Download 1 - Mi Portal
Document related concepts
Transcript
UNIVERSIDAD DE ALCALÁ DE HENARES PRÁCTICAS DE FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA Curso 2007-2008 LICENCIATURA EN CIENCIAS AMBIENTALES Departamento de Microbiología y Parasitología 1.- ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL En Microbiología es imprescindible que tanto el material como los medios de cultivo que se utilizan, estén libres de toda clase de microorganismos. Esto se consigue mediante la esterilización. Si bien existen distintos métodos físicos y químicos de esterilización, en estas prácticas se utilizará la esterilización física por calor, que es la más empleada en un laboratorio de Microbiología Básica. A) Esterilización por calor seco: El calor directo, "incineración", se emplea para esterilizar el asa de siembra. Consiste en someter directamente a la acción de la llama de un mechero de gas el asa de siembra hasta la incandescencia. A su vez, otros materiales como espátulas, bocas de tubos de ensayo, cuellos de matraces etc… son flameados directamente sobre la llama del mechero (simplemente pasados por la llama) antes y después de su utilización. El calor seco en "Horno Pasteur" se emplea para esterilizar el material de vidrio como matraces, probetas, tubos, pipetas etc. La esterilización se consigue a temperaturas de 160-180 ºC durante 2-3 horas. B) Esterilización por calor húmedo: La esterilización por calor húmedo se lleva a cabo en el "Autoclave". Este aparato es esencial en un laboratorio de Microbiología, ya que en él se esterilizan los medios de cultivo. A su vez, puede ser empleado también para esterilizar cualquier utensilio o instrumento que no se deteriore por el calor. En el autoclave, los materiales se someten a una temperatura de 120 ºC (correspondiente a 1 atmósfera de presión) durante 20 minutos. Una vez esterilizados en el autoclave, los medios de cultivo sólidos, que contienen agar, deben ser vertidos en placas Petri o colocados en baños de agua a 55-60 ºC antes de ser repartidos en placas para evitar su solidificación. Material a esterilizar Los objetos que el alumno esterilizará en estas prácticas son: Pipetas Asa de siembra Asa de vidrio Procedimiento La esterilización de pipetas se llevará a cabo en el Horno Pasteur. En primer lugar se introduce un poquito de algodón graso en la boca de la pipeta, como protección para evitar la contaminación del investigador y también de la muestra. A continuación, se envuelven en papel "manila", utilizando la superficie rugosa para rodear al material y 2 dejando la cara brillante del papel hacia fuera. Finalmente, se depositan las pipetas en el Horno Pasteur. El asa de siembra, se esteriliza en la llama del mechero de gas hasta incandescencia. Su filamento de nicrón debe ponerse rojo en toda su longitud. El asa de vidrio se humedece en alcohol y se flamea en la llama del mechero. Para ello, es suficiente con pasar el asa humedecida por la llama, retirándola inmediatamente. 2.- SIEMBRA DE MICROORGANISMOS La siembra es un proceso mediante el cual llevamos una porción de un cultivo de un microorganismo denominado inóculo a un medio de cultivo adecuado para su crecimiento. Toda siembra de microorganismos debe realizarse en condiciones de esterilidad. El inóculo puede proceder de un medio sólido, líquido o semisólido y lo podemos inocular en un medio sólido, líquido o semisólido. La transferencia del inóculo puede hacerse utilizando el asa de siembra o una pipeta, dependiendo del experimento en cuestión. Material Cultivos puros de bacterias en tubos de agar nutritivo (AN) inclinado Tubos de agar nutritivo Objetivo Sembrar en tubo un microorganismo Gram positivo y otro Gram negativo. Procedimiento Para realizar la siembra de un microorganismo contenido en un tubo a otro tubo se procede de la siguiente manera: 1.- Los tubos, tanto el que contiene el cultivo puro del microorganismo como el que contiene el medio virgen, se deben tomar con la mano izquierda. Con la mano derecha se toma el asa y se esteriliza a la llama del mechero, hasta que se pone al rojo. 2.