promotor
constitutivo 35S del CaMV. Estas construcciones se introdujeron en plantas de S.
tuberosum.
La transparencia 19 muestra una comparación del contenido de almidón en
microtubérculos de plantas controles y transformadas en relación con el contenido de
fructanos de las plantas transformadas. Como se muestra en la gráfica, los
microtubérculos que acumularon altos niveles de fructanos (plantas transformadas KP)
mostraron severas reducciones en el contenido de almidón, con niveles que
alcanzaron un tercio de los observados en las plantas controles (un promedio de 64,9
mg de almidón/g de peso fresco en microtubérculos sin transformar versus 18,9 mg/g
en microtubérculos de plantas transformadas con el gen sacB). Las plantas
conteniendo el gen ftf exhibieron un contenido más bajo de fructano y niveles menos
reducidos de almidón. La transparencia 20 muestra resultados del mismo trabajo. Se
determinó el contenido de fructano y almidón en hojas jóvenes, de mediana edad y
viejas, en plantas controles y transgénicas conteniendo el gen sacB (gráfico de la
derecha). En las plantas controles de mediana edad se observaron los mayores
contenidos de almidón. El análisis del contenido de fructanos en las plantas
transgénicas reveló que los fructanos se acumulaban durante todo el desarrollo de la
hoja. Los más altos niveles de fructano se alcanzaron en las hojas más viejas, pero las
hojas jóvenes y de mediana edad también presentaron incrementos significativos. La
acumulación de fructanos en las hojas viejas alcanzó hasta un 30% del peso seco. La
acumulación de fructanos afectó dramáticamente el total de carbohidratos no
estructurales en las hojas de las plantas de Solanum (gráfico de la izquierda). Esto
demuestra que el metabolismo de los carbohidratos en hojas también es afectado.
Otra especie transformada con un gen de la fructosil-transferasa fue la remolacha
azucarera (Beta vulgaris). Se transformaron plantas con el gen 1-sst que codifica una
1-sacarosa:sacarosa fructosil transferasa aislada de Helianthus tuberosus
(transparencias 21 y 22). En H. tuberosus, la 1-SST media los primeros pasos en la
síntesis de los fructanos de bajo peso molecular (GF2, GF3 y GF4). En la raíz de las
plantas de B. vulgaris transformadas, la sacarosa fue convertida en su casi totalidad
en estos fructanos. En contraste, la expresión del gen 1-sst en las hojas resultó en
bajos niveles de fructanos. A pesar de que la composición de los carbohidratos de
almacenamiento resultó alterada, la expresión del gen 1-sst no produjo cambios
visibles en el fenotipo ni afectó la tasa de crecimiento de las raíces.
Modificaciones en las rutas de síntesis de ácidos grasos
Transparencias 23-35
En forma similar a los hidratos de carbono, los ácidos grasos de distintos tipos se
producen en grandes cantidades a partir de los cultivos oleaginosos como colza
(canola), soja y maíz, tanto para propósitos industriales como alimentarios. La
ingeniería metabólica ha comenzado a jugar un rol importante en el mejoramiento de
estos cultivos, ya sea incrementando la producción de ácidos grasos existentes como
en el diseño de nuevos productos. La canasta tradicional de oleaginosas está
compuesta principalmente por trece cultivos: algodón, coco, colza, girasol, lino, maíz,
maní, oliva, palma de aceite, palmiste (palma kernel), ricino, soja y sésamo (ajonjolí).
La de grasas animales la componen la manteca de cerdo, el sebo, la manteca
(mantequilla) y los aceites de pescados. En la tabla de la transparencia 24 se
muestran los valores de la producción mundial de aceites y grasas desde 1990 al
2002. Puede observarse que los aceites de soja, palma, colza y girasol representan el
67% de la producción mundial de grasas y aceites en el acumulado 1998-2002. En
este cuadro no se tiene en cuenta la producción de grasa de cerdo, de aves de corral,
de pescado, de otras grasas animales y de sebo. En quinto lugar está ocupado por el
ghee, una mantequilla líquida clarificada por evaporación. La posición número 14
incluye aceites y grasas derivadas de peces y afines, excluyendo mamíferos.
Los constituyentes primarios de los aceites y las grasas son los triacilgliceroles
(TAGs), los cuales están compuestos por ácidos grasos y glicerol. Los TAGs que son
líquidos a temperatura ambiente son denominados aceites, mientras que aquellos que
son sólidos bajo estas condiciones son conocidos como grasas. La composición de
ácidos grasos de los TAGs determina el rango de aceites y grasas para propósitos
nutricionales. Ello permite discriminar entre los lípidos que son considerados
colesterogénicos y aquellos que no lo son. Los ácidos grasos de propiedades
especiales abren un gran campo de aplicaciones técnicas para la síntesis oleoquímica.
Estas aplicaciones no nutricionales dependen de la composición de ácidos grasos de
los TAGs y, en particular, de la disponibilidad de residuos grasos homogéneos. Han
sido descriptos más de 210 tipos diferentes de ácidos grasos en semillas y frutas de
plantas, pero sólo a unos pocos se les ha encontrado una aplicación no alimentaria.
Ejemplos de ellos son el ácido láurico (C12:0), el cual es ampliamente usado para la
producción de detergentes y surfactantes; los ácidos linoleico y linolénico (9,12
C18:2, 9,12,15 C18:3) usados en pinturas, barnices y coberturas; el ácido ricinoleico
(9,12 OH-C18:1) para coberturas y lubricantes y el ácido erúcico (13 C22:1) como
lubricante, agente antideslizante y como precursor de la síntesis de Nylon entre otras
cosas. Los ejemplos que se describen en la transparencia 25 muestran las principales
características que se tienen en cuenta en la clasificación de los ácidos grasos: a)
variación en la longitud de la cadena; b) variación en la posición números de dobles
ligaduras y c) sustitución por grupos funcionales.
La transparencia 26 muestra un esquema general de los pasos implicados en las rutas
biosintéticas de los ácidos grasos. Las enzimas individuales de síntesis de ácidos
grasos polimerizan en forma secuencial unidades de C2 derivadas de acetil-CoA a
una cadena acil en crecimiento, la cual está unida a una pequeña proteína (proteína
transportadora de acilos; ACP). En una serie de 7 ciclos de condensación, se produce
un acil-tioester de C16:0, palmitoil-[ACP], lo que requiere, entre otras actividades, de la
acción de una enzima de condensación (-cetoacil-[ACP] sintetasa I; KAS I). La
terminación prematura de la cadena por clivaje tiolítico de los intermediarios de acil[ACP] mediante la expresión de acil-[ACP] tioesterasas específicas puede resultar en
la producción de ácidos grasos de cadenas cortas e intermedias C8:0-C14:0. El
palmitoil-[ACP] es el punto de partida para la producción de ácido petroselínico en
semillas de coriandro. En muchos tejidos vegetales en que se acumulan lípidos, el
palmitoil-[ACP] es elongado a estearoil-[ACP] C18:0 por una KAS II específica. La
desaturación de estearoil-[ACP] a oleoil-[ACP] es catalizada por una enzima soluble, la
9-estearoil-ACP desaturasa, presente en el plástido. La sobrexpresión de esta
enzima resulta en la producción de aceites con alto contenido de ácidos grasos
insaturados y con bajos niveles de ácido esteárico. En general, el ácido graso
producido en mayor cantidad en las plantas es el ácido oleico, el que es liberado por la
acción de la oleoil-[ACP] tioesterasa y activado a oleoil-CoA por una acil-CoA sintetasa
en la envoltura externa del cloroplasto mientras es exportado al retículo endoplásmico.
El ácido oleico es incorporado en TAGs de almacenamiento durante la maduración de
la semilla. En la membrana del retículo endoplásmico, se encuentran enzimas que
introducen diversas modificaciones tales como insaturaciones (desaturasas
específicas),
hidroxilaciones,
conjugaciones,
epoxidaciones,
acetilaciones,
elongaciones y reducciones.
La tabla de la transparencia 27 describe la composición de ácidos grasos de aceites
obtenidos de algunos cultivos de interés comercial. La tabla de la transparencia 28
muestra ejemplos de ácidos grasos no comestibles simples o conjugados y de las
especies vegetales que los producen. El tratamiento de ácido erúcico y de ácido
petroselénico con ozono da origen a productos de interés para la industria. El ácido
láurico es utilizado para la fabricación de detergentes, surfactantes y shampúes. Los
ácidos dicarboxílico y brassílico pueden emplearse para la producción de Nylon.
La transparencia 29 enumera los principales objetivos perseguidos en la modificación
de ácidos grasos mediante ingeniería genética. Los perfiles de ácidos grasos pueden
modificarse para obtener distintas proporciones de ácidos grasos saturados,
monoinsaturados, de cadena media o con distintas sustituciones. Para ello, se
introducen en la planta los genes de las enzimas apropiadas o se inhibe (mediante
introducción de genes antisentido o silenciamiento génico) la expresión de las enzimas
endógenas responsables del paso biosintético involucrado.
Los aceites con alto contenido de ácidos grasos saturados como palmítico y esteárico
tienen gran demanda industrial, ya que son utilizados para la fabricación de jabones,
detergentes y cosméticos. La mayoría de las plantas producen aceites con bajo
contenido de ácidos grasos saturados. En las transparencias 30 a 32, se presenta un
ejemplo en el que se modificó el perfil de ácidos grasos en semillas de Brassica napus
y Brassica rapa con el objeto de incrementar la producción de ácido esteárico. Con tal
fin, se realizaron construcciones con genes antisentido de la estearoil-ACP desaturasa
de B. rapa para reducir la síntesis de ácidos grasos insaturados. Este procedimiento
permite inhibir, total o parcialmente el siguiente paso de síntesis.
estearil-ACP-desaturasa
18:0- ACP
---------------------------------------- 18:1-ACP
(estearoil-ACP)
+ O2
(oleoil-ACP)
+ ferredoxina
Las construcciones antisentido fueron puestas bajo la regulación de genes que se
expresan durante el llenado de la semilla, es decir durante el período de máxima
síntesis de ácidos grasos.
La transparencia 31 muestra los perfiles de ácidos grasos en semillas de las plantas
transgénicas obtenidas con las construcciones previamente descriptas. Se observó
que las semillas de la línea 3242-T-1 contenían hasta un 32% de estearato. En base a
los niveles de estearato, se dividió a las semillas en dos grupos que correspondían a la
segregación mendeliana del transgen: con alto estearato y con niveles normales de
estearato. En las gráficas se observan los perfiles de la composición de ácidos grasos
de cada grupo. Se analizaron 50 semillas maduras de la línea 3242-T-1. De ellas, 21
resultaron contener alto estearato (niveles que variaban entre 21,5% a 32%), y 29
resultaron con niveles equivalentes a las plantas control (Tobin) sin transformar
(niveles entre 1,0-1,6%). El incremento de estearato fue acompañado por un descenso
en los niveles de ácido oleico, el producto de reacción de la estearil-ACP desaturasa.
La transparencia 32 muestra un análisis de extractos de 10 semillas de la planta
transgénica 3242-T-1 y de 10 semillas de una planta control para determinar los
niveles de desaturasa y el contenido de estearato. El fenotipo de alto estearato se
correlacionó con una marcada reducción de la enzima en el análisis de Western blot.
Por el contrario, las semillas 3242-T-1 (segregantes no transgénicos) o las semillas
control no transformadas (Tobin), exhibieron niveles no normales de estearato y de
expresión de la enzima.
Los aceites compuestos con ácidos grasos saturados de cadena media también son
utilizados en la industria cosmética para la fabricación de jabones, champúes, etc.
