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MAESTRÍA EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA GENÓMICA BIBAC DE BANANO (Musa ssp) Leticia Peraza Echeverría Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C. Posgrado en Ciencias y Biotecnología de Plantas Desarrollo de un protocolo para la construcción de una biblioteca genómica BIBAC de banano (musa ssp) Tesis que presenta para obtener el grado de Maestro en Ciencias Leticia Peraza Echeverría CENTRO DE INVESTIGAclóN CIENTÍFICA DE YUCATAN Mérjda, Yucatán, México 2003 AGRADECIMIENTOS Este trabajo se realizó en los laboratorios de la Unidad de Bi.otecnología del Cen{ro de lnvestigación Científica de Yucatán, A. C. (CICY), bajo la dirección del Dr Andrew C. James K. y el Dr Dieter Kaemmer a quienes agradezco su amistad, confianza y apoyo. Agradezco de mariera importante la beca-crédito recibida durante el primer año de la maestría, al Conseio Nacional de Ciencia y Tecnología con el número de registro 162940. A los revisores externos, Dr. Miguel Gómez Lim y Dr. Jean Philippe Vi.elle del Centro de lnvestigación y Estudios Avanzados del l.P.N. (CINVESTAV, Unidad lrapuato), por susvaliosassugerenci.asquepermitieronenriquecerestetrabajo. A los revisores internos Dra Cecilia Rodri'guez G. y Dra. Blondy Canto C. por su amistadysusexcelentescomentariosyaportaci.onesparamejorarestetrabajo. A la Dra. Mi-Kyung Lee por su valioso apoyo {écnico y amistad durante la estancja de entrenamiento en la técnica para la construcción de bibliotecas genómicas BIBAC, realizada en el laboratorio de SoW and Crop Center del Texas A & M University, bajo la direcci.Ón del Dr Hong-Bin Zhang, a quien también agradezco su amistad y confianza. A Pablo, Tere, Rosa e llka, compañeros de posgrado, por su amistad. A todos y cada uno de mis amjgos del grupo de plátanq compañerismo, entusiasmo y apoyo. por su amistad, DEDICATORIA AmimadreDalja,miabuelaEstílitaymiabueloSebastián(q.p.d)porquesinsuamor, apoyo y enseñanza no hubiera yo llegado hasta donde me encuentro ahora. A mis hijos Ricardo, Eyner y Eri.ck por su amor jncondicíonal, su paci.encja y su entusjasmo. A Santy, Vicky, Wi.lly y Mary por su cariño, ejemplo y confianza. Sin ustedes hubiera sjdo imposible Contenido Resumen Abstract lntroducción Capítulo l Antecedentes Generalidades del género Musa El genoma del género Musa lmportancia económica de bananos y plátanos en México Selección e Íntroducción de cultivares resístentes Obtención de nuevos clones generados en los programas de mejoramiento convencional Banano silvestre Calcutta 4 (Musa aoum/.naía ssp Oumannicoides) lntroduccjón de plantas genéticamente mocljficadas a través de la transformación genética Vector binario tipo cosmido pCLD04541 Principales pasos para la construcción de una biblioteca genómica con insertos de ADN de alto peso molecular Objetivo general Objetivos específicos Estrategia experimental Referencias Capítulo ll Preparación del vector binario pcLD04541 33 lntroducción Materiales y métodos Obtención y purificación del vector de clonación 33 33 pCLD04541 Purificación del vector pCLD04541 mediante 35 gradiente de cloruro de cesío Linearización del vector pCLD04541 con la enzima 35 BamH 1 o Hi.ndl 11 Desfosforilación del vector pCLD04541 linearizado Resultados Obtención y purificación del vector de clonación pCLD04541 Linearización y desfosforilación del vector pCLD04541 Discusión Referencias 36 36 37 37 37 39 41 capítulo '11 Preparación de fragmentos de alto peso molecular lntroducción Materiales y Métodos Material vegetal Extracción de núcleos de Calcutta 4 Deteminación de las condiciones óptimas para la digestión parcial del ADN genómico con las enzima BamHl o Hi.ndlll Selección de los fragmentos de ADN de 100 a 400 kb por electroforesis de campo pulsante (ECP) Resultados Extracción de núcleos de Calcutta 4 Selección de los fragmentos de ADN de 100 a 400 kb por electroforesis de campo pulsante (ECP) Discusión Referencias Capítulo lv Obtención de clonas BIBAC lntroducción Resultados Ligación del vector V41 con los fragmento de ADN seleccionados en las fracciones Fl y F2 Número de colonias necesarias para tener una bi bl ioteca representativa Referencias Discusión general Conclusiones Perspectivas Anexo 50 61 63 65 65 66 Materiales y métodos Ligación del vector V41 con los fragmentos de ADN seleccionados en las fracciones Fl y F2 Digestión con la enzima ~ofl y deteminación del tamaño promedio de inserlo Discusión 45 66 68 68 RESUMEN Los bananos y plátanos representan un cultivo de gran importancia, :,|':c::ta:mb::::oenA:?Smgs,Íseessupnoabí:spg:aA::,fuecnet:trda:á":staesdeenAsta:r,yáE::n:syue| Caribe Sin embargo, este cultivo es amenazado por plagas y enfermedades que causan cuan{iosas pérdjdas en el rendimiento, y por consecuencia en las ganancias, ap'r%cg\raan#?scodnees#.?orp.e#t.e,33osíyiÉ_-¿;ii:'á5S;í:e_yd_uv|cu!'or*:Snuqeung'aseeF:fsag=an=ofiÉadss prograrnas de mejoramjento para la producción de híbridos resistentes a las principalesenfermedades,nosehaobtenidoalafechaningúnbananooplátanoque cubra los requerimientos necesarios que exige el mercado internacional, en respecto como por ejemplo, la palatabilidad y la fisi.ología postcosecha. Es um necesidad entonces, el buscar nuevas altemativas para la obtención de plantas resistentes de banano que mantengan las caracteríslicas originales de palatabilidad, tamaño de racimo y el tiempo de almacenamien{o, por ejemplo Una alternativaquepuedeserutilizadacomoherramientaparaelaislamientodegenesde i.nterés (como los de resistenci'a a enfermedades), es la construccíón de bibliotecas genómicasconinsertosdeADNdegrantamaño(enpromediomayorque100kb)a #¿redneseesrp:C::tseF:S:Ssteen;eÉac:/rfyerAm,e„d;8:asc,ye:!"'Zpaanr:°sveegcut%r:#||:r::asn':fser:::':: resistencia parcial o total a vanedades susceptibles de importancia económica, a través de la transformacjón mediada por Agnoóacíeri.um. Esta herramienta no solo podrá ser utjlizada para el aislamiemo de genes, sino también para el estudio completodelgenomadelgéneroMusa,delcualseconocemuypoco. Ean ss'o bp:e#ann'=¡.t:3ribaa.j?,ns^er.S,e^'.3uC^C'en_ó_ _=I_ bapaio silvestre dipio.ide Musa las ?acsu%gnaat?c,sosnpesbugEt2#na,gcoida:5-t:,OP6-.c^f,--c;iS;v8i3cvoÍ_t#=:ed.:;.ao,bsi'gxóegs:£pa=Egogds?ab%eucsear condiciones Óptimas para la construcción de una biblioteca genómica BIBAC, debido a que este banano es la principal fuente de resistencia contra la Sigatoka :t:,?zr:d:peasraui:'zc:g:a:,:n'of:epá:g:,apTacsósdme,dTej:nr:rTo,,eáteonoc:?nvaedn.c,:nca[DOEJ5Z:?t:Í cual ti.ene un tamaño de 29 kb. El vector pCLD04541 fue purificado utilízando dos gradientes de cloruro de cesjo, posteriormente se linearizó con la enzima BamHl o HÍ.ndTIl y se desfosforiló. Se aislaron núcleos de hojas jóvenes obtenidas de plantas ex vtíno y se incluyeron en agarosa de bajo punto de fusión formando bloques, los cuales fueron digeridosconproteinasaKparaliberaralADNyexponerloaunadigestiónparcialcon la enzjma BamHl o Hr.ndHl, ensayando previamente diferentes concentraciones de cada una para determinar las concentracjones Ópti.mas a las cuales se obtenían fragmentos de ADN entre 100 y 400 kb Para la obtención de estos últimos se procedjódedosformas:1)realizandounaprimerayúnicaselecci.óndefragmentosde ADN,y2)efectuandoprimeraysegundaselecci.ÓndefragmentosdeADN. tantodeE±tv::tooor.238akrbz,a::mf:ed:gÉ£:2d534moaon:rba,::g:,%en::,eunnt:rce::c:3;f:aoTaTe]n2o3 14 (inseftovector) Se electroporaron 20 Ltl de células competentes DH10B usando k_5G;L2,H:edsep:%3c,8:y2;eF,asqeueá:::r:Tngeed,,onsueLeecrt¿vod:Bcco::n::tsra::C::n#:aTn€e: (blancas)Posteriormente,afindecaracterizarlasligacionesobtenidasencuantoal tamaño de inserto y el número de colonias con vector sin inserto (clonas vacías) se analizaron colon.ias al azar (de F1), aislando el ADN recombinante med.ian¢ mini preparación y digiriéndolo con la enzima Non para liberar al inserto y determinar su tamañopromedioSeseleccionarondosligaciones,unaprovenientedelasfracciones ¡,r:o;ríí:2s;:::deB¡rT:#ecnot:su:,:aeTa::g:onmHe,:,á,¡ec:nnseuftnotg::2:#oym,:d::rae„Fnasc::: Con estas ligaciones se pueden constrw dos bibliotecas genómicas BIBAC ii;,Ía::?án:oddceá:;:;i::n:cr:r;r:,:.:;dr:d::e:rtoeng:un:o:x::t,::::n::s:r::,:ti;'ro`:o:rai:la,:o:p:rn:;":ei:; estarán listos para ser utilizados en la transformación genética de plantas Agrobacterium mediante ABSTRACT countr,e:::a:::t:a|dAE;,a=úánnsdaer:stmAPs,:a:Lecrreopti,eypaahr:cu:#,:n,o.pdosord;:::ooi,:,: bananasarethesourceofanimportantinputofforeigncurrencyinLatinAmericaand :hneor%rLbsbFoasnsesH:nw:hv:ry,teh,'dsac:3Pth:tphrroefi:teb|,:;,bayffepcet:nt§8:fh€Lseeassme:„t:::dcuacuesr: and the large banana expo" companies Although many resistant hybrids have been obtained from conven{ional breeding programs, to date none of the resistant banana hybrids developed attain international s{andards, in respect of for example, palatabi.lityandpostharvestphysiology M js therefore necessav to search for new alternatives to obtain disease resistant banana plank that maintain their original traits such as palatiabmw bunch size and sheM life. An alternati.ve triat can be used as a tool for the isolation of :nfteáfsset:nsgeg:ens:stasnutchw::r:s:s::enscea::necsu,,t,,::hmeui:eosf:arggeen;n::chg;rnao,::c,árnar,:: ;ohTcs;r::tne3ewiha,:'tga'n:do::cbu::[:e:goh,,taDnTAAárooór:c!::,:;ogukbbs,e::,:gt';,,|:svp::::3í: to transfer parcially or totaw this resistance by Agnoóacíenum-mediated :r,3:sí:rc::t:o:igtn:f,::n%oennooT,Fca::s:|Pcoensafnotrti:ssct:gt;bá:tx:r#sasguecnhoLb:ar,esmay lnthisworkthewimdmbananaMusaaoum7naíasspbumannícoidestype :fa,::s%t:hcweasksn:,::te:gt:,::tnsár,::tkag%na:omk,:„£:adv,,sbeug:dsef:r,stth[:mp:,rnpossoeur:: :::#t't%T:'e3r3%dL3go4P5r4°íg,rawmh:chhTahse:esc,tz°eroufs28kf8r+t::8:B84;4aísvt::to:'nwaa? #TtrÁfi;gmu;',nogr#:di?,Uannddsd°efpcheos:;To#::'gegradlents,Subsequentlyitwashneanzed Nuclei were isolated from young leaves obtained from ex vitro plants, these were embedded in agarose plugs (LMP), and di.gested with proteinase K. A wjde range of restriction enzyme concentrations were used to obtain the optimal partial digestion conditions wm BamHl or H/ndlll in order to obtain fragments between 100 ::g,42°)°fii:t::d°sper:::8U::zsews:i:c't:oS;e:ft°DR&{a;rna:r£%Tt:n+She`),nae:::zte%'Zvees:J:C*:: Iigated independenw wm the fragments from F1 (100-250 kb) and F2 (250400 kb) using molar ratjos of 1.2 or 1.4 (inseh..vector). Twenv mi.croli.tres of competent cells LDeHdíuo:)w#rteet::eccyt:#:,a,t:ÍGW,áhnd|;-HéAo[2Á,ft::t2:,Lgiht:d.::!e:nod,p,:act::g,nnaLn: cells (white) were recorded Subsequently, with the aim of characterizing the ligations í::tJ:c,tno:::oiázt:daE;thme,nn,:re::rd?gfeesTepdvw:toh,o;;efls,ecn:,yo:,:stowreer,ee:::d,::,,yns:L:cáendd theaverageinsensizeestimatedbypulsed-fieldelectrophoresis. ave,ageT,#e,Lg3izoen:fw,e2r:i:,:Cnt:dth:noethf::Trof:gfra?nJseft,ged:;eedst:áthwpt:mHT;dY,',thwit: :Fbaavne::3ed:Fceuh"S'Zec:fníb2e2c2o7n5tbruc#oih4eosxet'hgea#:;Fo#:eBn':#:s:::°gTv',:;'baragr¿eo/: ofprobabilivofincludingaugenesinthelibravThisisthefmttransformation-ready banana genom.ic library constructed with a binary vectctr. lNTRODUCCIÓN Los bananos y plátanos, pertenecientes al género Musa, son F.,gTen!Io±LS?_#,con_ape_soa_rs€=ohne#osana&aioc±su*iaeotFiicg#FiasR.b!3_f_5!?=_ag_géoon?fdoeECs_r#E:,pngrc£enes 8'hp:°p'£::ed?[°9P5°5r)C'°nar°n 'OS genomas A y 8 respectivamente (Simmonds y Los cultivares comestibles son considerados tanto alimento básico, como :Tg-:rhóap|:eosfu::Leeá:sgaÁa:,:,:,s;:n,g:a,p::seei::avJ:§c:ft,Joesa:ÍLo:,:i,c::,,?se:rpóupé:oseí ap^ror_:_z_ü.nt:'gaomyphga:azngsedeencvuaí,net€a:d¿€:!tF:,aa-d<.o=S=£.,E.