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TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE
¿QUÉ ES LA TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE?
• El término ADN recombinante hace referencia a la
creación de nuevas combinaciones de segmentos o
de moléculas de ADN que no se encuentran juntas
de manera natural.
• La tecnología del ADN recombinante utiliza técnicas
que provienen de la bioquímica de los ácidos
nucleicos unidas a metodologías genéricas
desarrolladas originalmente para la investigación de
bacterias y de virus.
¿CUÁLES SON SUS APLICACIONES?
• Aplicaciones en investigación y medicina
- Producción a gran escala de proteínas de utilidad
médica
- Animales transgénicos
- Terapia génica
• Aplicaciones industriales
• Aplicaciones en agricultura
- Mejora genética de los cultivos
- Nuevos insecticidas naturales
2 FUNCIONES BÁSICAS
• CLONAR (OBTENER MULTIPLES COPIAS) UN GEN
• EXPRESAR UNA PROTEÍNA (CODIFICADA POR
EL GEN DE INTERÉS)
¿Y CÓMO SE HACE?
2 ELEMENTOS ESENCIALES
• SECUENCIA DE ADN DE INTERÉS
• VECTOR
VECTORES
Agentes que pueden insertar un fragmento de ADN dentro de
una célula huésped = MOLÉCULA DE ADN TRANSPORTADORA
1. Plásmidos
• Inserción de hasta 10kb
• Sistema más común
2. Fagos
• Filamentosos (M13, capacidad de inserción 10kb)
• Tipo I (T1, capacidad 23kb)
• Lamba (capacidad 25kb)
•P1 (capacidad 100 kb)
3. Cósmidos
• Capacidad de 44kb
• Plásmidos con sitios cos
4. BAC
• Capacidad de 300kb
• Cromosoma artificial de bacterias
Células Huésped
Levaduras
Células mamíferas
Bacterias
Saccharomyces cereviseae,
Pichia pastoris, etc.
Líneas celulares como
CHO ( cél. Ovario Hamster)
GRAM NEGATIVAS (E. coli, P.aeruginosa)
GRAM POSITIVAS (Bacillus subtilis,
S.aureus, Streptommyces)
1. Plásmidos
Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena
circular covalentemente cerrado (ccc) extracromosómicas
de origen natural que tienen un origen de replicación
(ori+) y que se replican autónomamente en las células
bacterianas.
¿Porqué son empleados como vectores?
Porque son:
- Pequeños.
- Producen múltiples copias.
LOS PLÁSMIDOS SON ELEMENTOS DE TRANSFERENCIA
DE INFORMACIÓN GENÉTICA ENTRE BACTERIAS
PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE CLONADO
GEN DE
RESISTENCIA
AL
ANTIBIÓTICO
(MARCADOR
DE SELECCION)
GEN LACZ
(MARCADOR
DE
SELECCIÓN)
SITIO DE
CLONADO
MÚLTIPLE
ORIGEN DE
REPLICACION
lacZ
AmpR
ADN foráneo
GEN LACZ
SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE
AMPR
PLÁSMIDO DE CLONADO
ORIGEN DE REPLICACIÓN
PRODUCTO DE PCR
PLÁSMIDO DE CLONADO
DIGESTIÓN DEL PLÁSMIDO Y
DEL FRAGMENTO DE ADN CON
LA MISMA ENZIMA DE
RESTRICCION
PRODUCTO DE PCR
EcoRI
EcoRI
DIGESTIÓN CON LA MISMA
ENZIMA DE RESTRICCION
PLÁSMIDO DE CLONADO
PRODUCTO DE PCR
DIGERIDO CON EcoRI
PLÁSMIDO DE CLONADO
DIGERIDO CON EcoRI
DIGESTIÓN CON LA MISMA
ENZIMA DE RESTRICCION
LIGACIÓN
¿CON QUÉ?
ADN LIGASA
ADN LIGASA
TUBO CON MEZCLA DE
FRAGMENTO DE ADN Y
PLÁSMIDO DIGERIDOS CON
EcoRI
DOS RESULTADOS
POSIBLES ….
PLÁSMIDO NO
RECOMBINANTE
PLÁSMIDO RECOMBINANTE
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
¿CÓMO?
MÉTODO QUÍMICO O FÍSICO
TUBO CON MEZCLA DE
PLÁSMIDOS
RECOMBINANTES Y NO
RECOMBINANTES
TUBO CON CULTIVO
LÍQUIDO DE BACTERIAS
BACTERIA NO
TRANSFORMADA
DOS RESULTADOS
POSIBLES ….
BACTERIA
TRANSFORMADA
SIEMBRA PLACAS CON MEDIO AGAR LB
SUPLEMENTADO CON AMPICILINA, IPTG Y X-gal
INCUBACIÓN A 37°C POR 16 HORAS
TRES RESULTADOS POSIBLES ….
A.
