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UNIVERSIDAD DE ALCALÁ DE HENARES
PRÁCTICAS DE FUNDAMENTOS DE
MICROBIOLOGÍA
Curso 2007-2008
LICENCIATURA EN CIENCIAS AMBIENTALES
Departamento de Microbiología y Parasitología
1.- ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL
En Microbiología es imprescindible que tanto el material como los medios de
cultivo que se utilizan, estén libres de toda clase de microorganismos. Esto se consigue
mediante la esterilización.
Si bien existen distintos métodos físicos y químicos de esterilización, en estas
prácticas se utilizará la esterilización física por calor, que es la más empleada en un
laboratorio de Microbiología Básica.
A) Esterilización por calor seco:
 El calor directo, "incineración", se emplea para esterilizar el asa de siembra.
Consiste en someter directamente a la acción de la llama de un mechero de gas
el asa de siembra hasta la incandescencia. A su vez, otros materiales como
espátulas, bocas de tubos de ensayo, cuellos de matraces etc… son flameados
directamente sobre la llama del mechero (simplemente pasados por la llama)
antes y después de su utilización.
 El calor seco en "Horno Pasteur" se emplea para esterilizar el material de
vidrio como matraces, probetas, tubos, pipetas etc. La esterilización se consigue
a temperaturas de 160-180 ºC durante 2-3 horas.
B) Esterilización por calor húmedo:
 La esterilización por calor húmedo se lleva a cabo en el "Autoclave". Este
aparato es esencial en un laboratorio de Microbiología, ya que en él se
esterilizan los medios de cultivo. A su vez, puede ser empleado también para
esterilizar cualquier utensilio o instrumento que no se deteriore por el calor. En
el autoclave, los materiales se someten a una temperatura de 120 ºC
(correspondiente a 1 atmósfera de presión) durante 20 minutos. Una vez
esterilizados en el autoclave, los medios de cultivo sólidos, que contienen agar,
deben ser vertidos en placas Petri o colocados en baños de agua a 55-60 ºC antes
de ser repartidos en placas para evitar su solidificación.
Material a esterilizar
Los objetos que el alumno esterilizará en estas prácticas son:



Pipetas
Asa de siembra
Asa de vidrio
Procedimiento
La esterilización de pipetas se llevará a cabo en el Horno Pasteur. En primer
lugar se introduce un poquito de algodón graso en la boca de la pipeta, como protección
para evitar la contaminación del investigador y también de la muestra. A continuación,
se envuelven en papel "manila", utilizando la superficie rugosa para rodear al material y
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dejando la cara brillante del papel hacia fuera. Finalmente, se depositan las pipetas en el
Horno Pasteur.
El asa de siembra, se esteriliza en la llama del mechero de gas hasta
incandescencia. Su filamento de nicrón debe ponerse rojo en toda su longitud. El asa de
vidrio se humedece en alcohol y se flamea en la llama del mechero. Para ello, es
suficiente con pasar el asa humedecida por la llama, retirándola inmediatamente.
2.- SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
La siembra es un proceso mediante el cual llevamos una porción de un cultivo
de un microorganismo denominado inóculo a un medio de cultivo adecuado para su
crecimiento. Toda siembra de microorganismos debe realizarse en condiciones de
esterilidad. El inóculo puede proceder de un medio sólido, líquido o semisólido y lo
podemos inocular en un medio sólido, líquido o semisólido. La transferencia del inóculo
puede hacerse utilizando el asa de siembra o una pipeta, dependiendo del experimento
en cuestión.
Material


Cultivos puros de bacterias en tubos de agar nutritivo (AN) inclinado
Tubos de agar nutritivo
Objetivo
Sembrar en tubo un microorganismo Gram positivo y otro Gram negativo.
Procedimiento
Para realizar la siembra de un microorganismo contenido en un tubo a otro tubo se
procede de la siguiente manera:
1.- Los tubos, tanto el que contiene el cultivo puro del microorganismo como el que
contiene el medio virgen, se deben tomar con la mano izquierda. Con la mano derecha
se toma el asa y se esteriliza a la llama del mechero, hasta que se pone al rojo.