á"s?.d^c::|`'9vPopa='i£eesnt¥c'eo¿taae#nús££:Éde: por un amplio rango de variedades, Ias cuales incluyen tanto bananos que son ingeridos como fruta de postie (porque en su madurez son dulces y fácilmente digeribles) como plátanos que son generalmente más almidonosos y pueden ser ingeridosmaduroseinmadur®Estosúltimossonfritos,cocidosotostadosDeeste ¡EUut:sesg:ovpeYeídge7n2)°btener tamb'én harlnas, mermeladas, puré e inciuso cerveza tone,adaLsampertorfcuacs?'áé,aa:u:Laiesn,:f,98mo,on:.:,p:osdudc:dg,reendeÁdf::a:eAs::d:i"g::;ficdo: AméricaLatmylasregionesdelCaribe(FAO,2000)Alrededordel87%detodoslos bananos y plát~ crecidos en el mundo son producidos a pequeña escala en huertosfamiliares,paraautoconsumooparalaventaenelmercadolocaloregional,y ita;iob:aí;:tdi:,:i¡ne:o:cáu:i:::tií:,a]Í#T::aegeccj:jjrn¡:i;f,;;i;Fii::ii!ijnfí:;:o;?m;:o;:r.:;:a:y:ej i!u:fi:e;rfiíijíjiE::P;añjr;::;e;c:Í:te;n:fi.ioi:tsc;oij;Í:i,;:sg!:i;ií:íj!i'Ís!,Íí:i::;ic:£:id;::::n;jsc;c::!Ici::jac=;ie;s::; de Panamá, ocasionada por el hongo Fusanum oxyspowm Schlecht f cubense (Purseglove,1972)EstecuMfuesustituidoporcultivaresdelsubgrupoCavendish, :'xep:!:oc,gned:s;e:n::ose|encT:t,:::u:i,:::osfn,gea:tbe:,rg:,:sut:,s::g:Lp:oT:n:::ece:?,b,,: #áosepn^f::T;,áag"d,es,:mineaadc:sE,gatoeknafe::gerdaádqg:edeessoe=::on|:oq:dapo:eed,,a::enq: #,acá:Í:sc::,;nuuearg:rfeusnegnut:c,ud:;;eg:roopeasrtaoe:,:vead::sa:obs,teonsted,,:r3:rucdc,hóunmhaansáa4o Dentro de las estrategias planteadas para superar tanto las plagas y enfermedades,asi.comomejorarlascaracteri.sticasagronómicasenlaproduccióndel banano(PersleyyDeLanghe1987)sehapropuesto: 5 a)LainlroducciónyseleccióndecultivaresresistenlesSehantratadodesustiw :::t,,:,aerne,:s,,ot::l:sendimpe,r::aan::nt:au,s,c:::,rbe,te:t:,o,rlg::t)Yacr::oseehe:F:oensatgodseÁ?rTc: avc:y:tsat:,kóenepfo:,óalhgeg3,e,:,snper:dbua:tgooré:,daeT,bd:sac,aasso:,fne:esnec,tausv:nc?ampp::::a3#oa:nla b)Laobiencióndenuevosclonesati.avésdelosprogi.amasdemejoramiento iiieir:m::c:;Íaeí:::r::#,:;:;;oiíí;3;:o,s;:p3::s;t,:id;:a3i::i;p5rait;f:ó::::n:¡r;n:go:1íi:JC;;::eir`:eí;:; esencialmente en el meioramiento de parentales masculinos, con la consecuente creacióndediploidessintéticos,seguidodecruzassimplesconloscultivarestriploides e3nqe:Í,::;niti:1:9:;É,:asBdre::;::c;::or;geáihgtb;,:s:;Í::ri:i:,i,;ia:cb:;d:;;::;neu:toeh:a:a::::o:iiei8:!:es, i:áá:n:or::y::rnp:a:ft:::eo::,;:i:::aesi:hEaepr:a::d:ut:,i;oevn:f:::;,:e:ti::l::i:::£etto:r:eT:e;:rt::::; una buena ó excelente producción de racimos Los parentales femeninos utilizados Pma::c#::arr::::tse:tí::`d:SjTf::::t::"`::::rsmdeed8:á::r°fsu'e%`:nterFsb:::i%S::Leen:i'b:: Pisang Lilin y el banano silvestre Musa acuminafa spp burmannico/des, mejor g:gn:tc:!:nc:gT:,,,:§,,?::osaa,::fta:"ía(yDa::aa,%:ebalng::,áesteu,t,moesres,Stenteala ct La producción de plantas genéticamente modificadas a través de la tg,:nnés,i:aT::::nmgoedTfifctácdaasEt,,eT:,ogrraaT,eai:oncTÓon,eá:L:áopaarat:aaot:e:c#,ad:apLaant3: icioc:n;áa::n,t.en::i#:bs::u?3:u:p::.ii3e:s:t!e:::idí#ní:::n:::nLÉo:sr:3:!,:;::s:r:e:srai!h:o:sJr:c:::Fü:t; ::,ses:t%gr:p:stdáe:%sgepj3::::sg#t,a,,ará::::eFace,::;:dTcac:::,,nd:ecsaráocTe¡,,:tt,::sendt: resistenciaatravésdelatransformacióngenétimeslaalternatMenelmeioramiento :net:o3:::,nóontes:3:egroaoc%nL:sttar3,nesfg:má:Lóensgeennéet¡C:e:::daensuecr,eda:f,::::p:oormyo:: iídñ:i:i;íj:;:s:;d;:i:;n::;íiíi;i;ís:ÓÍ;;:;;i:ia;ije;#;j:i:ÍÍ::níg;;,;;;:u;;;:jfi:::caiígi;:sjA:£d;:o::i;:;ii[#ii(i!;id!o desoxirribonucleico) de gran tamaño (mayor que 100 kb) listas para usarst en la tiro:,i:.f:o:q:icu::en.éono;:u:ecn:t::i:a:3:a!t:e:,ig:ats:vj:opir:as,:,se`áa:nr::s:'::|::i:áai:o::::`Ta:r:::i3sirugs:;:; 6 de dichas bibliotecas pueden ser del tipo "Cromosoma Bacteriano Artificial Binario" •íB;bíi;eíiii:;í::rsa::i:Tií;jnii:£hí::;:;i;s;íi;ci:d;j:emeiAS:!:íj::#::aí!:::oin¡;b:,a:nn::,inig::r!a:|::íie;ñ¥;;ai genómiffi BIBAC que pueda ser usada inmediatamente en la transformación de plantas. Enelpresentetrabajosedesarrollounprotocoloparagenerarunabiblioteca genómica del banano silvestre Calcutta 4, como se mencionó an{eriormente, este :::raanoE,P::::orrs:,,:t=n,:,naadc:nftur:dv:r::pso::fseJTdeo,apdceibá¡g::,,a:T::;:::ft:,.geaé:k: los vectores binarios convencionales (PBC) La construcción de es{a biblioleca, asi' :::Ff:tuurcoareancte:ríáas::é:,dceo::tht:?edne,:ess,ps:,emn:::spg:as::spt:,:orq;:ni:::aa.sfeorr;t:,rz:g: dichogenesalgúnbananodeinteréscomerci.al REFERENCIAS DeLangheE.A.(1992)Geneticimprovementofbananaandplantainthenew J:a;:'t:t2::§ií§:¡a§:§a:Íd;§Ín;;°:§:§;i!§íijiíiiiii:§:§§íi;í;:¡Í§::;j;i;;Í;b:a;Si:;;:::fi|;:;;i;;ní:;Ís;usi:;bs::i;n;:et:m;:a:S Scjentia Horticul{urae 25, ppl 37-147 :P:e;e:eg:§Í:ii:::eii:Íii;P;rLi:§;íiig§jg:fr:;(:F;d§;::n:£:t:::7n;;n:B;::::S:h::a:nd:L:j:r:d:;s';:b;::;;íísg:acnt::er sa-T::oa:,::::én:a::cgsní;infete:b:u;,e:tf:nbL:nToaah:Hf#::es::!:re4,s|:s7:nct::fpu,,:r:agr,cu,ture Possibilities ln Disease of bananas, abacá and enset, Jones, D R (Ed) Cabi sá-;pán::Ls;;n;gr::p::á:s:,Í6é::cTreonpno,:t,eES::aT:,,kaues:,spp,|9c#,"EÍ::S3:P,,cABB group) protoplast isolation from regenerable embryogenic cew suspension 7 :::,:Lo;Ía§n,;3:::#e;p;íjj:3Í{:§n;::;:::o6í:Kf%,r,Í9::t¡o;ny::¡3e:;í::aoía;¡;dna:p:an:::::na:n{:::,:vp:ptTe:,,a Tao'Qba:T:ar2ás83Jg'kLin-npni:¡3:):c?ñ;an,:g,:a5l:::ta:b:ij#ot::Fnpi:so:Erb£::adg,::t:rs TheG,:::,,eúcué:,dG:::emairccsh,cVooL3:í#2o4og,o,lát:?t:gyfortheg,oba,M"a 388:T'€i833|Sp°pft;tsmRep°h°fameetingheidinA"musA,i7.2o„ vuy,ste;i;;,Joépr::,,ijgg::c5i,::pr?eaenriga:::a:::,;::h:G::a:r:e,ig:a,rcc:h:;;,:ioe#:p:,n:;t4::3;:tnst,tute CAPITULO 1 Antecedentes GENERALIDADESDELGÉNEROMusa :%fs°:Td%:::°n:eí:?onr%€ash:eorrg:C:e:a::eci;r,:a!Toegs:::'iaass:v:a:n€t:a'}°miá°£r:Unce:S::;od¥:a:r:§tseár:ádna::s: fi::ñ::Í;:::u:Ld:aocs;!,;;;a:Sspii::d;eí:n:fír;#j:a:;ivíñií,;:er:;i:ttíi,,;oiiii#,:;í;f:;d::i:;:;j,:iea;d,iae:;::i: f:rn::c:¡f:csa:c¡:::::e;:,,g:s,aá%a,::d#:ucau::ddaób:::d:::o;:,#gr£:s:,sáénnzgu:,sÉ:fñná,e:: Lasbrácteasylasfloresinseftadasindependientementesobmelpedúnculo :::u:onT::::nioesdneucá::a3ásí,ceespt:a?afr,:r,:ss%asr:oui,nf::c::ná|ecsu::t:::::r:ossqnuueds: distales,lasbrácteassondecolorrojizo,púrpuraovioleadebtialasantocianinas í%J:rrn:t:°:S'):::áecii¡;!v'8;:i:rd::¿*oé;;:ic::!§::::%iió:g:gÉd:r(dge:yíe::::ie:a;:9:8as;;S,€:'g::rE: Or,'gen díí:am:,:ffá„::a,o,gebnaonT:o?,yyp,#:::sÓ:í?t,:,:á:s,,gceuny:mc:n?r,ocdoen3t,,;:f:,:aá, Á::::r ABBy de los ¡§S;;:C::rn±:sV:a:rtí,:r:;:íí:;d:ets;í:::ojn#e:nB;¥S¡b#;[r::mS,§,B:ír,Í,3¡eES;,et,#:t#: --'' "'t`'v'ut'o .un un número cromosómicá-dé '3`áu,á'r'oLdchn:íoar;.: lnc ^an--~-_ ^ -_ "LosgenomasAy8deMusadifierenentamaño,elgenoma8es12%más ;:á;nt:ri::b;;%ie:!!:i?:a::gíi:n:5;£:dg;:fínaieí|jí:jíi::;a!:Í:Íe::7cáji;:sj::eí:eá::::Lai:eii:r:ii:::i::ií¡; EL GENOMA DEL GÉNERO Musa estud,o::,s,tae:sot::c#r:rTa::Ó:p:::cr,=nddeé,gÁgoNm:eg:doMás:,u:aí,r::teTsutyüd:f,cJuey, partjculares. Sehanutilizadovariostiposdemarcadoresmolecularesybioquímicospara •:¡;;e::gea::,8,::e::te:;:g:é:¡::oy,aEas:tá::,:aa?:aniier:st,a:::Tna:nticp:ersrome:tn:!Í;:d!%:o::::,iu:,:'X:í:::: itgr;b3uay,oBeunhea:thoo,,::,hdaenr::::eci:odso::,r:rcst,uorna:essddee::osmc::om:::myatsra`nFsi:£c::naéá :n::ií§;:::';a;iriis;Í::¡;:i:_;b_::;Í:;;i;:(!íis:;:j{§;ie;d:Íiiec2;íi|ij;;i:§:ití:§e:a,:;::ii!°;Ssaoe:%;:;::::Piiigi;:;ii:;:íi :t-órjcró-n ael cariotipo en Musa de `os cromosomas (1 -2 _T_T!_9e .east:ag::£,rd°¿ ::::::::=::;:::-:::::::;::::-:::::-::::-:::::::::;:=;s::--:::::::-:::::::_;:-:-::::-::::ii;s:::::,:::-:::-;:::-:s:::::-:::::,--:-:-:=;--::-::::-::=::::1:;-:::;:.:::::i-:::-:-::-:-::=:::: t,:::|£|ik|ceeáns::,,32::u:¡,,:::zga;::o:ng;!¡¡cn;:::cira:dta;:snvi¡:,in:ti;:oh::p:3`::r:2rn:kgo;,,'oA:Si:ms::ui::i:i hMaunsac,o:,g_:_or::s_,:eeca:,::;C;ag:go:,r::ru3;:a:n:;::sdi:,erib:tg:;eiy:Íjtó#mo::aa-:láoe¡::;ig:t::::ii 'V'u.,\^. _-. descrita (Baurehs eí al.,1996), a detalle. A n'ivel de sye:::::Lac:aT:r:3,:^n;cTalt:T;S:T:#,:;:d::,tqa:;,;:ecp:J::::::i;:nun::un::t Se ha identificado al„ 1998), y una ¥§¡;:Í.::::,:,;::;Írá:a.N,te_Guc¡;nrd::fásetí:::H;::m::n,a,:,dyeá,::d§::rpL:eon:cÍ:,,édrc:;u_:_: banano; algunos transferencia que metalotion.ina. En la actualidad, las nuevas tecnologias están permitiendo dar un nuevo ::fcoeqsuaen#ár,eac:,,ó:eg:::o::edsetu,g,?n::s,tigg:,::me,:ae,d:r::taegFan::onóuml:ahde:¡abT`nean;: :ñ:;§;;:::r;s::;íííí;:t;;;8oÍ:ͧt:p;:%3síñ:::h;¡Ír:¡;s::r:Í¡:n:;£;;a;nj:í{t:e:nj:Í;íjz:atst¡:::;e;e;:p:§brt;a:¡§ebc¡;;íͧ;c::e:; clonación de genes, la secuenciación del genoma completo, el mapeo fisico y la 10 fttiia:::aeí:,;i;ám;ieba,;is;:;c;a:s:sa:!:tio::e:ní;o:i::;;rí;ci!ere::ói¡;jts:::#;:¡;n;i;a:::,:Bi;?naA:g:::::¡,rTs:::sr %§,:,tt::n,c::o§::n:et:eí:j:us:e::bí:,u:et:ett:¡;„;;pc¡::,t3r:„ort:,Sr:g:odo:;a::amroe,áge:é,:,::rd,: •osobJeE;á:spt:g:ieg3obs,b!:tnetgsdeie.Tá:nusnoar::p,:fear:taecroenr:fTtin::npáLaacá:p#:,? ;i[:c::;Ug:a::SgpeencotgudnedFomc::f::Sc8::::n;:;::cmo°h:St':e°,rgaon+Z::[:n,estructura IMPORTANCIAECONÓMICADEBANANOSYPLÁTANOSENMÉXICO adcvc==tis=vaag:rr:3ud:ÉÉaasrnhgS.é=s^xSc*_o:n:a#ítyát:a¿n#p3%becabinD?ÍT¡£mo#eg!Q##^:-Spdr_e?_=É,,?ose si|:prc:oiíf::e:ai:asb;:s:7;ó:RhEáoh;oa:nied:úcse;":muít,,:J::,,:::c:o:,gToyenanerti:d:a:ss,::,af:,it::adrd:es,:;uc%Í;ep:an:j 95 % se destina al consumo nacional (Orozco-Romero ef at 1998) A nivd de £gte::aías,LFa#:r,2#e:oiFaÁ,á:,2t3í,,,oyo::p:,es,eqpi,,;t:,:#heandg:?dcuocnc,g„:::.::9a3gs p#:¥fds:esn:a:;M::;í:;:3%::::¡óT::::[;::á¡:f;to::íjí;tí:r:g::e:nufi§:;;:¡:g;::dcd:e:§;á£í;á:s:ya¡:;,g:5t:;:o;o:ys::q;;rj enfermedad ha modificado el mane/o de la§ plantaciones, principalmente los •i::r::je:snaty:s::h:3:5Paeapr::Ó3ngyood;,fn:on::;C,::;Í:;:;;;:::8:ee:;at,hTa,a:gu:t::Zi:u::oapTr¡:ítt:°:StemT;; ;n:vte3na:ia;:::axíi;c:ta;Te:n,,:g:::7c:oó:::o:noeí|:i:i::Do:S:áí:3Feu:nLá¡::m:::te::ei,!iise::;í;á, negraolaSigatokaa""sinotambiénporbacterias,virusyplagas,provocando asi.mjsmoladismjnuciónenelrendjmi.entodelosfrutos propuestotresestrategias1)laseleccióneintroduccióndecultivaresresistentes,2)Ia ino°`nr^e±aes±:=a§!=£g==edie).=°snet|ea#Óe:a=,#°tsodeuf=rc:^°ns^dae^.