Estos ácidos grasos están presentes en algunos cultivos como palma, cocotero,
Cuphea, pero no en las semillas de los cultivos extensivos. La transparencia 33
muestra un ejemplo en el cual se cambió el perfil de ácidos grasos en detrimento de
los de cadena larga y en favor de los de cadena media. La 12:0 acil-ACP-tioesterasa
es una enzima que interrumpe el proceso de elongación de los ácidos grasos para
producir ácido láurico (C12:0). En el trabajo que se presenta, se transformó
Arabidopsis thaliana con el gen de la 12:0 acil-ACP-tioesterasa de Umbellinaria
californica. La actividad de la tioesterasa se midió en conjuntos de 40 semillas
maduras obtenidas de las plantas transgénicas. La actividad de la enzima en las
plantas transgénicas varió entre 300 y 1.000 mU por semilla. En contraste, las plantas
control exhibieron actividades promedio de 7 mU de por semilla. Como se muestra en
la tabla, el laurato se acumuló en las semillas de plantas transformadas y permaneció
ausente en plantas de Arabidposis no transformadas. En la transparencia 34 se
analiza el perfil de ácidos grasos en 100 semillas maduras de cada planta por
cromatografía gas-líquido. Las plantas transformadas exhibieron un alto contenido de
ácido láurico y un descenso concomitante de algunos ácidos grasos de cadena larga
( 16). La única excepción fue el linolenato, el que no fue afectado por la acción de la
enzima introducida. El total de ácidos grasos por semilla permaneció sin cambios.
Debido al amplio conocimiento disponible sobre la síntesis de ácidos grasos en
distintos organismos, dentro de las limitaciones que imponen los efectos fisiológicos no
deseados, es posible cambiar el perfil de ácidos grasos de una especie vegetal en un
rango muy amplio de composiciones. La tabla de la transparencia 35 muestra
ejemplos de modificaciones introducidas en B. napus (colza), uno de los cultivos en
que más trabajo se ha realizado al respecto. El aceite producido por las semillas de B.
napus posee un alto contenido de ácido erúcico, lo que lo torna inadecuado para usos
alimentarios. La supresión de la expresión de la oleoil-CoA-elongasa en una mutante
natural seleccionada por mejoramiento clásico permitió eliminar la producción de ácido
erúcico y desarrollar el cultivo comercial (canola, por canadian oil). El aceite de canola
posee un alto contenido de ácido oleico (62%) y niveles elevados de aceites omega 6
y 3 (22% y 10%, respectivamente). La introducción por ingeniería genética de distintas
tioesterasas, desaturasas, elongasas y secuencias antisentido (listadas en la tabla) en
este cultivo ha permitido cambiar su composición de ácidos grasos en forma
sustancial. Trabajos similares han sido efectuados en la soja (Glycine max). Algunas
de estas variedades transgénicas han ingresado ya en la etapa comercial.
Modificaciones en las rutas de síntesis de aminoácidos
Transparencias 36-45
Los animales, incluyendo al hombre, son incapaces de sintetizar 10 de los 20
aminoácidos requeridos para la síntesis de proteínas, por lo que estos aminoácidos
“esenciales” deben ser obtenidos de la dieta. Los alimentos para animales se
complementan muchas veces con aminoácidos puros producidos en bacterias por
fermentación para obtener un balance adecuado. Un objetivo importante de la
biotecnología vegetal ha sido crear variedades con una mejor composición
aminoacídica de las semillas para mejorar la nutrición de humanos y animales
domésticos. Los blancos más importantes han sido el contenido de lisina en los
cereales y el de metionina en las leguminosas. Existen al menos tres estrategias para
cambiar la composición aminoacídica de las semillas: a) alterar la regulación de las
rutas de síntesis de los aminoácidos esenciales suprimiendo la inhibición por alta
concentración de producto; b) sobrexpresar proteínas foráneas con mejor composición
aminoacídica en semillas o frutos de interés; c) modificar las secuencias de las
proteínas de reserva propias del cultivo de interés introduciendo secuencias ricas en
aminoácidos esenciales (transparencia 37). Esto último permite evitar la introducción
de genes de proteínas foráneas, cuya acumulación en muchos casos va en detrimento
de la morfología y viabilidad de las semillas.
La transparencia 38 muestra un esquema de las vías de síntesis de lisina, metionina y
treonina y de los mecanismos de regulación negativa que actúan en las distintas rutas.
La lisina al igual que la treonina, metionina e isoleucina, son aminoácidos derivados de
aspartato. El primer paso de la vía de síntesis de estos aminoácidos es la fosforilación
del aspartato por la enzima aspartato kinasa (AK), la que es regulada negativamente
por la acumulación de lisina. La dihidrodipicolinato sintetasa (DHDPS) es la primera
enzima comprometida en la ruta de la síntesis de lisina y es también regulada
negativamente por acumulación de este aminoácido. Por su parte, la acumulación de
treonina también regula negativamente la actividad de AK. La expresión de genes
heterólogos de estas enzimas insensibles a la regulación por acumulación de
producto, en forma individual o conjunta, ha sido utilizada para variar la composición
de estos aminoácidos esenciales en semillas de cereales y leguminosas.
Como un ejemplo de la estrategia descripta, se presenta el caso de la transformación
de soja (Glycine max) con genes heterólogos para incrementar el contenido de lisina
(transparencias 39 y 40). El gen de dihidrodipicolinato sintetasa (DHDPS) de
Coynebacterium glutamicum (gen dapA) y el gen mutado de aspartato kinasa (AK) de
Escherichia coli (gen lysC) son insensibles a la inhibición por lisina. Ambas secuencias
se clonaron bajo la dirección de un promotor específico de semilla (promotor de
faseolina [Pv5’], aislado de Phaseolus vulgaris) y se ligaron a secuencias que codifican
péptidos señal de transporte al cloroplasto (organela en que está localizada la síntesis
de lisina, metionina y treonina). Ambas construcciones, acompañadas por el gen uidA
(gus) como gen reportero, se introdujeron en plantas de soja mediante biobalística.
Las construcciones fueron introducidas también en plantas de canola por cotransformación vía A. tumefaciens. Las plantas fueron autopolinizadas para obtener
líneas homocigotas. La expresión del gen dapA produce un incremento de lisina libre
unas 100 veces mayor en canola y de hasta 25% mayor en soja. La expresión de
ambos genes, aumentó varios cientos de veces los niveles de lisina libre y hasta 5
veces el total de lisina en semillas de soja. La transparencia 40 muestra algunos de los
resultados obtenidos en este trabajo. Se extrajeron los aminoácidos libres de 10
semillas segregantes R1 para cada línea transgénica y se determinó su composición.
En el gráfico se compara la línea A2396-145 (barras violetas) con la línea A2396-183
(barras verdes). Ambas líneas expresan los dos transgenes y se indica la
determinación de -glucuronidasa (GUS), dihidrodipicolinato sintetasa (DHDPS) y
aspartato kinasa (AK). Se observa un incremento significativo de lisina libre cuando las
semillas expresan los dos transgenes. Las semillas de la generación R2 exhiben los
más altos niveles de lisina libre cuando ambos genes están en homocigosis. Los
niveles de acumulación de lisina libre se incrementaron de 10 a 100 veces en las
distintas líneas transgénicas.
Las dietas basadas en semillas de leguminosas generalmente contienen un adecuado
suplemento de lisina, pero son deficientes en aminoácidos azufrados como metionina
y cisteína. La tabla superior de la transparencia 41 muestra que las semillas de
leguminosas poseen un bajo contenido de metionina mientras que las de otras
especies, como maíz (Zea mays), nuez de Brasil (Bertholletia excelsa) y girasol
(Helianthus annuus), son ricas en este aminoácido. Los niveles de aminoácidos
sulfurados en todos los cultivos mencionados varían entre las distintas variedades. El
requerimiento de metionina para el crecimiento animal es 1,6-1,9 g por 100 g de
proteína total. La tabla inferior enumera cultivos en los que fueron introducidos genes
de proteínas ricas en metionina con el propósito de incrementar su contenido en este
aminoácido. Se detallan los genes que fueron utilizados y los niveles alcanzados. La
albúmina 2S de B. excelsa se utilizó exitosamente para incrementar el contenido de
metionina de soja y canola (transparencias 42 y 43). Sin embargo, esta proteína
demostró poseer propiedades alergénicas, por lo que se decidió detener toda
investigación posterior. La albumina 2S de H. annuus no es alergénica, por lo que el
gen correspondiente se ha convertido en un candidato de elección para efectuar este
tipo de modificaciones.
El cerdo es un buen ejemplo de cría intensiva que utiliza alimentos de origen vegetal.
Para un crecimiento óptimo, este animal requiere que el 3,5% de la proteína dietaria
esté compuesta de aminoácidos sulfurados, de los que por lo menos el 1,6% debe ser
metionina. Se han desarrollado plantas transgénicas de canola (B. napus), haba (Vicia
narbonensis) y lupino (Lupinus angustifolius) en las que se expresaron genes de
proteínas foráneas ricas en metionina y se enriqueció el contenido de este aminoácido
en las semillas. En algunos casos la modificación genética permite satisfacer el nivel
óptimo de crecimiento sin el agregado de suplementos externos.
Las transparencias 44 y 45 presentan otro ejemplo en que se transformó un cultivo de
interés alimentario con una proteína de reserva foránea para cambiar el perfil de la
composición aminoacídica. S. tuberosum es la cuarta producción alimentaria mundial.
Los aminoácidos esenciales que limitan su valor nutritivo son la lisina, la tirosina y los
aminoácidos sulfurados. La albúmina AmA1 de Amaranthus hypocondriacus no es
alergénica y es una proteína cuya composición está bien balanceada en términos de
aminoácidos esenciales. Se diseñaron dos construcciones genéticas que permitieron
la expresión constitutiva (promotor 35S de CaMV); serie de plantas pSB8) o tubérculoespecífica (promotor GBSS de la sintetasa de almidón unida al gránulo; serie de
plantas pSB8G) del gen AmA1. Se transformaron plantas de S. tuberosum con ambas
versiones del gen AmA1 utilizando el sistema basado en Agrobacterium. Se
observaron incrementos en prácticamente todos los aminoácidos. Se analizó el
contenido de aminoácidos en tubérculos de 2 líneas que mostraron altos niveles de
expresión del gen AmA1, una en la que la expresión era constitutiva (línea pSB8-3) y
otra en que la expresión era específica de tubérculo (línea pSB8G-5). En ambas
líneas, el contenido de lisina, metionina, cisteína y tirosina se incrementó en forma
significativa respecto de las plantas control. La línea que expresaba la proteína en los
tubérculos en forma tejido-específica exhibió mayores incrementos en la composición
de aminoácidos (gráfico de la derecha). El contenido de proteínas de los tubérculos se
incrementó entre un 35-45%. También se observó que las plantas transgénicas
exhibían un aumento en el tamaño y el número tubérculos por planta.
Modificaciones en las rutas de síntesis de hormonas
Transparencias 46-52
La senescencia en plantas está regulada por un programa genético coordinado por
cambios en el contenido de hormonas como el etileno, el ácido abscísico (ABA) y las
citoquininas. La senescencia de las flores y la maduración de los frutos se acelera
luego del corte debido a la producción de estas hormonas, lo que reduce su tiempo de
comercialización. La inhibición de su síntesis por técnicas de ingeniería genética
permite evitar su formación y retrasar los eventos de maduración y senescencia. El
etileno es esencial para el desarrollo, crecimiento y supervivencia de las plantas. Es la
hormona responsable de señalizar los cambios en las semillas durante la germinación,
el desarrollo de flores y frutos, el inicio de ciertos mecanismos de defensa de las
plantas, y participa en un número importante de interacciones con otras hormonas de
plantas. Al comienzo de la maduración de los frutos se producen altos niveles de
etileno en casi todos los tejidos de la planta. La síntesis de esta hormona utiliza como
precursor S-adenosil metionina (SAM), compuesto que deriva de la metionina
transparencia 47). Este compuesto actúa además como precursor en muchas otras
rutas y, por lo tanto, es abundante en diversos tejidos. La enzima ácido 1aminociclopropano-1-carboxílico sintetasa (ACC sintetasa) convierte SAM en ácido 1aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) y 5´-metiltioadenosina (MTA), y esta última es
luego reciclada a L-metionina. El último paso de esta vía de síntesis es la conversión
de ACC a etileno mediante la intervención de la enzima 1-aminociclopropano-1carboxílico oxidasa (ACC oxidasa). Se ha establecido que la ACC sintetasa y la ACC
oxidasa presentan varias isoformas que se activan en distintas condiciones
fisiológicas. Ambas enzimas son inducibles durante la maduración de los frutos.