2.- Se destapa el tubo que contiene el microorganismo, tomando el tapón con el dedo
meñique de la mano derecha. Se esteriliza la boca del tubo pasándolo ligeramente por la
llama del mechero. Se introduce el asa, se roza suavemente la superficie del cultivo, y se
saca el asa con cuidado para no tocar las paredes del tubo. Se esteriliza la boca del tubo
y se cierra.
3.- Se abre el tubo que contiene el medio virgen y se esteriliza la boca en la llama del
mechero. Se introduce el asa de siembra (que contiene una muestra del
microorganismo) hasta el fondo del tubo. Al sacar de nuevo el asa se avanza en zig-zag
sobre la superficie del agar. De esta forma se extiende el microorganismo en la
superficie del medio sólido. Se flamea la boca del tubo antes de cerrarlo de nuevo, y el
asa de siembra se esteriliza a la llama del mechero.
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Los tubos inoculados se incuban en una estufa a 37 ºC durante 24 horas, escribiendo el
nombre del microorganismo resembrado en el tubo nuevo.
3.- OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE MICROORGANISMOS
El microscopio óptico es esencial en un laboratorio de Microbiología. Se emplea
para la observación de microorganismos en fresco (vivos) o previa tinción de los
mismos (fijados). Al microscopio óptico, podemos determinar la morfología de los
microorganismos, sus agrupaciones, su movilidad (en fresco) y determinadas
características estructurales.
En estas prácticas se observarán al microscopio óptico distintos cultivos de
bacterias. Debido a su pequeño tamaño, se emplearán para su visualización distintas
tinciones que además de facilitar su visualización, nos permitirán determinar distintas
características estructurales de las mismas. A su vez, mediante preparaciones en fresco
se observará la morfología de distintos microorganismos eucariotas: levaduras y hongos
filamentosos.
a) Preparaciones en fresco
La observación de preparaciones en fresco es útil para comparar el tamaño,
disposición y sobre todo la movilidad de los microorganismos. Existen distintos
métodos, aunque el más empleado y que se utilizará en estas prácticas es el montaje
húmedo. Para ello se coloca una gota de una suspensión de microorganismo sobre un
portaobjetos y se deposita sobre ella un cubreobjetos, procurando no queden encerradas
burbujas. La visualización se realiza en el microscopio óptico comenzando a enfocar
con el objetivo de menor aumento. Posteriormente, y de forma progresiva se pasa a
objetivos de mayor aumento hasta que la visualización de la muestra sea adecuada.
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b) Tinción de bacterias
La tinción de bacterias proporciona contraste entre el microorganismo y el
entorno, permitiendo diferenciar los tipos morfológicos de bacterias, así como, en su
caso, estructuras internas y externas.
En función de los colorantes empleados existen distintos tipos de tinciones:
 Tinción simple. Emplea un solo colorante, generalmente el azul de metileno.
 Tinción negativa. Colorea el entorno permaneciendo la bacteria sin teñir. Se
realiza con el colorante nigrosina o con tinta china.
 Tinciones diferenciales. Emplean más de un colorante, por lo que las
bacterias o estructuras bacterianas pueden teñirse de distintos colores.
Para realizar las tinciones de bacterias se emplea el siguiente procedimiento.
1.- Realización de un frotis.
Para realizar un frotis de la muestra a analizar, en primer lugar se coloca una
gotita de agua sobre un portaobjetos y sobre ella se deposita una porción del cultivo,
extendiéndola bien sobre la superficie del porta.
2.- Fijación a la llama del mechero.
La fijación a la llama del mechero adhiere (fija) los microorganismos al
portaobjetos, de manera que sobre ellos se pueden añadir distintos colorantes sin que
sean eliminados físicamente por lavado. Para fijar la preparación, ésta debe pasarse
sobre la llama del mechero hasta la evaporación del agua presente en la misma. Es
preciso evitar el calentamiento excesivo de la preparación para no destruir la estructura
de los microorganismos (evitar "achicharrarlos"). Para ello, se sugiere pasar la
preparación 3-4 veces sobre la llama y dejar enfriar ligeramente. Continuar con esta
operación hasta que la muestra esté seca.
3.- Adición de colorantes.
Los colorantes se añaden sobre la preparación de forma que cubran la muestra
completamente. Los utensilios que se emplean en este proceso son un cristalizador, una
varilla de tinción y los frascos de colorantes.