=t9=_ata"e,sehn t;:;e::;n::#:anc:::yg3¡:,:::Ío#o::je:y;:Db¡¡aLnn:td:;Shg:dTe%tá:7¡Sme:::gLaomd:f:caáaesamt::ovréasm¿eení: 11 SELECCIÓNEINTRODUCCIÓNDECULTIVARESRESISTENTES s,gn,ficaEJa:anseir:8L°d|i:endt:nddeeio`:cui|:vaot:kdae#%raasphp:s:a#::::troudnuac,dr:dnuucecj%: cultivaresresistentesotolerantesalaenfermedadEnAméricacentral,poreiemplo, sehansustituidolasvariedadeslocalessusceptiblesconloscultivaresdebananosde cocina(ABB)talescomoChato,PelipitaySaba(Jarreteía/,1985) oca,,zadpoorenoter,aoepsat:edeeÁfr,,:::,tu::,e,cn::or:gc;o#:rodperofaggrbcu:tuit,:artrsoT;Fpi:,d`:':t)é ::Í;;Í:;§:¡;í:§Íje;:;§:;¡ñs;u{;::;e§:u:::;:§::::t:e:s:;:j::§;;:Í:§:j{;::eí;jd;§ut;¡;;;t:;;:¡:r;;:§;§:::;;Í::::§o::;§;s OBTENCIÓNDENUEVOSCLONESGENERADOSENLOSPROGRA" DEMEJORAMIENTOCONVENCIONAL •::i::::íí,;!níi:r!r:irs:j;;s,:d¡e;n:v2;2s:ti!a::i?itggc:ris::E:nn(::gHg,g,S::ínucn:d:íahodá:::P:r;r3:ri:mo:,::;dá: parenta,E:T:#adme,enct:"?veanrét:c3,::Tá::c!oenb:l:sáaqbuaesasdoonef:l:,esse,eAC:,,á,:nda:Lpeol:en, i:uiivies:dL¡:;;guis::s:gr:s::;u:nti:u::?s:;;gsn;:sie:Íein;ic;r,Í:ts:!:i:Íci:!tp;r::ggr#giía:;aé;,:iicatij:`jz:;:d:; ::,T:,,::ni;:;istg:ep:!e:,,pa,rág;a,,Pdr:g,udcoc,:ns:eaíap,::ds:sstesn,:,t:t,:::tr:i:trs%::::: negra,laSigatokaamarillayelmaldePanamá r:e:sc::d;:n:i\;;i,,:ní:;,:ea::r::cti:p;:Í3á,;!::p:a:i::oÍ;o:.:a:jsn:s:Íe:;sio:r::::ia;Íbariigjsí,,,:F;idiír::c:#:;i;ri::iai ¡j¡::;j;;::so:§a::#:M¡jsr;;í{:¥;§:P¡:#ñr§,;:¡;:::Í;§ta;;*R§oíjd¡:[;:j:r:o::::;j#:§::§dr¡;:a;=Ío:jní¡r;ñ¡í:p;;::etT3:; 12 :=-::--:_:::Í=:Í::_Í::::::s:::_::ií-::::=-=:::i:::::i Laintroduccióndehi'bridosresistentesparasustituirloscultivaressusceptibles :Rn:a:::#:Oksa:,:::tí#j,dqoueFiiÁ-p2a3|,a#:)aene:es3|eesrt:,a:mu:nateveág#ar3on:cnesóduabd: ;,:v:::au:co|s:aduT::j:u;;.,íii::7:::,r:9:?:6;,:u:eyma,:ení::|:|:g:ucnp:rohg:r:sTd::dao::pT:ed:!oi::,:,,ct,:í#s:::,:á: BANANO SILVESTRE DIPLOIDE CALCUTTA 4 « acumi.naía ssp burmann¡co¡dás, LasplantasdiploidessilvestrescomoCalcutta4seoriginarondelaespecieM acumínaíaCollaytienensucentmdediversidadeneloes{edeMalasiadondeseha reportado qm cuatro de las cinco subespecies se sobrelapan, éstas son ;,:íia¥n:a:€e:SpS'ftm:°%ac3ecn;"as'í:sm(:|i:r!:m:#aian:d°S#'::Sir;j:°X:e:spigu7;;:i§:sr:):a:;g:Tsr°on;:; ::t2e7'a°csy33:Tnyas,:::dEacu,:fe°nr;,rdeaqdui::rngseaunatemperaturaóptimadecrecimiento Calcutta4,esunaplantamonoicaLainflorescenciaesunaespigacomplejay :::s::ted,g:uuen§tpoesd::cdu¿osvf;Faosrossoodr:ne:;:::js,adsefl:,r:so::á:,Ta:r¿euge,aedsat3ne:ngrpuops::,g: !rrií;É;oiíe,sas:Í;,R;íj;a,:c:o:::::Fn;jrí::ií!:;dry:l;::ro:;;o,:::goTfs:,:;:uí|::is::s:ei::p;o;dá:3:o:s;r:n;:n;a:íi:, loscuakssoneventualmenteeliminadosLasfloresfemeninassonaproximadamente de"cmdelargo,conunovarioinferiortriJocularbiendesarrolladoylasmasculinas deaproximadarrúáhté-6'¿#lcvovna'goe=ntTaeTg:e'5l :ot:::::Ld:e:,:rup::ái:á2::c:áf'::;;,:á::JTe:go:a:s::r:;:se:a:dn:::o:í::::?sirsn:o:ssofa:ú;:uiponans::fcd:udcJ:r:: 13 semillas,aproximadamentede5mmdediámetro,sonsubg`obosasoangulares,mw duras,conendospermoyconunembriónmuypequeñoenelexwmdelmicrópm ¡:%t;¡¡í:::a;::;::c¡fí§;;¡:e;;;Ñ¡n;:#;:§ÍÍ:a;!:ñf;¡Ío:3s::Ír;;,¡::::u:;¡:::::osÍ;§¡¡;Í;:ñ;;;;j:;:;:d;:í;:r:::í¡:§:¡í::s:Ír;; de nulo .interés comercial. Desde el punto de visb taxonómico este banano se clasifica (según Purseglove,1972)comosemencionaacontinuación. C'aseSubclase OrdenFamilia GéneSecc ro¡Ón Lilió s'ida MonocotiledóneaLilidae' Zin iberaesMusaceaeMusa EUMusaÑñacupjp3±6ÚFñáannicog± Es ecieSubesec.ie EstasubespeciesedistribuyegeográficamentedesdeSriLanka,"deleste yBurmacaicufta4,esconsideradadesdeeipuntodevisüdesuresistencia,Como una linea pm (true-breeding), adecuada para su utilización en el me]oramiento i:i;;íj:!Í:i:Íp;Ín:sj::::£:í;::¡:i:;;ii:;;i:ri;:in;iii:i;::;Íiicií;rií:;ii:;:c;ieiíu;Í:::í:;itp;:jáir:ail;i::iíiíF;;;¡Í;!!;;:i;;s p:ri.;tdaotHEo::i;:ri,:e#::;f::::;`r%i::a;d:oe;L::sí,u:l;:rtií:feFii,:r3a:pTo:io:::T;:b;:o:,a:noasng::i::o:::: E:áat:cn,3:,aTaB,s,goant:aaesnpeegcr,:,Sá,::::res:sa::#3,::Mm,ódme::ds;r::nut:ar::í;::Lót:,eens:: i;i:v:u;:s:::ni,::e:,:,ai:al:qi:;:3oi:a:Ís;;j:ii,fciü;ii:sl:á;:t;:::rc:i,;p;i,r:aT:3,:e::niií:,di:ie:g;Í::a:d:ar:ai::;; PO' Vuy'alt„", v. _-_, genético de la res.istencia a la S.igatoka 14 jj;r;Í:i::i;:;ie;;i;Í::;i:f:!Íri;nií;jjí¡;s;t:;:Íjnñi;;iííi;o;s;;;:iiise;:;;;Í:i¡::;:i;;:i:ipie;i!;:d;i;Í:!;vii¡j:s TRAVÉéNDTER:AD¥ifLÓsNFgEfATéróTNA%ÉNEENTi:LSAMENTEMOD,F,cADASA Elmejoramientomo'ecularenplantasutilizandounaampliagamadetécnicas t:E;Íjt;;idr;;ngii;:;i:;e:i:::::Ííi:;:,:i\ÍÍ:::i:ó;;íiíjí|:!;;Íi:;:i:tj:;!j:íji::d;Ó::iaíí:Ís:aíjin;e;i,;;j;s¡;:ii;Í:s:ci;¡;a, "alternativaalmejoramientoclásico,sinocomounaherramientacomplementaria Los biólogos moleculares y los me/oradores tradicionales deben traba/ar :::::t3:Fonst:u7t:vr:r::et:á,:=:i:csosg,#csh:,em:nrte:risgy5)Pararea"za"spruebasde MmeE8.:o?nm*..cna° C°nvencEonal del b"m y p"m a .ravés de .a transformación genétjca La primera prioridad en el me/oramiento del banano es la generación de ;u:;bvraar::ent:ec,á3rcgoanq::s,:;::cbaas:doenef:rTae::greosdu:c,3,nagsaesxuai,,neseT:r::gmo:n,:, ::a:i:a:iiahg:#;:tn:oa?:::L:ps::3icñ;;:s:,;:d:ar:cgFi:e:;!Ísmy,;;á:oe:g:a:gn:ci::n::,:de:|eti.::!g:r:;; totalesterilidadfemeninaEsporestoquelaintroducciónderesistenciaatravésdela ¿rGág;orLTa:£:sgf:feent,cfa:st::FeadteerÁstLv:oTáunye:t:a¡j,svacr:a+:ssoumT:,3reaT,:ennttaost:ság:; fundamentodelai.ngeni.eríagenética. A#::ji!!:;;%Íe;e;nu;Sj:;;::;ié;;:;u:ncs;d;:iu!:§::;;!gíi;:;;js§:;e:y:g::;i;:u:§::fi:i:á:Í:in§::Íe§:::;;íj:;:a;a;idi:j:a;§g; DNA,paraintroducmciial"tmdegenalascélulasvegetales,latransferenciadel 15 T-DNAesreguladaporunprocesocomp`eioqiie`nvolucraalosge"devri" de la bacteria. :::acv,::,,:si,ag::o:::,,:aa::e:nné:%:s,!i:r:ma:áaedd;:íi;,eacT::,:o::!sd,:dd:riÉn:sÍ!;:or:c`:me:;¥o:h:asns:u,; :E£:fiíj:a:;;P::°:aTí:eq;¡;Sr:e::::n;§{:::;:;¡¥:::8:Í:::¡;;:,:r;;Í:g:eeun:bee:r::t:n:;r::d:;:;¡;dn=es:p°::8;S;::::gr::::sn: (Sági ef a/.,1997). 3Ío::::i::tic;:;±,:iin;jg;e;i::;:eii;s;£Í;:Í:;a:r,:;í::,t:tri::a;;you:3::2:::;o;ii:Íee:a:isí::;;!:::i:nt:v!ííjs::i:#ii:yjó;;ii li:o:v:;ne,:A:,:cs;og:9:;F::;eeng:ornee:e:ter,ou,aorreasc,odne,bsaenaT:":aenshf::mr:á:n::::oopla;i::taé i%r:,r!:Íeg::7:¡::a:e,e::E;;i;!b;s;;:upii!:!s::::1;a:n:eix;:eiñr!;;:::::e;;átri;lEÍ:;;::;a;n;s;;!iii,¡diein:(;B:iík:i:;i:tii i::5ii::a;n;gb!f;ei§;§::t?:a}s:g:éd::;i:s%nep:i{¥iai:a:i;:;iae:::%:,:dce;;í§::ip8r§::;P:;:;i:n:Spii%::;e:ii:¥d: Mediantelastecnologiastradicionalesdemeioramientomoleculareraposible :::rno,s:f:íj:eg:r:,:3::esdese:ie::c:::ndte::f3;#::dd:o:sdt:3i::e::::,;uri:a:::vcad?;:;:g;:n::i:á:pd:r3mj`:i !j::ii:;ii;i:aí::,ii:ia;:,ijíi!í::;iq;l:::i¡s;yir¡;,gini:,;:jilc;:iie::::Ó:fi:gi:C!e:S,efs::;:iFj:t:e:;;i; BibliotecasgenómicasconinsertosdeADNdegianümaño(%a4m kb) hospedeu,::b(,g::i:r::sgoel:ra,::ra:;qdueef,n:::t,ecnoeTofraugn:enctoo,:c:,,Ó:zadred:e*iañ 16 genómico,inse"eniinvector,estosfragmentossesobreJapanyensucon/unto representana,9eriáñ=énñtrtedc=ourheosrgoasn:tamgon ;:iíií:i:§:§;¡ih;;§:;;Íiici::;Fi;¡Í[§Íeí;Í;:;e;Í:;§::;§:i::Í;i§::jba:i:ií:ij:í:£:A;ij:tíi§n§§:#i;iaiinf!:Íiáiaí;§:i;§d§e!e i:sstaso!!t;:'i:ot:o,ip:ti;g,:i:a:Ó,egso,Ísi::t:ond::i:;í:o,sAert;£:ods:::eiaa:,:::i3;:d,ant:rnése,hamnapsédo, :;á:r:§;£:t::j§;o§t:;n:fig;oÍ;::¡::::;:;Í:¡;Í:¡;:Í::Í:AÍ;y;,¡t¡;íu§:T§:n;:;:§;:;:í§:§;SÍ:j§;::Íje:ny:t;:§:Í;¡j;:::;§:e[: clonaciónbasadosenbacteriacomoloscósmidos,fosmidos,bacteriófagosPl,BACs, PACsy:?:s_::ñi:¿t-e_m`=:eac%#a°c.'ó°nsb%Sg3do°es:feóvsarid'SÉ;:oi£o:eu.rióyEa% ::r:nx:Le:L::sAm:::nts::mn,acs#:b;tsrs:;?:ssm,t:ae::ro:::,rEg::;a::qu:i::f,:c;a!e::e.:L:e,v:aend::e:::rf:qt::,:is;,;: Ír:o::;;;¡:,::uína°;bp§j§;;tr¡¡:;:Síd:ñ§::t¡¡ÍC:;jd;°r8::U;a:¡;::aec:Í:e§§::r:;:;::¡fi;gb:°n:;°;::t;:Ísn:síjg;s;e;:s;§;fí;::j:í:g:; fósmidos,yhash400kbparalosBAC,PACyPBC s::tvee;:o:po:séfscso:;:a:ns::,sa:s:;tae:ra::::,:,ii::Ls:i:::bná::e:s::o:::F;;:g;,Sfyea:,i;i:!e:m::sedn:f::so:qa:ce:Ó:n, de BAC. :;;:ni::aígíg:::ii:;Í:í:í;pis;o:?:ph:;;ñop:A;id2:o::Í:níj:;i:p::;;:i:o;Ío!n;k:ija:ri:Íjáiiii:níjji;;Í:!:;a:::a!ij;i:ir;:e:; ::#f%t°oSs (qGU,:d:,+¿eenfdaa/? 2roeog;?nes largas del genoma o más aun cromosomas 17 BibliotecasBACdesaTrolladasenelgéi`eroMusa •smo3:ei:t:e:ár#aubdr:r;ar:::udneo,3:::!::,v::Je:,:,o:e::eratee,Cdoenssa,:::Fo`::erunnactoanpa: fisicodebananoutilizandolatécnicadehibridización/ns/Wporfluorescencia(BAC- f::Hp,,::ern::it;;gn,:,::ant,;nng,berse,ákpearpao::t:i,#,taer,hzhaoc;ó:fdai,,2óroa3S,,ocac,ondepuntosde checaspeo:so.táracg:sht:úyeennde"::t::3,,g:e:aotÉÁ,8ad:`x3:::#,á,:Bju::`faB:si:::c`: CGU,:bas,e¿á„Ca°8:Leomm:::a8:n:::,jams,£¿bdi.o)tecasconsmasparaeigenomaA(The 18 YAC BAC __--\v``.'Olluu'a _. _...u u iusraio eseri i!:piíñií:jíiÁ::a:t;eai:tíde:ii:á:Í.:s:á:n;;q:ÍT::aíoíui;jr,i.:r!:É!;Í::faucr:N:YmA£:;,,,;c:oa:e;:R:nu§É;;u:_:^cfa:_:_ut,óg::t:ucdt: :íí{e:;a;i#:apíiidís¡s:::;í::a;íd;§eií:;}oai,ií;b;d:af;o§§x:i¡Íj§:;&íj!;;í;°°!:Bg íjn:,:;rei::::q:Í;C;UE!¥j::#a:;tg#fin:d;;§i', 19 TransferenciadeADNdeal.opesomolecularalgenomadeplantas (Tanksley ef a/.,1995). conten,::b:,o::cavsecgt::eósm.::nsar:oosn:,ns:::o;a:ae,:DY'a::foa#oacpl:snodmeol::,uu',aaré vegetales clonac.ión. ¡e¡ats:Te:;oei:t;::;ij;ií::ngs;m:ii::::oi:í::j:;áa:3;ae:ro:::s::L::::n:;:`Íj:is:t:::;:s:Ía:pv::r;ii:apn;ig3`:Íi •hn:edrieo:odse,,gá:nt;ammb:::„q,:eBia-,á:%eb,,,,dsaedftá:n,Vaesnt:?onna:sP,::T,:r::::::i::i:)s:: :;i:a:d:o::di:;a:':Tg:e:r§,,Ódn:9:9:8P);::=:j:2sntc:°:P:;§:C%e:::a}t:d:s:oi;V::%:j:S:e:ri:::||:gue:n!; 20 t3.a=e%]3bo§:os°n::.ab#m8:®vpea:rt=oer=:%p:aecrnha%§odp%#°óósnsigvonescbtda°e::e=:,vabe:sE#,;n§egs,npb#nomog§dc°gs=APp#N:áadegemsná:esr de 100 kb_ deADN:::irseud:::+¿°es3PoBocksb:::müoi::eBSAdcesc)°npaArcysmantenerestab/esfragmentos tíí:i:i;:§::°r;:iiiu§;::::ii:i::Í:i:i:§;§;;iri:;;iííi§;§osií§Sií;u;Íi;!:Íjii;§:;§:í;§i{j;§;§iij¡;§§Íin§;§::i§;Íjí:;§jí;:Í:;:) :í3!;::Ó;ieiíi;;;;ji;o!jo;::;d::i:ia:q:Tee::::y;g:!;;;j::q,:2j!eotábi::;:mg,u::oáa!ii¡t;áit;;::;aáp;a;:j::::o;pi:r:o;:;nr Estatecnologíadetransformaciónhacontribuidoenlac/onaciónbasadaen j,:anTá3sg:::sp`¡i;:,a#n,nte,piirg:,,os#,:c:douenne:ee:nt::ter::e:n,,if;::d::;fn:ur:::::,:ó:::::c:n::¡n:t!:ai: ::á,,?,:agne;::ái::e:ncz?=aosadqeu:::§r:t:ems:tiebnoc,:£ntranagrupadosporeJemp,o,osque Enlosañ%recientstÍasbibliotecasgenómicasquecontieneninsertosde §:§::o:ff:cd;ó¡::r;;a:j;¡a:n;::ípÍÍ:e§í::p::a:§:F:;:í::;í§a;s:Í;:¡t:,;;a¡;pg::s:í:ges§::;,¡:yí::::¡::¡aí;í§;ft::s:,,;;;: sus característi.cas más notables. 21 vegetalesconstruidasenvectoresBACyBIBAC,consuscaracteris"prmcüW Cuadro l Algunas bibl.iotecas genóm`cas vegmonocotiledóneas,D,dicot.iledóneas. Tamaño deTg:;,ooTdaeDMbM750 Tamaño8:Q.Tseodi°o Equival®ntosdelgenoma6x Roferenclas Tipos devector Aplicacione§Mapeofisicoyc`onación::#:; OrganlsmoSorgo•`¡.:'.:..`¡ de resistencia basado entec::o:pi:i:ii:óííefld:Íó;toiifto;::3;i:p.aeo) Woo eta/.1994 pBeloBAC 11 1 57 kb Friiters ef aí.,1997Vinazeíg1a/,1998 D LechugaLc!ucasaííva) 111 2300-2700 kb 2x pBeloEAC 11 (a Manzar`a 5x 120 7509532250 D pBe`oBAC ' 8¿;ngaec*:nd(eb:ess::tae::Lae'vTypmapst Ham`ilton ef a/. ,1999Dongefa/,1999 (Malusxdormsiica)Tomate\::`:.::`::.;.`....` D A,godón(GossypiumhirsutLimCañadeazúcaí(Sacnanjmspp) 125 4632x BIBAC 2CLD04541 masada en el mapeo)ntíael PpBe\oBAC 11plnd`goBAC451 120130kb D Tomkins eí aí.,1999LllaveFgkgyg°Ía'' 45x `stencia co'zól1:Í:y:i::,eg::!ó:n" del gen de reCionaciónpovemaliza 30005600800-930 M Tngo (genoma A)m: : : gum)Papa(SO'anumtubemsum(G/ys,: amax) ffiracteris icomodegenecomMapeorisicogcnoClonación(ba s do resistenciaoelVOyginDéticodei 1 1 5 kb155kb148kb MD resistenci nvec:`£aB:' tDesar ol\odecobehi ramestud\ldentiíicac ontieneng 56x37x n en el área de laicamoiecuiarunabibliotecacon laásamp\iaparaelnoma Song eí a/„ 2000Tomk'inse(a/.,2000 pBeloBAC 11BeloBAC`1 27 4x D (£:%aeduam M 5ooo P BeloBAC 1' ode' 8,::edsepcLoá:vso:udee'ter\cla 1115 i06kb 6& P ~%•Amamp`m~detragmentosderestricciónpol`mórficos..RARErestricciónporendor`ucleas®asistidopwReMvulasre Yu el a/„ 2000 CONTINUACIÓN DEL CUADRO 1 M Tamaño de 0D 9enomahaploide(Mbp) Tamaño promediodeinsorto Equivalentes del genóma Tipo de Organjsmo vector Aplicaciones Referencia Petunia inflata D 1158 1364 76x B'BAC 2 Aislamiemo de grandes fragmentos de ADN conteniendo el locus de auto-incomoatibilidad(S,\ Mccubbin eí a/ , 2000 ldentificación de clonas ligadas al locusderestauracióndefertilidad Wu eí a/„ 2000 Brassica napus D 1150 1 05 kb 7x PCLD04541 D 450-500 118 kb 154x plndigoBAC 536 D 380 80kb 96x pBeloBAC 11 que incluye el locus del gen de la resistencia contra el virus de la tristezadeloscítricos Yang ef a/., 2001 D 450 94kb 6x pCLD04541 Clonación basada en el mapeo yconstrucc(óndeunmapafisico Men eí a/ , 2001 D 758 8x pBeloBAC 11 Análisis del genoma dol betabel a través de la caractenzación del centrómero delmutantePR01 Gindullis eí a/„ 2001 125 kb D®8arrollo do un mapa físlco a .ravós do BAC-FisH. o8ta t)lbllotoca sorá una horramlonta l mpoiunto dontro dol consorclo intomaclonal dol oonomad®Mu88 Vilarinhos et a/„2002 Melón (Cucijmis melc» ldentificxición de clonas ligadas al locu8 Cítnco (PO"rus Betabel (Beta vumans) Banano, Calcu" 4 („usa acumlnsú| M 600 100 kb 9x plndlgoBAC-5 D 3000 80kb 45x pBeloBAC n genes putativos de receptores transmembranales M 420 130 kb 67x pCLD04541 Clonación basada en el mapeo de genes de resistencia