- Se destapa el tubo que contiene el microorganismo, tomando el tapón con el dedo meñique de la mano derecha. Se esteriliza la boca del tubo pasándolo ligeramente por la llama del mechero. Se introduce el asa, se roza suavemente la superficie del cultivo, y se saca el asa con cuidado para no tocar las paredes del tubo. Se esteriliza la boca del tubo y se cierra. 3.- Se abre el tubo que contiene el medio virgen y se esteriliza la boca en la llama del mechero. Se introduce el asa de siembra (que contiene una muestra del microorganismo) hasta el fondo del tubo. Al sacar de nuevo el asa se avanza en zig-zag sobre la superficie del agar. De esta forma se extiende el microorganismo en la superficie del medio sólido. Se flamea la boca del tubo antes de cerrarlo de nuevo, y el asa de siembra se esteriliza a la llama del mechero. 3 Los tubos inoculados se incuban en una estufa a 37 ºC durante 24 horas, escribiendo el nombre del microorganismo resembrado en el tubo nuevo. 3.- OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE MICROORGANISMOS El microscopio óptico es esencial en un laboratorio de Microbiología. Se emplea para la observación de microorganismos en fresco (vivos) o previa tinción de los mismos (fijados). Al microscopio óptico, podemos determinar la morfología de los microorganismos, sus agrupaciones, su movilidad (en fresco) y determinadas características estructurales. En estas prácticas se observarán al microscopio óptico distintos cultivos de bacterias. Debido a su pequeño tamaño, se emplearán para su visualización distintas tinciones que además de facilitar su visualización, nos permitirán determinar distintas características estructurales de las mismas. A su vez, mediante preparaciones en fresco se observará la morfología de distintos microorganismos eucariotas: levaduras y hongos filamentosos. a) Preparaciones en fresco La observación de preparaciones en fresco es útil para comparar el tamaño, disposición y sobre todo la movilidad de los microorganismos. Existen distintos métodos, aunque el más empleado y que se utilizará en estas prácticas es el montaje húmedo. Para ello se coloca una gota de una suspensión de microorganismo sobre un portaobjetos y se deposita sobre ella un cubreobjetos, procurando no queden encerradas burbujas. La visualización se realiza en el microscopio óptico comenzando a enfocar con el objetivo de menor aumento. Posteriormente, y de forma progresiva se pasa a objetivos de mayor aumento hasta que la visualización de la muestra sea adecuada. 4 b) Tinción de bacterias La tinción de bacterias proporciona contraste entre el microorganismo y el entorno, permitiendo diferenciar los tipos morfológicos de bacterias, así como, en su caso, estructuras internas y externas. En función de los colorantes empleados existen distintos tipos de tinciones: Tinción simple. Emplea un solo colorante, generalmente el azul de metileno. Tinción negativa. Colorea el entorno permaneciendo la bacteria sin teñir. Se realiza con el colorante nigrosina o con tinta china. Tinciones diferenciales. Emplean más de un colorante, por lo que las bacterias o estructuras bacterianas pueden teñirse de distintos colores. Para realizar las tinciones de bacterias se emplea el siguiente procedimiento. 1.- Realización de un frotis. Para realizar un frotis de la muestra a analizar, en primer lugar se coloca una gotita de agua sobre un portaobjetos y sobre ella se deposita una porción del cultivo, extendiéndola bien sobre la superficie del porta. 2.- Fijación a la llama del mechero. La fijación a la llama del mechero adhiere (fija) los microorganismos al portaobjetos, de manera que sobre ellos se pueden añadir distintos colorantes sin que sean eliminados físicamente por lavado. Para fijar la preparación, ésta debe pasarse sobre la llama del mechero hasta la evaporación del agua presente en la misma. Es preciso evitar el calentamiento excesivo de la preparación para no destruir la estructura de los microorganismos (evitar "achicharrarlos"). Para ello, se sugiere pasar la preparación 3-4 veces sobre la llama y dejar enfriar ligeramente. Continuar con esta operación hasta que la muestra esté seca. 3.