Download 1 la purificacion de preparaciones enzymaticas para la

CANAL-LLAUBERES – PURIFICACION DE PREPARACIONES ENZYMATICAS PARA LA ENOLOGIA – Page 1
LA PURIFICACION DE PREPARACIONES ENZYMATICAS PARA LA
ENOLOGIA. IMPACTOS SOBRE LA CALIDAD DE VINOS TINTOS Y
BLANCOS
Rose-Marie Canal-Llaubères
Novozymes France, 23, parvis des Chartrons, 33074 Bordeaux Cédex
Introducción
Las preparaciones enzimáticas, producidas por microorganismos no modificados
genéticamente, contienen numerosas actividades enzimáticas. Los hongos
filamentosos ubicuos no patogénicos son aislados del suelo, donde contribuyen con la
microflora. El espectro de actividades enzimáticas se explica por la adaptación del
microorganismo a su hábitat natural. Las especies empleadas en enología, Aspergillus
niger y Trichoderma harzianum, contienen, además de las actividades por las que son
cultivadas (pectinasas de A. niger, β-1,3-1,6 glucanasas de T. harzianum), otras
actividades como celulasas, β-glucosidasas, xilanasas, galactanasas y proteasas, por
mencionar algunas. Ciertas actividades son indeseables en las aplicaciones
enológicas, tal es el caso de la cinamil-esterasa (CE) presente en A. niger. En
consecuencia, es razonable elaborar peparaciones con niveles de actividad CE débil o
bien nula. En la industria, se eligen las condiciones de fermentación para fomentar la
producción de actividades “principales”. Es en base a las actividades que se
caracterizan las preparaciones enzimáticas. Sin embargo, el espectro enzimático de
cada preparación, específico de cada productor, depende de la cepa y de las
condiciones de cultivo. Para obtener preparaciones con un solo tipo de actividad es
necesario utilizar microorganismos genéticamente modificados (MGM). Luego de
haber presentado el origen, las cepas y las condiciones de fermentación, este artículo
repasará las actividades enzimáticas responsables de la formación de fenoles
volátiles en los vinos y el rol de la purificación en actividades enzimáticas indeseables.
Nota: preferimos reservar el término enzima a una proteína con poder catalítico
definido (ejemplo: pectin-esterasa). Las preparaciones enzimáticas contienen gran
cantidad de enzimas o actividades enzimáticas.
¿Cuáles son las fuentes fúngicas de enzimas?
Las especies de hongos, comúnmente empleadas en la industria biotecnológica para
la producción de enzimas enológicas, pertenecen a la familia de las Ascomicetas
(como todas las especies de Saccharomyces). Estos organismos no son patógenos y
colonizan hábitat naturales. Aspergillus niger (Foto 1) es un hongo microscópico
filamentoso.
Foto 1 : Esquema de Aspergillus niger
Trichoderma harzianum (Foto 2) se aisla del suelo, donde forma parte de la flora
natural. Algunas especies son reconocidas como funguicidas y protegen a los cultivos
de Botrytis, o podredumbre gris (mildiou).
VINIDEA.NET WINE INTERNET TECHNICAL JOURNAL, 2003, N. 7
1
CANAL-LLAUBERES – PURIFICACION DE PREPARACIONES ENZYMATICAS PARA LA ENOLOGIA – Page 2
Foto 2 : Trichoderma harzianum
Aspergillus y Trichoderma son dos microorganismos empleados para la elaboración
de preparaciones enzimáticas destinadas a la enología (pectinasas, glucanasas). Las
otras preparaciones son extraídas de huevos blancos (lisozima) o de cultivos de
Lactobacillus fermentum (ureasa). El uso de preparaciones enzimáticas en la enología
obedece a tres niveles de reglamentaciones (Goutel, 1996): comunitario, nacional e
internacional, este último basado en las resoluciones de la OIV.