4.- Observación al microscopio óptico.
Una vez finalizada la aplicación de colorantes, la preparación se deja secar al
aire y una vez seca se visualiza en el microscopio óptico. Para ello, enfocar la
preparación con el objetivo de menor aumento y llegar progresivamente al objetivo de
inmersión, para el que se requiere la adición de aceite de inmersión.
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1) TINCIÓN SIMPLE
El colorante más empleado en la tinción simple de bacterias es el azul de metileno.
Procedimiento:
 Frotis de la muestra
 Fijación a la llama del mechero
 Adición del colorante azul de metileno durante 2 minutos.
 Retirar el colorante y lavar con agua.
 Secar al aire y observar al microscopio.
Con la tinción simple podemos observar claramente la morfología de las
bacterias, así como las agrupaciones de las mismas.
2) TINCIÓN NEGATIVA
La tinción negativa se emplea en Bacteriología para observar la morfología de
las bacterias y para visualizar la cápsula, estructura externa a la pared celular que
aparece en algunas de ellas.
Procedimiento:
 Colocar una gota de nigrosina sobre un portaobjetos.
 Añadir sobre ella una porción del cultivo a analizar.
 Secar al aire y observar al microscopio.
En la tinción negativa, las células aparecen transparentes mientras que el fondo
aparece negro. Esto resalta la morfología de la bacteria analizada, así como la presencia
de la cápsula, si ésta existe.
3) TINCIÓN DE GRAM
Es la tinción diferencial más importante en Bacteriología, ya que permite
clasificar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas en función del color que
adquieran sus células.
Procedimiento:
 Frotis de la muestra.
 Fijación a la llama del mechero.
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 Adición del colorante primario cristal violeta durante 2 minutos.
 Escurrir el exceso de colorante y aplicar el agente mordiente lugol durante 1
minuto. Este compuesto aumenta la afinidad del cristal violeta por las
células.
 Decolorar con alcohol de 96º. Añadir 3 veces alcohol a la preparación y
tirarlo a continuación. Lavar con agua una vez eliminado el alcohol
 Aplicar el colorante secundario o de contraste safranina durante 1 minuto.
 Lavar con agua, secar al aire y observar al microscopio.
Las bacterias Gram positivas aparecen coloreadas de violeta y las Gram
negativas de color rojizo correspondiente a la safranina.
4) TINCIÓN DE ESPORAS, MÉTODO DE WIRTZ
Las esporas o endosporas bacterianas son estructuras altamente resistentes al
calor, a la desecación, a radiaciones y a compuestos químicos. Las endosporas se
forman en el interior de bacterias de distintos géneros, entre los que destacan Bacillus y
Clostridium. Por técnicas normales de tinción, estas estructuras no se tiñen apareciendo
como formas altamente refringentes.
Mediante la utilización del calor, que facilita la penetración del colorante, y
de colorantes más concentrados, las esporas se tiñen y resisten la decoloración. La
utilización de un colorante de contraste permite la diferenciación de las células
vegetativas de las esporas.
Procedimiento:
 Frotis de un cultivo de Bacillus.
 Fijación a la llama.
 Cubrir la preparación con verde malaquita, calentando la preparación
durante 5 minutos con un hisopo de algodón empapado en alcohol. El
calentamiento debe ser intermitente hasta que se produzcan vapores.
 Escurrir el colorante y lavar con agua destilada.
 Añadir el colorante de contraste safranina durante 1 minuto.
 Lavar con agua destilada, secar y observar al microscopio.
Las esporas aparecen coloreadas de verde mientras que las células vegetativas
presentan el color de la safranina.
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5) TINCIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS
Ciertas especies de bacterias de los géneros Lactobacillus y Spirillum,
presentan gránulos o inclusiones con diferente capacidad tintorial al resto de la célula.
Dichos gránulos, denominados corpúsculos metacromáticos, son inclusiones de
polifosfatos que actúan como material de reserva.
Procedimiento:
 Realizar un frotis con una porción de yogur que previamente ha sido
incubado durante 24 horas a 37 ºC.
 Fijar a la llama.
 Añadir azul de metileno durante 5 minutos.
 Lavar con agua, secar y observar al microscopio.
Los corpúsculos metacromáticos aparecen teñidos de azul más intenso que el
resto de la célula bacteriana.
6) TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE O ZIEHL-NEELSEN
Algunas bacterias como las pertenecientes al género Mycobacterium como
Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis, son difíciles de teñir por
procedimientos normales debido a la presencia en su pared celular de ácidos micólicos
en gran cantidad (40%), lo que les confiere gran impermeabilidad. La tinción de estas
micobacterias es facilitada por la aplicación de calor. Además, una vez teñidas retienen
el colorante incluso tras ser decoloradas con potentes agentes como el alcohol-ácido. De
ahí su nombre de ácido-alcohol resistentes.
Procedimiento:
 Realizar un frotis de Mycobacterium smegmatis y Micrococcus luteus.
 Fijar a la llama.
 Añadir fuchsina fenicada y durante 5 minutos calentar por debajo de la
preparación con un hisopo encendido, de manera intermitente, hasta la
emisión de vapores, pero evitando que hierva.
 Decolorar con alcohol-ácido durante 2 minutos.
 Lavar con agua destilada.
 Añadir el colorante de contraste azul de metileno durante 1 minuto.
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 Lavar con agua destilada, secar al aire y observar con objetivo de
inmersión.
Las micobacterias aparecen teñidas del color de la fuchsina, mientras que las
bacterias que no pertenecen a este grupo (la mayoría de las bacterias) aparecen teñidas
de azul.
4.- OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE OTROS MICROORGANISMOS
Además de las bacterias más "clásicas" se observarán al microscopio otros
microorganismos procariotas y eucariotas.
A) Procariotas:
1) Actinomicetos. Son bacterias filamentosas que presentan un crecimiento micelial
característico formando colonias secas y pulverulentas. Estas colonias se
caracterizan por la presencia de un micelio sustrato adherido al agar y un micelio
aéreo a partir del cual se forman esporas en cadenas. Uno de los actinomicetos más
frecuentes en la Naturaleza es el género Streptomyces, productor de numerosos
antibíóticos y responsable del olor a tierra mojada. La observación de las distintas
fases de este ciclo de vida necesita el empleo de una metodología de cultivo
especial, que se detalla a continuación:
1.- Verter en una placa de cultivo estéril el medio agar-soja fundido
2.- Colocar, de forma inclinada, en el medio de cultivo antes de que solidifique, un
porta estéril. Dejar solidificar.
3.- Sembrar el microorganismo (Streptomyces) en la zona del medio de cultivo
adyacente al porta.
4.- Incubar a 28 °C, durante 72 horas.
5.- Extraer el porta del medio de cultivo; fijar a la llama y hacer un Gram.
B) Eucariotas:
A diferencia de bacterias poseen núcleo y orgánulos típicos eucarióticos como las
mitocondrias, aparato de Golgi, retículo endoplásmico, vacuolas etc. El tamaño de estos
microorganismos es mayor que el de las bacterias.
1) Levaduras. Son organismos eucariotas unicelulares. Su morfología puede ser
esférica como ocurre en la levadura del pan y la cerveza (Saccharomyces cerevisiae)
o ovalada, característica del género Candida. En su interior fácilmente se puede
visualizar vacuolas y el núcleo.
2) Hongos filamentosos. Son organismos eucariotas caracterizados por un crecimiento
micelial en forma de hifas o filamentos. Las estructuras de reproducción asexual
(esporas) se forman a partir de las hifas en regiones especializadas denominadas
esporangióforos o conidióforos en función de su estructura.
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Streptomyces sp
Saccharomyces sp.
Penicillium sp.
Aspergillus sp
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5.- AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE UNA POBLACIÓN MIXTA
En la Naturaleza los microorganismos aparecen formando poblaciones mixtas y
heterogéneas de células, donde cada célula microbiana lleva a cabo sus funciones vitales
de forma independiente. Para estudiar las funciones de cada especie o cepa microbiana
presente en un ambiente natural es preciso aislarla del resto de células con las que
convive naturalmente.
Los métodos de aislamiento de microorganismos y la obtención de cultivos
puros a partir de muestras naturales son:
1) Siembra por agotamiento.
2) Diluciones sucesivas de la muestra.
3) Cultivo por enriquecimiento.