- Adición de colorantes. Los colorantes se añaden sobre la preparación de forma que cubran la muestra completamente. Los utensilios que se emplean en este proceso son un cristalizador, una varilla de tinción y los frascos de colorantes. 4.- Observación al microscopio óptico. Una vez finalizada la aplicación de colorantes, la preparación se deja secar al aire y una vez seca se visualiza en el microscopio óptico. Para ello, enfocar la preparación con el objetivo de menor aumento y llegar progresivamente al objetivo de inmersión, para el que se requiere la adición de aceite de inmersión. 5 1) TINCIÓN SIMPLE El colorante más empleado en la tinción simple de bacterias es el azul de metileno. Procedimiento: Frotis de la muestra Fijación a la llama del mechero Adición del colorante azul de metileno durante 2 minutos. Retirar el colorante y lavar con agua. Secar al aire y observar al microscopio. Con la tinción simple podemos observar claramente la morfología de las bacterias, así como las agrupaciones de las mismas. 2) TINCIÓN NEGATIVA La tinción negativa se emplea en Bacteriología para observar la morfología de las bacterias y para visualizar la cápsula, estructura externa a la pared celular que aparece en algunas de ellas. Procedimiento: Colocar una gota de nigrosina sobre un portaobjetos. Añadir sobre ella una porción del cultivo a analizar. Secar al aire y observar al microscopio. En la tinción negativa, las células aparecen transparentes mientras que el fondo aparece negro. Esto resalta la morfología de la bacteria analizada, así como la presencia de la cápsula, si ésta existe. 3) TINCIÓN DE GRAM Es la tinción diferencial más importante en Bacteriología, ya que permite clasificar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas en función del color que adquieran sus células. Procedimiento: Frotis de la muestra. Fijación a la llama del mechero. 6 Adición del colorante primario cristal violeta durante 2 minutos. Escurrir el exceso de colorante y aplicar el agente mordiente lugol durante 1 minuto. Este compuesto aumenta la afinidad del cristal violeta por las células. Decolorar con alcohol de 96º. Añadir 3 veces alcohol a la preparación y tirarlo a continuación. Lavar con agua una vez eliminado el alcohol Aplicar el colorante secundario o de contraste safranina durante 1 minuto. Lavar con agua, secar al aire y observar al microscopio. Las bacterias Gram positivas aparecen coloreadas de violeta y las Gram negativas de color rojizo correspondiente a la safranina. 4) TINCIÓN DE ESPORAS, MÉTODO DE WIRTZ Las esporas o endosporas bacterianas son estructuras altamente resistentes al calor, a la desecación, a radiaciones y a compuestos químicos. Las endosporas se forman en el interior de bacterias de distintos géneros, entre los que destacan Bacillus y Clostridium. Por técnicas normales de tinción, estas estructuras no se tiñen apareciendo como formas altamente refringentes. Mediante la utilización del calor, que facilita la penetración del colorante, y de colorantes más concentrados, las esporas se tiñen y resisten la decoloración. La utilización de un colorante de contraste permite la diferenciación de las células vegetativas de las esporas. Procedimiento: Frotis de un cultivo de Bacillus. Fijación a la llama. Cubrir la preparación con verde malaquita, calentando la preparación durante 5 minutos con un hisopo de algodón empapado en alcohol. El calentamiento debe ser intermitente hasta que se produzcan vapores. Escurrir el colorante y lavar con agua destilada. Añadir el colorante de contraste safranina durante 1 minuto. Lavar con agua destilada, secar y observar al microscopio. Las esporas aparecen coloreadas de verde mientras que las células vegetativas presentan el color de la safranina. 