Las estrategias más utilizadas para arrestar la síntesis de etileno se basan en la
introducción de genes antisentido de las enzimas ACC sintetasa y/o ACC oxidasa.
Otra alternativa que también ha sido implementada es la expresión de genes de
enzimas que degraden el ACC, como la ACC deaminasa aislada de Pseudomonas
spp. Esta enzima degrada al ACC en -cetobutirato y NH3. Las transparencias 48 a 50
y muestran ejemplos de cultivos en que se ha inhibido la producción de etileno para
evitar la senescencia y la maduración de los frutos. Se transformaron melón, tomate,
clavel, brócoli y tabaco con genes antisentido de ACC-oxidasa o de ACC-sintasa de
distintas especies y de ACC-deamina de Pseudomonas spp. En el caso del melón se
inhibió la producción de etileno utilizando un gen antisentido de ACC-oxidasa de
manzana. Las plantas controles produjeron hasta un 340% más de etileno que las
plantas transgénicas.
En la figura superior de la transparencia 49 se muestran frutos de melón (Cucumis
melo) obtenidos a partir de plantas transformadas con el gen antisentido de la ACCoxidasa de manzana (AS1) y frutos control no transformados a los 15 d post-cosecha.
Las plantas transformadas permanecen sin madurar, mientras que los controles
maduran normalmente. Además, el sabor y el aroma se preservaron mejor en los
melones transformados. La figura inferior muestra plantas de clavel (Dianthus
caryophyllus L; cv White Sim) transformadas con un gen antisentido de ACC oxidasa
dirigido por el control del promotor de 35S de CaMV. La senescencia de la flor se
retarda en la planta transgénica (izquierda) en comparación con la control (derecha).
Las dos flores tienen 8 d de post-cosecha.
Se han implementado diferentes estrategias para evitar la maduración de los frutos del
tomate. En la transparencia 50 se muestran resultados de trabajos en que se ha
inhibido la producción de etileno utilizando genes antisentido de ACC sintetasa y de
ACC oxidasa o un gen de ACC deaminasa. En las fotografías superiores se observan
los resultados obtenidos mediante transformación con ACC sintetasa. De izquierda a
derecha, se muestran frutos de plantas control mantenidos en aire por 60 d, de plantas
transgénica mantenidos en aire por 78 d, y de plantas transgénicas mantenida en
atmósfera de 10 ppm de etileno por 78 d. En las fotografías centrales se observan
resultados obtenidos mediante transformación con ACC oxidasa. De izquierda a
derecha, se muestran frutos de planta no transformadas mantenidos en aire, de
plantas transgénicas mantenidos en aire y de plantas transgénicas mantenidos en
atmósfera de 10 ppm de etileno. Por último, en las fotografías inferiores se observan
resultados obtenidos mediante transformación con el gen de ACC deaminasa. Se
muestran frutos de tomate de una planta no transformada (izquierda) y de planta
transgénica (derecha) mantenidos a 20oC en aire por 138 d.
Las transparencias 51 y 52 muestran otra estrategia implementada para evitar la
senescencia de las flores. Como se ha dicho, la senescencia en plantas está regulada
por un programa genético coordinado que es mediado por cambios en el contenido de
etileno, ácido abscisico (ABA) y citoquininas. La isopentenil transferasa (ipt) es la
enzima limitante en la síntesis de citoquininas y su sobrexpresión durante la
senescencia incrementa el nivel de estas hormonas y retrasa este proceso. En el
trabajo que se presenta en la transparencia, se expreso el gen ipt de A. tumefaciens
para retrasar la senescencia de flores de Petunia x hybrida cv V26. El gen fue puesto
bajo el control del promotor específico de senescencia SAG12 (construcción PSAG12IPT).
La transparencia 52 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Se
observó que en las líneas transformadas la senescencia de las flores se retrasó de 6 a
10 días luego de su polinización respecto de las flores control. El nivel de los
transcriptos de ipt se incrementó notablemente luego de la polinización y ello fue
acompañado por un incremento de citoquininas. La acumulación de ABA y de otras
hormonas que regulan la senescencia de la flor, fue significativamente mayor en las
corolas de las plantas controles.
Metabolitos secundarios
Transparencias 53-60
Los metabolitos presentes en las plantas pueden ser divididos en dos grupos
fundamentales: los metabolitos primarios (proteínas, ácidos grasos y carbohidratos),
que sostienen los procesos bioquímicos esenciales de la célula, y los metabolitos
secundarios, (compuestos de muy diversa estructura química) que actúan como
mediadores en las interacciones entre las plantas y su medio ambiente. Los
metabolitos secundarios no poseen un rol aparente en el crecimiento o en el desarrollo
de las plantas y no son esenciales per se para sus funciones vitales, pero juegan un
rol importante para su supervivencia en los ecosistemas. Por ejemplo, muchos de
estos compuestos están involucrados en las interacciones plantas-microorganismos,
plantas-insectos y plantas-plantas. Asimismo, constituyen la respuesta química a los
polinizadores y dispersores de semillas, a los competidores y a los herbívoros, a los
patógenos y a los estreses abióticos. En general los metabolitos secundarios son
específicos de especie. Por otro lado, suelen producirse en forma tejido-específica y
en estructuras especializadas. Según sus características químicas, los metabolitos
secundarios pueden clasificarse en tres grupos principales: a) terpenos (compuestos
lipídicos); b) fenoles (compuestos derivados de carbohidratos) y c) alcaloides
(compuestos derivados de aminoácidos).
Los metabolitos secundarios son necesarios (o al menos beneficiosos) para la
supervivencia de las plantas en su medio ambiente (transparencia 55). Forman parte
del sistema de defensa de la planta y están involucrados en la resistencia a pestes y
enfermedades a través de la producción de fitoalexinas y fitoanticipinas. Se definen
como fitoanticipinas aquellos metabolitos preexistentes en la planta (toxinas
preformadas) que pueden ser activados en respuesta a enfermedades. Las
fitolaexinas comprenden metabolitos que son sintetizados de novo y se acumulan en
grandes concentraciones después de una infección fúngica o bacteriana, ayudando así
a limitar el desarrollo del patógeno.
Alelopatía: cualquier efecto directo o indirecto, benéfico o perjudicial de una planta o microorganismo
sobre otro a través de la producción de compuestos químicos secretados al medio ambiente.
Aleloquímicos: biomoléculas no nutricionales producidas por un organismo y secretadas al ambiente que
influyen en el crecimiento, desarrollo, salud y comportamiento de otro(s).
La transparencia 56 resume las principales propiedades biológicas de los metabolitos
secundarios que son de interés económico por sus aplicaciones en la salud y otros
sectores productivos. Los terpenoides (transparencia 57) tienen numerosas
aplicaciones en la industria de alimentos. Por ejemplo, los monoterpenos determinan
el aroma de los componentes de los aceites esenciales de numerosas hierbas, como
la menta y la albahaca. Los carotenoides se emplean como colorantes en la industria
cosmética y alimentaria. Entre los flavonoides (transparencia 58) se encuentran
pigmentos diversos como las antocianinas, principales responsables de la coloración
floral. Por otro lado, los flavonoides e isoflavonoides son de interés en el mejoramiento
de la calidad nutricional de los alimentos debido a sus actividades antioxidantes y
anticancerígenas. Como ejemplos, entre estos compuestos pueden mencionarse los
flavonoides quercetina y epicatequina y el isoflavonoide genisteína. Los alcaloides
(transparencia 59) poseen potentes efectos farmacológicos debido a que son capaces
de atravesar las membranas celulares rápidamente. Dos de las principales y más
comunes sustancias activadoras del sistema nervioso central son alcaloides: la
nicotina (tabaco) y la cafeína (té, café y chocolate). El opio, la morfina y la codeína son
alcaloides que se encuentra en el látex del fruto de la amapola. Se han llevado a cabo
algunos trabajos tendientes a modificar por ingeniería genética la expresión de
alcaloides importantes para la industria farmacéutica. La biosíntesis de alcaloides del
indol ha sido una de las vías que más ha sido estudiada, debido a que existen al
menos 15 alcaloides de este tipo de importancia industrial, entre los cuales se incluyen
los antitumorales vinblastina y vincristina usados para tratar distintos linfomas. Dentro
de los alcaloides del tropano, puede citarse a la escopolamina, compuesto con
actividad anticolinérgica de gran importancia medicinal.
Manipulación genética del metabolismo secundario
Transparencias 61-66
La ingeniería metabólica se puede definir como el re-direccionamiento de una o más
reacciones enzimáticas en una vía biosintética para producir nuevos compuestos,
aumentar la producción de compuestos preexistentes, o disminuir la producción de
compuestos no deseados. Se trata de un campo de aplicación relativamente nuevo
que es muy dependiente del conocimiento bioquímico y fisiológico. Como resultado del
uso de trazadores radioactivos, hacia 1975 se disponía ya de nociones generales
adecuadas sobre la relación producto-sustrato en muchas vías metabólicas. El
desarrollo rápido de este campo ocurrió a partir de la disponibilidad de herramientas
de biología molecular (clonado de genes, análisis de promotores, técnicas de
transformación, etc.), las que permitieron explorar los mecanismos moleculares que
regulan la producción de metabolitos secundarios. De esta forma, a partir de la década
de los 80, se logró un progreso significativo en la disección de muchas vías
biosintéticas y en la sobrexpresión de genes heterólogos, lo que permitió los primeros
avances. Desde entonces se han logrado numerosos resultados exitosos y un número
aún mayor de resultados no esperados. El conocimiento ganado ha conducido a
concebir el funcionamiento del metabolismo como el de una gran red de reacciones
químicas interrelacionadas, en que la modificación de un sólo componente puede
producir un impacto considerable en el metabolismo de todo el organismo. Aún así, el
metabolismo secundario es un blanco particularmente atractivo para mejorar el
rendimiento de un producto determinado sin que ello afecte marcadamente procesos
esenciales para la planta. Sin embargo, para lograr esto de una manera relativamente
controlada, no basta con conocer los componentes (enzimas y metabolitos) que
participan de una determinada vía metabólica, también se debe conocer la regulación
de esta vía (pasos limitantes, mecanismos de retroalimentación) y su relación con
otras vías biosintéticas (vías competitivas). También es importante conocer la
compartimentalización celular de la ruta en estudio y la participación de tejidos u
órganos especializados en la producción de determinados metabolitos.
La importancia económica de los metabolitos secundarios se ha acrecentado en los
últimos años, y ello ha estimulado el interés en el estudio de su metabolismo y, en
particular, en la modificación de ciertas rutas biosintéticas mediante técnicas de
ingeniería genética. Sin embargo, el progreso en este campo ha sido limitado
(transparencia 62). Una de las principales restricciones es que se conoce poco acerca
de la biosíntesis de muchos componentes de interés, mientras que en otros casos sólo
existen consideraciones teóricas sobre sus vías metabólicas. Las vías metabólicas a
nivel de genes, enzimas y productos sólo han sido mapeadas en detalle para los
flavonoides y las antocianinas. Para otras vías, sólo se conocen unas pocas enzimas y
sólo algunos genes han sido clonados. Por otro parte, pocas plantas han sido
estudiadas en profundidad en cuanto a su metabolismo secundario. Entre ellas, se
encuentran N. tabacum (antocianinas, flavonoides, terpenoides, alcaloides),
Catharantus roseus (alcaloides, flavonoides) y Cinchona (antraquinonas y alcaloides).