y mapeo fisico Tao eí a/„ 2002 D 120 1 62 kb 115x BIEmc 2 Para facilitar la ldentlficación de genes a trsvés de un escrutinio decx?mDlememaclón Chang eí a/ , 2003 500 1 02 kb 52x pBeloBAcl' Ensamble de "contiguous° de clones BAC que ext.enden al fidr7, el locus queconfiereresistenciaalamanchaneara Glrasol (Helianthus annuus` Arroz (Oryza sativa) Arabidospsis thal'ana ROsa (Rosa rugosa) Luo eí a/., 2001 Construcx>ión de un contiguo de 1.2 Mb trifol'ala) Lotusiaponicus (Fom-2) que confiere resistencia almarchitamientodelmelóncausadaporFusanum ldentificación de clonas que comienen D Gentzbittel eí a/ 2002 Kaufmann eí a/ 2003 VECTOR BINARIO TIPO COSMIDO pCLD04541 El vector pCLD04541 fue construido inseftando un fragmento de 9.1 kb que contiene al sitio cos (para el empaquetamiento en lambda), el gen 35S-NPTll (qLie confiere resistencia a kanamicina) y un sitio múltiple de restricción "dark Bluescript' (dBS), dentro del sitio de restricción Scal del plásmido pSLJ1711 (Jones eí a/ ,1992); éste a su vez fue derivado del plásmido pRK290 (Difta eí a/ ,1980), (figura 2). El sitio múltiple de restricción dark Bluescript (dBS) contiene sitios para múltiples enzimas, varios de estos son únicos en todo el plásmido, de tal manera que permiten linearizar al vector para la introducción del ADN foráneo; además, este sitio proporciona un color azul intenso, diferente al color azul que normalmente se desarrolla en colonias de E. co//. sobre 5-bromo4-cloro-3-indolid-beta-D-galactosido (X-Gal) e lsopropiltiogalactosido (lpTG), lo que contrasta mejor y permite distinguh más fácilmente las clonas blancas positivas Esto último representa una gran ventaja en un vector binario de baja copia (5-8 copias por equivalente cromosómico). Como se muestra en la figura 2, el pRK290 contiene un gen bacteriano que confiere resistencia a tetraciclina. Para consultar sobre su secuencia y mapa de restricción, el número de accesión es AF 184978 en el Genebank. RI-K (69" (4¥oS`íg|(is|2),j (28i2) sínj:5zpsr Figura 2. Vector tipo cósmido pCLD04541 de 29 kb. dBS, sitio múltiple de re§tricción del ''dark bluescript"; * ::,no:md,:,:ea:t¡:c;,,Ógne:ná=rsés=tséns::áoap:ertarae:,:,TnEaque,am,entoen,ambda,35S-NPT„ionfiereres,stenc,aa 24 PRINCIPALES PASOS PARA LA CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA GENÓMICACONINSERTOSDEADNDEALTOPESOMOLECULAR La metodologi'a para la construcción de bibliotecas con insertos de ADN de altopesomolecularhasjdosjgnificativamentemejoradadesdequelossi.stemasBAC, PAC y PBC fueron establecidos. En la figura 3 se muestra el procedjmiento generalmente utiljzado en la cons{rucción de bibliotecas con insertos grandes (la mayoría de más de 100 kb), su clonación en bacterias y su ordenami.en{o (Zhang, 2000). Este mjsmo esquema ha sido utilizado exitosamente en la construcci.Ón de varias bibliotecas BAC, PAC y BIBAC de plantas, ani.males, insectos y microorganismos, y consi.ste en los siguientes pasos. a) Preparación del vector. El vector debe estar totalmente purificado y ser de la más alta calidad (Íntegro y m de ADN bacteriano), se debe realizar una djgestjón apropiada (nunca sobredi.gerido o poco digerjdo) y desfosforilarlo completamente. b) Extracción de núcleos. Se extraen núcleos de las hojas y estos son jncluidos en agarosa, donde posteriormente son someti.dos a di.gesti.ón con la enzima protei.nasa K (para di.gerir las proteínas nativas entre las que se encuentran las de la membrana nuclear) y dejar libre al ADN genómico. c) Djgestjón parcial del ADN genómico. La parte técnica más djfícil del procedimiento es la obtención de fragmentos de ADN del tamaño requerido (100400kb),estosúltimossonobtenidosatravésdeunadjgestiónparcialdel áepeNccFoenaa,¿%::sounmgo¿;c::ara;caor:tseaT,duot,,,::n¿ooseí:ocTruoef:reds:sadgear::ajp: pulsante (ECP). d) Ligacióm La inserción de los fragmentos selecci.onados en el vector es otro de los pasos cruciales, debido a que se debe optimjzar la relación inseho:vector. e),Er3rbs,í:tremc:c,::tbr::tsefrá:::,c,,g:ná,:,cÉc:Óo7,d:o:,oe|aASDPNoS,:,cvá#,:::taemabs,F:::: el número total de clonas requeridas para tener completa la biblioteca dependen estrechamente de las células competentes utiljzadas. Una ligación eficienti3 introduci.da en células competentes con una efici.encja de {ransformación menor a 10" colonias/Hg de ADN requerjrá, entre otros, de un mayor número de eventos de transformación, de un mayor número de cajas Petri, lo que al m encarecerá de manera impohante la construcción de la biblioteca. Por lo tanto, se recomienda utjlizar siempre células comerciales como las DH10B de GibcoBRL que poseen una efi.ciencia de transformación mayor a 10`° colonias/Hg de ADN. 25 Objetivo general Establecer las condiciones Óptimas para la construcción de la biblioteca genómica del banano silvestre Musa acum/naía ssp burmannicoídes tipo Calcutta 4, utilizandounvectordetipoCromosomaBacterianoArtificialBinario(pCLD04541). O bjetivos es pecificos 1.- Purificar el vector binario pCLD04541 a través de una lisis alcal.ina y utilizando dos gradientes de cloruro de cesio Linearizar al vector con la enzima BamHl o Hi.ndlll y desfosforilarlo. 2.- Obtener núcleos de hojas de Calcutta 4, incluirlos en agarosa de bajo punto de fusión y digerirlos con proteinasa K. El.iminar la proteinasa K lavando los plugs con PMSF 3.- Digerir parcialmente al ADN genómico con la enzima BamHl o Hi.ndlll para obtener fragmentos entre 100 y 400 kb. 4.-Ligar los fragmentos seleccionados de 100 a 250 kb y de 250 a 400 kb al vector pCLD04541 (linearizado y desfosforilado) utilizando una relac.ión 1.2 o 14 (inseno.vector) para cada zona (Fl o F2). 5.- Transformar células de E. co// DH10B (por electroporación) con las l.igaciones realizadas, util.izando 1.5 o 2 LLl de cada una,. 6.- Caracterizar las ligaciones en cuanto al tamaño promedio de inserto y el número de clonas sin inseho. Calcular con base en el tamaño promedio de .inseho el número total de clonas que serían necesarias para tener representado 10x el genom.a haploide de Calcutta 4 con un 99 % de probab.ilidad de encontrar cualqu.ier secuencia de interés. E§trateg ia experimenta l Se purificó, Imearizó y desfosforiló el vector pCLD04541, paralelamente se extrajeron núcleos de hojas ióvenes de Calcutta 4 crecidas en invernadero y se incluyeronenbloquesdeagarosadenominados"plugs".Éstosfueronexpuestosauna ;:,ruc:#edne,:,s:ánci:::ozleJ:asaa#,a:a::bne,a;nad,?Ds:uEt:,,ióD:,gcet::fT;S:,:u:ed:gae#: pulsante para cuales fueron vector,1:2 y con 1.5 o 2 separar los fragmentos originados en el rango de 100 a 400 kb, Ios ligados al vector pCLD04541 bajo dos relaciones molares de inserto: W Se transformaron, por electroporación células de E. coW (DH10B) Ltl de las ligaciones efectuadas; Ias células transformadas fueron plaqueadas en el medio selectivo LB con tetraciclina, X-Gal e lpTG. Las cé" recombinantes (blancas) fueron analizadas para estimar el tamaño promed.io del inserto y ei número de clonas sin inserto. Con esto se determinó que relación Tolar inserto:vector y que cantidad de l.igac.ión utilizada en la transformación fueron meiores para obtener una mayor eficiencia de transformac.ión. Por último se estimó el número total de clonas que se requieren para tener una bibl.ioteca representativa de Calcutta 4_ 26 DELA Q4muTTA 4 em#bkdgeef"ug#oT3#%rrosa . Digestión parcial de ADN con - BamHl o Hindlll y selecci.Ón de L,neaá,::fco]gfno%nc,g:::+%,#,,w fragmento de 100400 kb utilizando ECP Vector ljnearizado Ligación (T4 'jgasa) ^ Plásmido con inserto Transformación de E. co//. (cepa DH10B) Células recombinantes en medio LB selectivo con Tetracicli`na, X-Gal e lpTG Ordenamiento al azar de cada biblioteca Figm2.Esciue"generalparalaconstruccióndelabiblio{ecadeCalcutta4utilizandoelvectorbinario !:pooor:é::#:.::|:#b#ote®E,noordseen:eT:e:t:qsuee:esfi::Leoieqnuaeda,:sdec:ocnuaesm3ua€:np.ss::,::esne,gu=ndc::,:: ?'-8inL::-ab::Poef:::r:-,3|np¿::i-;aé:as_aD?#:,áaó:,á::t,,gi,Gd,e,::rpnr:rp:,'t,:ga%::dmofores,Sdeffimpopu,sante, 27 REFERENCIAS Arondel,V.,Lemieux,8.,11wang,1.,Gibson,S.,Goodmam"andSomerville, C.R. (1992). Map-based cloning of a gene controlling omega-3 fatv acid Ba,¡nt.Kdue£:t;r.aj'.?nc`,:nA¿3:'£:£:`§.S:,'eDnociee'z:i:+£,P#,6j3Zá5rik"oiezew Beetham, P. R. and May, G. D. (2000). ldentification and chromosomal localizat.ion of the monkey retrotransposon in Musa sp. Molecular and General Genetics, 263 (6), pp 908-915 Baurens,F.C.,NoyerJ.L.,Lanaud,C.andLagodaP.J.L.(1996).Useof competitive PCR to assay copy number of repetitive elements in banana. 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All rights reserved, pp 13-17 Zhang,H-BandWu,Ch.(2001).BACastoolsforgenomicsequencing.Plant Physiology and Biochemestry 39, pp 195-209 32 CAPITUL0 11 Preparacjón del vector binario pCLD04541 lNTRODUCCIÓN ElprimervectorbinarioBACdesarrolladoparaserusadoenlatransformación :::ae:t:j::fit:p:ieto:b:t:i:Ía!dn:due;'gga::nnd`eEaecTa::ti:acd:eíít,pp:::c;,,á::n,2,,-e2muc:oap;i;.,c:e#:o,,:: r:jjiri:::r::un`t::?ár::;,,tdee:va:aq:;e:s:|!,::;t:ae,:a3:tí":3:,:::n:sd:e::t:p:oa::n;:Zah:::iíro:o;o!r:cícéónfa?saor: Comosemencionóenelcapítuloantenor,losplásmidosycósmidoscomolos BACsyPACs,puedenmantenerestablesgrandesinsertosdeADNforáneo,además dequepermitenunamejormanipulaciónypurificacióndelADN,yunamejorselección ;asrt::3:i4:,:,aá,et:;fo(:a:d::ó:naz:,iern::d:ut;v:ogsd8!,á,g::c5;p,#:ig;vR:,ien:t:;:dL:;myuot:f;:aii:;¡r:a::;:r elaboracióndebibliotecascomplementariasyelgen/aczcomomarcadordeselección de células recombi.nantes. La preparación del vect" de clonación BAC o BIBAC es uno de los puntos más críticos duranb la construcción de bibliotecas genómicas y consiste en la purificacióm la linearización (corte del vector con una enzima de restricción), y desfosforilaciónparaevitarlarecircularizacióndelvectordurantelaligación la MATERIALES Y MÉTODOS ElvectorpCLD04541fuedonadoporelDrHong-BinZhangdeTexasA&M University, College Station, TX OblenciónypurificacióndelvectordeclonaciónpCLD04541 Texas AS&e#n,:v::s,;:tco:,%á%,,astraet%onTaTdxa en e, manua, de, Dr Zhang t2ooo, de ;éLSDeo4P:a4q|Tesaorgrnecmé:uá:ossdó:,,d:t:CBk,tdr:pt:naco,,;g?LT|eox:rárc::sá:r:::3:,:o5ng:i,VR:,8í 10gm)conteniendo15Hgmdetetraciclina,60Hg/mlde5-bromo4-cloro-3-indolyl- ::,tt:v-:-ag3;a:!oá,:roaíte-%La,,:,n:cHhgéT;adr:,:s:t[::::áonga,:cct:,so,:,:Í,Fn|:)dyu::srec,Óe, 33 2-Seseleccionóumcoloniaazul,seinoculóen50mldemedioLBconteniendo15 53/rT`,ad:btteet:ac:;Ci`::,¥nsóec:,U:t`Vóa37C'Cenagitación(2"rpm)durantetodaianoche 3-Setomaron5mldelinóculo,seadicionarona500mldemedioLBcon15Wde tpert:::`rc:`rnoan:nsteot:r!t'Y,?roas3:c°uFt,::ag`tac`Óna250rmdurantetodaianochese :#:ScPuuai;udeed%-%;°rasdecreclmlentodelcuwosemidioladensidadópticaa6oo 5-Seañadieron5mldeunasoluciónstockdecloramfenicol(34mg/mlenetanoopor cadalitrodecuMysecontinuóincubandopor14horasa37°Cenagitacióna250 rpm. 6.- Se alicuotaron células en cinco tubos de centrifuga . _ __ _i:.`i.Á de 250 ai e^hrenadante ml y se las céiuias en i,iiiuu `u,,v. ._ __ _ _ getr;feusguasr:enna,::2d°agpg::,,,ta5eT`To%4mi:epT°Estf:,r¿°rmenteseeliminoeisobrenadante 7-Secentrifugóa5520g(rotorJA-14deBeckman)por10rnma4°Cyseeliminóel igobr:nMai:n::u:::ar:i3,,p2áahsMedr:STur:sP-eHng,,:pCHagipast,,,aen,om,de,aso"„ 8-Se añadió a cada tubo 1 ml de una solución de lisozima (10 mg/ml, recién 3rae,gaá:gdea,,:Ta:opTrTd::::iu-,:Fe,spHEs8,myusye,#ánat:eumnp:Latgr:a::b:eunete,ap?,::zLl: sea eficiente. :o7osdeeasñ38`)óyas=#e£:PÓ°g:r°anmd`od:,'taubs:`£`nónm'|cr::`édne,%raedpeazr:dhaa!?a2q¥ed:eNf%9mHó unasoluciónmuyviscosaytransparentePosteriormenteseincubóentiielopor5min 10 -Se adicionó 15 ml de la solución 111 fria (5 M de KOAc, pH 4 8-5 3) y se agitó suavemente por inversión para mezclar, formándose un precipitado blanco que consiste en el ADN cromosomal bacteriano, el ARN de am peso molecular y el compleio de potasio/SDS/proteína/membranas Finalmente se incubó en hielo por 5 min. 11-Secentrifugóa5520g(rotorJA-14deBeckman)por10mma4°Cysefftúe` sobrenadante de cada tubo a través de cuatm capas de "cheesecloth", el filtrado se colectó en tubos limpios. 