Download Diseño de primers 2014

Curso Posgrado 2014
Dra. María Gabriela Lacoste
El diseño de los primers para una PCR es FUNDAMENTAL.
Longitud
Especificidad
Temperatura de
Hibridación
Complementariedad
de secuencias
Contendido
GC
Reconocer una SECUENCIA UNICA dentro del ADN templado
Especificidad de un primer depende de la LONGITUD del mismo.
SECUENCIA CORRECTA!!
La longitud de la secuencia es fundamental para la asociación
ESPECIFICIDAD
Por ejemplo:
Hay una probabilidad de ¼ (4-1) de encontrar una A, G, C o T en una secuencia
dada.
Hay una probabilidad de 1/16 (4-2) de encontrar una secuencia de dinucleótidos.
Hay una probabilidad de 1/256 (4-4) de encontrar una secuencia de
tetranucleótidos.
Si tenemos una secuencia de 17 pb, estadísticamente, esta estará presente una
vez cada 4-17 bases o aproximadamente 17 billones de bases.
LONGITUD IDEAL: 18-24 nt
Muy largos: fallas en el annealing
bajo rendimiento
Depende de la LONGITUD y la COMPOSICION del primer.
T° annealing depende de la Temperatura de melting o fusión (Tm) de
los primers.
Tm= temperatura a la cual la mitad de las moléculas de primer están apareadas
con el ADN molde.
Tm=2 (A+T) + 4(G+C)
Tm
longitud
contenido GC
Los primers no deben tener T°a muy
diferentes entre si (no mas de 5°C).
T°annealing: 5° C por
debajo del Tm más
bajo del par de
primers (T°a=al
menos 50°C)
BAJO RENDIMIENTO O
NO AMPLIFICACION
OPTIMA
INESPECIFICIDAD
T°annealing
40-60% CONTENIDO GC
Asegura la unión estable entre el primer y el ADN templado
Evitar tramos de polipurinas o polipirimidinas
PoliT, PoliA o PoliA/T
unión más débil: se puede separar el complejo
primer-templado en esa zona.
PoliC, PoliG o PoliG/C
unión más fuerte: hibridación no específica.
G o C en el extremo 3´
Elongación empieza en el extremo 3´del primer.
Asegura la unión correcta del primer al molde en el extremo 3´ (unión más
fuerte que A/T)
aumenta la eficiencia de la reacción
PROBLEMA: Si el extremo 3´tiene 3 o mas G/C se puede unir
establemente a casi cualquier secuencia con tres G/C.
IDEAL:
Extremo 5´ estable con 1 o 2 bases G/C y extremo 3´con no mas
de UNA base G/C
Complementariedad intra-primer
Más de 3 pb: el primer se pliega sobre si mismo en una estructura doble
cadena
interfiere con el annealing al ADN templado.
Complementariedad inter-primer
Formación de dímeros
competencia
disminuye la formación de producto por
BUSQUEDA DE LA SECUENCIA DE INTERÉS
Y DISEÑO DE PRIMERS CON PRIMER-BLAST
National Center for Biotechnology Information
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Si queremos buscar un gen completo, por ejemplo, el CFTR humano
2°
1°
3°
OMIM: información acerca de la asociación del
gen con enfermedades humanas
En este caso el gen es demasiado grande para el programa Primer
BLAST, por lo que tenemos que buscar un fragmento menor de
interés dentro del gen.
Si queremos buscar un fragmento del gen, por ejemplo, el exón 10 del
CFTR humano
2°
1°
3°
Seleccionar el tamaño de amplicón deseado
Elegimos pares de primers para controlar estructura secundaria
y alineación.
OTROS PROGRAMAS DE DISEÑO DE PRIMERS
PrimerQuest: http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index
COMO UBICAR MI PRIMER EN LA SECUENCIA
Forward
Reverse OJO!!!!
ATGGGAGAACTGGAGCCTTC 5´ 3´
ORIGIN
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
gcagagtacc
tttacaaata
gcgtgatttg
tgattatggg
tctgttctca
tttcctatga
gaaactatgt
atttggctcc
tactgtgaat
atgaaataaa
ttatgaaatg
tatatggcat
tgaaacagga
agaatataca
ataatgacct
agaactggag
gttttcctgg
tgaatataga
gaaaactttt
atattcaatc
ggatcaatta
tgcaatttat
gtgagaattt
gcatataagt
ACCGATTGAATATGGAGCCAA
5´ 3´
AACCGAGGTATAAGTTAGCCA
3´ 5´
TTGGCTCCATATTCAATCGGT complementaria
agtattttaa
cttctgctta
aataatgatg
ccttcagagg
attatgcctg
tacagaagcg
tgattatgca
ggttagtcta
ataaaacaca
tttttaaata
tgttcactca
gatatgtggt
atattttgaa
ggatgataat
ggttttattt
gtaaaattaa
gcaccattaa
tcatcaaagc
tatgaaccct
catatattta
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atgggttcat
ttagtgagac
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ANALISIS DE PRIMERS
OLIGO ANALYZER 3.1
Analizamos el Primer FORWARD
Parámetros generales
Hairpin
El Tm debe ser menor que la temperatura de annealing
propuesta para la reacción. Se sugiere que el Tm del hairpin
debe ser al menos 50°C menor que la T de annealing.
Self-Dimer
El valor de ∆G debe estar entre 0 y -9 kcal/mol.
Hetero-Dimer
Copiamos la secuencia
del primer reverse
Hetero-Dimer
El valor de ∆G debe estar entre 0 y -9 kcal/mol.
NCBI Blast
Alineamos nuestro primer con la base de datos, para comparar
su similitud con otras secuencias.
Repetimos el procedimiento con el primer REVERSE…
… y también podemos analizar otros pares de primers propuestos por
el programa de diseño hasta seleccionar el par que cumpla con las
mejores características…