Download Laboratorio de Química Biológica Acción in vitro de eritropoyetina y

Laboratorio de Química Biológica
Acción in vitro de eritropoyetina y eritropoyetina carbamilada sobre células endoteliales
Directora: Dra. Daniela Vittori
La eritropoyetina (Epo) es el regulador más importante de la producción de eritrocitos, por lo tanto es ampliamente
usado en la clínica para el tratamiento de anemia. Debido a que la anemia de enfermedades crónicas (ACD) es causada
por varias etiologías, existe información contradictoria con respecto al éxito del tratamiento con eritropoyetina
recombinante humana (rhuEpo), además de reportes sobre resistencia al tratamiento. Últimamente, este factor de
crecimiento ha sido considerado también como citoprotector pleiotrópico con acción sobre diversos tejidos. Su rol sobre
las células endoteliales aún está en estudio.
Las enfermedades crónicas están generalmente acompañadas de procesos inflamatorios en los que se ha descripto que
células endoteliales producen óxido nítrico (NO) vía activación de la enzima óxido nítrico sintetasa (eNOS) (1,2). El NO
liberado puede ejercer diversos efectos protectores sobre la función endotelial, incluyendo vasodilatación y disminución
de la expresión de moléculas de adhesión.
Durante la administración crónica con Epo se ha observado el aumento de presión arterial y resistencia vascular
periférica. Por eso, algunos autores atribuyeron estos efectos negativos a una disminución de la producción de NO y de
la expresión de NOS en células endoteliales inducidas por Epo (3). Sin embargo, en las mismas células se ha observado la
inducción de la activación de eNOS y liberación de NO por Epo (4).
Además de los efectos beneficiosos que se le otorgan a la Epo, se han descripto, como se mencionó antes, distintos
efectos adversos. Con el objeto de evitar estos efectos secundarios y/o de modificar la actividad de la Epo, la industria
farmacéutica se ha abocado a la obtención de sustitutos de la Epo, tales como proteínas modificadas derivadas de Epo y
péptidos sintéticos que presentan variada actividad biológica, muchos de los cuales se encuentran en etapa de estudios
preclínicos. Uno de estos compuestos en estudio es la Epo carbamilada (cEpo) en los residuos lisina de la cadena
aminoacídica.
El objetivo del siguiente trabajo es avanzar en el conocimiento de la acción que ejerce Epo sobre las células endoteliales
y dilucidar si cEpo ejerce una acción similar o antagónica.
ACTIVIDADES Y METODOLOGÍA
Antes de comenzar con el proyecto el alumno recibirá entrenamiento en el desarrollo de cultivos de líneas celulares.
Actividad 1: Optimización de cultivos de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC)
Estandarización del cultivo de células HUVEC (células de vena de cordón umbilical humano) obtenidas en ATCC. Ensayos
con distintos medios de cultivos y factores de crecimiento (5,6). Las células se cultivarán a 37ºC y atmósfera con 5% de
CO2.
Actividad 2: Acción de Epo y cEpo sobre la proliferación de células HUVEC
a) Carbamilación de rhEPO de los grupos ε-amino de residuos lisina (7) con modificaciones introducidas en nuestro
laboratorio. Control de la carbamilación por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones nativas (8).
b) Curva de crecimiento dosis-respuesta de la exposición de células HUVEC (luego del 3er pasaje) a distintas
concentraciones de Epo (1-100 U/ml = 20-2000 ng/ml) y cEpo (20-2000 ng/ml). Evaluación de crecimiento celular por
ensayo de MTT (9).
Actividad 3: Análisis de expresión y actividad de eNOS en células HUVEC estimuladas con Epo o cEpo
c) Se estudiará la expresión y activación de la enzima en células HUVEC incubadas con Epo o cEpo, empleando
electroforesis en geles de poliacrilamida y Western blotting revelando con anticuerpo anti eNOS y anti eNOS p-Ser
1177 (activación) (1).
d) Uno de los marcadores más usados de la producción de NO en sistemas biológicos es la determinación de los niveles
de nitritos (NO2-), ya que es un producto estable de oxidación de NO. Se evaluará la actividad de eNOS por
determinación de la concentración de nitritos liberados al medio luego de la incubación de las células con distintas
concentraciones de Epo y cEpo. Curvas dosis respuesta, determinación por Método de Griess.
Referencias
1. Pandolfi A, Di Pietro N, Sirolli V, Giardinelli A, Di Silvestre S, Amoroso L, Di Tomo P, et al. Mechanisms of Uremic
Erythrocyte-Induced Adhesion of Human Monocytes to cultured. Endothelial cells. J Cell Physiol 213: 699-709,
2007.
2. Kleinbongard P, Schulz R, Rassaf T, Lauer T, et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide
synthase. Blood 107: 2943-2951, 2006.
3. Wang XQ, Vaziri ND: Erythropoietin depresses nitric oxide synthase expression by human endothelial cells.
Hypertension 33: 894–899, 1999.
4. Beleslin-Cokic B, Cokic V, Yu X, Weksler B, Schechter A, Noguchi C. Erythropoietin and hypoxia stimulate
erythropoietin receptor and nitric oxide production by endothelial cells. Blood 104: 2073-2080, 2004.
5. Scalera F, Kielstein J, Martens-Lobenhoffer J, Postel S, Täger M, Bode-Böger S. Erythropoietin Increases
Asymmetric Dimethylarginine in Endothelial Cells: Role of Dimethylarginine Dimethylaminohydrolase. J Am Soc
Nephrol 16: 892-898, 2005.
6. Wu X, Johns E, Richards N. Relationship between erythropoietin and nitric oxide in the contraction of rat renal
arcuate arteries and human umbilical vein endothelial cells. Clinical Science 97:413–419, 1999.
7. Leist M, Ghezzi P, Grasso G, Bianchi R, Villa P, Fratelli M, et al. Derivatives of Erythropoietin that are tissue
protective but not erythropoietic. Science 305:239-242, 2004.
8. Chamorro M. Caracterización y función de la eritropoyetina carbamilada. Tesina de Licenciatura, Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales, 2008.
9. Callero M, Vota D, Chamorro M, Wenker S, Vittori D, Nesse A. Calcium as a mediator between erythropoietin
and protein tyrosine phosphatase 1B. Arch Biochem Biophys 505:242-249, 2011.