Esto constituye una importante limitación, ya que los metabolitos secundarios son
especie específicos. Esto implica que determinadas vías biosintéticas están presentes
y son características de determinadas especies y no de otras. Cuando el objetivo de la
modificación del metabolismo secundario es mejorar la calidad nutricional de un cultivo
comestible, es necesario considerar el riesgo de que la modificación realizada
conduzca a la producción de compuestos tóxicos no deseados. Para poder disminuir
este riesgo, se requiere conocer con la mayor precisión posible el perfil de los
metabolitos que produce la planta, lo que es corrientemente conocido como su
“metaboloma”. Sin embargo, no existen en la actualidad métodos que nos permitan
obtener este perfil en forma completa. En muchos casos, los métodos cromatográficos,
como la cromatografía gaseosa y la cromatografía líquida de alta resolución, separan
pobremente componentes con propiedades físicas muy distintas. La espectrometría
HNMR, que detecta todos los compuestos presentes con la misma sensibilidad, no
puede registrar compuestos minoritarios. De esta manera, para el análisis del
metaboloma se deberán utilizar simultáneamente diferentes métodos y, a su vez,
mejorar las técnicas actuales.
La ingeniería genética del metabolismo secundario tiene usualmente como objetivo
aumentar o disminuir la cantidad de un cierto compuesto o grupo de compuestos. En
general, lo que se intenta es aumentar la producción de un determinado compuesto en
plantas que normalmente lo producen, o transferir partes de una vía metabólica a
especies vegetales que no producen el metabolito en cuestión. El ejemplo más exitoso
en el que se ha aplicado esta última estrategia es la producción de -caroteno en arroz
(ver caso del “golden rice”). También es de interés la producción de nuevos
metabolitos que no son producidos naturalmente por las plantas. Para aumentar la
producción de un compuesto se utilizan básicamente dos estrategias: a) variar la
expresión de uno o varios genes con el fin de superar un paso metabólico limitante,
inhibir una vía metabólica competitiva o disminuir el catabolismo del compuesto blanco
y, b) variar la expresión de genes regulatorios (factores de transcripción) que controlan
múltiples vías de biosíntesis. Para disminuir los niveles de un producto no deseado,
pueden ser utilizadas diversas estrategias. Por ejemplo, un paso enzimático de una
determinada vía metabólica puede silenciarse por disminución de la expresión del
correspondiente ARNm, mediante la expresión del ARN antisentido, mediante
silenciamiento post-transcripcional (ARN de interferencia), o por sobrexpresión de un
anticuerpo contra la enzima blanco. La estrategia del ARN antisentido ha sido utilizada
con éxito para modificar los colores de las flores. Otras estrategias incluyen desvío del
flujo metabólico a una vía competitiva o aumento del catabolismo del compuesto
blanco.
Los factores de transcripción son proteínas que modifican la expresión de los genes
por unión a secuencias específicas de ADN ubicadas en las regiones regulatorias de
los mismos (transparencias 64 y 65). Muchos factores de transcripción permiten el
control de la expresión de múltiples genes dentro de una misma vía metabólica. Entre
los primeros factores de transcripción descriptos en plantas se encuentran los factores
R y C1, los que están involucrados en el control de la biosíntesis de antocianinas de la
aleurona de maíz. La inducción de la vía de la síntesis de antocianinas en células
indiferenciadas de maíz pudo inducirse por sobrexpresión de estos dos factores de
transcripción. Asimismo, la sobrexpresión de estos factores en arroz produjo la
activación de la vía de síntesis de las antocianinas, lo que se tradujo en un aumento
de la resistencia del arroz a la infección por un patógeno fúngico. Este ejemplo
muestra que la acumulación de un producto natural puede modificarse por la
sobrexpresión de determinados factores de transcripción, aún en especies de plantas
heterólogas. Los factores de transcripción también pueden ser represores de la
acumulación de un producto natural. Por ejemplo el knocking out del factor de
transcripción MYB4 en frutilla llevó a la reducción de la pigmentación de las flores y a
la disminución de los niveles de antocianinas y flavonoles, sugiriendo que, en esta
especie, MYB4 actúa como un represor de ciertos pasos de la síntesis de flavonoides.
Se acepta actualmente que el control del flujo metabólico a través de una vía
biosintética se encuentra en más de un paso de esta vía. Estos “puntos” de control
(pasos limitantes) pueden ser modificados por condiciones ambientales, metabólicas o
del desarrollo y son, en última instancia, responsables de la productividad de la planta.
La distribución del control regulatorio hace que la modificación del metabolismo por
introducción o inhibición de unos pocos genes estructurales sea difícil de alcanzar. A
pesar de los esfuerzos realizados para identificar los pasos limitantes de diferentes
vías metabólicas, la sobrexpresión de genes sólo ha permitido obtener aumentos del
flujo metabólico de moderados a muy pequeños. Estos resultados contrastan con los
obtenidos con los factores de transcripción en que, por ejemplo, se han reportado
aumentos de hasta 25 veces en el nivel de antocianinas de hojas de tomate
sobrexpresando el factor de transcripción DELILA. Este efecto se debe a que los
factores de transcripción controlan en forma simultánea la expresión de la mayoría de
los genes comprendidos en una vía determinada, lo que permite eludir las
restricciones generadas por la existencia de pasos limitantes. Además, la modulación
del flujo metabólico utilizando factores de transcripción no requiere de la identificación,
aislamiento y caracterización molecular de los genes que componen la vía en cuestión.
Sin embargo, la modificación del metabolismo a través de la expresión de factores de
transcripción no es una panacea para resolver todos los problemas de la ingeniería
metabólica de plantas. Como es obvio, los factores de transcripción no pueden inducir
vías metabólicas que no están presentes en la planta, por lo que, en estos casos, es
necesario introducir todos los genes necesarios para recrear las mismas en las plantas
de interés. Por esta razón, la ingeniería genética de genes estructurales continuará
siendo necesaria para encarar muchos problemas.
La transparencia 66 enumera los principales objetivos que son usualmente
considerados al encarar la modificación genética de las principales vías del
metabolismo secundario (terpenoides, flavonoides y alcaloides). Cada uno de estos
objetivos será ilustrado mediante la presentación de ejemplos específicos.
Terpenoides
Transparencias 67-84
Los terpenoides son compuestos lipídicos derivados del isopreno. Los diferentes
lípidos isoprenoides se sintetizan a partir de la condensación de varias unidades de
isopreno activo (isopreno fosforilado). La adición de dos unidades de isopreno dan
lugar a distintos tipos de terpenos, de manera que se distinguen monoterpenos,
sesquiterpenos, diterpenos, etc., según contengan, respectivamente, dos, tres, cuatro,
etc., isoprenos. Además, entre ellos los hay acíclicos, ramificados y cíclicos y aquellos
que pueden contener otros grupos funcionales (cetona, alcohol). Algunos terpenos,
como el ácido abscísico y el ácido giberélico, que son reguladores del crecimiento de
la planta, forman parte del metabolismo primario.
Monoterpenos: los aceites esenciales contienen monoterpenos volátiles que son
almacenados en los pelos glandulares de la epidermis. Estas esencias volátiles o
aceites esenciales se obtienen de flores, de frutos, de hierbas y especias y son usados
en perfumes y saborizantes. Algunas de las plantas más utilizadas para la obtención
de este tipo de compuestos son: la menta (mentol) y el limón (limoneno). Algunas
plantas emiten terpenos volátiles después que los insectos se ha alimentado de ellas.
Estos atraen a los enemigos naturales del insecto predador y actúan como un
mecanismo de defensa contra el mismo. Los piretroides (Crisantemo spp.) son
monoterpenos con actividad insecticida que resultan ventajosos por su baja
persistencia en el medio ambiente y baja toxicidad para mamíferos.
Sesquiterpenos: los aceites esenciales de hierbas y especias también contienen
sesquiterpenos. Algunos sesquiterpenos actúan en los mecanismos de defensa de la
planta produciendo fitolaexinas como la rosina y otras sustancias repelentes de
herbívoros.
Diterpenos: Las resinas contienen diterpenos. Cuando los canales que transportan la
resina son dañados, la descarga de la resina sirve como una barrera química y física a
la alimentación de los insectos. Por otro lado, los diterpenos se polimerizan cuando la
resina es expuesta al aire y contribuye a sellar las heridas. Ciertos escarabajos de la
corteza han adquirido la capacidad de metabolizar los monoterpenos contenidos en la
resina de las coníferas, convirtiéndose en depredadores especializados. Algunos
diterpenos son muy importantes en aplicaciones medicinales. Una de las drogas más
potentes contra ciertos tipos de cáncer es un diterpeno, el paclitaxel (Taxol), obtenido
originalmente de la corteza del tejo del Pacífico (Taxus brevifolia).
Triterpenos: El algodoncillo de Siria (Asclepias syriaca) contiene triterpenos que se
acumulan en las larvas de las mariposas Monarca, un lepidóptero que se alimenta de
esta planta. En los adultos, los triterpenos son almacenados en las alas de la mariposa
y ello las vuelve tóxicas para sus depredadores, los pájaros. El triterpeno digitalis,
obtenido de la dedalera o digital (Digitalis purpurea), fortalece y aminora la contracción
del músculo cardíaco. Fue desarrollado como droga hacia el final del siglo XVIII
basándose en un remedio casero (té hecho con hojas de foxglove púrpura) y se usaba
para tratar la angina de pecho.
Tetraterpenos: Entre los tetraterpenos se encuentran los carotenoides, compuestos
que son de gran importancia como suplementos dietarios. Los carotenoides son
sintetizados de novo a partir de geranil difosfato por todos los organismos
fotosintéticos. Participan en la captación de la luz y en la protección por el exceso de
luz blanca. Muchas bacterias no fotosintéticas (Erwinia herbicola, Thermus aquaticus,
Deinococcus radiodurans) y hongos (Neurospora crassa, Phycomyces blakesleeanus)
sintetizan también carotenoides. En las plantas, los carotenoides se acumulan en
cloroplastos y en cromoplastos. Se puede encontrar un amplio rango de carotenoides
en los cromoplastos (por ejemplo, licopeno en fruto de tomate, -caroteno en raíces de
zanahoria, luteína y zeaxantina en endospermo de maíz).
Los aromas de los alimentos tienen una gran influencia en la elección de los mismos.
El aroma de los frutos y de los vegetales son mezclas de metabolitos volátiles,
generalmente presentes en partes por millón. La combinación y la proporción de las
distintas sustancias volátiles determinan el aroma particular de cada fruto o alimento.
El tomate cultivado es un alimento popular y ampliamente consumido en el mundo. Su
gran aceptabilidad no está exclusivamente relacionada a su capacidad nutricional y
versatilidad, sino también a su típico sabor y aroma. El característico sabor y aroma
del tomate no sólo está dado por la relación de azúcares (fructosa-glucosa) a ácidos
(ácido cítrico, principalmente) sino también a la presencia de más de 400 diferentes
compuesto volátiles. Los principales esfuerzos para mejorar el sabor de los tomates se
han concentrado en controlar la relación ácido/azúcar en el fruto y en mejorar la
textura y las características de almacenamiento (retardo de la maduración). Los
tomates que carecen del distintivo “aroma a tomate” son percibidos por el público
como productos de baja calidad. El mejoramiento de la calidad del aroma del tomate
por técnicas de cruzamiento convencional es muy difícil debido a la gran cantidad de
genes que involucran la formación de estos compuestos volátiles. A pesar de que
muchos sabores y aromas específicos han sido identificados en frutos y vegetales, las
enzimas y genes que controlan su producción han sido poco estudiados. Uno de los
10 compuestos volátiles más importantes que determinan el aroma del tomate es el
alcohol monoterpeno acíclico s-linalol. La estrategia adoptada en el trabajo que se
presenta en las transparencias 69 a 72 fue sobrexpresar el gen de la enzima linalol
sintetasa (LIS) de Clarkia breweri en el fruto del tomate maduro. Para ello, el transgen
fue puesto bajo la dirección de un promotor específico de la maduración del fruto
(pE8). Se transformaron dos variedades de tomate que poseen poco aroma: UC82B
(variedad de tomate para procesado) y CB3 (variedad de tomate fresco). La enzima
linanol sintetasa (LIS) es responsable de la presencia del monoterpeno s-linalol en el
perfume de las flores de C. breweri. Esta enzima usa geranildifosfato (GPP) como
sustrato. Como el GPP también es un intermediario en la vía que lleva a la síntesis de
los carotenoides y en el tomate ocurre una importante acumulación de licopeno y otros
carotenoides durante la maduración, se asumió que la sobrexpresión de LIS de C.
breweri en el fruto conduciría a la utilización de parte de la reserva de isoprenoides
que se encuentra en los plástidos para formar s-linalol durante la maduración.