7 5) TINCIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS Ciertas especies de bacterias de los géneros Lactobacillus y Spirillum, presentan gránulos o inclusiones con diferente capacidad tintorial al resto de la célula. Dichos gránulos, denominados corpúsculos metacromáticos, son inclusiones de polifosfatos que actúan como material de reserva. Procedimiento: Realizar un frotis con una porción de yogur que previamente ha sido incubado durante 24 horas a 37 ºC. Fijar a la llama. Añadir azul de metileno durante 5 minutos. Lavar con agua, secar y observar al microscopio. Los corpúsculos metacromáticos aparecen teñidos de azul más intenso que el resto de la célula bacteriana. 6) TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE O ZIEHL-NEELSEN Algunas bacterias como las pertenecientes al género Mycobacterium como Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis, son difíciles de teñir por procedimientos normales debido a la presencia en su pared celular de ácidos micólicos en gran cantidad (40%), lo que les confiere gran impermeabilidad. La tinción de estas micobacterias es facilitada por la aplicación de calor. Además, una vez teñidas retienen el colorante incluso tras ser decoloradas con potentes agentes como el alcohol-ácido. De ahí su nombre de ácido-alcohol resistentes. Procedimiento: Realizar un frotis de Mycobacterium smegmatis y Micrococcus luteus. Fijar a la llama. Añadir fuchsina fenicada y durante 5 minutos calentar por debajo de la preparación con un hisopo encendido, de manera intermitente, hasta la emisión de vapores, pero evitando que hierva. Decolorar con alcohol-ácido durante 2 minutos. Lavar con agua destilada. Añadir el colorante de contraste azul de metileno durante 1 minuto. 8 Lavar con agua destilada, secar al aire y observar con objetivo de inmersión. Las micobacterias aparecen teñidas del color de la fuchsina, mientras que las bacterias que no pertenecen a este grupo (la mayoría de las bacterias) aparecen teñidas de azul. 4.- OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE OTROS MICROORGANISMOS Además de las bacterias más "clásicas" se observarán al microscopio otros microorganismos procariotas y eucariotas. A) Procariotas: 1) Actinomicetos. Son bacterias filamentosas que presentan un crecimiento micelial característico formando colonias secas y pulverulentas. Estas colonias se caracterizan por la presencia de un micelio sustrato adherido al agar y un micelio aéreo a partir del cual se forman esporas en cadenas. Uno de los actinomicetos más frecuentes en la Naturaleza es el género Streptomyces, productor de numerosos antibíóticos y responsable del olor a tierra mojada. La observación de las distintas fases de este ciclo de vida necesita el empleo de una metodología de cultivo especial, que se detalla a continuación: 1.- Verter en una placa de cultivo estéril el medio agar-soja fundido 2.- Colocar, de forma inclinada, en el medio de cultivo antes de que solidifique, un porta estéril. Dejar solidificar. 3.- Sembrar el microorganismo (Streptomyces) en la zona del medio de cultivo adyacente al porta. 4.- Incubar a 28 °C, durante 72 horas. 5.- Extraer el porta del medio de cultivo; fijar a la llama y hacer un Gram. B) Eucariotas: A diferencia de bacterias poseen núcleo y orgánulos típicos eucarióticos como las mitocondrias, aparato de Golgi, retículo endoplásmico, vacuolas etc. El tamaño de estos microorganismos es mayor que el de las bacterias. 1) Levaduras. Son organismos eucariotas unicelulares. Su morfología puede ser esférica como ocurre en la levadura del pan y la cerveza (Saccharomyces cerevisiae) o ovalada, característica del género Candida. En su interior fácilmente se puede visualizar vacuolas y el núcleo. 2) Hongos filamentosos. Son organismos eucariotas caracterizados por un crecimiento micelial en forma de hifas o filamentos. Las estructuras de reproducción asexual (esporas) se forman a partir de las hifas en regiones especializadas denominadas esporangióforos o conidióforos en función de su estructura. 9 Streptomyces sp Saccharomyces sp. Penicillium sp. Aspergillus sp 10 5.- AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE UNA POBLACIÓN MIXTA En la Naturaleza los microorganismos aparecen formando poblaciones mixtas y heterogéneas de células, donde cada célula microbiana lleva a cabo sus funciones vitales de forma independiente. Para estudiar las funciones de cada especie o cepa microbiana presente en un ambiente natural es preciso aislarla del resto de células con las que convive naturalmente. Los métodos de aislamiento de microorganismos y la obtención de cultivos puros a partir de muestras naturales son: 1) Siembra por agotamiento. 2) Diluciones sucesivas de la muestra. 3) Cultivo por enriquecimiento. En esta práctica aprenderemos a utilizar el primer método, la siembra por agotamiento. Con ella conseguimos obtener colonias aisladas que provienen del crecimiento de una sola célula, siendo, por tanto, un cultivo puro o un clon. Procedimiento: A partir de una población mixta de microorganismos se aislarán distintas bacterias mediante el proceso de siembra por agotamiento. Para ello, y en condiciones de esterilidad, se tomará con el asa de siembra un inóculo de la población mixta y se sembrará en una placa Petri con medio PCA (medio nutritivo) en la dirección (1) haciendo varias estrías. Esterilizar el asa de siembra y extender parte del inóculo anterior haciendo estrías en la dirección (2). Esterilizar el asa de siembra y extender parte del inóculo anterior haciendo estrías en la dirección (3). Esterilizar el asa de siembra y hacer un cuarto grupo de estrías (4). 1 2 3 4 Incubar la placa a 37 ºC durante 24 horas. Observar la presencia de colonias aisladas. Colonias de apariencia diferente provienen de microorganismos diferentes 11 mientras que colonias de la misma morfología, color y apariencia provienen del mismo tipo de microorganismo. 6.- AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS PRESENTES EN UNA MUESTRA DE SUELO El suelo contiene numerosos microorganismos. Los más frecuentes son bacterias unicelulares, actinomicetos, hongos filamentosos y levaduras. Estos microorganismos pueden ser aislados mediante la utilización de medios de cultivos adecuados. El número de microorganismos presentes en una muestra de suelo depende de gran número de factores. Las condiciones ambientales, físicas y químicas del suelo determinan en gran medida el número de microorganismos presentes y el tipo específico de estos. Por ejemplo, suelos altamente contaminados apenas contienen microorganismos. Los suelos muy ácidos sólo presentarán microorganismos acidófilos, ya que son los únicos capaces de desarrollarse, mientras en suelos neutros el número y la diversidad microbiana aumenta. El método empleado en Microbiología para determinar el número de microorganismos viables en una muestra determinada, en nuestro caso una muestra de suelo, es el de las diluciones sucesivas o seriadas. Este método también permite la obtención de colonias aisladas y por tanto la obtención de cultivos puros. El fundamento de este método es la dilución de una muestra microbiana en agua destilada estéril hasta obtener una alícuota suficientemente diluida que al ser inoculada en una placa Petri genere colonias aisladas que puedan ser contadas. Procedimiento: Se empleará un gramo de tierra como muestra de análisis. Dicho gramo será vertido en un tubo que contiene 9 ml de agua destilada estéril. De esta manera se consigue la dilución 10-1. Tras homogeneizar la muestra se toma con una pipeta estéril 1 ml de la dilución 10-1 y se lleva a un tubo con agua destilada estéril obteniéndose así la dilución 10-2. Este procedimiento se repite hasta conseguir la dilución 10-5. De cada una de las diluciones anteriores se toma con una pipeta estéril 0,1 ml de muestra y se deposita en el centro de una placa Petri con medio de cultivo PCA (Plate Count Agar) o de recuento en placa. El inóculo se extiende sobre la superficie de la placa con el asa de vidrio y finalmente las placas obtenidas (10-1 a 10-5) se incuban a 37 ºC durante 24-48 horas. Transcurrido este tiempo se determina el número de microorganismos mesófilos viables presentes en la muestra analizada. Para ello se emplea una placa que contenga entre 30-300 colonias aisladas. Con el número de colonias contadas se determina el número de microorganismos viables o U.F.C. presentes en 1 gramo de tierra utilizando esta fórmula. N= C x 1/D x 1/i 12 N= número de células viables o u.f.c./gramo. C= número de colonias contadas en la placa. D= dilución empleada. I = inóculo empleado. 