En esta práctica aprenderemos a utilizar el primer método, la siembra por
agotamiento. Con ella conseguimos obtener colonias aisladas que provienen del
crecimiento de una sola célula, siendo, por tanto, un cultivo puro o un clon.
Procedimiento:
A partir de una población mixta de microorganismos se aislarán distintas
bacterias mediante el proceso de siembra por agotamiento.
Para ello, y en condiciones de esterilidad, se tomará con el asa de siembra un
inóculo de la población mixta y se sembrará en una placa Petri con medio PCA (medio
nutritivo) en la dirección (1) haciendo varias estrías. Esterilizar el asa de siembra y
extender parte del inóculo anterior haciendo estrías en la dirección (2). Esterilizar el asa
de siembra y extender parte del inóculo anterior haciendo estrías en la dirección (3).
Esterilizar el asa de siembra y hacer un cuarto grupo de estrías (4).
1
2
3
4
Incubar la placa a 37 ºC durante 24 horas. Observar la presencia de colonias
aisladas. Colonias de apariencia diferente provienen de microorganismos diferentes
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mientras que colonias de la misma morfología, color y apariencia provienen del mismo
tipo de microorganismo.
6.- AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS PRESENTES
EN UNA MUESTRA DE SUELO
El suelo contiene numerosos microorganismos. Los más frecuentes son bacterias
unicelulares, actinomicetos, hongos filamentosos y levaduras. Estos microorganismos
pueden ser aislados mediante la utilización de medios de cultivos adecuados.
El número de microorganismos presentes en una muestra de suelo depende de
gran número de factores. Las condiciones ambientales, físicas y químicas del suelo
determinan en gran medida el número de microorganismos presentes y el tipo específico
de estos. Por ejemplo, suelos altamente contaminados apenas contienen
microorganismos. Los suelos muy ácidos sólo presentarán microorganismos acidófilos,
ya que son los únicos capaces de desarrollarse, mientras en suelos neutros el número y
la diversidad microbiana aumenta.
El método empleado en Microbiología para determinar el número de
microorganismos viables en una muestra determinada, en nuestro caso una muestra de
suelo, es el de las diluciones sucesivas o seriadas. Este método también permite la
obtención de colonias aisladas y por tanto la obtención de cultivos puros.
El fundamento de este método es la dilución de una muestra microbiana en agua
destilada estéril hasta obtener una alícuota suficientemente diluida que al ser inoculada
en una placa Petri genere colonias aisladas que puedan ser contadas.
Procedimiento:
Se empleará un gramo de tierra como muestra de análisis. Dicho gramo será
vertido en un tubo que contiene 9 ml de agua destilada estéril. De esta manera se
consigue la dilución 10-1. Tras homogeneizar la muestra se toma con una pipeta estéril 1
ml de la dilución 10-1 y se lleva a un tubo con agua destilada estéril obteniéndose así la
dilución 10-2. Este procedimiento se repite hasta conseguir la dilución 10-5.
De cada una de las diluciones anteriores se toma con una pipeta estéril 0,1 ml de
muestra y se deposita en el centro de una placa Petri con medio de cultivo PCA (Plate
Count Agar) o de recuento en placa. El inóculo se extiende sobre la superficie de la
placa con el asa de vidrio y finalmente las placas obtenidas (10-1 a 10-5) se incuban a 37
ºC durante 24-48 horas. Transcurrido este tiempo se determina el número de
microorganismos mesófilos viables presentes en la muestra analizada. Para ello se
emplea una placa que contenga entre 30-300 colonias aisladas. Con el número de
colonias contadas se determina el número de microorganismos viables o U.F.C.
presentes en 1 gramo de tierra utilizando esta fórmula.
N= C x 1/D x 1/i
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N= número de células viables o u.f.c./gramo.
C= número de colonias contadas en la placa.
D= dilución empleada.
I = inóculo empleado.
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 gr. de tierra
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
(0,1 ml)
P.C.A
.A
10-4
1 0-5
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7.- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA. COLIMETRÍA PRESUNTIVA
Y CONFIRMATIVA
El agua se puede considerar como un medio fundamental para la vida. Interviene
en nuestra alimentación y en la preparación de alimentos y puede ser, además, un vector
de gérmenes peligrosos. Su análisis es de extrema importancia, puesto que de su calidad
depende la salud pública.
El Real Decreto 144/2003 establece los criterios sanitarios que deben cumplir las aguas
de consumo humano y las instalaciones que permiten su suministro desde la captación
hasta el grifo del consumidor y el control de éstas, garantizando su salubridad, calidad y
limpieza, con el fin de proteger la salud de las personas de los efectos adversos
derivados de cualquier tipo de contaminación de las aguas.
Aguas de consumo humano
Parámetros microbiológicos definidos según el
Real Decreto 140/2003.
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Objetivo
Realizar un recuento de las bacterias coliformes totales y de los coliformes
fecales (E. coli), presentes en una muestra de agua potable, utilizando la técnica del
Número Más Probable (NMP).
Las enterobacterias lactosa positivas o coliformes son microorganismos capaces
de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, en presencia de sales biliares. La
investigación y recuento de coliformes y sobre todo, de coliformes fecales (Escherichia
coli) son operaciones fundamentales en la Microbiología de los Alimentos, ya que estos
microorganismos son indicadores de contaminación fecal.
Dado que ciertos coliformes no tienen origen fecal, se ha sugerido la necesidad
de separar los coliformes fecales de los no fecales, y utilizar preferentemente a los
primeros como indicadores. Por ello, se recurre al empleo de ciertas características de la
bacteria de origen fecal por excelencia: E. coli, como son su crecimiento en medios
lactosados-biliados, temperatura selectiva de incubación (43-45 ºC) y capacidad de
producir indol en agua de peptona. La presencia de E. coli en aguas o en alimentos
indica claramente, contaminación fecal contraída de manera directa o indirecta.
Procedimiento:
1) COLIFORMES TOTALES
A) Colimetría presuntiva
Se emplea como medio de cultivo líquido el caldo McConkey que contiene lactosa y
un indicador de pH, el púrpura de bromocresol. Este medio a pH ácido es amarillo y a
pH básico o neutro es púrpura.
Se inoculan tres series de tubos cada una con:
a) tres tubos de 10 ml de MacConkey doble concentrado.
b) tres tubos de 9 ml de MacConkey de concentración normal.
c) tres tubos de 9,9 ml de MacConkey de concentración normal.
A la primera serie de 10 ml se le añaden 10 ml del agua problema. A la segunda
serie de 9 ml se le añaden 1 ml de agua problema y a la tercera serie de 9,9 ml se le
añaden 0,1 ml de agua problema.
Tras incubar la batería de tubos a 37 ºC durante 24 horas, la presencia de
coliformes se detecta por el viraje del indicador del medio a amarillo y por la aparición
de gas en la campana Durham. El número de coliformes presente en la muestra de agua
contaminada se determina mediante el Número Más Probable o NMP.
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Caldo McConkey
Incubar 37ºC 24 horas
B) Colimetría confirmativa.
Transferir 0,1 ml de un tubo positivo de caldo McConkey a placas VRBA
utilizando la técnica de siembra por agotamiento. Incubar a 37 ºC durante 24 horas. La
presencia de coliformes totales se detecta por la aparición de colonias rodeadas de un
halo púrpura como consecuencia de la precipitación de sales biliares.
2) COLIFORMES FECALES
Inocular una alícuota de un tubo positivo de caldo McConkey obtenido en la
detección de coliformes totales en un tubo de caldo McConkey estéril. Incubar a 44 ºC
durante 24 horas.
Inocular de un tubo positivo de McConkey a 44 ºC una alícuota mediante la
técnica de siembra por agotamiento en medio agar Levine. Incubar a 44 ºC durante 24
horas. Las colonias de Escherichia coli en agar-Levine son de 2-3 mm de diámetro y
presentan un centro azul-negro con brillo metálico cuando se observan con luz reflejada.
A veces el brillo no se manifiesta.
Además, es necesario también realizar pruebas de confirmación
complementarias (I.M.Vi.C.) con una colonia presuntamente de E. coli crecida en agarLevine.
Indol (I):
Tomar una colonia crecida en agar-Levine, presuntamente de E. coli, e
inocularla en un tubo con agua de peptona (AP). Incubar a 37 ºC durante 24 horas. Tras
el periodo de incubación mencionado, añadir 2-3 gotas de reactivo de Ehrlich-Kovacs.
Si aparece una coloración o anillo rojo en la superficie del tubo la prueba es positiva.