La transparencia 71 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Las
variedades elegidas para la transformación (UC82B y CB3) no producen
prácticamente s-linalol, lo que facilita el análisis de los resultados. La primera
generación de tomates transgénicos (T1) fue analizada por Southern blot para
identificar líneas con una única copia del transgen. La mayoría de estas plantas
presentaban acumulación de s-linalol. Aquellas que producían mayores niveles (6
líneas de UC82B y 4 líneas de CB3) fueron autofecundadas para obtener la
generación T2. Se determinó el patrón de compuestos volátiles de ambas variedades
no transformadas y resultó similar. En el panel izquierdo de la transparencia, se
presenta un cromatograma mostrando el análisis de espectrometría de masa de
extractos de frutos de una línea CB3 y de su control no transformado. La única
diferencia significativa en el patrón de compuestos volátiles de las líneas transgénicas
con respecto a sus controles fue la producción de s-linalol y de 8-hidroxilinalol. La
linalol sintetasa (LIS) cataliza la formación del enantiómero puro s-linalol a partir de
geranil difosfato (GPP). Dado que el s-linalol es un alcohol alílico terciario, puede
racemizarse en ambientes ácidos como el que prevalece durante la maduración del
tomate. Por esta razón, se examinó por cromatografía gaseosa la quiralidad del linalol
acumulado en las líneas transgénicas. El mismo fue enantioméricamente puro,
detectándose exclusivamente s-linalol. La aparente falta de quiralización puede reflejar
la compartimentalización que separa al linalol del ambiente ácido de la pulpa del
tomate. En muchas plantas el linalol se acumula en estructuras secretorias como las
tricomas o es emitido al medio ambiente. Todavía no se sabe como se distribuye el
linalol en los tejidos del fruto del tomate. La acumulación de 8-hidroxilanol puede
explicarse por hidroxilación alílica, una reacción común en el metabolismo de los
monoterpenos. En el panel de la derecha se muestra el análisis quiral de la misma
línea transgénica presentada en el panel izquierdo (cromatograma superior). El
cromatograma inferior muestra la separación racémica de una mezcla sintética de
linalol analizado bajo las mismas condiciones.
La transparencia 72 muestra un análisis de los metabolitos de valor nutricional que se
acumulan en el fruto del tomate son sintetizados a través de la ruta de los terpenoides.
Los mismos incluyen hormonas, pigmentos y vitaminas, tales como giberelinas,
licopeno y tocoferol. La modificación de la vía de los terpenoides por ingeniería
genética podría tener efectos negativos sobre la acumulación de otros terpenoides o
de hormonas que podrían afectar el desarrollo o la capacidad nutricional del fruto. Por
esta razón, debe analizarse el posible efecto de la acumulación de s-linalol sobre la
acumulación de otros terpenoides. La tabla resume algunos resultados que
demuestran que los niveles de tocoferoles y carotenoides, como licopeno y -caroteno,
no variaron significativamente respecto de los de las plantas control.
.
Los monoterpenos son los principales componentes del aceite esencial en la familia de
las mentas (Lamiaceae), incluyendo a la menta (Menta x piperita) que ha sido usada
como sistema modelo para el estudio de la vía de síntesis de los monoterpenos. El
aceite esencial de menta está formado en su mayor parte por mentol (50%), mentona
(10-30%), metil ésteres (10%) y otros terpenos como pulegona, piperitona y
mentofurano. Las trazas de jasmonato (0,1%), mejoran sustancialmente la calidad del
aceite esencial. El mentol y el mentil acetato son los responsables del característico
aroma fresco y penetrante de la menta. El mentol se encuentra mayormente en hojas
viejas y es preferencialmente formado durante períodos con mayor exposición solar.
El mentofurano es un componente indeseable del aceite esencial derivado de la
pulegona, que contribuye a la producción de un aceite esencial sin aroma y a la
pérdida de color durante el almacenamiento. El mentofurano puede alcanzar niveles
industrialmente inaceptables en plantas que crecen en condiciones de estrés como
falta de luz, sequedad y altas temperaturas, condiciones sobre las que los agricultores
tienen un control limitado. Por lo tanto, resulta interesante disminuir la acumulación de
estos metabolitos indeseables y maximizar la producción de mentol. En principio, esto
podría lograrse a través de la modificación de la síntesis de monoterpenos. En el
trabajo que se presenta en las transparencias 73 a 77, los autores desarrollaron dos
estrategias paralelas para alcanzar este objetivo. Con este fin, sobrexpresaron la
enzima 1-deoxi-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (DXR) e inhibieron la expresión de
la enzima mentofurano sintetasa (MFR). La fotografía de la transparencia 74 muestra
hojas de distintas mentas (de izquierda a derecha, menta (Mentha piperita), menta
agua de colonia (M. citrata), menta japonesa (M. arvensis var. piperascens, también
conocida como variedad japonica), menta plateada (M. longifolia), menta verde
marroquí (M. spicata), menta piña (M. suaveolens) y menta carintia (M. carinthiaca =
M. arvensis x M. suaveolens).
La transparencia 75 muestra un esquema de las vías de síntesis de monoterpenos en
el que se señalan los pasos afectados por ingeniería metabólica. Con la finalidad de
aumentar la producción de mentol se sobrexpresó la enzima 1-deoxi-xilulosa-5-fosfato
reductoisomerasa (DXR). La misma cataliza la conversión de 1-deoxi-di-xilulosa-5fosfato (DXP) en metileritritol fosfato, la que constituye un paso limitante en la
producción de los precursores de la síntesis de terpenoides y, por lo tanto, un posible
blanco para controlar el flujo metabólico a través de esta rama. El ADNc de la enzima
DXR de menta codifica una pre-proteína que posee un péptido señal de exportación a
los plástidos. Se clonó el ADNc de DXR bajo la regulación del promotor constitutivo
35S CaMV y el terminador NOS del gen de la nopalina sintetasa y la construcción
resultante se utilizó para transformar plantas de M. piperita. Por otro lado, con el
objetivo de disminuir la producción de mentofurano, se inhibió la expresión de la
enzima mentofurano sintetasa (MFS) por silenciamiento génico post-transcripcional.
Para ello, se transformaron plantas de M. piperita con la versión antisentido del ADNc
que codifica la enzima MFS bajo la regulación del promotor 35S de CaMV. La MFS
cataliza la conversión de pulegona en mentofurano. Por lo tanto, si se inhibe su
expresión, se espera que los niveles de mentofurano disminuyan y que se produzca un
cierto aumento de pulegona. Las plantas fueron transformadas por infección de
explantos de hojas con la cepa EHA105 de A. tumefaciens portando los vectores
binarios que contenían las dos construcciones descriptas. Se obtuvieron 57 plantas
transgénicas DXR y 19 plantas transgénicas MFS. De las plantas transgénicas, 47
presentaron un fenotipo normal, 11 presentaron una pigmentación anormal (sugiriendo
algún problema en la síntesis de clorofila) y 4 plantas presentaban una pigmentación
anormal pero en mosaico.
La transparencia 76 muestra ensayos realizados para determinar si la diferencia
fenotípica observada en la plantas DXR correlacionaba con el patrón de expresión del
transgen dxr se analizó el nivel del ARNm correspondiente en hojas inmaduras y
maduras de plantas control y transgénicas. En el panel A de la transparencia se
observa que el ARNm de DXR se expresa fuertemente en hojas inmaduras, tanto en
plantas normales como en plantas transgénicas con fenotipo normal. Sin embargo, no
se expresa en las plantas transgénicas con fenotipo de pigmentación normal y se
expresa levemente en las plantas que presentan pigmentación en mosaico. En las
hojas maduras (panel B), se puede observar que el ARNm DXR se expresa en las
plantas transgénicas normales y con mosaico y no se expresa en las plantas normales
ni en las transgénicas con fenotipo anormal. Dado que la 1-deoxi-di-xilulosa-5-fosfato
reductoisomerasa (DXR) opera como un proveedor de precursores para la síntesis de
metabolitos esenciales (entre ellos, la clorofila), no es sorprendente observar un alto
nivel de expresión de este compuesto en hojas jóvenes. A medida que las hojas
maduran, se espera que la síntesis de DXR disminuya, tal como se observa en las
plantas control. Al expresar DXR bajo un promotor constitutivo, se logró que la enzima
se exprese tanto en las hojas jóvenes como en las hojas maduras de las plantas
transgénicas con fenotipo normal, logrando de esta manera mantener activa la vía del
DXP. En las plantas con pigmentación anormal (despigmentadas), la sobrexpresión de
DXR produjo la co-supresión del gen dxr. La inhibición de la expresión del gen dxr
podría comprometer la síntesis de clorofila provocando la despigmentación de las
hojas. Se midieron los niveles de DXR en extractos de hojas maduras de plantas
control y transgénicas y se observó que la actividad correlacionó bien con los niveles
de ARNm. Las plantas transgénicas con fenotipo normal presentaron 2 a 4 veces más
actividad de DXR que las plantas control.
La transparencia 77 muestra un análisis de los aceites esenciales de plantas de menta
transformadas y control. Los tricomas glandulares de la menta están prácticamente
dedicados a la producción de monoterpenos a partir de los precursores que son
generados a través de la vía de la 1-deoxi-di-xilulosa-5-fosfato (DXP) en plástidos. Por
lo tanto, es razonable pensar que las alteraciones en el flujo metabólico debidas a
cambios en la expresión del gen dxr podrían reflejarse en la acumulación del aceite
esencial. El análisis del aceite esencial de menta se realizó por destilación de las
hojas, seguida por la separación de los componentes en cromatografía gaseosa y por
su cuantificación utilizando estándares internos. La tabla muestra algunos de los
resultados obtenidos del análisis de plantas control y transgénicas DXR y MFS. Las
plantas DXR acumularon más aceite esencial que las plantas control (la tabla no
muestra los valores totales) y esta diferencia se debe principalmente a un aumento en
la producción de mentol. En cuanto a las plantas MFS, el rendimiento final de aceite
esencial fue similar al de las plantas control, pero la inhibición de la expresión de MFS
llevó a una disminución de los niveles de mentofurano y, sorprendentemente, a una
disminución de los niveles de pulegona y a un aumento de la producción de mentol.
Estos valores se mantuvieron aún en condiciones de estrés, situación que
normalmente conduce al incremento de mentofurano. Este ejemplo muestra como los
resultados de la modificación del metabolismo puede tener aspectos impredecibles
originados en la falta de conocimiento y en la complejidad de la regulación de las vías
de metabólicas. En este caso, utilizando una estrategia que se esperaba disminuyera
sólo la producción de mentofurano, se logró disminuir los niveles de pulegona y
aumentar los del mentol. Probablemente, ello fue causado por el desvío del flujo
metabólico hacia la síntesis de mentol. Por otro lado, debe destacarse la similitud entre
la composición del aceite esencial de las plantas DXR46 y de las plantas MFS. En las
plantas DXR46, se observa una disminución de mentofurano y pulegona no esperable
por la sobrexpresión de DXR. Una posible explicación para esta observación es que
en esta línea se haya producido una inserción que inactivó al gen mfs.
