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BOLILLA 1
• ENZIMAS: Naturaleza Química- Propiedades GeneralesNomenclatura y Clasificacion- Coenzimas y Grupos Prostéticos.
• Actividad Enzimática: Unidad de enzima- Actividad específicaActividad molecular.
• Complejo ES- Ecuación de Michaelis Menten y Ecuación de
Lineweaver Burk- Significado e importancia de Km y KcatalíticaInhibición competitiva y no Competitiva.
• Factores que afectan la actividad enzimatica: [Enzima]- pH – T[S]
• Regulación Enzimática: Enzimas alostéricas (propiedades y
cinética)- Zimógenos- Modulación Covalente
• Isoenzimas: Propiedades e importancia.
ENZIMAS
• Transformación de nutrientes simples en
moléculas complejas y viceversa
• Extracción de energía desde combustibles
por oxidación
• Polimerización de subunidades para
formar macromoléculas, etc
CARACTERISTICAS DE LAS
ENZIMAS
• PROTEINAS y RNA (Ribozimas): Estructura terciaria y cuaternaria
• SITIO DE UNION AL SUSTRATO: Uniones no Covalentes (puente
de hidrógeno, hidrofóbicas, electrostáticas
• NECESITAN DE FACTORES ENZIMATICOS: Inorgánicos (metales)
y orgánicos (Coenzimas)
• ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO: Estereoespecificidad y
especificidad geométrica
•
SON REGULABLES: La síntesis de la proteína, su actividad y
degradación.
DISTRIBUCION DE LAS
ENZIMAS
• COMPARTIMENTALIZACION: Diferentes
localización dentro de la célula.
• SISTEMAS MULTIENZIMATICOS: Enzimas
relacionadas agrupadas formando verdaderos
complejos
• ENZIMAS MULTIFUNCIONALES: Una enzima
que presenta distintos sitios catalíticos
USOS DE ENZIMAS EN BIOTECNOLOGIA
• Mutagénesis Dirigida:
- Estudiar mecanismos enzimáticos
- Cambiar especificidades enzimáticas
- Aumento de tolerancia a condiciones
extremas.
• Enzimas híbridas. Proteinas de fusión
• Ej. Activ.de glucanasas y celulasas
microbiana, Activ.Nucleasa estafilococica
Tipos de reacciones catalizadas
por enzimas
•
•
•
•
•
Oxido-reducción
Rotura y formación de enlaces C-C
Reorganizaciones internas
Transferencia de grupos
Reacciones de condensación
Cómo se clasifican las enzimas???
Clase
-
subclase
Lactato
1
deshidrogenasa
1-OXIDORREDUCTASAS
Alcohol deshidrogenasa
(EC 1.1.1.1)
2. TRANSFERASAS
Hexoquinasa
(EC 2.7.1.2)
1
-
subsubclase
1
-
nº de orden
27
3. HIDROLASAS
Carboxipeptidasa A
(EC 3.4.17.1)
4. LIASAS
Piruvato
descarboxilasa
(EC 4.1.1.1)
5. ISOMERASAS
Fumarasa ó malato
isomerasa
(EC 5.2.1.1)
6. LIGASAS
Piruvato
carboxilasa
(EC 6.4.1.1)
VITAMINAS-COENZIMAS
Niacina
NAD, NADP
Ion Hidruro (:H -)
PDH
GAD
Riboflavina (Vit.B2)
FAD, FMN
Electrones
SDH
Tiamina (Vit. B1)
PP-tiamina
Aldehídos
PDH, TC
Acido pantoténico
Coenzima A
Grupos acilo
Acido fólico
TH4
Grupos
monocarbonados
Piridoxina (B6)
P-piridoxal
Transferencia
grupos aminos
Acido lipoico
Lipoamida
Electrones y
grupos acilos.
Tiolasa
Ser-Treon.
Deshidrat.