Rojo de Metilo (M):
Tomar una colonia crecida en agar-Levine, presuntamente de E. coli, e
inocularla en un tubo de medio caldo glucosado o Clark y Lubs (RMVP). Incubar a 37
16
ºC durante 24 horas. Añadir, tras el periodo de incuabación 1-2 gotas del reactivo rojo
de metilo que es un indicador de pH que vira a color rojo a pH inferiores a 4,4 mientras
es incoloro a pH superiores. Una coloración roja para el tubo analizado indicará que la
prueba es positiva. La acidez generada en el tubo es debida a la producción de una
mezcla de ácidos por fermentación de la glucosa.
Acetil metil carbinol (Voges Proskauer) (VP):
Tomar una colonia crecida en agar-Levine, presuntamente de E. coli, e
inocularla en un tubo de medio caldo glucosado o Clark y Lubs (RMVP). Incubar a 37
ºC durante 24 horas. Añadir 0,6 ml de -naftol al 40% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar
para intensificar la reacción. Un color rojo del tubo a los 10 minutos significa que la
prueba es positiva demostrándose que la bacteria analizada degrada la glucosa mediante
fermentación butanodiólica produciendo acetil-metil-carbinol o acetoina como
intermediario de esta ruta.
Citrato (C):
Tomar una colonia crecida en agar-Levine presuntamente de E. coli e inocularla
en un tubo de medio citrato de Simmons. Sembrar en superficie realizando estrias y
también por picadura introduciendo el asa de siembra en el medio. Con esta reacción se
determina la capacidad que poseen algunos microorganismos para utilizar el citrato
como única fuente de carbono. La positividad de la prueba se demuesta por el
crecimiento en el pico de flauta y el viraje del color del medio de cultivo de verde a
azul, debido a la alcalinización del medio.
El resultado para Escherichia coli en la prueba del IMViC es el siguiente:
Escherichia coli
Enterobacter aerogenes
I
+
M
+
Vi
C
-
-
-
-
+
+
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7) AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE LA GARGANTA
En la boca, garganta y fosas nasales de un individuo sano se encuentran un número
considerable de bacterias, algunas de ellas patógenas en potencia, pudiendo por tanto
ocasionar enfermedad en algunas personas.
Entre los microorganismos más frecuentes presentes en la garganta y en las fosas
nasales están Staphylococcus aureus, estreptococos de distintas especies, neumococos,
bacilos diftéricos, Branhamella catarrhalis y Haemophilus influenzae.
En la cavidad orofaríngea existe una abundante flora microbiana. Las muestras de
exudado faríngeo se recogen en pacientes que presentan, por ejemplo, amigdalitis. Se
suele buscar la presencia de estreptococos -hemolíticos del grupo A (Streptococcus
pyogenes).
Material:
-Placas de Agar Sangre.
-Hisopo estéril.
-Asa de siembra.
Procedimiento:
a) Tomar una muestra de la garganta con un hisopo estéril.
b) Inocular las placas de agar sangre con los microorganismos presentes en el
hisopo. Para ello frotar el hisopo en una pequeña porción de agar y extender el
inóculo por agotamiento con el asa de siembra. Incubar a 37º C durante 24
horas.
c) Observar las distintas colonias aparecidas y hacer una tinción de Gram de las
colonias crecidas. Ciertos microorganismos cuando crecen en el medio de agar
sangre producen reacciones de hemólisis que pueden ser de dos tipos:  y . La
reacción de -hemólisis se caracteriza por la aparición de un halo verdoso
alrededor de las colonias a veces con desintegración parcial de los glóbulos
rojos. Cuando se produce la -hemólisis aparece un halo transparente alrededor
de las colonias, como consecuencia de la lisis total de los glóbulos rojos.
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Plan de realización de las prácticas
Día 1 (lunes). Siembra de bacterias en tubos de agar nutritivo (una bacteria Gram positiva y
otra Gram negativa).
 Tinción simple de cultivos de bacterias; una Gram positiva y otra Gram
negativa.
 Tinción negativa de cultivos de bacterias; una Gram positiva y otra Gram
negativa.
 Tinción de Gram de cultivos de bacterias; una Gram positiva y otra Gram
negativa.
 Colimetría Presuntiva.