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 gr. de tierra 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 (0,1 ml) P.C.A .A 10-4 1 0-5 13 7.- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA. COLIMETRÍA PRESUNTIVA Y CONFIRMATIVA El agua se puede considerar como un medio fundamental para la vida. Interviene en nuestra alimentación y en la preparación de alimentos y puede ser, además, un vector de gérmenes peligrosos. Su análisis es de extrema importancia, puesto que de su calidad depende la salud pública. El Real Decreto 144/2003 establece los criterios sanitarios que deben cumplir las aguas de consumo humano y las instalaciones que permiten su suministro desde la captación hasta el grifo del consumidor y el control de éstas, garantizando su salubridad, calidad y limpieza, con el fin de proteger la salud de las personas de los efectos adversos derivados de cualquier tipo de contaminación de las aguas. Aguas de consumo humano Parámetros microbiológicos definidos según el Real Decreto 140/2003. 14 Objetivo Realizar un recuento de las bacterias coliformes totales y de los coliformes fecales (E. coli), presentes en una muestra de agua potable, utilizando la técnica del Número Más Probable (NMP). Las enterobacterias lactosa positivas o coliformes son microorganismos capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, en presencia de sales biliares. La investigación y recuento de coliformes y sobre todo, de coliformes fecales (Escherichia coli) son operaciones fundamentales en la Microbiología de los Alimentos, ya que estos microorganismos son indicadores de contaminación fecal. Dado que ciertos coliformes no tienen origen fecal, se ha sugerido la necesidad de separar los coliformes fecales de los no fecales, y utilizar preferentemente a los primeros como indicadores. Por ello, se recurre al empleo de ciertas características de la bacteria de origen fecal por excelencia: E. coli, como son su crecimiento en medios lactosados-biliados, temperatura selectiva de incubación (43-45 ºC) y capacidad de producir indol en agua de peptona. La presencia de E. coli en aguas o en alimentos indica claramente, contaminación fecal contraída de manera directa o indirecta. Procedimiento: 1) COLIFORMES TOTALES A) Colimetría presuntiva Se emplea como medio de cultivo líquido el caldo McConkey que contiene lactosa y un indicador de pH, el púrpura de bromocresol. Este medio a pH ácido es amarillo y a pH básico o neutro es púrpura. Se inoculan tres series de tubos cada una con: a) tres tubos de 10 ml de MacConkey doble concentrado. b) tres tubos de 9 ml de MacConkey de concentración normal. c) tres tubos de 9,9 ml de MacConkey de concentración normal. A la primera serie de 10 ml se le añaden 10 ml del agua problema. A la segunda serie de 9 ml se le añaden 1 ml de agua problema y a la tercera serie de 9,9 ml se le añaden 0,1 ml de agua problema. Tras incubar la batería de tubos a 37 ºC durante 24 horas, la presencia de coliformes se detecta por el viraje del indicador del medio a amarillo y por la aparición de gas en la campana Durham. El número de coliformes presente en la muestra de agua contaminada se determina mediante el Número Más Probable o NMP. 15 Caldo McConkey Incubar 37ºC 24 horas B) Colimetría confirmativa. Transferir 0,1 ml de un tubo positivo de caldo McConkey a placas VRBA utilizando la técnica de siembra por agotamiento. Incubar a 37 ºC durante 24 horas. La presencia de coliformes totales se detecta por la aparición de colonias rodeadas de un halo púrpura como consecuencia de la precipitación de sales biliares. 