GPT
AAC-DESC
PDH
Ejemplos de Enzimas que requieren iones
metálicos como cofactores
Citocromo oxidasa
Catalasa
Fe++ ó Fe+++
Peroxidasa
Anhidrasa carbónica
Zn++
Hexoquinasa
Glucosa-6-fosfatasa
Mg++
Piruvato quinasa
Piruvato quinasa
K+
ACTIVIDAD ENZIMATICA
• Unidades Internacionales
Cantidad de enzima que cataliza la transformación
de 1 umol de S por minuto
1 katal = 6 x 107 U.I.E.
mmol de S transformados
U.I.E. =
min
• Actividad Específica
Actividad enzimática por cada miligramo de proteína
U.I.E.
presente en la muestra Actividad específica =
mgr de proteína
• Actividad Molecular ó Numero de Recambio
Moléculas de S convertibles en P por unidad de
tiempo y por molécula de enzima mmol de S transformados/min
Actividad molecular =
Mol de enzima
ACTIVIDAD ESPECIFICA
A
B
Prot.Tot: ∑
+
+ +
Prot.Tot: ∑
+
+
Prot.Tot: ∑
+
D
Actividad
=
específica
U.I.E.
Activ. Enzimática
=
mgr de proteína
Prot. totales
Prot.Tot: ∑
Como funcionan las enzimas??
Modelo llave-cerradura
Sitio
activo
Modelo inducido
Sitio
activo
Estado de
transición
(ES)
Ejemplo: REACCION CATALIZADA POR LA
HEXOQUINASA
D-Glucosa
Factores que afectan la actividad enzimática
• Concentración de Sustrato
• Concentración de Enzima
• pH
• Temperatura
EFECTO DE LA CONCENTRACION DE
SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD INICIAL
Velocidad inicial
(vo)
[S]
Efecto de la concentración de
enzima sobre la actividad
v
[E]
Concentración saturante de
sustrato, pH y temp. constantes
Influencia del pH sobre la
actividad enzimática
Actividad
enzimática
pH
Ejemplos de enzimas con
diferentes pH óptimo
Influencia de la Temperatura sobre la
actividad enzimática
Actividad
enzimática
T. óptima
T(ºC)
ISOENZIMAS
 Diferentes formas moleculares de una
misma enzima.
 Son sintetizadas por genes diferentes
 Tienen diferente composición aminoacídica
por lo que pueden separarse por electroforesis.
Catalizan la misma reacción, actuando sobre
el mismo sustrato para dar el mismo producto
Dos isoenzimas presentan en general
diferentes valores de Km y Vmáx.
 Se encuentran ubicadas en diferentes
compartimentos de la célula ó en diferentes
tejidos.
 Son utilizadas en clínica para determinar
el origen del tejido dañado
Lactato deshidrogenasa (LDH)
Presenta 5 isoenzimas con distinta
composición en cuanto a sus subunidades
y c/u es específica de un tejido.