12-Se añadieron 06 volúmenes de isopropanol a cada tubo y se incubó a temperatura ambiente por 10 min. 13 -Se centrifugó a 15 300 g (rotor JA" de Beckman) por 10 mm a temperatura amb.iente y se eliminó el sobrenadante. 34 14 - Se invir(ieron los tubos para que todo el líquido escurriera, se enjuagaron las ggáe:e,sroi:r':i-t#odsec3:c:t:::,,a:o7ro|oío:,n,eamt:ei:teurraatuarTba,;nbtF;n::,cseentdr::ggnaó,ei sobrenadanteysede,Óst=:cá;.€=.óarsvti,,,=. 15.-Se disolvi.ó todo el ADN en 15 ml de TE. PurificacióndelvectorpCLD04541(V4nmedian.egiadientedecloruro de cesio. 1 L Se vertú la solución de ADN plasmídico m ml) en una probeta graduada (de t2o:a:8í6gíá,Seagregóío8gdec,orurodeces,osÓ„porcadam,deso„ten 2 -Se añadió 12 ml de una solución s(ock de bromuro de etidio (10 mg/mo a la solucióndeADN/Cscl,semezclómuybien,sedeterminóelvolumendeestasolución (21"asícomoelpesodelaprobetacontodosestoscomponentesDNA+Cscl+EB :;27|d2::,,,d:,'ópae:n:tr:::2::naár,P:aá:á;itp:;ini|epn:t:3ed:e!::osR:r3;:::tá:a:,e2d3;ugeD-N;¡.2¡8s5!,:gE;á,¥s;tig g:,:Sc',::deensttuuvb°osdednetr:edn:;,fruagna9°oi¥,%eer:í°tuqbue:edsedBee:k5jaín6yg:g'eqsu:hgreapr::'t:o': glicerol hasta casj el tope de los tubos. 396og%o:,¡gv#pynor:o2oS2:e:¥É#ng£:o*:eánn„3fuu,:o%n¥aw"3gcdeent:\e"c5:axnL.tsvoe\d:a#cdke#:on:o= 4 - Se sacaron los tubos de la centrífuga con mucho ciiidado Se observaron dos viea:n:::sg:diu:b;::r:araoig:un::a:ed:e:i=hraéfruá::i,:urg:::t::,:,t::f:::::Lipgrix:,i::r:bm3:i;:,á::::y:v,:,, alvectorcircularV41Seformótambiénunapastillarojaenelfondodeltubo,que conteni'a un comple/o de ARN y bromuro de etidjo 5 -Se inserffi una agup (número 21) en la pane superior del tubo para permim la entrada de am La colecta de la banda inferior, que correspondía al vector V41, se reahzóuki:Zban8°e:,::J:r'qnugea::nmaugyuJ,amg:'nnaunTee::;:rezadeipiásmido,fuenecesario hacerunadoblepurificaciónengradienedeclorurodecesio,repitiendodelpaso1al 5. 6 - Se recuperó la banda de ADN, se lavó con una solución de alcohol-isoami.Iico saturado con agua (bien agl.tada antes de iiearia\ h --.--.-_ _ _ ' -' 'v`,`-' , ' ' '',\J completamente el bromuro d:9:[t:dq,:, ::tt:Ses:eha:tsaar:au)e ::Sobbtuqv:eunsae ::T:,:': jncolora de ADN/Cscl. 35 ::-,nu:#::::du:Óis:oa|Pás%o::irg!,:rgJ:aA!2:eN?(éia::ái:#Tpvo3r,e:Tneiniisoa:eo4:%ap:rs,e5amñ,:d,`oy:: 8 - Se eliminó el sobrenadante, se lavó la pastilla con etanol al 70% (dos veces), gnÁrbf#g::dd:S:,:,ot2eí088(t:t3reJfÉ20Ftneapme:*t:asn!E%:e'rom#'|:e£:::iirapc:3th"aey| ADN plasmidico en iin gel de agarosa al 1%, utilizando como estándar el ADN de lambda. LinearizacióndelvectorpCLD04541conlaenzimaBamHlocon"M La mezcla de reacción para linearizar con la enzima BamHl se realizó adicionandolossiguientescomponentesH20bidestiladaestéril,238hADNV41,100 Lil(10Lig),amohiguadordereacción10x(lnvitrogen),40Lil,espermidina40"20h Bamm(10U/m2Wparaunvolumenfinalde400ulSeincubóa37°Cpor2horas, go3S;eor¿ormenteSeleañadió1tilmU)másdeenzimaysedeióincubandooühora La mezcla de reacción para linearizar con la enzima H/ndm se rea% adicionandolossiguientescomponentesH20bidestiladaesté"240Lil,ADNV4t98 Lil(5ug),amortiguadordereacción10x(lnvitrogen),40Hl,espermidina40"20Lil, H/ndm(10U/m2hparaunvolumenfinalde400LilSeincubóa37ÓCpor2horas posteriormenteseleañadió1W(10U)másdeenzimaysedeióincubandootrahora a 37 OC_ near,zaE:r,f,=a:,ó%adme±,veocto=:,neHa,r:áf,ÍoseAa::c,oT:zc:andveo,:ema::,Ó¡4odoe,HT;ctdo: fíc:::í¡;,te:i;e:it::iuH!,::3iM;;:g:rEÍ55n;r:fnumro,!,t:óp6!2;t;ioeiim::s;ri:du::i:c:e:n#:d:o:ri::5,lí;áíi;j:P::;d::r 10 mim se descaftó el sobrenadante y se lavó la pastilla con etano` al 70%, se centrifugó a 10 621 g por 5 min, se secó la pastilla y se disolvió en 400 H de H20 bidestest.ilada estéril. Desfosforilación del vectoT pCLD04541 linearizado. vector l.inear.izado estuvo La mezcla . de .__i_^ reacción para desfosforilar el 48 5 ul; vector linearizado ^^n`n^nan+a<. H.O bidest. constituida por los siguientes componentes.. H20 bidest., 4ü o H vt;u`u, ,„ ..... ____ 400 Hl (35 HgJ+/"H y 5 Lig-BamHl ), amortiguador de reacción 10x de CIAP (fosfatasaalcalinaintestinaldeternera)50LilylaenzimaCIAP*(BioLabsde05U/W 1 5 Hl, para un volumen final de 500Lil Se incubó a 37 ac por 1 h La reacción se ie%::nr:a::iai,:i:b:,e:T:,:,,::FPTrfoos5e#cuE:a8535ocH,pg:3%Dms,na)3:o/áeío5eonfr,`ard: *La enzima CIAP se diluyó a 0 5 U/Ltl con el amortiguador de dilución de lnvitrogen- 36 (5755H±o,sseea::t':';nsóe:e'natr,Tu::C:a,d7eg¿ega:C;°o: §4§;;::ne;n;::::;:¡;rí¡:T¡p;;:;;u:¡u:É¡;¡:u¡:í;;;:b§:;an¡Ío;Í;s;:€:íír:,íÍ3:p:¡;j::#Í;:Ey:;Á::c:í:v;:¡f::p¡j§g;:;po::; §o%:c:ett¡,;:á::ngd:e:,::e:::¡eísn§o,::::5Tr:Tc#na:c:ód:eeí§:¡:gcáar::Dmñ::d;¡áfi;¡,:eregne,2doeoaH:adr:s:2£ Prueba de desfosforilación ídr::::t:i:ri:j:;|:n;;:Í;i::s;iícig:;oí;íi:jíñ¡:!c:::f;í;g;ÍÍ;d:;;eí::;:;::g:!zíii!Í:::!te:;uíjq:::r:í;::ie:;p;;,ig;¡:e:T:o:: RESULTADOS ObtenciónypurificacióndelvectordeclonaciónpCLD04541 El vector pCLD045" fue aislado mediante el método de lisis alcalina convencional,mlanecesidaddeutilizarunKitSeutilizóunaaltaconcentraciónde ͧÍ:§rja¡jí;§jr:::,,::t:,;::::ríqíj,;:Ó:::&:§:ÍÍ:¡;;;dj:fi;uͧt§Ó;jr:::e:n;c;#Íj:#í:j;:§c;,e;;r¡;;;¡:E::;::c;;op:s;á:s:m;:í; concentracjón estimada fue de 200 ng/Hl. Linearizaciónydesfosforilacióndelvectorpcld04541 desfosfo:,fadno:C::gaurí:n::faetifz:rétqoudeo%:rae*ara%:Í¿fLcacc::nfedne:,,P:áesT:db°e":t::zrázrafe°no: §jníug:o:n:£:£c::::dan:tr:£::t§;3rí::n:r¡:::eípíoe::{::c:E:é:r:Ó::án:d:Sv;t3er:qc:í::s:::;ct;:dá:r:énotd:eEj,::;cáa::n:ta::,; ;f:i,;ií:ai;o;Íin:ií,icí:i;:iiiii!;a::::Í;É#í¡iís::;:ci:;;:::aréi!,s;:;a;i,,:iv:;i,i,;á::fi:g::fi;Í;a:i:a:;:;, 37 Se obtuvieron en total 4 Lig/200 ul, se concentración estimada fue de 20 ng/LLl. Se oDtuviewH " `vu, . r3__ gíe3Fár:Lo,aoa„,:nu3á:,:addeo2%ou:y,asee:L#;:enH::odT„a;2geos:osEf:r,,Fag3rrFa3cBo::eTt:::,tá: •~ .--- J^ fna ha % nm se obtuvo 3.5 ug/100 Hl, se prepararon alicuotas de 20 Hl y estimada fue de 35 ng/ul, se almacenaron a -20 ac. ADN de lambda (ng) 5 10 15 20 25 V41 ADN de lambda (ng) F"m3A)Cumestándardelambdaparaestimarlaconcenmmde`vestüpCLD045WW lineanzadoconlaenzimaBamHl(20ng/LLl)8)Curvaestandardelambdapmestim#laconcentracm ::lá:cfoonre:?uLe:o#=:a:?á,á,,,,no,oa:,:aTdBOEcgn5l:7eoni,,m3%:,,:md,:!::rlgáH,t,nE:::r:::r:::Smeu:;a::aert,áios 38 Prueba de desfosforilación :§:,,fu:osaf:¡#%:g::e::;eás::e:§:¡:j:;;;;::rí:::rg{acíjr:a:Íí§o:rí[%nsníí:ít,rA:¡¡o:r;£e:a;;::bsd:Eí;;§;¡¡;±oce;b:c::n;g:; azules del 5 0/o. DISCUSIÓN Elgradodepurezadelplásmidoesunfactordeextremaimporianciaenla construcciónde"bibliotecaBACoBIBAC,porloqueesnecesarioasegurarsede obtenerunADNplasmídi.colomáspuroposi.ble. t,poBACS:EiEArspoEnna:fc:,::r=t::sevsércat:er::asBÁ8,a,o,:cpuuar,:=::ó:n:::::,avne:tnor:: rd=aenng#n;,e_b;aaram_€_ogg,adi,7_a82"Í:-#¿po£cÉíeu`:Éc:gvens€,B:#:`:?a~sp_¡tLr!ag3gs?S.:ees=sueÉggg?t::=Én É:E:ZnboasJac::3:as,e,haa2o::apáaosepnormcoédrfí:iryeiuv:cutráf;ceanc,::arnet3uát,ansue:eprroobd,:m®a:=s g::opre:dpué3,Gí3Aecsi:efi::omsahasnes,daonecí:as,tdr::d:t,y::tnodr:su:oenst:::en,ukT)eáoendoem::gáa; $2rngv!éis:'3="e£t%gEortsa,sgñd`-g-cm*TÍ:#re=Ssyo,sapr:t:`¡Sgnt,dsoom,=gn?eii£,Te.y,:dkg:i:dgisÉOÉte:£=oaáíoí 2001). LapurificacióndelvectorpBeloBAC11(elmásutilizadodelosBACs)seha j;#u;;n:::::'í::sae:do:::::a:r:ot#:ei;:m:3oíse::eseTe:c:t:?Tr:a:j:s;e:n:t?erg:::r:;sa:;reo:::oÁ::,f:ao3n::n:g: iají!zÍ:,::i:Íia::i;Ír:i:nra;;jj::t:e;::::::;:Íi;¡;í:ngí!:!¡d;:t;;::ip;uñTíi:ir::iji;;::g;f;ííi::zíi;:u;:;:a:o:n:jí;ir;ií;, ciue utilizan los "ki.ts" antes menci.onados pmr:ef:tr,a:LOTsueríf:;::ir:essm:;n:pA:ieá;goedTo:ir:g:::,:r::igd:eed;::rda::,u:rea,rio:s-2:;:,,:u:r,::don:t::eési:io: bíi:::|síi;i;a;eiai;¡jaia:o;i;::;ia;i;:Íg:;q;u¡jí::f;iiu;Íi:::,::;is;i;:;ai#;ñíe;;o;;r;ií:jieiíi:;;:¡:::i;i:;:;;ii:; 39 2332g,r::,:?t2ifneg:,,oá:rso,deCes,o,Mekseme-ooo,Me-„,,2oo"" acentr,t:gsaecpóanra:Lóngrdaed`,ep|i:sm`dde°¥e4nts:de:dApe¥:rq°uT:bsr:oTi:rb;:tdeor:anc%'nac|roar:::3: ::iáoaic,qo::r3ed:e:eus::-abr:F:::n,ceae:,#)e:3ram:téóJ:s:b:enní:3nd:f:r::c::assgid:a::,::3 :Í:i:nit;:¡a;g;;:is;:.;:;i;é:::,v:q::i:í:si:tu;:;:d;:h:t,ííní:!i:ií!s¡t`:;;::i:iii;aí,;qi!:;::;tuui::;i:j:i:i:ii:í;r::jii!ji ::re::£:::aná,iebr:o:E?:uoreo::g:ft:;,:o|ihe:s:táaec:!,::d:oes:,:e:nrei:sá:ms:ñ:gc:u:i,soEnds!::ír::TnTd::::,r:e:a::tá; á,:cg::L:::tá::t:13risdáemn;ero:i:,,oarr,r2odoel,Ces,oqueCont,eneCant,dadesSaturantes Otro punto importante a considerar es la desfosforilación del vector V41 :¡:osir;;g;:ñ:;;n!;;::eisivrn;:;ij:a;::;s;;:r:ij:;:;:jza:;:!;iz;::;i:idiioi:ieoíii;:;i:i;:,::,;i:;;d;:o%;iii;iig!:;;:i:ñ;i:so!:iic (eznnz:+2a)'(8:bLdb?oaoFsU:t:rb2°oSo;rc0factoresesencialesparaiaoptimaactividaddeia i:a:!;i:íi;i::I:::;Ííeo;:eii:::jíií,i:iy;;zÍ;Í::;¡;oí;Í:e;g:í¡;i!ije:1ji:;;:ijíiií::iíí::!:iii;jie;n:;ciií[iij:!u::;a concentraciónX,esnecesariodiluirlaconelamortiguadordedilucióndelnvitrogem q#:gezcn:án,:,:nseee:t£:t,:::nc%Tpaosn::tnecséndt:a::¿:%rsmnaeg::a:,á:ptuíé;#ed:,,#£2e;ZdTam# des,osfoEr:,::,Tner:ed:::::Tob,ndaenntt::(::iorná:;ob,:::::!::,te::i:seds,r:ná;::E:e8:do,o (Zhang, 2000). 40 Aunque la purificacíón del vector pCLD04541 siguiendo el método de gradientes de densidad con cloruro de cesio requirió de destreza manual y de mucho más tiempo en comparación con otros métodos de purificación reportados en la literatura, el resultado fue la obtención de ADN plasmídico altamente purificado, linearizado y desfosforilado el cual fue utilizado para establecer el protocolo para la construcción de la biblioteca genómica BIBAC de Calcufta 4. REFERENCIAS Cantor, C.R and Schimmel, P.R.(1980) Biophysi.cal chemestry. Part 111: the behaveour of biological macromolecules. Freeman publications, Francjsco, pp 1251 San Gindullis, F., Dechyeva, D. and Schmidt,T. (2001). Construction and caracterization of a BAC library for the molecular dissection of a single wild beet centromere and sugar beet (Beía w/gan.s) genome analysis. Genome, 44, pp 846-855 Hamillon, C. M„ Frary, A., Lewis, C., and Tanksley, S.D. (1996).Stable transfer of i.ntact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proceedings of the National Academic Science. USA 93, pp 9975-9979 Hamillon, C. M. (1997). A binary-BAC system for plant transformation with highmolecular-weight DNA. Gene, 200, pp 107-116 Meksem, K., l{obrist, K., Ruben, E., Hyten, D., Tao, Q., Zhang, H-B and Lightfoo.,D. A. (2000). Two large-inseh soybean genomic libraries constructed in a bi.nary vector. applications in chromosome walking and genome wide physical mapping. 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AIl rights reserved, pp 13-17 41 CAPITULO 111 Preparación de fragmentos de ADN de alto peso molecular INTRODUCCIÓN EI ADN genómico de alto peso molecular (megabase) debe ser de alta calidad (Iibre de fragmentos pequeños, de sales y de impurezas), esto es un requisito esencial en la construcción de bibliotecas BAC o BIBAC EI ADN megabase es muy susceptible a la ruptura física durante su preparación, Ios más utilizados _ métodos _ J_ _í'_.'