2) COLIFORMES FECALES Inocular una alícuota de un tubo positivo de caldo McConkey obtenido en la detección de coliformes totales en un tubo de caldo McConkey estéril. Incubar a 44 ºC durante 24 horas. Inocular de un tubo positivo de McConkey a 44 ºC una alícuota mediante la técnica de siembra por agotamiento en medio agar Levine. Incubar a 44 ºC durante 24 horas. Las colonias de Escherichia coli en agar-Levine son de 2-3 mm de diámetro y presentan un centro azul-negro con brillo metálico cuando se observan con luz reflejada. A veces el brillo no se manifiesta. Además, es necesario también realizar pruebas de confirmación complementarias (I.M.Vi.C.) con una colonia presuntamente de E. coli crecida en agarLevine. Indol (I): Tomar una colonia crecida en agar-Levine, presuntamente de E. coli, e inocularla en un tubo con agua de peptona (AP). Incubar a 37 ºC durante 24 horas. Tras el periodo de incubación mencionado, añadir 2-3 gotas de reactivo de Ehrlich-Kovacs. Si aparece una coloración o anillo rojo en la superficie del tubo la prueba es positiva. Rojo de Metilo (M): Tomar una colonia crecida en agar-Levine, presuntamente de E. coli, e inocularla en un tubo de medio caldo glucosado o Clark y Lubs (RMVP). Incubar a 37 16 ºC durante 24 horas. Añadir, tras el periodo de incuabación 1-2 gotas del reactivo rojo de metilo que es un indicador de pH que vira a color rojo a pH inferiores a 4,4 mientras es incoloro a pH superiores. Una coloración roja para el tubo analizado indicará que la prueba es positiva. La acidez generada en el tubo es debida a la producción de una mezcla de ácidos por fermentación de la glucosa. Acetil metil carbinol (Voges Proskauer) (VP): Tomar una colonia crecida en agar-Levine, presuntamente de E. coli, e inocularla en un tubo de medio caldo glucosado o Clark y Lubs (RMVP). Incubar a 37 ºC durante 24 horas. Añadir 0,6 ml de -naftol al 40% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar para intensificar la reacción. Un color rojo del tubo a los 10 minutos significa que la prueba es positiva demostrándose que la bacteria analizada degrada la glucosa mediante fermentación butanodiólica produciendo acetil-metil-carbinol o acetoina como intermediario de esta ruta. Citrato (C): Tomar una colonia crecida en agar-Levine presuntamente de E. coli e inocularla en un tubo de medio citrato de Simmons. Sembrar en superficie realizando estrias y también por picadura introduciendo el asa de siembra en el medio. Con esta reacción se determina la capacidad que poseen algunos microorganismos para utilizar el citrato como única fuente de carbono. La positividad de la prueba se demuesta por el crecimiento en el pico de flauta y el viraje del color del medio de cultivo de verde a azul, debido a la alcalinización del medio. El resultado para Escherichia coli en la prueba del IMViC es el siguiente: Escherichia coli Enterobacter aerogenes I + M + Vi C - - - - + + 17 7) AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE LA GARGANTA En la boca, garganta y fosas nasales de un individuo sano se encuentran un número considerable de bacterias, algunas de ellas patógenas en potencia, pudiendo por tanto ocasionar enfermedad en algunas personas. Entre los microorganismos más frecuentes presentes en la garganta y en las fosas nasales están Staphylococcus aureus, estreptococos de distintas especies, neumococos, bacilos diftéricos, Branhamella catarrhalis y Haemophilus influenzae. En la cavidad orofaríngea existe una abundante flora microbiana. Las muestras de exudado faríngeo se recogen en pacientes que presentan, por ejemplo, amigdalitis. Se suele buscar la presencia de estreptococos -hemolíticos del grupo A (Streptococcus pyogenes). Material: -Placas de Agar Sangre. -Hisopo estéril. -Asa de siembra. Procedimiento: a) Tomar una muestra de la garganta con un hisopo estéril. b) Inocular las placas de agar sangre con los microorganismos presentes en el hisopo. Para ello frotar el hisopo en una pequeña porción de agar y extender el inóculo por agotamiento con el asa de siembra. Incubar a 37º C durante 24 horas. c) Observar las distintas colonias aparecidas y hacer una tinción de Gram de las colonias crecidas. Ciertos microorganismos cuando crecen en el medio de agar sangre producen reacciones de hemólisis que pueden ser de dos tipos: y . La reacción de -hemólisis se caracteriza por la aparición de un halo verdoso alrededor de las colonias a veces con desintegración parcial de los glóbulos rojos. Cuando se produce la -hemólisis aparece un halo transparente alrededor de las colonias, como consecuencia de la lisis total de los glóbulos rojos. 