Artemisia annua L es una hierba aromática anual utilizada en la medicina tradicional
china para el tratamiento de la fiebre (transparencia 78). A partir de ella se extrae la
artemisina, un sesquiterpeno que posee una eficiente actividad antiparasitaria contra
cepas multirresistentes de Plasmodium falciparum, el agente causante de la malaria.
Debido a la aparición de cepas de Plasmodium resistentes a la cloroquina (droga
antimalárica), la artesimina y sus derivados son actualmente considerados como una
importante alternativa para el tratamiento de la malaria. Las limitaciones para su uso
están dadas básicamente por la dificultad de obtener una alta producción de la droga.
Las fuentes naturales de obtención son limitadas y la síntesis química es difícil y
costosa. Los intentos por producir artesimina a partir de células en cultivo de A. annua
L. no han tenido el éxito esperado. Por estas razones, una alternativa es producir
plantas transgénicas de A. annua L. que sobrexpresen los genes de las enzimas
involucradas en la biosíntesis de artemisina. Las transparencias 79 y 80 presentan los
resultados de un trabajo realizado en esta dirección. Se transformaron plantas de A.
annua L. por incubación de explantos de hojas con A. tumefaciens LBA 4404 portando
el ADNc de la enzima farnesil difosfato sintetasa (FDS) de Gossypium arboreum bajo
el promotor 35S del CaMV.
La transparencia 80 muestra los niveles de artemisina alcanzados en plantas de A.
annua transgenicas y controles. La artesimina fue extraída por calentamiento de las
hojas de plantas transgénicas y control en una solución de éter de petróleo y sus
niveles se determinaron por HPLC. El gráfico de barras muestra los niveles de
artesimina obtenidos en plantas control no transformadas (1) y en plantas transgénicas
(2 a 6). En estas últimas se obtuvieron valores de entre 8 y 10 mg de artemisina por g
de peso seco, lo que representa aproximadamente un aumento de 3 veces respecto
de la planta no transformada.
La vitamina A (retinol) es un nutriente esencial cuya carencia en humanos puede
afectar severamente la visión, la reproducción y la función inmune (transparencia 81).
Se estima que unos 250.000 niños quedan ciegos cada año por esta deficiencia
nutricional en el sudeste asiático. Más aún, la deficiencia en vitamina A exacerba otras
enfermedades, como la diarrea, las enfermedades respiratorias y las enfermedades
típicas de la infancia como la rubeola. Se estima que en el mundo existen 124 millones
de niños deficientes en vitamina A y que una provisión adecuada de la misma podría
evitar de 1 a 2 millones de muertes anuales. El arroz es uno de los principales
alimentos para millones de personas. Generalmente, se lo consume luego de un
tratamiento que remueve las capas externas (pericarpio, tegumento y aleuronas). Esto
se hace para evitar que la aleurona, al ser una capa rica en aceites, se vuelva rancia
durante el almacenamiento del grano. Por lo tanto la parte comestible del arroz
consiste básicamente en el endospermo, compuesto por gránulos de almidón y
cuerpos proteicos, pero carece de los nutrientes esenciales para el mantenimiento de
la salud, como es la pro-vitamina A (-caroteno). El hecho que el arroz sea la principal
fuente de alimentos de muchas poblaciones contribuye al problema de la deficiencia
en vitamina A, convirtiéndose en un serio problema de salud pública en al menos 26
países que incluyen áreas altamente pobladas de Asia, Africa y América latina.
Una estrategia complementaria a las ya existentes para reducir la deficiencia de
vitamina A en los países subdesarrollados podría ser la fortificación de los principales
alimentos de estas poblaciones con pro-vitamina A. La administración de la provitamina A o -caroteno tiene como ventaja que puede acumularse en el organismo sin
efectos nocivos a diferencia de su producto final, la vitamina A. En el caso del arroz, la
suplementación con -caroteno sólo puede lograse a través del uso de tecnologías
recombinantes y no por mejoramiento convencional, ya que no existen cultivares de
arroz que produzcan este compuesto en el endospermo. Dado que la transformación
del arroz está bien establecida y que todas las enzimas que componen la vía de la
síntesis de la pro-vitamina A han sido identificadas a nivel molecular, la modificación
genética del cultivo para producir la pro-vitamina A en el endospermo es un objetivo
factible.
El arroz produce geranil-geranil difosfato, precursor de los -carotenos, pero carece de
las enzimas correspondientes a esta ruta biosintética. Para completar la vía de síntesis
del -caroteno es necesario introducir por ingeniería genética 4 enzimas: la fitoeno
sintetasa, fitoeno desaturasa, la caroteno desaturasa y la licopeno ciclasa.
Alternativamente, para simplificar el trabajo de transformación, el número de enzimas
puede ser reducido utilizando una fitoeno desaturasa bacteriana que es capaz de
reemplazar a las dos desaturasas vegetales. La introducción de la vía de síntesis de
-caroteno en arroz se efectuó por transformación con A. tumefaciens portando
vectores que contenían los siguientes genes: a) gen de fitoeno sintetasa (psy) de
Narcissus pseudonarcissus bajo el control del promotor glutelina específico de
endosperma (Gt1); b) gen de la fitoeno desaturasa (crtl) de Erwinia uredovora
conteniendo la secuencia para el péptido de tránsito de la subunidad menor de la
Rubisco de arveja bajo el control del promotor 35S CaMV; c) gen de la licopeno ciclasa
(lcyl) de N. pseudonarcissus conteniendo la secuencia para un péptido de tránsito que
permite la importación a plástidos
bajo el control del promotor 35S CaMV
(transparencia 83).
La transparencia 84 muestra resultados de este trabajo. Se transfirieron al invernadero
10 líneas transgénicas para las 3 enzimas con el fin de obtener semillas. Todas las
líneas mostraron un fenotipo vegetativo normal y fueron fértiles. Las semillas maduras
de las líneas transgénicas T0 y de las plantas control se secaron al aire y se aisló el
endospermo. En la mayoría de las plantas transformadas, el endospermo presentó
una coloración amarilla, sugiriendo la formación de carotenos. Se cuantificó por
fotometría el contenido de carotenoides en semillas de líneas transgénicas individuales
y se analizaron las muestras por cromatografía líquida de alta presión (HPLC).
Ninguna de las líneas transgénicas acumuló licopeno en cantidades detectables, pero
todas ellas produjeron -caroteno (por ejemplo, la línea z11b produjo 1,6 g/g de caroteno) y algunas líneas produjeron otros carotenoides como zeaxantina y luteína. El
patrón de carotenoides obtenido en el endospermo de las plantas transgénicas es
cualitativamente similar al que se encuentra en hojas verdes de plantas normales. Esto
sugiere que las enzimas  y -ciclasas son expresadas constitutivamente en el
endospermo de arroz y/o que la expresión de estas enzimas es inducida por la
formación de licopeno o derivados de él. La cantidad de vitamina A recomendada es
de 1 mg por día, lo que corresponde aproximadamente a 6 mg de -caroteno. Con
estas plantas transgénicas los autores sugieren que es posible llegar a obtener 2 g
de -caroteno por g de arroz, lo que corresponde a 100 g de vitamina A por cada 300
g de arroz. Si bien este valor esta aún lejos de los requerimientos diarios necesarios,
podría tener un alto impacto en la dieta normal de poblaciones del sudeste asiático
donde la avitaminosis A es un problema importante y el consumo de arroz es alto. La
transparencia muestra los fenotipos de semillas de una línea transgénica (z11b) y de
una control. Los gráficos de la derecha muestran los respectivos contenidos de
carotenoides.
La transparencia 32 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. La
gráfica y las fotografías muestran resultados alcanzados durante el proceso de
desarrollo de las variedades del arroz dorado (“golden rice”). El objetivo del desarrollo
consiste en obtener variedades que satisfagan los requerimientos mínimos para
consumo humano. Por esta razón, se transformaron distintas variedades de arroz con
un plásmido que porta como gen selector la fosfomanosa isomerasa, lo que permite
evitar el uso de genes de resistencia a antibióticos. Por otro lado, se utilizó A.
tumefaciens como sistema de transformación con el fin de obtener patrones de
integración definidos y se determinó la ausencia de transferencia de ADN foráneo más
allá de los bordes derecho e izquierdo del vector binario. Se priorizaron los eventos de
integración simple, de manera de evitar posibles efectos epigenéticos en
subsecuentes generaciones. Se eligieron 3 variedades de arroz para transformar: una
variedad japonesa (Taipei 309) y 2 variedades indias (IR64 and MTL250). La elección
de las variedades indias se debió a que éstas son consumidas principalmente en las
áreas con alta deficiencia en vitamina A. Cabe destacar que, en un trabajo previo, los
autores determinaron que la transformación con los genes psy y crtl es suficiente para
producir -caroteno en arroz.
El desarrollo del “golden rice” ha sido posible gracias a los aportes de dos agencias, la
Rockefeller Foundation y el programa de investigación de la Comunidad Europea. Si
bien el aporte de la Rockefeller Foundation es libre de obligaciones, la Comunidad
Europea requiere la participación de una contraparte industrial que debe hacerse
cargo de los riesgos del desarrollo de la invención durante la etapa de investigación.
En este caso, la contraparte industrial fue la compañía Zeneca (fusionada
recientemente con Novartis para formar Syngenta). Este requerimiento de la
Comunidad Europea afectó el status legal del proyecto “Golden Rice”, el que se
desarrolla ahora por dos vías, una comercial y una no comercial o humanitaria.
Syngenta (a través de la compania alemana Greennovations) recibe una licencia
exclusiva para la comercialización de la tecnología en los países desarrollados.
Simultáneamente, Syngenta le otorga a los inventores (Potrykus y Beyer) la licencia
exclusiva y el derecho de sub-licenciar la tecnología para uso no comercial. El
desarrollo del proyecto “golden rice” requiere del uso de varias tecnologías que son
propiedades de otras industrias privadas y, por lo tanto su uso comercial o no
comercial requiere el consentimiento por escrito de los respectivos propietarios
intelectuales de estas tecnologías. Este complejo problema de propiedad intelectual,
que involucró múltiples negociaciones entre compañías, fue resuelto por Syngenta,
dado que ni la Universidad participante ni personas privadas tenían la capacidad para
resolverlo. También se convino que los avances derivados de la investigación
realizados por Syngenta estarían disponibles, libres de cargo, para la vía humanitaria
del proyecto.
Los carotenoides son un grupo de pigmentos naturales ampliamente distribuidos en la
naturaleza. Son sintetizados en todos los organismos fotosintéticos y en algunas
bacterias y hongos. Dado que los animales son incapaces de sintetizarlos de novo
deben obtenerlos a través de la dieta. Por esta razón, la manipulación del contenido y
composición de carotenoides en las plantas puede mejorar su valor agronómico y
nutricional y proveer una fuente de productos económicamente importantes para la
industria. Dado que en los últimos años se han identificado gran parte de las enzimas
involucradas en la síntesis de carotenoides, actualmente es posible modificar la
expresión de los carotenoides por manipulación genética. En este trabajo, se reporta la
producción de astaxantina en flores de tabaco. La astaxantina (3.3´-dihidroxi-b,bcaroteno-4.4´diona) es un cetocarotenoide que forma parte de la dieta natural de
muchos animales acuáticos. Este pigmento es el responsable del característico color
rosado del salmón, la trucha y el camarón. Se ha demostrado que, tanto en la trucha
como en el salmón, la astaxantina protege los huevos del daño por radiación
ultravioleta y mejora la tasa de crecimiento de los juveniles. En la naturaleza, la
astaxantina es sintetizada por bacterias y microalgas marinas y desde allí pasa a los
peces a través de la cadena alimentaria. Para que desarrollen su característico color
rosado, los peces cultivados, como el salmón y la trucha, deben ser alimentados con
dietas suplementadas con astaxantina. Actualmente, la astaxantina se produce
comercialmente por síntesis química y se vende como fórmula alimentaria.