__ .J---+-'-~ ^para J^ evitar este problema son.. el aislamientó de protoplastos de células vegetales o de núcleos de células vegetales y animales, Ios cuales son incluidos en una matriz de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) en foi.ma de bloques cúbicos (plugs) o en forma de microesferas. La agarosa en los plugs o en las microesferas actúa como una matriz sólida y porosa, permitiendo la difusión de los diferentes reactivos para la liberación del ADN y la subsiguiente manipulación (Schwans y Cantor,1984) En plantas, se ha utilizado más ampliamente el método de extracc`ión de núcleos (Zhang ef a/.,1995), que consiste en el rompimiento físico de la pared celular, el aislamiento de los núcleos y su inclusión en agarosa formando plugs o en microesferas. Este método es simple, resulta en una baia contaminación por ADN de cloroplasto y mitocondria, es económico y se puede aplicar a una gran variedad de espec.ies vegetales (Zhang eí a/., 1995). Posterior a la preparación de los plugs, es necesario determinar la digestib.il.idad del ADN megabase, ya que la presencia de altas cantidades de polisacáridos o fenoles (que en algunas especies vegetales se encuentran en grandes cantidades), pueden inhibir la acción de las enzimas de restricción. EI ADN genómico debe ser parcialmente digerido, para producir fragmentos del tamaño deseado para su clonación Para la separación de los fragmentos grandes de ADN no se utiliza la electroforesis convencional, ya que utiliza un campo eléctrico estático (Birren y Lai, 1993). Bajo estas condiciones las moléculas se alargan y se alinean con el campo y migran hacia el ánodo a través de un proceso llamado ``reptación"; esto significa que el ADN se mueve como una serpiente, esto es, la ``cabeza" selecc.iona el camino y el "cuerpo'' le sigue Normalmente las moléculas más grandes de 20 kb no pueden separarse entre sÍ, ya que tienen la misma área de sección-cruzada después de que se alinean en el campo eléctrico. Se ha demostrado que después de remover el campo eléctrico, las moléculas de ADN alargadas se relajan, regresando a su estado no pehurbado. La proporción de relajación es dependiente de la longitud del ADN (Klotz y Zimm,1972). Esta propiedad se explotó para separar grandes moléculas de ADN cambios periódicos en la orientación del campo eléctrico forza a las moléculas de ADN a relajarse, al removerse el primer campo, y a elongarse para alinearse con el segundo campo. 42 La efectividad de la interrupci.ón y cambio de dirección del campo se demostró a través de la separación de cromosomas de levadura, los cuales son de tamaño en kHobases (Schwarts y Cantor,1984) Esta electroforesis fue denominada electroforesis de campo pulsante (ECP) (PFGE-Pulse Field Gel Elec{roforesis). EI ADN debe cambiar su conformaci.ón y reorientarse antes de que pueda mi.grar en la dirección del segundo campo. El tiempo requerido para esta reorientación se correlaciona con la longM de la molécula. Moléculas muy grandes de ADN se tomarán más tiempo para realinearse, en comparación con las moléculas pequeñas, debido a la barrera física que presenta la matriz de agarosa La selección de los fragmentos de ADN de tamaño determinado se efectúa utilizando geles preparativos sometidos a electroforesis de campo pulsante. Se realiza una primera selección del ADN parcialmente digerido; si éste es muy concentrado, fragmentos pequeños de ADN co-migran con los grandes durante la electroforesis, ya que se quedan atrapados entre estos. Para enriquecer la preparación con fragmentos de ADN de gran tamaño y eliminar los de menor tamaño, se hace necesaria una segunda selección de fragmentos, que permi.te aumentar el tamaño promedio de los insertos en la biblioteca. Finalmenle, Ios fragmentos seleccionados de ADN son recuperados del gel utilizando la enzima gelasa que degrada el gel, o a través de la electroelución utilizando tubos de diálisis (Strong eí a/.,1997). Este segundo método es ampliamente utilizado; Ia electroelución se lleva a cabo u{ilizando electroforesis de campo pulsante En el presente capítulo se describe la extracción de núcleos de Calcufta 4, el procesamiento de los mismos (inclusión en agarosa de bajo punto de fusión), digestión de la membrana nuclear con proteinasa K y la inac{ivación de esta enzima con fenilmelil sulfonH fluoride (PMSF), la estandarización de las condiciones Óptimas para la digestión parcial con la enzima BamHl o H/.ndlll y la ob{ención de fragmentos de ADN de alto peso molecular (100 a 400 kb). MATERIALES Y MÉTODOS Matei.ial vegetal Se utilizaron 45 plantas de Calcutta 4 micropropagadas /'n v/fno y adaptadas a condiciones de invernadero del CICY; se regaron dos veces por semana, se fenilizaron cada 15 días y se expusieron a la luz solar (77.63 Hmol a 168.6 Hmol). Cuando alcanzaron una altura promedio de 80 cm, aproximadamente dos meses en el invernadero, las plantas reci.bieron un tratamiento de obscuridad por 72 horas, previo a la cosecha de las hojas, para promover la degradación del almidón acumulado, que es difícil de remover durante el procedimiento de exti.acción de núcleos, por lo que dismi`nuye la calidad del ADN. Posterior al tratamienlo de oscuridad se colectaron las primeras dos hojas jóvenes de cada planta, se pesaron en paquetes de 50 g cada uno y fueron inmediatamen{e congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80 °C. 43 Extracción de núcleos de Calcutta 4 Se utilizaron 100 g de hojas congeladas a -80 °C. Este mater.ial se procesó para la obtención de los núcleos siguiendo la metodología reportada por Zhang colaboradores (1995). y 1.-Se molieron 100 g de tejido congelado (en dos morteros) adicionando suficiente nitrógeno líquido para evitar el descongelamiento del material, por aprox.imadamente 20 min hasta la obtención de un polvo fino. lnmediatamente, éste es transferido a 1 litro de la solución HB lx (anexo 1) conteniendo 2% de polivinilpirrolidona (PVP40) (modificación), 0.15% de P-mercaptoetanol y 0.5% de Triton X-100; se dejó incubar en hielo con agitac.ión muy suave durante 10 min, se filtró con dos capas de "cheesecloth" y una capa de "miracloth" y se recuperó el filtrado en tubos de centrífuga previamente enfriados y estériles de 250 ml. 2.- Se centrifugó el filtrado util.izando un rotor (Beckman) de ángulo fijo a 1 800 g por 20 min a 4 ac, se eliminó el sobrenadante y se añadió, a cada tubo, 1 ml de amortiguador de lavado previamente enfriado (anexol). La pastilla se resuspendió suavemente con ayuda de un pincel estéril previamente remojado en el amortiguador de lavado frío. 3.- Se colectaron todas las resuspensiones nucleares en un solo tubo de 40 ml (oakridge) utilizando puntas cortadas; se llenó el tubo con amortiguador de lavado. 4.- Se centrifugó utilizando un rotor de ángulo móvil (sw.inging bucket centrifuge) a 1,800 g por 15 min a 4 °C, posteriormente se decantó el sobrenadante y la pastilla se resuspendió en amortiguador de lavado con la ayuda del pincel; este paso se repitió 4 veces. Esta etapa es muy impoftante porque minimiza la contaminación con organelos como mitocondria y cloroplasto. 5.- Después del Último lavado se resuspendió la pastilla de núcleos en una pequeña cantidad (aprox 1 ml en total) de amohiguador HB 1 x sin P-mercaptoetanol (anexo 1). Los núcleos se almacenaron en hielo hasta su incliisión en agarosa lnclusión de los núcleos en agarosa (plugs) de bajo punto de fusión (LMP) 1 -Se prepararon 5 ml de agarosa de bajo punto de fusión (BRL USA) al 1% utilizando el amortiguador HB lx sin mercaptoetanol ni Triton X-100; Ia solución se precalentó en baño María a 45 °C antes de usarse. 2.- La suspensión de núcleos se precalentó a 45 °C por 5 min; se mezclaron volúmenes iguales de agarosa y núcleos agitando muy suavemente de vez en vez, se utilizó una punta coriada para pipetear la suspensión de núcleos. 3.- Se mantuvo la mezcla núcleos-agarosa en el baño a 45 °C mientras se llenaban los pozos del molde, añadiendo 90 ul por pozo y utilizando la misma punta cortada, el 44 molde se mantuvo sobre hjelo. Cuando la agarosa estuvo completamente solidificada, los moldes se transfirieron a un tubo falcon de 50 ml conteniendo 10 volúmenes del amortiguador de ljsjs (anexo 1). 4 - Se incubaron los plugs en el amortiguador de lisis por 48 h a 50 °C con agitacjón suave; después de 24 h el amortiguador se cambió por uno nuevo 5.- Se lavaron los plugs con 0.5 M de EDTA (pH 9.0-9.3) durante una hora a 50 °C, posteriormente con 0.05 M de EDTA (pH 8) por una hora, en hi.elo, por úl{imo se almacenaron en 0.05 M de EDTA, pH s a 4°C. En este paso los plugs conteniendo el ADN megabase puede ser almacenado por un año a 4 °C sin que sufra una degradación signjficativa. Determinación de las condiciones óptimas para la digestión parcial del ADN genómico con las enzima BamHl o #/.nd" Se efectuaron 2 experimentos para determinar la concentración óptima de la enzima de restricción que generara fragmentos de ADN de al{o peso molecular en el rango de 100 a 400 kb. En el primero se utilizó la enzima BamHl y fue realizado en la Universidad de Texas A & M. En el segundo se utilizó la enzjma Hí."H y fue realizado en el CICY. Previamente a la digesti.Ón, los plugs que habían estado almacenados en 0.05 M de EDTA se depositaron en un tubo falcon de 50 ml y se lavaron (den{ro de la campana de extraccíón) tres veces con 10 volúmenes de TE frío conteniendo 0.1 mM de fenilmetH sulfonil fluoride (PMSF-PhenylMethyl Sulfonyl Fluoride) para eliminar la proteinasa K que afecta la acción de las enzimas de restricción. Cada lavado se incubó en hielo por una hora Posteriormente, se dieron otros tres lavados (también de unahoracadauno)conTEfríoeincubandoenhieloyfinalmentesealmacenóa4°C. VerificacióndelaintegridaddelADNenlosplugsypruebadedigestión Para determinar si el ADN no se encontraba degradado y con contaminantes que interfirieran en la digestión, se corrieron tres pruebas. 1) digestión con la enzima BamHI, 2) digestión con H/.ndlH y 3) análisis de los plugs sin digerir. Para ello se utilizó electroforesjs de campo pulsante. La digestión parcial del ADN genómico, se efectuó utilizando dos amortiguadores; el amorti.guador de digestión 1 que conlenía todos los componentes para la digestión a excepción de la enzima de restricción y la albúmjna sérica bovi.na (BSA-Bovine Seric Albumin), en este amortiguador se incubaron los plugs por 30 min (dos veces) con la finaljdad de permftm que los componentes se difundieran dentro de los plugs. El amortiguador de digestión 2 contenia todos los componentes para la digestión incluyendo la enzima y el BSA. Para determinar las condiciones ópti.mas de diges{ión parcial o prueba de digestión se utilizaron 2 plugs, mientras que para la djgestión parcial a gran escala se 45 utilizaron 10 plugs; cada plug se seccionó en 24 paftes util.izando un filo estérw (figura 4 A). Para la prueba de d.igestión parc.ial se utilizaron seis pedacitos de plug por reacción La mezcla de reacción se preparó como se describe a continuacióm la mezcla de reacción del amoftiguador para la d.igestión 1, por cada concentración de enzima a utilizar, fue de: 867 Hl, H20 bidest., 22.5 Hl (3.75 Lil x 6), ADN megabase; m Hl de amortiguador 10x de la enzima BamHl (hecho en el lab.); 2 Hl, espermidina lM.,1 LLl, DTT IM; como esta mezcla de digestión se utilizó para dos incubaciones (de 30 min cada una), las cantidades se duplicaron. Para el amoniguador de digest.ión 2, Ia mezcla de reacción para cada concentración fue la s.iguiente: 137 til, H20 bidest., 22.5 ul de ADN (6 pedacitos).,17 Ltl, amortiguador de la enzima BamHl o "H 10x; 0.34 Lil, espermidina lM, 017 Ltl, DTT I M., m Hl, BSA (10 mg/ml), 2-10 Lil de enzima BamHl o H/."H de 1 U/Lil o 0.1 U/Li.l; el volumen final de reacción fue de aprox. 