18 Plan de realización de las prácticas Día 1 (lunes). Siembra de bacterias en tubos de agar nutritivo (una bacteria Gram positiva y otra Gram negativa). Tinción simple de cultivos de bacterias; una Gram positiva y otra Gram negativa. Tinción negativa de cultivos de bacterias; una Gram positiva y otra Gram negativa. Tinción de Gram de cultivos de bacterias; una Gram positiva y otra Gram negativa. Colimetría Presuntiva. Siembra en agar soja del actinomiceto Preparación de una placa de agar PCA Día 2 (martes). Ver resultados de los cultivos realizados. Confirmar la presencia de las bacterias inoculadas mediante tinción de Gram. Ver resultados de la colimetría presuntiva. Determinar el número de coliformes mediante el Número Más Probable (NMP). Colimetría Confirmativa: a) Coliformes totales b) Coliformes fecales. Aislamiento y recuento de microorganismos aerobios mesófilos del suelo. Aislamiento de microorganismos de una población mixta. Tinción de esporas. Aislamiento en agar sangre de microorganismos presentes en la garganta. Día 3 (miércoles). Ver resultados de la colimetría confirmativa. Identificación de Escherichia coli mediante IMViC (inoculación de las pruebas bioquímicas). Ver resultados del aislamiento realizado. Confirmar el aislamiento mediante tinción de Gram. Tinción de corpúsculos metacromáticos. Tinción ácido-alcohol resistente. Tinción de Gram de las colonias crecidas en agar sangre Día 4 (jueves). Ver resultados de IMViC. Determinar el número de bacterias mesófilas presentes en muestra de suelo. Observación microscópica de colonias pertenecientes a la muestra de suelo: tinción en fresco y tinción de Gram. Observación microscópica de actinomicetos. Gram y tinción en fresco. Observación microscópica de levaduras; tinción en fresco. Observación microscópica de hongos filamentosos: tinción en fresco. 19 NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) Número de tubos que dan la reacción positiva 3 tubos de 10 ml 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 tubos de 1 ml 0 0 1 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 tubos de 0,1 ml NMP/100 ml de agua 0 <3 1 3 0 3 0 4 1 7 0 7 1 11 0 11 0 9 1 14 0 15 1 20 0 21 1 28 0 23 1 39 2 64 0 43 1 75 2 120 0 93 1 150 2 210 0 240 1 480 2 1100 3 >2400 20 MEDIOS DE CULTIVO Composición (g/l agua destilada) Agar nutritivo Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Cloruro sódico Agar pH: 7,4 (aprox.) PCA (plate count agar) 1 2 5 5 20 Caldo MacConkey Lactosa Peptona Sales biliares Cloruro sódico Púrpura de bromocresol 10 20 5 5 0,01 Agua de peptona pH: 7,0 ± 0,2 10 5 9 1,5 Agar sangre Glucosa Extracto de levadura Triptona 1 2,5 5 Harina de soja 20 Agar pH: 7,0 ± 0,2 20 Agar 20 Agar MacConkey pH: 7,4 ± 0,2 Peptona Cloruro sódico Fosfato disódico Fosfato potásico Agar soja Lactosa Peptona Sales biliares Cloruro sódico Rojo neutro Cristal violeta Agar pH: 7,2 ± 0,2 Caldo glucosado (caldo MRVP) (medio de Clark y Lubs) Glucosa Peptona Fosfato potásico pH: 7,0 (aprox.) 10 20 1,5 5 0,03 0,001 20 VRBA (violet red bile agar) Extracto de levadura 3 Lactosa 10 Peptona 7 Sales biliares 1,5 Cloruro sódico 5 Rojo neutro 0,03 Cristal violeta 0,002 Agar 20 pH: 7,4 ± 0,2 Agar citrato de Simmons 5 7 5 Citrato sódico Fosfato monoamónico Fosfato dipotásico Sulfato magnésico Cloruro sódico Azul de bromotimol Agar pH: 6,8 ± 0,2 2 1 1 0,2 5 0,08 20 Extracto de carne Triptona Cloruro sódico Sangre de oveja desfibrinada Agar 10 10 5 7% 20 Agar Levine (Agar EMB) Lactosa Peptona Fosfato dipotásico Eosina amarilla Azul de metileno Agar pH: 7,1 ± 0,2 10 10 2 0,4 0,065 20