La producción de las preparaciones
Las preparaciones enzimáticas se obtienen generalmente por fermentación. En la
industria, las especies seleccionadas son cultivadas sobre sustratos agrícolas, tales
como la harina de soja o almidón de papa. El método más comúnmente utilizado es el
cultivo en medio sumergido. Canal-Llaubères (2002) describe las diferentes etapas de
producción desde la fermentación hasta la formulación. El resultado de la
fermentación es una preparación enzimática con gran cantidad de actividades,
desprovista del microorganismo productor. La electroforesis de una preparación de
pectinasas, Foto 3, muestra las diferentes bandas que la componen. Cada banda
corresponde a una actividad enzimática (de izquierda a derecha: siembra 1, pectinasa
producida por una cepa de Aspergillus niger, siembras 2 y 3, pectinasa producida por
otra cepa de A. niger, siembra 4, pectina liasa A producida por un MGM, siembra 5,
marcadores de peso molecular)
Foto 3: Gel de electroforesis (SDS PAGE) de preparaciones de pectinasas producidas
por Aspergillus niger (a la derecha : siembra 5, marcador de peso molecular).
Esta foto permite visualizar la complejidad de las preparaciones enzimáticas,
obtenidas a partir de un microorganismo no modificado genéticamente (no MGM),
comparadas con preparaciones mono componentes (o enzima) producidas por un
MGM. Es importante destacar que la enzima no se modifica, quien es modificado es el
microorganismo productor. Este, mediante mutaciones genéticas, es inducido a la
síntesis del tipo de actividad enzimática deseado. Recordemos que denominamos
VINIDEA.NET WINE INTERNET TECHNICAL JOURNAL, 2003, N. 7
2
CANAL-LLAUBERES – PURIFICACION DE PREPARACIONES ENZYMATICAS PARA LA ENOLOGIA – Page 3
enzima a un prótido de naturaleza catalítica, producido por una célula viva y, como
todas las proteínas, son biodegradables.
Actividades enzimáticas indeseables
De todas las actividades enzimáticas conocidas, algunas han sido identificadas como
capaces de originar desviaciones organolépticas (pérdidas de frescura en vinos
blancos, aparición de caracteres fenólicos más o menos pronunciados en vinos
blancos y tintos). Este es el caso de la cinamil-esterasa, concomitante a las
preparaciones de pectinasas elaboradas a partir de cepas de Aspergillus niger. Las
mezclas enzimáticas de Trichoderma harzianum son ejemplos naturales de la
actividad CE. El nivel de actividad depende del microorganismo y también de las
condiciones de fermentación.
Purificación y caracterización de la actividad cinamil-esterasa
A partir de la introducción de la pectinasas en la Enología para la decantación de
mostos, a mediados de los años 70, Burkhardt (1976) notó que su empleo llevaba a
una rápida pérdida del bouquet de vinos blancos alemanes. Él atribuyó estos defectos
organolépticos a la presencia de una actividad enzimática “depsidasa” producida por
Aspergillus niger y contenida en las preparaciones enzimáticas utilizadas. Estas
actividades son susceptibles de hidrolizar los compuestos hidroxi-cinamoil tartárico de
los mostos blancos. Maurer (1987) calificó estas actividades como “clorogénicas” pero
las definió de manera idéntica. Numerosos autores se inclinan a este problema sin
siquiera aportar respuestas sobre la identificación de las sustancias volátiles
responsables por la pérdida de tipicidad de tales vinos. Los trabajos de Chatonnet et
al. (1992) permiten poner en evidencia el rol de las preparaciones de pectinasa sobre
el contenido de fenoles volátiles de los vinos. Con anterioridad, Chatonnet et al.
(1989) habían demostrado el papel de Saccharomyces cerevisiae en la formación de
estos compuestos. Barbe (1995) purificó y caracterizó la actividad de la cinamilesterasa. Se trata de glicoproteína de peso molecular estimado en 240 000Da,
formado por dos unidades de 120 000Da.
Formación de fenoles volátiles
Los fenoles volátiles, vinil- y etil-, contribuyen al aroma de los vinos blancos y tintos.
En ciertas concentraciones, estos compuestos pueden aportar languidez mientras
disimulan el frutado, o incluso depreciar los vinos por desarrollo de aromas a farmacia,
tinta, pintura o clavo de olor (vinil-4-fenol, vinil-4-guayacol) y aromas a establo y sudor
(etil-4-fenol, etil-4-guayacol). Estos compuestos provienen del metabolismo de los
ácidos fenólicos bajo la acción de microorganismos durante la fermentación.