200 Hl de mezcla por tubo. Se ensayaron concentraciones de 0, 0.3 U, 0.6 U 1.2 U, 2 4 U y 4 8 U de enzima BamH/ incubando a 37 °C por s m.in. En el caso de la enzima H/" para la prueba de digestión se ensayaron las concentraciones de 0, 0 3 U, 0.6 U,1.2 U y 2.4 U de enzima, como se había mencionado, los expermentos con H/.ndlH fueron realizados en el CICY, por lo que se ensayaron 3 diferentes tiempos de incubación a 37 °C, los cuales fueron.12 min,16 min y 20 min. Las reacciones efectuadas con diferentes concentraciones de BamHl o H/.ndHl (cada una con seis pedacitos de plug), se analizaron en un gel de agarosa al Wo preparado en O.5x de TBE (anexo 1). Para esto los pedacitos de plug se depositaron en un solo pozo y el marcador de lambda de 50 kb en los pozos extremos. Los pozos del gel fueron sellados con 1% de agarosa. El gel se depositó en la base de electíoforesis de un CHEF DR n (BioRad) utilizando como amortiguador de corrida TBE O.5x. Las condiciones de corrida fueron. pulso inicial 50 s, pulso final 50 s, 6 V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),120° de ángulo, tiempo de corrida 16 h. Al final de la corrida, el gel fue teñido con una solución de bromuro de etidio durante 30 min y desteñido durante 30 min con agua destilada. Para llevar a cabo la primera selección de fragmentos de alto peso molecular, se seleccionaron tres concentraciones de enzima BamHl o de H/.ndlll, que formaban una zona de compresión bien definida entre 50 y 500 kb. Procedimiento de digestión a gran escala. Experimento realizado en la Universidad de Texas A & M Se incubaron, en un tubo falcon de 50 ml, todos los pedacitos correspond.ientes a 10 plugs (240 pedacitos en total) en el amortiguador 1 durante 30 min; éste se reemplazó con el mismo volumen de amortiguador 1 y se incubó por otros 30 min Posteriormente se transfir.ieron seis pedacitos de plug en tubos de eppendori de 1.5 ml y se les añadió 170 Lil del amortiguador de digestión 2, adicionando al final la concentración de enzima correspond.iente a cada tubo. Las concentraciones ensayadas fuei.on de 0.1 U, 0.2 U y 0.3 U de BamHl y se utilizaron 80 pedacitos de 46 plug por cada concentración en un total de 40 tubos. Todas las reacciones se incubaron en el amortiguador 2 durante 1 hora en hielo y luego a 37 °C durante s min. La reacción se detuvo ponjendo los tubos eppendori inmediatamente en hi.elo y adicionándo 1/10 del volumen de EDTA 0.5 M, pH S Eme£imep!g±ea!±za9gj2!igQ)LY Se incubaron, en un tubo falcon de 50 ml, todos los pedacitos correspondientes a 10 plugs (240 pedaci.tos en total) en el amortiguador 1 duran{e 30 min;éstesereemplazóconelmismovolumendeamohiguador1yseincubóporotros 30 min Posteriormente se transfirieron seis pedacitos de plug en lubos de eppendoff gael.:5nrmlnxr?e.,!e^sa^ñ_adTg_:|o_uL5_e_,_?T"n.,gLéiir-ói€iiGtti*Ógn`i:`fi.ic:or-ancdpovf,„,Enoan, la concen{ración de enzima correspondiente a cada tubo. Las concentraciones ensayadas fueron de 0.2 U, 0.3 U y 0.4 U de H/'ndlH y se utilizaron 80 pedacitos de plug por cada concentración, en un total de 40 tubos. Todas las reacciones se incubaron en el amortiguador 2 durante 1 hora en hielo y luego a 37 °C durante 12 min, 16 min y 20 min. La reacci.ón se detuvo poniendo los tubos eppendori inmediatamenteenhieloyadicionando1/10delvolumendeEDTA(0.5M,pH8). Selección de los fragmentos de ADN de 100 a 400 kb por electroforesjs de campo pulsante (ECP) Prjmera se[ección de fragmentos La digestión parci.al a gran escala utilizando 10 plugs se analizó en un gel preparatM3 de agarosa al 1% en O.5x de TBE; en esta ocasión, Ios dientes del peine fueron sellados dejando únicamente libres los pozos de los extremos para el marcador de 50 kb. Cada pedacito de plug fue ordenado en fila india dentro del pozo, es decir uno después del otro, hasta depositar los 240 pedacitos de plugs, si era necesario se formaban "dos pisos" (Fi.gura 4 8). Posteriormen{e, el pozo se selló con la mi.sma agarosa al 1%. Las condiciones de comda para la primera selección fueron. amortiguador de corrida O.5x de TBE, pulso inicial 90 s, pulso final 90 s, 6 V/cm, 12.5 °C, 80 rpm (bomba), 120° de ángulo, tiempo de corrida 16 h. Al final de la corrida el gel se colocó sobre hielo y se prosigui.ó a cortar los extremos del mismo, estos incluían al marcador ^ y unos 5 mm de los extremos del carril conteniendo los plugs Estos bordes fueron teñidos con una solución de bromuro de etidio durante 30 min, desteñidos con agua bidestilada duranle otros 30 min y fotografiados sobre un transiluminador de UV para localizar la zona comprendida entre 100 y 400 kb. Con ayuda de una regla se localizó la regjón de i.nterés y se cortó el gel preparativoparatenerlosfragmentosde100a250kb(F1)yde250a400kb(F2) Purificación de los fragmentos de ADN de la zona Fl y F2 a través de electroelución (1) Las membranas de diálisis de 14 KD (Gibco BRL) se cortaron de acuerdo al anchodelgel,selavaronprimeroconaguadestiladaestérilfríayluegoconO.5xde 47 TBE,frío.ElgelcorrespondientealazonaF1,quecomprendialosfragmentosde100 a 250 kb y el de la zona F2, que comprendía los fragmentos de 250 a 400 kb, fueron 13.75HI 1 1 1 1 1 \ 1 Plug Piezas de plug ordenadas en el pozo del gel M Gel preparativo Figum 4. A) División en 24 pahes "iguales" de un plug conteniendo ADN de ab peso molecular; se utilizaron 6 partes para cada concentración en la mezcla de digestión parc.ial. 8) Forma en que se ordenan en el gel preparatM (uno después del otro) las 240 partes de los 10 plugs para la primera selección de fragmentos; M, marcador de lambda de 50 kb. 48 ln{roducidos cada uno a los tubos de diáljsi.s, cerrando primero un extremo con un clip; se añadió por tubo de 400 a sOO til de TBE O.5x frío, y se cerró el otro extremo con otro clip para posteriormente colocarlos en la cámara de electroforesis del CHEF DR 11 Las condiciones de corrida fueron: amohiguador de corrida O.5x de TBE, pulso inicial 40 s, pulso final 40 s, 6 V/cm, 12.5 °C, 80 rpm (bomba), 120° de ánguio, tiempo de corrida 4 h, Después de las 4 h, Ios {ubos de diálisis fueron girados " y la corrida continuó por 50 s, para despegar el ADN eluído de la pared del tubo de diálisis. Segunda selección de fragmentos Se elaboró otro gel preparati.vo de agarosa al 1% en O.5x de TBE; en es{e `ac^ aa A.`iiJ:Á ^J ..^:__ _ ._ ___.. caso se dividió el peine a la mitad y se sello cada mitad procurando dejar •---------....-- r/.`-`.uiciiiu`+ ut;/ai inHi`/;Ai.aJaÉ` --.. _ ..., y ___ individuales, ..h^ uno^1al^ centro uno_ a cada extremo. para depositar el marcadortres pozos de 50 kb. Después de deposi.tar el marcador, Ios pozos fueron sellados con la misma agarosa al 1%. EI ADN electoeluído se recuperó de los tubos de diálisis con una punta cortada (todo debe estar en frío). EI ADN de cada zona, Fl y F2, fue puesto en tubos eppendoff de 1 5 ml. A cada fracción se le añadíó lm del volumen del amortiguador de carga 10x (anexo 1), se agitó muy suavemente hasta homogenizar y se depositi5 al gel preparatM3 prevjamente sumergido dentro de la cámara de electroforesis Las condiciones para la segunda selección fueron.. amortíguador de corrida O.5x de TBE, pulso i.nicial 5 s, pulso final 5 s, 4 V/cm, 12 5 °C, 80 rpm (bomba), 120° de ángulo, tiempo de corrida 6 h. Al final de la corrida el gel fue puesto sobre hielo y se prosiguió a cortar los extremos del gel los cuales incluían al marcador y unos 5 mm de los extremos del carril conteniendo las muestras de ADN. Estos extremos fueron teñidos con una solución de bromuro de etkl® durante 30 min y luego fueron desteñidos con agua durante 30 min, para fotografiarse sobre un transiluminador de UV y localizar las zonas Fl y F2. Con ayuda de una regla se localizaron y se cortó el gel preparativo para obtener la banda correspondiente a los fragmento de 100 a 250 kb y la correspondjente a los fragmentos de 250 a 400 kb. Purificación de los fragmentos de ADN de la zona Fl y F2 a través de electroelución (2) Se procedió exactamente de la misma manera como se mencionó en la purificación de fragmentos de ADN de la primera selección, solamente que se debe añadh de 200 a 350 Hl de TBE O.5x al tubo de diáli.sis en lugar de 400 a 800 Hl como ocurre para la recuperación de la banda de primera selección. Diálisi§ lnmediatamente después de la electroelución los tubos de diálisis con{eniendo los ADNs electroeluídos se dializaron en un m de O.5x TE (anexo 1) estérw y frío, durante 5 h a 4 °C(cuarto ícuartofrío), frín`haciendo ha.ianrh .-mhi^-.^ i` [`,dé_ j_ T-E-iríó' Ti-£_!_ d-uTa-h'''e'cáává . cambios de o.5x hora (4 veces). 49 Deteminación de la concentración de ADN en cada fracción (Fl y F2) Se colectó la solución de ADN de cada tubo (midiendo el volumen) utilizando una punta cortada y se depositó en tubos eppendori (1.5 ml) por fracción. Se tomaron 5 Hl de cada fracción, se añadieron 2 Hl de amortiguador de carga (anexo 1) y se anal.izaron en un gel de agarosa al 1% en O.5x de TBE, empleando concentraciones conocidas del marcador lambda como estándar (5, 10, 15, 20, 25 y 30 ng). Las condiciones de corrida fueron: 70 V, amortiguador 0 5x de TBE, 30 min de corrida. Posteriormente el gel se t.iñó con bromuro de etidio por 30 min y se destiñó por otros 30 min. Finalmente se tomó una fotografía del ADN revelado con luz UV y se determinó su concentración en base a los estándares de concntraciones conocidas RESULTADOS Extracción de núcleos de Calcutta 4 Siguiendo el protocolo de Zhang y colaboradores (1995), se pudieron obtener aproximadamente 200 bloques de agarosa (plugs) conteniendo ADN de alto peso molecular a partir de 100 g de tejido de hojas de plantas de invernadero expuestas a un tratamiento de oscuridad por 72 h. Cabe mencionar que estos bloques tenían iina coloración café muy tenue y transparente ( figura 5). Estos fueron almacenados a 4 °C. Selección de fragmentos de ADN de 100 a 400 kb mediante electroforesis de campo pulsante (ECP) ADN de alto peso molecular. Para estimar la calidad del ADN de alto peso molecular se seleccionaron al azar 12 plugs (figura 6); un barrido significa una degradación del ADN y una zona de compresión significa que el ADN está Íntegro, en cuanto a la cantidad, Ia intensidad de la zona de compresión indicaria si es elevada, media o baja. Los resultados indicaron que el ADN aislado de Calcutta 4 estaba muy poco degradado y que la cantidad estimada del ADN de alto peso molecular era media EI ADN de alto peso molecular pudo ser digerido con la enzima BamHl y con la enzima Hi.MH (figura 7 y 8) Este experimento indicó que no contenía componentes que interfirieran con la digestión del ADN, por lo que los plugs eran de muy buena cal.idad para el establec.imiento de las condiciones óptimas para la construcción de la biblioteca. En Texas, por sugerencia del Dr Zhang se decidió trabajar con la enzima BamHl para establecer un protocolo para la construcción de la biblioteca genómica BIBAC para CalcLitta 4, debido a que el vector pCLD04541 había sido linearizado con esta misma enzima. En la figura 7 A, se observa que a una concentración de 0 3 U de BamHl se forma una zona de compresión entre 100 kb y 400 kb, mientras que a mayores concentraciones, el ADN se sobre-digirió; por lo tanto, para realizar la 50 primera selecci.ón de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se decidió utilizar 0.3 U y dos concentraciones debajo de ésta.. 0.1 U y 0.2 U En el CICY, se determinó la concentración óptima de enzima H/.ndlll y el ::Tcpeontróapct,'Ómnodgeo,:cúbá:,é:z:m:7yoac,2Enm,|adfi;grnr:uzac:¿ns:39soecw:eq,::m:::: mejor zona de compresión entre 100 y 400 kb, por lo que se decidió trabajar con esta concentración y dos concentraciones más, 0.2 U, y 0.4 U de H/.ndlll. 