El alto costo de la síntesis química de la astaxantina lo convierte en uno de los
componentes más caros de la cría del salmón, representando aproximadamente el
15% del costo total de producción. Por otro lado, la molécula de astaxantina tiene dos
centros quirales idénticos, la astaxantina sintética se produce como una mezcla de 3
isómeros configuracionales: (3S,3´S), (3S,3´R) y (3R,3´R) mientras que la astaxantina
natural sólo existe en la configuración (3S,3´S). Las consecuencias de alimentar peces
con productos no naturales como los isómeros no naturales de la astaxantina no se
encuentran bien establecidas. Las desventajas planteadas llevaron a la búsqueda de
fuentes alternativas de producción de astaxantina. En el trabajo que se comenta en la
transparencia 35 y las siguientes transparencias, los autores modificaron la vía de
síntesis de los carotenoides para producir astaxantina en cromoplastos de tabaco por
expresión de la enzima -caroteno cetolasa (CrtlO) del alga Haemetococcus pluvialis.
Para sobrexpresar la -caroteno cetolasa, se utilizó el promotor y la secuencia de
tránsito de la fitoeno desaturasa (Pds). De esta manera, la expresión de la
construcción se restringió a los tejidos que contienen cromoplastos, como los de los
frutos y las flores.
La transparencia 36 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. En la
figura se muestra la vía de síntesis de la astaxantina a partir de -caroteno. Como
puede observarse, la -caroteno cetolasa cataliza la conversión del -caroteno en
cantaxantina en dos pasos mediados por el agregado de grupos ceto en C4 y C´4. En
conjunción con la enzima -caroteno hidroxilasa (Crl-b), presente en la planta, este
proceso permite la formación de astaxantina. Los compuestos que participan de esta
rama de la vía de síntesis se indican en anaranjado. De esta manera, se logró
expresar astaxantina con su conformación natural en los cromoplastos del tejido del
nectario, el cual normalmente sólo sintetiza -caroteno y xantófilas.
Flavonoides
Transparencias 85-95
Los flavonoides son un grupo diverso de compuestos sintetizados por las plantas a
partir de fenilpropanoides y precursores derivados del acetato. Estos compuestos
juegan un importante rol en el desarrollo y crecimiento de las plantas (protección
contra luz UV, atracción de polinizadores, activación de genes de modulación,
fertilidad, germinación del polen), así como en la defensa contra patógenos (hongos,
virus, bacterias) y plagas (transparencia 86). Los flavonoides poseen generalmente
actividad antioxidante, particularmente los flavonoles como el kemferol y la quercetina.
Por esta razón, los efectos benéficos para la salud de los frutos, vegetales, té verde o
vino tinto pueden ser atribuidos en parte a los flavonoides. Existen crecientes
evidencias que apoyarían esta actividad protectora de los flavonoides, la cual está
basada tanto en su actividad antioxidante como en su capacidad para inducir enzimas
humanas protectoras. Estudios epidemiológicos sugieren una correlación directa entre
el consumo de una dieta alta en flavonoides y la disminución en el riesgo de sufrir
enfermedades cardiovaculares, cáncer y otras enfermedades relacionadas con la
edad, como la demencia senil. Por otro lado, los isoflavonoides presentes en
leguminosas poseen actividades anticancerígenas y estrogénicas, haciendo que
también sean considerados como compuestos potencialmente beneficiosos para la
salud. Sin embargo, son necesarias evidencias más acabadas sobre sus efectos
benéficos in vivo. Recientemente, Duarte et al. (2001) han demostrado que la
quercetina tiene la capacidad de disminuir la presión arterial en ratas hipertensas. Otro
estudio realizado en humanos concluyó que el extracto de vino tinto libre de alcohol y
uno de sus componentes, la quercetina, pueden inhibir la oxidación del LDL luego de
una suplementación in vivo. El incremento de la biosíntesis de flavonoides en cultivos
de interés podría generar una fuente de materia prima apropiada para la producción de
alimentos con propiedades benéficas para la salud humana y animal. Sin embargo,
cabe destacar que, dado que los flavonoides e isoflavonoides actúan como señales
para la infección tanto de microorganismos patógenos como benéficos, la ingeniería
metabólica de esta vía podría tener repercusiones ecológicas complejas.
Una de las primeras vías biosintéticas a ser modificadas por ingeniería genética fue la
vía de síntesis de flavonoides y antocianinas. Esto se debió principalmente a que era
una de las vías biosintéticas más conocidas y los resultados de su manipulación eran
fácilmente observables a través de cambios en el color de las flores. La transparencia
87 muestra un esquema de los principales pasos involucrados en la síntesis de
flavonoides y antocianinas. Los flavonoides se clasifican según su estructura central
aglicona en 5 grupos: chalconas, flavononas, flavonoides, dihidroflavonoides y
antocianinas. Hasta el presente, han sido identificados más de 4.000 flavonoides
diferentes. Esta gran diversidad es consecuencia de distintas modificaciones químicas
sobre la estructura aglicona, tales como glicosilación, metilación y acetilación.
La transparencia 88 muestra las estructuras químicas de los principales pigmentos
florales de plantas superiores: las antocianinas. Las antocianinas pelargonidina,
cianidina y delfinidina son los compuestos responsables de los colores anaranjado,
rojo y azul, respectivamente, de los pigmentos que dan la tonalidad final a las flores.
Los productos de la floricultura, como las plantas ornamentales y las flores de corte,
son apreciados por el atractivo de sus flores, frutos y follaje. La producción global de
flores de corte ha alcanzado niveles industriales en el Siglo XX y la industria se
encuentra actualmente en plena expansión (transparencia 89). El cultivo de flores
cortadas y bulbos de flores se extiende ampliamente a lo largo del mundo. Estadísticas
basadas en los 17 principales países productores, permiten estimar que la superficie
mundial destinada a flores cortadas es de 60.000 ha. En cuanto a la demanda mundial
de flores cortadas sólo pueden darse cifras aproximadas. Se estima que el mercado
mundial de flores cortadas está creciendo a una tasa de 6-9% por año. La demanda
total en 1985 era aproximadamente de U$S 12.000 millones. En 1990, ésta subió a
aproximadamente a U$S 25 mil millones. No existen estadísticas exactas sobre la
producción florícola de América Latina, pero está claro que el volumen producido está
creciendo muy rápidamente en esta región. Debido al buen clima e infraestructura que
ha favorecido la entrada de capital y conocimiento desde el extranjero, esta región ha
alcanzado una posición en el comercio mundial que hoy se acerca al de la Unión
Europea. A nivel de flores cortadas, los dos países productores y también
exportadores más importantes de esta región son Colombia y Ecuador. En cambio,
Costa Rica es gran productor de plantas ornamentales. Usando métodos tradicionales
de cruzamiento y selección, los cultivadores han logrado desarrollar nuevas
variedades de plantas de corte de flores y de ornamentales con características
deseables de color, forma, arquitectura, vida en el vaso y resistencia a pestes y
enfermedades. De esta manera, se han logrado, por ejemplo, rosas, crisantemos y
claveles en una variedad de colores. En contraste, la falta de éxito para obtener flores
azules se debe a que estas especies de plantas carecen de la información genética
necesaria para sintetizar los pigmentos derivados de la delfinidina. En términos
generales, podría decirse que una de las principales desventajas de los cultivadores
tradicionales en este campo es el repertorio limitado de genes presentes en las
especies que se desea modificar. Las técnicas de ingeniería genética permitirán alterar
muchas características individuales de los cultivos ornamentales una vez que los
genes que las determinan hayan sido clonados, a condición de que la especie en
cuestión pueda ser transformada y regenerada, y que los genes introducidos puedan
ser expresados de la forma deseada. Una vez obtenidas las variedades transgénicas,
su viabilidad comercial depende de la estabilidad y perdurabilidad del fenotipo
modificado. En general, esto se ha logrado por introgresión de los genes incorporados
por transformación.
Es inusual encontrar la gama completa de colores dentro de las especies florales
convencionales. En Petunia hybrida, una de las plantas en que la vía de síntesis de
antocianinas ha sido más extensamente estudiada, se producen derivados de
delfinidinas y de cianidinas pero no derivados de pelargonidina. Esto se debe a la
especificidad de la enzima dihidroflavonol 4-reductasa de petunia, la cual no puede
reducir al precursor de pelargonidina, el dihidrokemferol, en kemferol. Sin embargo,
hace casi dos décadas se obtuvo una variedad de petunias anaranjadas que
representa el primer producto exitoso de modificación del color de las flores por
ingeniería genética. La transparencia 90 muestra un esquema de la correspondiente
ruta biosintética en la que se ha subrayado el paso afectado por la modificación
genética. Esto se logró transformando una variedad de petunia blanca con el gen de la
dihidroflavonol 4-reductasa (DFR) de maíz. La variedad de petunia blanca (mutante
RLo1) acumula dihidrokemferol debido a que los genes f3’h (3´flavonoide hidroxilasa) y
f3’5’ (3´-5´flavonoide hidroxilasa) se hallan afectados por mutaciones; en
consecuencia, produce flores que no muestran pigmentación. La transformación de
esta variedad con el gen de maíz condujo a la producción y acumulación de
pelargonidina, obteniéndose flores de petunia color anaranjado (fotografía de la
derecha). Muchos de estos transformantes sufrieron inestabilidad epigenética
(expresión inestable debido a la metilación del promotor), no pudiéndose obtener
cultivares uniformemente coloreados, lo cual impidió su comercialización. Sin
embargo, los investigadores de la empresa Novartis lograron obtener petunias
anaranjadas uniformemente coloreadas por introgresión del gen DFR en plantas de
petunia.
Dado que las antocianinas se acumulan en vacuolas y que su espectro de absorción
depende del pH, éstas se convierten en indicadores naturales del pH vacuolar. A pH
ácido, las antocianinas toman un color que varía entre el rojo y el anaranjado,
mientras que a pH más básico se vuelven más azuladas. Por ejemplo, el cambio de
púrpura a azul durante el desarrollo de las flores de Ipomoea se correlaciona con un
aumento del pH vacuolar, lo que requiere la actividad de una bomba Na+/H+
(PURPLE) que alcaliniza el contenido vacuolar. En petunia, el pH vacuolar es
normalmente ácido al comenzar la floración, haciendo que las antocianinas viren en el
rango de los anaranjados. Mediante el análisis genético de mutantes que exhibían
flores con colores más azulados, se identificaron 7 loci, denominados PH1 a PH7, que
estarían involucrados en el desarrollo de estos fenotipos. Como el pH vacuolar del
tejido floral es más básico que en las flores salvajes, se sugirió que estos loci eran
requeridos para la acidificación vacuolar. La transparencia 91 muestra la incidencia del
pH vacuolar sobre el color de las flores. En la hilera superior se muestran flores que
acumulan antocianinas 3´-hidroxiladas (tipo cianidinas) y en la hilera inferior, flores que
acumulan antocianinas 3´,5´-hidroxiladas (tipo delfinidinas). De izquierda a derecha, se
muestran flores salvajes para el gen ph4 (ph4+) y petunias mutantes para el locus
pH4. Se observan dos fenotipos: uno estable (ph4- estable) y otro inestable (pH4inestable).
Las flores modificadas genéticamente se encuentran actualmente disponibles en
muchas partes del mundo. La primera introducción en el mercado la llevó a cabo la
empresa australiana Florigene en 1996 con el lanzamiento de los claveles violetas
Moondust®. Desde entonces, esta variedad ha sido comercializada en Japón, EEUU y
Europa. En 1998, la misma empresa inició la comercialización de la segunda variedad
de claveles modificados genéticamente Moonshadow®. La transparencia 93 muestra
detalles de las flores transgénicas. Estos claveles transgénicos han sido sometidos a
un riguroso escrutinio regulatorio y, en principio, no presentan mayores riesgos para el
ambiente que los obtenidos por métodos convencionales. La mayoría de estos
claveles son infértiles. Por otro lado la dispersión de semillas se ve limitada ya que las
flores son removidas de la planta cuando están aún cerradas. La mayoría de las
plantas son cultivadas en invernaderos, lo cual disminuyen el riesgo de dispersión del
polen, y los claveles son propagados por corte y no vegetativamente (bulbos,
tubérculos, etc.) de manera que la dispersión por residuos está limitada.