1. Formación de vinil-fenoles
Barbe (1995) demostró la evolución del contenido de vinil-4-fenol y vinil-4-guayacol
durante la fermentación alcohólica, con y sin preparaciones enzimáticas pectolíticas.
La presencia de vinil-fenoles es únicamente detectada en vinos blancos. Su formación
depende de las reacciones enzimáticas mediante la intervención de la cinamato
decarboxilasa (CD) de levaduras (Albagnac, 1975). El gen POF1 (fenólico off-flavor),
que codifica la síntesis de esta proteína, ha sido clonado por Meaden y Taylor (1991).
La actividad CD está con frecuencia presente en Saccharomyces y en la mayoría de
las cepas de levaduras enológicas secas activas (Grando et al., 1993). Así, las cepas
desprovistas de actividad cinamato decarboxilasa (o pof-) han sido seleccionadas para
evitar la formación de vinil-fenoles. En vinos tintos esta actividad es inhibida por los
compuestos fenólicos de las uvas tintas (Chatonnet et al., 1989). El contenido de vinilfenoles es más importante en vinos blancos provenientes de tratamientos enzimáticos
con pectinasas que presentan una actividad CE, la velocidad de incremento en
relación a un vino testigo podrá ser del 50% (Figura 3). Las preparaciones enzimáticas
no contienen la cinamato decarboxilasa. La Figura 1 muestra la hidrólisis de ésteres
VINIDEA.NET WINE INTERNET TECHNICAL JOURNAL, 2003, N. 7
3
CANAL-LLAUBERES – PURIFICACION DE PREPARACIONES ENZYMATICAS PARA LA ENOLOGIA – Page 4
tartáricos de los ácidos cinámicos del mosto, bajo la acción de una actividad
secundaria de tipo esterasa, presente en las preparaciones enzimáticas. En uvas
maduras la concentración de los precursores es 2 a 5 veces más elevada que la de
los ácidos fenólicos libres.
R
Cinamil-esterasa
O
HO
CH
CH
C
O
precursores
Acido tartárico
R
O
HO
CH
CH
C
OH
Ácidos fenólicos libres
Figura 1. Formación de vinil-fenoles en vinos blancos. Etapa 1: hidrólisis de derivados
hidroxicinamoil tartáricos por la acción de CE (preparación de pectinasas, Botrytis
cinerea).
La aparición de vinil-fenoles en vinos es descripta en la Figura 2. Estos compuestos
son formados por la decarboxilación de los ácidos cinámicos libres en el mosto y de
los ácidos cinámicos provenientes de la hidrólisis de ésteres tartáricos mediante una
esterasa presente en las preparaciones pectolíticas, bajo la acción de la cinamato
decarboxilasa de Saccharomyces cerevisiae.
R
O
HO
CH
CH
C
Cinamato-decarboxilasa
OH
Saccharomyces
R
HO
CO2
CH
CH2
Vinil-fenol
Figura 2. Formación de vinil-fenoles de vino blanco. Etapa 2: hidrólisis de los ácidos
cinámicos por la acción de CD (Saccharomyces cerevisiae).
La puesta a punto de preparaciones pectolíticas, débiles en actividad CE, ha permitido
limitar la formación de vinil-fenoles en vinos blancos. Los resultados obtenidos en
Sauvignon blanc se presentan en la Figura 3. El empleo de preparaciones pectolíticas
clásicas (no purificadas de la actividad CE) para el desfangar los mostos, ocasiona en
los vinos un aumento de 2 a 4 veces más en el contenido de vinil-4-fenol, en relación
a los vinos testigos. El uso de preparaciones con actividad CE débil limita (FCE), por
debajo del umbral de percepción (770 µg/l), el contenido de vinil-4-fenol. Estos
resultados han sido confirmados en otros vinos (Muscat).