BACTERIA NO
TRANSFORMADA
EN UN MEDIO
CON AMPICILINA
LA BACTERIA SIN
PLÁSMIDO NO CRECE
TRES RESULTADOS POSIBLES ….
B.
BACTERIA
TRANSFORMADA
CON PLÁSMIDO NO
RECOMBINANTE
EN UN MEDIO
CON AMPICILINA
LA BACTERIA CON
PLÁSMIDO CRECE
EN UN MEDIO
CON IPTG Y Xgal
LA BACTERIA CON PLÁSMIDO
NO RECOMBINANTE (GEN
LACZ INTEGRO) ES AZUL
TRES RESULTADOS POSIBLES ….
C.
BACTERIA
TRANSFORMADA
CON PLÁSMIDO
RECOMBINANTE
EN UN MEDIO
CON AMPICILINA
LA BACTERIA CON
PLÁSMIDO CRECE
EN UN MEDIO
CON IPTG Y Xgal
LA BACTERIA CON PLÁSMIDO
NO RECOMBINANTE (GEN
LACZ DISRUPTO) ES BLANCA
PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN
COMPONENTES:
PARA LA AMPLIFICACIÓN
DEL GEN EN BACTERIAS
1. ORIGEN DE REPLICACIÓN
2. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las
bacterias que contienen el plásmido; ej. ampicilina)
3. SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE
4. PROMOTOR (debe ser fuerte para tener una expresión elevada)
5. SEÑAL DE TERMINACIÓN (finalización del ARNm)
PARA LA EXPRESIÓN DE
LA PROTEÍNA EN
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
PARA LA EXPRESIÓN DE
LA PROTEÍNA EN
BACTERIAS
6. GEN REPORTERO
7. GEN DE RESISTENCIA AL ANTIBIÓTICO (para seleccionar las
células que hayan incorporado el plásmido a su genoma; ej.
neomicina)
PLÁSMIDOS COMO VECTORES DE EXPRESIÓN
PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN
BACTERIAS
PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN EN
BACTERIAS: PROTEÍNAS DE FUSIÓN
¿SE PUEDEN EXPRESAR PROTEÍNAS HUMANAS O
DE MAMÍFEROS EN BACTERIAS?
• Las células bacterianas son extremadamente útiles para la
traducción
activa
de
proteínas
de
mamíferos,
immunológicamente activas.
• La expresión de genes de mamíferos en bacterias necesita
resolver los problemas siguientes:
1. Las proteínas producidas por estos métodos no presentan modificaciones
post-tranduccionales.
2. los promotores eucariotas no son reconocidos por las ARN polimerasas
bacterianas.
3. los genes eucariotas contienen intrones.
4. los ARNm eucariotas no son todo el tiempo traducidos por los ribosomas
bacterianos.
5. las proteínas presentes en grandes cantidades en las bacterias
forman cuerpos de inclusión insolubles
6. las proteínas eucariotas pueden ser reconocidas como cuerpos extraños por
las proteasas de la bacteria y ser degradadas.
EL CASO DE LA INSULINA HUMANA
SELECCIÓN DEL PROMOTOR
• Según la célula huésped:
- Bacteria
- Célula eucariotas
• Según el tipo de ARN deseado en células
eucariotas:
- ARNm: ARN POLIMERASA tipo II
-ARNsh: ARN POLIMERASA tipo III
PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN
TRANSFECCION ESTABLE Y TRANSITORIA
• Se denomina trasfección transitoria aquella en la que el
plásmido no ha sido integrado a uno de los cromosomas
eucarióticos.
• Se habla de transfección estable cuando el plásmido se ha
integrado a uno ó más cromosomas eucariotas.
CO-TRANSFECCION
La co-transfección es la transfección simultánea de varios
plásmidos. Mediante la co-transfección se puede verificar si la
transfección se ha realizado correctamente. Para lograrlo se cotransfecta un plásmido cuya presencia es verificada por una
reacción rápida y simple que indica que el plásmido de interés ha
sido bien transfectado.
GENES REPORTEROS O MARCADORES
GENES REPORTEROS O MARCADORES
GENES REPORTEROS O MARCADORES
2. FAGOS
¿ Qué son los virus ?
ESTRUCTURA DE LOS FAGOS
FAGOS
ICOSAEDRICOS
FAGOS
HELICOIDALES
CICLO
LITICO
VS.
CICLO
LISOGÉNICO
CLASIFICACION DE LOS FAGOS
• El genoma de los fagos puede ser:
-
RNA simple cadena (MS2, Qß),
RNA doble cadena (phi 6),
DNA simple cadena (phi X174, fd, M13) o
DNA doble cadena (T3, T7, lambda , T5, Mu, T2, T4).
• Los fagos pueden ser:
-líticos,
-temperados o lisogénicos
PARA PENSAR …..
LOS FAGOS UTILIZADOS COMO
VECTORES
¿SON LÍTICOS O LISOGÉNICOS?
PLÁSMIDO
FAGOS
3.Cósmidos
4. BAC
BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOME