Download Electroforesis en gel de agarosa y en gel de poliacrilamida

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Virología y Micología Veterinaria
Trabajo Práctico No. 4
ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica utilizada para separar grandes moléculas por tamaño a través de
la aplicación de un campo eléctrico y el uso de una matriz separadora a manera de tamiz. Las
moléculas que más frecuentemente se estudian con esta técnica son ADN, ARN y proteínas. La
matriz separadora que funciona como tamiz para separar este tipo de moléculas en función a su
tamaño son agarosa y acrilamida. Esta matriz separadora posee una consistencia tipo gel y es por
ello que normalmente se denominan de esta forma, gel de agarosa y gel de acrilamida o gel de
poliacrilamida. Las moléculas a ser separadas (contenidas en la suspensión o muestra) se
depositan en pequeños pozos o bolsillos que se hacen en uno de los extremos del gel; las
moléculas son forzadas a pasar a través del gel cuando se aplica corriente eléctrica. Este
procedimiento con el cual se hacen pasar las moléculas a través del gel se denomina comúnmente
corrida electroforética. Las moléculas más grandes tienden a entrelazarse y retardarse en el gel;
las moléculas más pequeñas pasan a través del gel más rápido y se movilizan más lejos del pozo
donde inicialmente fueron colocadas. Las moléculas de igual tamaño y carga migran a la misma
distancia desde el pozo y forman una sola banda electroforética.
Los ácidos nucléicos, ADN y ARN, son moléculas cargadas negativamente debido a los grupos
fosfatos que se encuentran en los puntos de unión entre un nucleótido y otro. Es por ello que, los
ácidos nucleicos migran hacia el polo positivo. A diferencia de los ácidos nucléicos, las proteínas
pueden estar cargadas positivamente, negativamente o no poseer carga. Para conferirle una carga
negativa uniforme las proteínas pueden ser cubiertas con un detergente antes de la corrida
electroforética, como SDS: Sulfato duodecilsulfato de sodio. Igualmente, las muestras que
contienen proteínas pueden ser calentadas para eliminar cualquier estructura secundaria que
podría hacer que dos moléculas del mismo tamaño migren diferente.
En nuestro caso, se realizará una corrida electroforética en gel de poliacrilamida para visualizar el
genoma de un virus tipo ARN de doble cadena, extraído a partir de heces; y una corrida
electroforética en gel de agarosa para el análisis de los amplicones obtenidos en la PCR.
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Migración de moléculas a través del gel
La distancia que un fragmento de ADN o ARN recorre es inversamente proporcional a su
longitud. Al transcurrir cierto tiempo de corrida, los fragmentos de tamaño similar se acumulan
formando bandas en el gel, figura 1.
Las corridas electroforéticas en gel de agarosa normalmente se llevan a cabo en una cámara
horizontal; mientras que las corridas en gel de poliacrilamida se realizan en cámaras verticales.
Se debe tener presente que la gravedad no tiene nada que ver con la separación de las moléculas,
sino el campo eléctrico que se genera.
Distancia de migración (cm)
Distancia de Migración (cm)
Figura No. 1. Grafica de migración de las moleculas de acuerdo a su tamaño.
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones
electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad,
porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos. La
poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bisacrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametil-etiléndiamina
(TEMED) y el persulfato de amonio. En presencia de radicales libres, los cuales son generados
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dada la reducción del persulfato de amonio por el TEMED, la polimerización de los monómeros
de acrilamida conlleva a la formación de cadenas lineales de poliacrilamida. La presencia de bisacrilamida hace posible una reacción de copolimerización que genera una especie de red
tridimensional. De esta manera, las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la
bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada
variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros de acrilamida.
Rango de separación de ADN o ARN doble cadena en gel de poliacrilamida
Concentración
de archilamida (%)
3,5
Tamaño aproximado
de las moléculas (pb)
1000-2000
5,0
80-500
8,0
60-400
12,0
40-200
15,0
25-150
20,0
6-100
Preparación del gel de poliacrilamida
El gel de poliacrilamida se logra al incorporar la mezcla de los reactivos en una delgada cámara
obtenida por ensamblaje de dos vidrios y colocación de dos separadores. Los separadores
determinarán el grosor del gel, así los más utilizados son los minigeles de poliacrilamida que
poseen entre 0,75mm y 1mm de grosor. Una vez que polimeriza y se obtiene el gel, este debe
ensamblase en la cámara vertical para realizar la corrida electroforética, figura 2.
Mini gel de poliacrilamida 7%:
Reactivo
Cantidad
H2O
3,1 ml
Acrilamida-bisacrilamida 30%
1,4 ml
1,5M Tris (pH 8,8)
1,5 ml
TEMED
0,005ml (5ul)
Persulfato de amonio (10%)
0,05ml (50ul)
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Pozos
Electrodo negativo (-)
Muestra
Dirección de la migración
Electrodo positivo (+)
Figura 2. Diagrama de electroforesis en gel de poliacrilamida.
Buffer de electroforesis o de corrida
La migración electroforética de ADN o ARN es afectada por la composición y fuerza iónica de la
solución tampón o buffer de electroforesis. En ausencia de iones la conductividad eléctrica es
mínima y el ADN o ARN migraría muy lentamente, si es que llegara a migrar. En caso contrario,
si la fuerza iónica del buffer es muy elevada, la conductividad eléctrica sería muy eficiente pero
traería como consecuencia un aumento de temperatura lo cual pudiera ocasionar la
desnaturalización del ADN o ARN y el gel podría fundirse. Es por ello que, se debe utilizar una
concentración adecuada de este buffer para lograr una electroforesis óptima. Durante la práctica,
la corrida electroforética en gel de poliacrilamida se llevará a cabo en presencia de una solución
tampón constituida por Tris-base 0,025M y Glicina 0,192M (Tris-glicina), conocida como buffer
de electroforesis o de corrida.