 Siembra en agar soja del actinomiceto
 Preparación de una placa de agar PCA
Día 2 (martes). Ver resultados de los cultivos realizados. Confirmar la presencia de las
bacterias inoculadas mediante tinción de Gram.
 Ver resultados de la colimetría presuntiva. Determinar el número de
coliformes mediante el Número Más Probable (NMP).
 Colimetría Confirmativa: a) Coliformes totales b) Coliformes fecales.
 Aislamiento y recuento de microorganismos aerobios mesófilos del suelo.
 Aislamiento de microorganismos de una población mixta.
 Tinción de esporas.
 Aislamiento en agar sangre de microorganismos presentes en la garganta.
Día 3 (miércoles). Ver resultados de la colimetría confirmativa.
 Identificación de Escherichia coli mediante IMViC (inoculación de las
pruebas bioquímicas).
 Ver resultados del aislamiento realizado. Confirmar el aislamiento mediante
tinción de Gram.
 Tinción de corpúsculos metacromáticos.
 Tinción ácido-alcohol resistente.
 Tinción de Gram de las colonias crecidas en agar sangre
Día 4 (jueves). Ver resultados de IMViC.
 Determinar el número de bacterias mesófilas presentes en muestra de suelo.
 Observación microscópica de colonias pertenecientes a la muestra de suelo:
tinción en fresco y tinción de Gram.
 Observación microscópica de actinomicetos. Gram y tinción en fresco.
 Observación microscópica de levaduras; tinción en fresco.
 Observación microscópica de hongos filamentosos: tinción en fresco.
19
NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
Número de tubos que dan la reacción positiva
3 tubos de 10 ml
0
0
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3 tubos de 1 ml
0
0
1
0
0
1
1
2
0
0
1
1
2
2
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
3
3 tubos de 0,1 ml NMP/100 ml de agua
0
<3
1
3
0
3
0
4
1
7
0
7
1
11
0
11
0
9
1
14
0
15
1
20
0
21
1
28
0
23
1
39
2
64
0
43
1
75
2
120
0
93
1
150
2
210
0
240
1
480
2
1100
3
>2400
20
MEDIOS DE CULTIVO
Composición (g/l agua destilada)
Agar nutritivo
Extracto de carne
Extracto de levadura
Peptona
Cloruro sódico
Agar
pH: 7,4 (aprox.)
PCA (plate count agar)
1
2
5
5
20
Caldo MacConkey
Lactosa
Peptona
Sales biliares
Cloruro sódico
Púrpura de bromocresol
10
20
5
5
0,01
Agua de peptona
pH: 7,0 ± 0,2
10
5
9
1,5
Agar sangre
Glucosa
Extracto de levadura
Triptona
1
2,5
5
Harina de soja
20
Agar
pH: 7,0 ± 0,2
20
Agar
20
Agar MacConkey
pH: 7,4 ± 0,2
Peptona
Cloruro sódico
Fosfato disódico
Fosfato potásico
Agar soja
Lactosa
Peptona
Sales biliares
Cloruro sódico
Rojo neutro
Cristal violeta
Agar
pH: 7,2 ± 0,2
Caldo glucosado (caldo MRVP)
(medio de Clark y Lubs)
Glucosa
Peptona
Fosfato potásico
pH: 7,0 (aprox.)
10
20
1,5
5
0,03
0,001
20
VRBA (violet red bile agar)
Extracto de levadura
3
Lactosa
10
Peptona
7
Sales biliares
1,5
Cloruro sódico
5
Rojo neutro
0,03
Cristal violeta
0,002
Agar
20
pH: 7,4 ± 0,2
Agar citrato de Simmons
5
7
5
Citrato sódico
Fosfato monoamónico
Fosfato dipotásico
Sulfato magnésico
Cloruro sódico
Azul de bromotimol
Agar
pH: 6,8 ± 0,2
2
1
1
0,2
5
0,08
20
Extracto de carne
Triptona
Cloruro sódico
Sangre de oveja desfibrinada
Agar
10
10
5
7%
20
Agar Levine (Agar EMB)
Lactosa
Peptona
Fosfato dipotásico
Eosina amarilla
Azul de metileno
Agar
pH: 7,1 ± 0,2
10
10
2
0,4
0,065
20