H4
H3M
M > Músculo
H > Corazón
H2M2
HM3
M4
Ejemplo de isoenzima: Glucoquinasa y
hexoquinasa
Actividad
enzimática
Glucoquinasa
Hexoquinasa
Km. hexq
Km. glucq
[glucosa mmol/l
Energía de activación de una Reacción
catalizada y una reacción no catalizada
REACCION NO CATALIZADA
REACCION
CATALIZADA
Diagrama de coordenadas de una reacción
enzimática catalizada y sin catalizar
Energía
Libre (G)
Estado de transición
(*)
∆G* reacción no
catalizada
(*)
DG* cat
S
ES
EP
P
Progreso de la reacción
Relación entre velocidad y concentración de
sustrato
E + S
k1
k-1
v o= k2[ES]
ES
k2
E + P
[E]t = [E] + [ES]
Concentración saturante de sustrato
[S] >>> [E]
Medida de velocidad inicial
Paso limitante: Descomposición de ES
k1
E + S
k2
ES
E + P
k-1
V. de Formación de ES = k1 ( [Et ] –[ ES ] ) [S]
V. de Descomp.de ES = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ]
ESTADO ESTACIONARIO
k1 ( [Et ] – [ ES ] ) [S]
v o= k2[ES]
Km = (k-1 + k2)/k1
Vmáx = k2 [Et]
= k-1
[ ES ] + k2 [ ES ]
Representación de la ecuación de
Michaelis - Menten
Vo
[S]
SIGNIFICADO DE Km
k1
E + S
k-1
k2<<< k-1
k2
ES
E + P Km = (k-1 + k2)/k1
Km = k-1 /k1
Km =Ks
Km se considera una medida de la afinidad
de la enzima por el sustrato
SIGNIFICADO DE Vmáx
E + S
k1
ES
k2
E + P
k-1
E + S
k1
k-1
ES
k2
k-2
EP
k3
P
[Et] = [E] + [ES]
Vmáx = k2 [Et]
No siempre el paso limitante de la velocidad está dado por k2
Vmáx = k3 [Et]
Vmáx = kcat [Et]
kcat
Constante de
velocidad del paso
limitante
Número de recambio (t-1)
Eficiencia catalítica de una enzima
Vmáx =
kcat [Et]
CUANDO [S] <<<< Km
La velocidad depende de la concentración de enzima
total y de la concentración de sustrato
kcat/Km es una constante de velocidad y es el mejor
parámetro para conocer la eficiencia catalítica de una
enzima
GRÁFICA DOBLE RECÍPROCA O DE
LINEWEAVER-BURK
Ordenada al origen = 1/Vmáx.
Pendiente= Km/Vmáx
Intersección c/eje x = - 1/Km
INHIBICION ENZIMATICA
COMPETITIVA
INHIBICION
REVERSIBLE
NO COMPETITIVA
ACOMPETITIVA
POR ENLACE COVALENTE
INHIBICION
IRREVERSIBLE
DIFP
Penicilina
Quimotripsina
Transpeptidasa
(Análogos del estado de transición)
INHIBIDOR SUICIDA
Alopurinol
Xantina oxidasa
INHIBICION REVERSIBLE
INHIBICION COMPETITIVA
E + S
ES
E + P
E
+
I
E
EI
Ki =
E
[E] [I]
[EI]
KM ap = Km(1 + [I]/Ki)
Ejemplo de Inhibidor competitivo
Fumarato + FAD+
Succinato + FADH2
Succinato
deshidrogenasa
COO(CH2)2
COOSuccinato
COOCH2
COOMalonato
v
Gráfica
de M-M
Km
Km ap
[S]
1/v
Gráfica
de L-B
-1/Km
-1/Kmap
1/[S]
INHIBICION NO COMPETITIVA
E
E + S
ES
+
+
I
I
E
E + P
I
I
EI + S
E
ESI
E
I
I
v
Gráfica
de M-M
Km
[S]
1/v
Gráfica
de L-B
Vmax.s/I
Vmáx ap.=
Km(1 + [I]/Ki)
-1/Km
1/[S]
INHIBICION ACOMPETITIVA
E + S
ES
E + P
+
I
E
E
E
ESI
E
I
Inhibición acompetitiva
1/ Vmáx
C/ Inhibidor
1/Vmax. Inh.
S/ Inhibidor
1/Vmax. s/Inh.
-1/Km c/inh
-1/Km s/inh
1/[S]
Características de los diferentes tipos de
inhibición reversible
Tipo de
inhibición
El Inhibidor
se une a
Competitiva
E
Efecto
s/Vmáx
Efecto
s/Km
Ninguno
Aumenta
Disminuye
Ninguno
Kma c/I. = Km s/Inh. (1+ [I]/Ki)
No competitiva
E y ES
Vmáx c/I= Vmáx. s/Inh. / 1 + [I]/ Ki
Acompetitiva
ES
Disminuye
Disminuye
Acción de inhibidores a distinta
concentración
COMPETITIVA
Pendiente = Km / Vmáx
NO COMPETITIVA
INHIBICION IRREVERSIBLE
. Por unión covalente del inhibidor
- Acetilcolinesterasa
- Quimotripsina
Enzima
inactivada
Diisopropilfluorfosfato (DFP)
INHIBICION IRREVERSIBLE
. Inhibidor suicida
Se une al sitio activo de la enzima y ésta cataliza la modificación
del inhibidor a otro compuesto que permanece unido a la enzima.