VINIDEA.NET WINE INTERNET TECHNICAL JOURNAL, 2003, N. 7
4
CANAL-LLAUBERES – PURIFICACION DE PREPARACIONES ENZYMATICAS PARA LA ENOLOGIA – Page 5
Vini-4-fenol (µg/l)
2000
1500
1000
Umbral de percepción
500
0
Testigo
Prep. Pura FCE
Prep. Estandar
P. Chatonnet & C. Barbe, 1992
Figura 3. Incidencia de las preparaciones enzimáticas en el contenido de vinil-fenoles
en Sauvignon (maceración pelicular de 12 horas a 15°C bajo CO2, desfangado en
presencia de pectinasas a 1 g/HL, NTU 100, con el agregado de 10 g/HL de LSA pof+)
2. Formación de etil-fenoles
En vinificación en tinto, es común encontrar vinos que presentan un carácter fenólico.
Saccharomyces no es responsable de la formación de fenoles volátiles, ya que la
actividad CD es inhibida por los compuestos fenólicos (Chatonnet et al., 1997). En
vinos tintos la contaminación por Brettanomyces es la responsable de su formación,
desarrollando aromas a cuero y, más allá del umbral de percepción, aromas a establo
o sudor. Por lo tanto, de acuerdo a Chatonnet, cerca de 1/3 de los vinos de Bordeaux
analizados presentan características fenólicas. De la misma manera, Gerbaux señala
que los vinos Pinot noir son particularmente sensibles a la contaminación por
Brettanomyces. En consecuencia, el 50% del vino en crianza y el 25% del vino
embotellado está contaminado. Esta levadura es capaz de decarboxilar los ácidos
fenólicos libres en el mosto y los liberados por el empleo de pectinasas (Figura 1).
Contrariamente a Saccharomyces, la cinamato decarboxilasa de Brettanomyces no es
inhibida por los polifenoles. Ella permite la formación de vinil-fenoles que luego son
reducidos a etil-fenoles por intermedio de una vinil-fenol reductasa (VPR) (Figura 4).
Los trabajos recientes de Gerbaux et al. (2002) muestran que ciertas prácticas, como
la maceración final en caliente y la utilización de pectinasas, en la variedad Pinot noir
pueden aumentar el riesgo de formación de estos compuestos en presencia de
levaduras contaminantes y pueden superar el umbral de percepción (400 µg/l con una
relación de etil-4-fenol/etil-4-guayacol de 10/1). Los autores demuestran que el
empleo de pectinasas no purificadas, con actividad CE, incrementan el contenido de
etil-fenoles en vinos, y en particular del etil-4-fenol, con la consecuencia negativa
sobre la calidad de los vinos. Las preparaciones de pectinasas FCE no ocasionan la
modificación de estas sustancias, en comparación con el vino testigo. Por lo tanto, las
preparaciones pectolíticas FCE justifican su uso en vinificaciones tintas.
VINIDEA.NET WINE INTERNET TECHNICAL JOURNAL, 2003, N. 7
5
CANAL-LLAUBERES – PURIFICACION DE PREPARACIONES ENZYMATICAS PARA LA ENOLOGIA – Page 6
R
Cinamato -decarboxilasa
O
CH
HO
CH
C
OH
Brettanomyces
R
HO
CO2
CH
CH2
Vinil-fenol reductasa
Etil-fenol
Figura 4. Formación de etil-fenoles en vinos tintos. Etapa 2: hidrólisis de ácidos
cinámicos por acción de CD (Brettanomyces) y formación de vinil-fenoles. Etapa 3:
reducción de vinil a etil-fenoles por acción de VPR (Brettanomyces).
El control de la actividad CE
La literatura menciona numerosas actividades esterásicas en Aspergillus sp. Esta, por
su parte, revela una gran confusión en la nomenclatura de las actividades estarasas
fúngicas (tanasa, depsidasa, clorogenasa, ácido hidroxicinámico ester hidrolasa) y
varias apreciaciones en el impacto cualitativo. Luego de la identificación y
caracterización de la actividad responsable de la hidrólisis de los esteres tartáricos de
los ácidos cinámicos, los estudios muestran que es posible eliminar parcialmente la
actividad cinamil esterasa de preparaciones peptolíticas mediante ultraflitración por
membrana de umbrales de 100.000 Da. La mayor parte de la actividad CE es retenida
y permite obtener una pequeña riqueza en actividad CE. En la producción, el método
más frecuentemente empleado está basado en el tratamiento de pH de la preparación
antes de que su formulación desnaturalice la actividad CE. Sin embargo, este proceso
también tiene un impacto sobre otras actividades enzimáticas, haciendo disminuir los
rendimientos. Los trabajos de Barbe (1995) permitieron validar este proceso de
purificación determinando el contenido límite mínimo de CE para el cual la producción
de vinil-fenoles permanecen por debajo de su umbral de percepción.