Una cantidad creciente de evidencias sugiere que los flavonoides, y en particular los
flavonoles, son potentes antioxidantes, y que un aumento en su consumo diario podría
reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares. Por esta razón, existe gran
interés en el desarrollo de cultivos comestibles que produzcan altos niveles de
flavonoles, siendo el tomate uno de los principales candidatos. El fruto maduro del
tomate posee en su piel pequeñas cantidades de flavonoides, principalmente
naringenina chalcona y el flavonol rutina. En la pulpa prácticamente no se producen
flavonoides. Dado que la piel del fruto representa sólo el 5% del peso total del mismo,
se procuró aumentar los niveles de flavonoles en la pulpa del tomate. Las
transparencias 94 y 95 presentan resultados de un trabajo en que se alcanzó este
objetivo. Para ello, se utilizó una estrategia basada en la expresión de factores de
transcripción heterólogos. Los factores de transcripción que regulan la síntesis de
flavonoides en diversas plantas forman parte de dos familias principales: la familia C1,
tipo MYB y la familia R, tipo MYC. Los autores sobrexpresaron en tomate los factores
de transcripción C1 (factor tipo MYB) y L1 (factor tipo MYC) de maíz. Transformaron
plantas de tomates con pares de construcciones diferentes en forma simultánea: a)
gen C1 bajo la regulación del promotor constitutivo 35S de CaMV y el gen L1 bajo la
regulación del promotor específico de fruto E8 (35SC1/E8L1); b) genes C1 y L1 bajo la
regulación del promotor específico de fruto E8 (E8C1/E8L1). Dado que los factores C1
y L1 actúan en forma coordinada, se asumió que ambas estrategias conducirían al
incremento específico de flavonoles en el fruto. Como controles, se transformaron
plantas de tomate con las siguientes construcciones: a) gen C1 bajo la regulación del
promotor constitutivo 35S de CaMV (35SC1); b) gen L1 bajo la regulación del promotor
específico de fruto E8 (E8L1). La transparencia 95 presenta una tabla que resume los
resultados del análisis de la expresión de flavonoides en tomates transformados con
cada una de las construcciones mencionadas. La cantidad y tipo de flavonoles fue
determinada por HPLC a partir de pulpa de tomates controles y transgénicos. Como
puede observarse, sólo hubo producción de flavonoles en las plantas que expresaban
los dos factores, lo que demuestra que ambos son requeridos para activar
completamente la vía correspondiente. En el gráfico de barras de la derecha se
muestran los niveles de expresión de los distintos flavonoles (kemferol, quercetina y
naringenina) en pulpa de tomate maduro obtenida a partir de diferentes líneas
transformadas con la construcción 35SC1/E8L1. En el fruto de las plantas
transgénicas se observa un aumento de kemferol de hasta 60 veces en relación con el
nivel de las plantas control. En contraste, la quercetina sólo aumentó unas 3 veces.
Los niveles de naringenina aumentaron aproximadamente 2 veces respecto de las
plantas control, pero sólo en algunas líneas transgénicas. Se obtuvieron resultados
similares con las plantas transformadas con las construcción E8C1/E8L1.
Alcaloides
Transparencias 96-101
Los alcaloides producidos por las plantas constituyen uno de los grupos de productos
naturales que provee mayor cantidad de compuestos farmacológicamente activos.
Como es generalmente el caso para los metabolitos secundarios, la producción de
alcaloides es baja, lo que hace que su producción a escala comercial sea muy cara.
Los métodos de producción alternativa (por ejemplo, la síntesis química) continúan
siendo impracticables, por lo que las plantas continúan siendo la mejor fuente de
obtención de estos valiosos compuestos. Recientemente, se ha logrado un
significativo progreso en la caracterización de las vías biosintéticas que llevan a la
producción de varios alcaloides y un número relevante de genes involucrados en estas
vías han sido clonados. Utilizando estos genes, es posible mejorar la productividad en
cultivos de células vegetales, en cultivos de tejidos vegetales o en plantas enteras
mediante enfoques de ingeniería metabólica.
La hiosciamina (y su forma racémica atropina) y la escopolamina son alcaloides del
tropano presentes en varias plantas solanáceas. Son usados en medicina como
agentes anticolinérgicos con acción sobre el sistema nervioso parasimpático. Dado
que difieren en sus acciones sobre el sistema nervioso central, existe una demanda
comercial de escopolamina 10 veces mayor que la de hiosciamina y atropina juntas.
Aunque varias especies de solanáceas pueden ser utilizadas como fuente comercial
de estos alcaloides, los contenidos de escopolamina son siempre mucho menores que
los de hiosciamina. Por esta razón, existe gran interés en aumentar los niveles de
escopolamina en plantas medicinales cultivables como la A. belladona. La
escopolamina se forma a partir de la hiosciamina vía la 6-hidroxihiosciamina. La
hiosciamina 6-hidroxilasa (H6H) cataliza la hidroxilación de la hiosciamina a 6hidroxihiosciamina, y la epoxidación de ésta a escopolamina (ver reacción en la
transparencia 97). A pesar de que la actividad de epoxidación de la H6H es bastante
menor que la de la actividad de hidroxilación, una serie de evidencias indirectas
sugiere que la reacción de epoxidación no es un paso limitante en la planta. Por
ejemplo, no se observa acumulación de 6-hidroxihiosciamina en plantas, pero sí
existe una correlación entre la actividad de H6H y la tasa de escopolamina/hiosciamina
en tejidos de raíces productoras de escopolamina. Por lo tanto, la enzima H6H parece
ser una un buen blanco para modificar la producción de escopolamina por ingeniería
metabólica. La estrategia elegida en el trabajo que se presenta en las transparencias
98 y 99 fue sobrexpresar la enzima en plantas que acumulan hiosciamina, asumiendo
que esto generaría un aumento de escopolamina en las plantas transformadas. El gen
que codifica la enzima hiosciamina hidroxilasa (H6H) de Hyosciamus niger fue clonado
bajo la regulación del promotor constitutivo 35S de CaMV. Esta construcción fue
utilizada para transformar A. belladona, una planta típicamente rica en hiosciamina.
La transparencia 99 muestra resultados de este trabajo. El cambio en la composición
de alcaloides de las plantas transgénica de A. belladonna fue remarcablemente
eficiente: la escopolamina fue prácticamente el único alcaloide presente en las partes
aéreas de la planta. Cabe destacar que la producción exclusiva de escopolamina no
pudo lograrse a través de cruzamientos convencionales. Mientras que usualmente la
purificación implica una extracción diferencial y una separación cromatográfica de la
fracción de alcaloides, debido a que la escopolamina se produce en forma exclusiva, la
purificación a partir de hojas transgénicas puede efectuarse sin dificultad mediante
recristalización de la fracción total de alcaloides. Por otra parte, la conversión a
escopolamina no fue eficiente en las raíces de plantas transgénicas, a pesar de
observarse una relativa alta expresión de H6H en las mismas. Existen dos argumentos
alternativos, pero no exclusivos, para explicar este resultado: a) la hiosciamina podría
ser sintetizada en un subgrupo de células de la raíz en el cual la expresión a partir del
promotor 35S de CaMV podría no ser tan fuerte y, b) la conversión de hiosciamina a
escopolamina puede ocurrir en forma más eficiente durante la translocación y
almacenamiento de los alcaloides en las partes aéreas. La transferencia del gen de
H6H y su expresión constitutiva en una planta típicamente rica en hiosciamina,
convirtió a esta planta herbácea perenne en una planta de alto valor farmacológico.
Existe una creciente demanda de café libre de cafeína debido a los efectos adversos
que este compuesto produce en personas sensibles: palpitaciones, aumento de la
presión sanguínea e insomnio. El café es actualmente descafeinado mediante un
proceso industrial costoso que da como resultado un café con menos sabor. Las
transparencias100 y 101 presentan un trabajo cuyo objetivo es la obtención de plantas
de Coffea canephora que no producen cafeína mediante técnicas de ingeniería
metabólica. La biosíntesis de cafeína en plantas de café involucra a tres Nmetiltransferasas: CaXMT1, CaMXMT1 (teobromina sintetasas) y CaDXMT1 (cafeína
sintetasa), que agregan grupos metilos a la xantosina en forma sucesiva para producir
cafeína. El trabajo comentado describe la construcción de plantas de café
transgénicas en que la expresión del gen de teobromina sintetasa (CaMXMT1) es
reprimida mediante ARN de interferencia (ARNi). Para diseñar los fragmentos cortos
(ARN-S) y largos (ARN-L) de ARNi se utilizaron secuencias del extremo 3´ no
codificante del gen CaMXMT1. Se transformó A. tumefaciens EHA101 con vectores
conteniendo las construcciones ARN-S y ARN-l, y el gen de la Proteína de
Fluorescencia Verde (gfp) de Aquearea victoria como control. Las bacterias
transformadas fueron usadas para transformar plantas de C. canephora. En cada
transformación se obtuvieron más de 35 brotes transgénicos somáticos
independientes. Los fenotipos fueron aparentemente normales. La transparencia 101
muestra resultados de este trabajo. Se colectaron hojas jóvenes de brotes de un año y
se les midió el contenido de alcaloides. Las plantas control y las transformadas con el
gen de la Proteína de Fluorescencia Verde (GFP) contenían cantidades similares de
teobromina y cafeína (aproximadamente 1 y 8 mg por g de tejido fresco,
respectivamente). En contraste, las hojas jóvenes de de las líneas transformadas
presentaron una reducción del 30-80% en el contenido de teobromina y un 50-70% en
el contenido de cafeína en comparación con las plantas control. Como el gen
CaMXMT1 se expresa en hojas jóvenes, yemas y frutos inmaduros, es de esperar que,
cuando las plantas transgénicas maduren, produzcan granos de café que, además de
su bajo contenido en cafeína, sean esencialmente normales. Actualmente, los autores
están utilizando el mismo enfoque con plantas de Coffea arabica, especie de la que se
obtiene el 70% del café que es comercializado mundialmente.
En los últimos años, se han sobrexpresado numerosos genes, ya sea en sus plantas
de origen o en otras especies (transparencia 102). En algunos casos, la sobrexpresión
resultó en un aumento de la acumulación de los compuestos deseados. Sin embargo,
en otros resultó sólo en el aumento de la enzima codificada por el propio gen o, peor
aún, en la producción de compuestos no deseados. Estos resultados evidencian la
complejidad de las redes metabólicas y la limitada capacidad existente para predecir
las consecuencias de sobrexpresar determinados genes estructurales. Esta situación
prevalecerá aún por cierto tiempo, en tanto y en cuanto no se cuente con mayor
información sobre la composición de las vías metabólicas que se desean modificar. En
este sentido, la utilización de factores de transcripción para activar vías metabólicas
completas parece ser actualmente una estrategia prometedora. En los próximos años,
el principal desafío será obtener mayor información acerca de la regulación metabólica
a todos los niveles: genético, enzimático, de la compartimentalización, del transporte y
de la acumulación. Dado que los metabolitos secundarios son específicos de especie,
la información genética obtenida de A. thaliana será de utilidad limitada, por lo que la
secuenciación de otras especies de interés será de gran valor en este campo. A su
vez, será necesario integrar los datos obtenidos de los estudios genómicos con los de
los estudios proteómicos y metabolómicos, lo que permitirá generar un panorama más
completo del conjunto de las interacciones regulatorias. A pesar del limitado
conocimiento actual de las vías metabólicas, se han obtenido ya resultados muy
interesantes, lo que demuestra el gran potencial de la ingeniería genética en la
modificación del metabolismo secundario. Esta capacidad se traducirá en el futuro en
numerosas aplicaciones en campos tales como “molecular farming”, fortalecimiento
nutricional y resistencia a patógenos.