Buffer de carga.
Antes de depositar las muestras en los pozos, éstas deben mezclarse con una solución
denominada buffer de carga. Este buffer de carga tiene tres propósitos:
1. Incrementar la densidad de la muestra, permitiendo que la muestra de ADN se
mantenga en el fondo del pozo.
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2. Incorpora color a la muestra, lo cual simplifica el proceso de carga de la muestra en
el pozo.
3. Contiene un colorante (azul de bromofenol) que en el campo eléctrico se moviliza hacia
el ánodo a una tasa predecible
El buffer de carga se utiliza tanto para la carga de muestras en gel de poliacrilamida como para la
carga de muestras en gel de agarosa.
Visualización de bandas electroforéticas.
El procedimiento descrito a continuación se refiere a una tinción a base de nitrato de plata, sin
embargo, existen diferentes métodos por los cuales puede teñirse un gel de poliacrilamida.
Una vez finalizada la corrida electroforética, el gel debe desensamblarse de los vidrios y lavarse
en agua destilado durante 30min.
-
Seguidamente el gel es sumergido en una solución 12mM de nitrato de plata durante
30min.
-
Se elimina la solución de nitrato de plata y se hacen tres lavados rápidos con agua
destilada.
-
Las bandas electroforéticas en el gel teñido son visualizadas al agregar la solución
reveladora compuesta por 0,76% formaldehído y 0,75M NaOH. Esta reacción es detenida
sustituyendo la solución de revelado por una solución de ácido acético al 5%. Las mismas
se observan de color marrón oscuro o de color negro.
Electroforesis en gel de agarosa
La agarosa es un polímero que se obtiene de algas marinas y la misma es hoy en día un producto
comercial presentado a manera de un polvo de color blanco. La preparación de un gel de agarosa
es muy similar a la preparación de gelatina, una vez que el polvo es disuelto por calentamiento en
una solución tampón específica se vierte en una cámara o dispositivo de forma cuadrada o
rectangular a la cual se le coloca un peine para que una vez que solidificado el gel los pozos
queden hechos, figura 3.
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Figura No. 3. Preparación del gel de agarosa.
Una vez solidificada la agarosa, el gel debe colocarse dentro de la cámara horizontal para realizar
la corrida electroforética, figura 4.
Buffer de electroforesis o de corrida
El buffer de electroforesis o de corrida posee las mismas propiedades descritas para el buffer de
corrida en gel de poliacrilamida. Pueden variar y la elección de este depende de la preferencia
que se tenga por alguno de ellos. Las soluciones tampón pueden ser Tri-acetato y EDTA
(TAE;pH8,0), Tris-borato (TBE) o Tris-fosfato (TPE) a una concentración de 50mM (pH7,7 –
7,8). Todos funcionan muy bien para la realización de las corridas electroforéticas.
En nuestro caso utilizaremos TBE, del cual se tiene preparada una solución stock 5X:
54gr de Tris base
27,5gr de ácido bórico
20ml de 0,5M EDTA (pH8,0)
A partir de esta solución stock se preparará la solución de trabajo a una concentración de 1X.
Buffer de carga
Posee las mismas propiedades y composición descritas para el buffer de carga en gel de
poliacrilamida.
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Vista de lado
Pozo para cargado
de la muestra
Cámara de
elctroforesis
Campo eléctrico
Dirección de la migración
Electrodo negativo (-)
A
Electrodo positivo (+)
B
Figura No. 4. Diagrama de una electroforesis en gel de agarosa. A, vista lateral de la cámara de
electroforesis con ubicación del gel y dirección de la corrida. B, cargado de la muestra en los
pozos.
Visualización de bandas electroforéticas.
Por lo general los geles de agarosa son teñidos son reactivos que tiene la propiedad de emitir
fluorescencia cuando son expuestos a luz UV. La tinción más utilizada ha sido la de Bromuro de
etidio, este colorante se intercala entre las bases nitrogenadas del ácido nucleico permitiendo que
los fragmentos de ADN o ARN puedan ser localizados en el gel una vez que se expone a la luz
UV. Dada la interacción del bromuro de etidio con el ADN, esta sustancia se constituye en un
poderoso mutágeno que también puede interactuar con el ADN de nuestras células así como lo
hace con el ADN en el gel. Es por ello que es obligatorio el uso de guantes. Hoy en día se
dispone se otros reactivos de marca registrada como SYBR gold o SYBR safe que poseen una
afinidad muy elevada por el ADN por lo que se requiere de muy baja concentración de este
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reactivo para la tinción de un gel. Se considera un colorante ultrasensible que emite gran
fluorescencia una vez que se ha unido al ADN y la fluorescencia emitida es 1000 veces mayor a
la obtenida con bromuro de etidio; es por ello que <20pg de ADN o ARN doble cadena pueden
ser visualizados en un gel de agarosa teñido con SYBR gold. Sin embargo, este reactivo también
se utiliza para teñir ADN y ARN de simple cadena pudiendo detectar desde100pg de ADN
simple cadena y desde 300pg de ARN de simple cadena.
Rango de separación de ADN o ARN doble cadena en gel de agarosa
Concentración del
gel de Agarosa (% {p/v})
Tamaño aproximado
de las moléculas (kb)
0,3
5 – 60
0.6
1 – 20
0.7
0,8 – 10
0.9
0,5 – 7
1.2
0,4 – 6
1.5
0,2 - 3
2.0
0,1 - 2
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