Conclusión
Las preparaciones enzimáticas para la enología y, especialmente, las pectinasas
pueden contener ciertas actividades indeseables como las cinamil esterasa de
Aspergillus niger. Su prescencia, puede en ciertos casos, dañar la calidad de vinos
blancos y tintos, produciendo una pérdida de la frescura aromática o exacerbando el
carácter fenólico para alcanzar notas pocos placenteras. Los elaboradores manejan
las precauciones para purificar las preparaciones de ésta actividad y para proponer
preparaciones peptolíticas con actividad cinamil esterasa débil (FCE). Su utilización
en los racimos (maceración) o en el mosto (clarificación) permite limitar la hidrólisis de
los esteres tartáricos de los ácidos fenólicos. Por lo tanto, la composición inicial de
mostos tintos y blancos no es modificada cuando el productor añade estas
preparaciones enzimáticas.
Bibliografía
Albagnac G., 1975. La décarboxylation des acides cinnamiques substitués par les levures.
Ann. Techn. Agric., 24,2, 133-141.
Barbe C., 1995. Recherches sur les activités estérases contaminantes des préparations
pectolytiques. Applications technologiques. Thèse de doctorat de l’université de Bordeaux II,
n°348.
VINIDEA.NET WINE INTERNET TECHNICAL JOURNAL, 2003, N. 7
6
CANAL-LLAUBERES – PURIFICACION DE PREPARACIONES ENZYMATICAS PARA LA ENOLOGIA – Page 7
Burkhardt V.R., 1976. Depsidspaltende Nebenwirkung von Enzympräparaten für die Be-und
Verarbeitung von Lebensmitteln beobachtet bei der Aufbereitung von Obst-und
Traubenmaischen. Dtsch. Lebensmittel-Rdsch.,
Canal-Llaubères R.M, 2002. Le procéde de production des préparations enzymatiques.
Applications à l’œnologie. Revue des Œnologues, 104, 35-37.
Chatonnet P., Barbe C., Canal-Llaubères R.M., Dubourdieu D. et Boidron J.N. , 1992.
Incidence de certaines préparations pectolytiques sur la teneur en phénols volatils des vins
blancs. J. Internat. Sci. Vigne Vin, 26, 4, 253-269.
Chatonnet P., Dubourdieu D., Boidron J.N., 1989. Incidence de certains facteurs sur la
décarboxylation des acides phénols par la levure. Conn. Vigne Vin, 23, 1, 59-62.
Chatonnet P., Viala C. and Dubourdieu D., 1997. Influence of polyphenolic components of
red wines on the microbial synthesis of volatile phenols. Am. J. Enol. Vitic., 48, 4, 443-448.
Gerbaux V., Vincent B. and Bertrand A., 2002. Influence of maceration temperature and
enzymes on the content of volatile phenols in Pinot noir wines. Am. J. Enol. Vit., 53, 2,131-137.
Goutel A.M., 1996. Réglementation de l’utilisation des enzymes en œnologie. Rev. Française
d’œnologie, 157, 25-27.
Grando M.S., Versini G ;, Nicolini G. and Mattivi F., 1993. Selective use of wine yeast strains
having different volatile phenols production, Vitis, 32, 43-50.
Maurer R., 1987. Pektin und Pektinabbau bei der Weinbereitung. Rebe-wein, (2), 370-374.
Meaden P.G. and Taylor N.R., 1991. Cloning of yeast gene which cause phenolic off-flavors in
beer. J. Inst. Brew., 97, 5, 353-357.
VINIDEA.NET WINE INTERNET TECHNICAL JOURNAL, 2003, N. 7
7