El ALOPURINOL es un inhibidor suicida que actúa sobre la
enzima xantina oxidasa (degradación de purinas).
Se forma el oxopurinol el cual queda unido a la enzima.
REGULACION DE LAS REACCIONES
CATALIZADAS POR ENZIMAS
REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS
ENZIMAS ALOSTERICAS
REGULACION POR
PROTEINAS
REGULACION DE LA SINTESIS
DE LAS ENZIMAS
REGULACION COVALENTE
REGULACION
POR PROTEOLISIS
ENZIMAS INDUCIBLES
ENZIMAS ALOSTERICAS
Enzima
1
Enzima
2
Enzima 1
MODULADORES POSITIVOS
Enzima
Enzima
3
4
ENZIMA ALOSTERICA
MODULADORES NEGATIVOS
Bifurcación de una vía metabolica
PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS
ALOSTERICAS
• Poseen un sitio de unión a un metabolito regulador (sitio
alostérico)
• La unión del metabolito a la enzima es de carácter
reversible y no covalente.
• Son homotrópicas o heterotrópicas.
• En general poseen dos o mas sitios reguladores.
• La mayoría posee dos o mas cadenas polipeptídicas o
subunidades.
• En general tienen un comportamiento cinético sigmoideo
CINETICA DE UNA ENZIMA ALOSTERICA
Curva Sigmoidea
Regulación de la actividad de la Aspartato
transcarbamilasa (ATCasa)
v
Aspartato (mM)
EJEMPLOS DE ENZIMAS
ALOSTERICAS
• Hexoquinasa, Fosfofructoquinasa y Piruvato
Quinasa
Vía glicolítica
• AcetilCoA carboxilasa
• Aspartato Transcarbamilasa
Biosíntesis de lípidos
Biosíntesis de nucleó
tidos pirimidínicos
• Glutamato Deshidrogenasa
Degradación de
aminoácidos
• Citrato sintasa, isocitrato y a-cetoglutarato
deshidrogenasas
Ciclo de Krebs
ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATCasa)
Dominio aspartato
Dominio
Zinc
Dominio alostérico
Dominio carbamil
fosfato
REGULACION POR MODIFICACION
COVALENTE
Enzima
Enzima
Enzima
Fosforilacion
Enzima
ADP-Ribosilación
Enzima
Fosfoadenilacion
Enzima
Ejemplo de regulación covalente
HO-CH2
CH2- HO
(Cadena lateral de Ser)
Fosforilasa b
(menos activa)
Fosforilasa
quinasa
ATP
2 Pi
ADP
2 H2 O
P -O-CH2
Fosforilasa
fosfatasa
CH2- O- P
Fosforilasa a
REGULACION POR PROTEOLISIS
• Por eliminación de una cadena peptídica, enzimas
inactivas se convierten en enzimas activas y
viceversa.
ZIMOGENOS
• Las enzimas digestivas: pepsinógeno y
quimotripsinógeno se convierten en las enzimas
activas pepsina y tripsina.
• Suele ocurrir una activación secuencial
produciéndose una cascada de activaciones. Ej.
Coagulación sanguínea.
REGULACION POR PROTEINAS
• Modifican la actividad de enzimas
involucradas en el metabolismo celular.
Por ej. Indirectamente activando o
inhibiendo la actividad de la glutamina
sintetasa.
• RNA polimerasa: Asn, Gln, Glu, Lys y Arg
forman enlaces hidrógenos con las bases
del DNA