51 Figura 5. Plugs de Calcutta 4 almacenados en 0 05 M de EDTA. M Plugs M plugs zona de compresion Figura 6. Análisis del ADN de alto peso molecular de plugs de Calcu" 4 para estimar ia caiidad y cantidad Concliciones de ECP. agarosa 1%, 0 5x TBE, pulso inicial 50 s, pulso final 50 s, 6 V/cm, 12.5 °C, 80 rpm (bomba),18 h de corrida M, marcador de lambda de 50 kb Tinción cm bromuro de etidio 52 A388kb - Unidades de BamHI M 0 03 061.224 4.8 0 M Unidades de Hindlll 97 kb _ +r- +rJLy12 min 16 mjn 20 min :i3rmma7ó8:r#39eo8'gd:S:íóc:bpaa:íJ:'pdoer3DmYnd;É)t°®Pneia°eT:¡'icau£,rnefflT,baei¡g°m:T,T':g;,nAy)2Co°L!: de incubación a 37 °C Condiciones de ECP: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 50 s, pulso final 50 s, 6 V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),18 h M, marcador de lambda de 50 kb Tinción con bromuro de etldio. 53 Selección de fragmentos obtenidos con BamHI Primer experimento. En la figura s se muestran los extremos del gel teñido correspondiente a la primera y única selección de fragmentos de ADN de Calcutta 4; las flechas indican los puntos de corte realizados en el gel antes de su tinción, para recuperar las fracciones. La fracción F1 (100 kb a 250 kb), fue recuperada realizando dos cortes en el gel, uno a los 8.2 cm de la regla de referencia y el segundo corte a los 7.6 cm; para recuperar la F2 (250 a 400 kb), se realizó un tercer corte a los 7.0 cm El grosor de cada sección de gel cortado fue de 6 mm máximo, ya que una cantidad mayor a ésta no entra en el tubo de diálisis. En la figura 9 se muestra el gel teñido con bromuro de etidio, expuesto a luz UV y ensamblado de nuevo para mostrar donde se coftaron las dos zonas. Los fragmentos obtenidos fueron directamente electroeluídos y dializados para posteriormente ligarlos al vector V41. Segundo experimento En la figura 10 se muestran los extremos del gel teñido de la primera selección y se indica con flechas los puntos de corte que se realizaron para aislar las fracc.iones del gel antes de su tinción. La fracción F1 (100 kb a 250 kb) fue recuperada realizando dos cohes en el gel, uno a los 6 5 cm de la regla de referencia y el segundo a los 5 9 cm, esto es, 6 mm de grosor. La segunda fracción F2 se recuperó haciendo un tercer corte considerando 6 mm hacia arriba, a los 5.3 mm. En la figura 11 se muestra el gel reconstruido después de la tinción de los extremos, en donde se separaron las dos zonas (Fl y F2) y la alta densidad del ADN de los plugs de Calcutta 4. En la figura 12 se muestra el gel preparativo en donde se efectuó la segunda selección de fragmentos. La corrida electroforética fue lo suficiente para dejar salir el ADN del pozo y poder observarlo como una banda bien definida. Esta segunda selección se llevó a cabo para eliminar fragmentos pequeños atrapados entre los fragmentos grandes. Para recuperar la banda de ADN, las fracciones F1 (lado izquierdo) y F2 (lado derecho) se recuperaron cortando a los 2 8 cm y a los 2.3 cm de la regla de referencia. En la figura 13 se muestra el gel reconstruido y el área donde se recuperaron las zonas (Fl y F2) Selección de fragmentos obtenidos con H/.ndlll Tercer experimento. En la figura 14 se muestran los extremos del gel teñido de la primera selección y se indica con flechas los puntos de corte que se realizaron para aislar las fracciones del gel antes de su tinción. La fracción F1 (100kb a 250 kb) fue recuperada realizando dc)s cohes en el gel, iino a los 9.2 cm de la regla de referencia :lsegundoalos8.6cm,estoes,6mmdegrosor.LasegundafracciónF2serecuperó haciendo un tercer corte considerando 6 mm hacia arriba, a los 8.0 cm. En la figura 15 se muestra el gel reconstruido después de la tinción de los extremos, en donde se separaron las dos zonas (Fl y F2) y la alta densidad del ADN de los plugs de Calcufta 4. 54 Extremos del gel preparativo M1>M 388kb + 97kb + Figura s Alineación de los extremos del gel correspondiente a la primera selección de fragmentos de ADN (prímer experimento), teñido con bromuro de etidio y examinado con luz UV para localizar la zona que contenga los fragmentos de ADN en{re 97 kb y 388 kb. Las flechas indican los corles que se efectuaron en la parte del gel no teñida y que contenía la zona de interés Concentración de BamHl 01, 0 2 y 0 3 U/200 Lil de reacción. Condiciones de ECP: agarosa 1°/o, 0 5x TBE, pulso inicial 90 s , pulso final 90 s , 6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba),16 h. de corrida; M, marcador de ^ de 50 kb Digestión de ADN de alto peso molecular 388 kb - 97 kb - Porción no teñida Figura 9 Reconstrucción del gel de la primera selección, teñido con bromuro de etidio y expuesto a UV. Se muestra la porción no teñicla correspondiente a los fragmenlos F1 (100-250 kb) y F2 (250 a 400 kb) recuperados para la segunda selección La inten§idad del ADN de Calcutla 4 teñido con bromuro de etidio refleja la alta densidad del ADN en los plugs M, marcador de ^ de 50 kb 55 ME¥emos del gel Prepa+ M 388kb + 97kb + Figura 10 Alineación de los extremos del gel correspondiente a la primera selección de fragmentos de ADN (segundo experimento), teñido con bromuro de etidio y examinado con luz UV para localizar la zona que contenga los fragmentos de ADN entre 97 KB y 388 kb. Concentración de BamHI 0 1, 0 2 y 0 3 U/200 iil de reacción Condiciones de ECP: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 90 s, pulso final 90 s, 6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (t)omba),16 h de corrida, M, marcador de lambda de 50 kb Digestión de ADN de alto peso molecular 388kb - Porción no teñida 97kb - Figura 11 Reconstrucción del gel de la primera selección, teñido con bromuro de etidio y expuesto a UV. Se muestra la porción no leñida correspondien{e a los fragmentos F1 (100-250 kb) y F2 (250 a 400 kb) recuperados para la segunda selección La intensidad del ADN de Calcutta 4 teñido con bromuro de etidio refleia la alta densidad del ADN en los plugs M, marcador de lambda de 50 kb 56 - Extremos del gel M 485kb - Figura 12 Alineación de los extremos del gel para la segunda seleccíón de fragmentos de ADN (segundo experimento), teñido con bromuro de elidio y examinado con luz UV para localizar la banda que contenga los fragmentos de ADN Condiciones de ECP agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inícial 5 s, pulso final 5 s, 6 V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba), 8 h de corrida; M, marcador de lambda de 50 kb MF1 F2M á:raebanda + _ 48.5kb Figum 13. Reconstrucción del.gel de la segunda selección. Teñido con bromuro de etidio y examinado cx)n luz UV para localizar la banda Fl que corresponde a los fragmentos de 100 a 250 kb y la banda F2 a la fracción de fragmentos de 250 a 400 kb M, marcador de lambda de 50 kb. 57 Extremos del gel preparativo > < MC CM 388_ kb 97kb Figura 14 Alineación de los extremos del gel para la primera selección de fragmentos de ADN (tercer experimento), teñido con bromuro de etidio y examinado con luz UV para localizar la zona que contenga los fragmentos de ADN entre 100 y 400 kb. Las flechas indican los cortes que se efectuaron en la parte del gel no teñida y que contenía la zona de interés. Concentración de H/.ncíIH 0 2, 0 3 y 0.4 U/200 Hl de reacción. Condiciones de ECP. agarosa 1%, O.5x TBE, pulso inicial 90 s, pulso final 90 s, 6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida, C, control sin enzima, M, marcador de lambda de 50 DLgestión de ADN de alto peso molecular 388 kb 97kb _ PorcLón de gel no teñida Figura 15. Reconstrucción del gel de la primera selección de los fragmentos de ADN. El gel fue teñido con bromuro de etidio y expuesto a UV. Mostrando una porción no teñida correspondiente a los fragmentos F1 (100-250 kb) y F2 (250 a 400 kb) recuperados para la segunda selección La intensidad del ADN de Calcufta 4 teñido con bromuro de etidio refleia la alta densidad del ADN en los plugs M, marcador de lambda de 50 kb. 58 En la figura 16 se muestra el gel preparativo en donde se efectuó la segunda selección de fragmentos. La corrida electroforética fue lo suficiente para dejar salir el ADN del pozo y poder observarlo como una banda bien definida Esta segunda selección se llevó a cabo para eliminar fragmentos pequeños atrapados entre los fragmentos grandes. Para recuperar la banda de ADN, las fracciones F1 (lado izquierdo) y F2 (lado derecho) se recuperaron cortando a los 2.7 cm y a los 2.1 cm de la regla de referencia. Extremos del gel Sa°nndeadeia{ -=-----ií:É:--- 48.5kb _ Figura 16 Alineación de los extremos del gel correspondiente a la segunda selección de fragmentos de ADN (tercer experimento) el gel fue teñído con bromuro de etidio y examinado con luz UV para localizar la banda que contenga los fragmentos de ADN La banda Fl corresponde a los fragmentos de 100 a 250 kb y la banda F2 corresponde a los fragmentos de 250 a 400 kb Condiciones de ECP agarosa 1°/o, O.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 5 s, 6 V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba), 8 h de corrida; M, marcador de lambda de 50 kb. Volumen de las fracciones recuperadas después de la diálisis Primer experimento. Se recuperaron 770 L.I de la fracción Fl y 800 Ltl de la fracción F2. Segundo experimento. Se recuperaron 280 Hl de la fracción Fl y 160 til de la fracción F2. Tercer experimento. Se recuperaron 334 Lil de la fracción Fl y 294 Ltl de la fracción F2. Determinación de la concentración de ADN en cada fracción (Fl y F2) Primer experimento En la figura 17 se muestra el gel donde se determinó la concentración de cada fracción proveniente de una sola selección de fragmentos, usando diferentes concentraciones estándar de ADN de lambda. Se estimaron 40 ng para la fracción F1, pero como se depositaron 5 Hl en el pozo entonces la 59 concentración fue de s ng/Hl; para la fracción F2 se estimaron 30 ng, como se depositaron 5 Hl entonces la concentración fue de 6 ng/Lil. Segundo experimento. En la figura 18 se muestra el gel donde se determinó la concentración de cada fracción obtenida en las dos selecciones de fragmentos, se estimó 15 ng para la fracción F1, como se depositaron 5 Lil en el pozo entonces se tiivo una concentración de 3 ng/Hl. Para la fracción F2 se estimaron 5 ng, como se depositaron 5 Ltl entonces se obtuvo 1 ng/Hl. Esta Última concentración fue muy baja por lo que no es recomendable utilizarla De preferencia se recomiendan concentraciones entre 2 a 10 ng/Lil, ya que son las más adecuadas para trabajar en los siguientes pasos. ADN Lambda 5ng 10ng 15ng 20ng 25ng FI F2 Figura 17. Gel para deteminar la concentración de ADN en las fracciones Fl y F2 provenientes de primera selección de fragmentos (primer experimento) La concentración se estimó utilizando m curva estándar de lambda Condiciones de corrida. agarosa 1 % en 0 5x TBE, 70 V, 30 min de corrida Tinción con bromuro de etidio. ADN de lambda 5ng 10ng 15ng 20ng 25ng 30ng FI F2 Figura 18. Gel para determinar la concentración de ADN en las fracciones Fl y F2 de la segunda selección de fragmentos (segundo experimento) La concentración se estimó utilizando una curva estándar de lamt)da. Condiciones de cx)rrida. agarosa 1 % en 0 5x TBE, 70 V, 30 min de corrida Tinción con bromuro de eticlio. 60 Tercer experimento. En la figura 19 se muestra el gel donde se determinó la concentración de cada fracción obteni.da en las dos selecciones de fragmentos; se estimó 20 ng/LLl para la fracción Fl y para la fracción F2 se estimaron 15 ng/iil. ADN de lambda 1 5 10 i5 2o FI F2 FI F2 Figura 19. Gel para deteminar la concentración de ADN de las fracciones Fl y F2 de la segunda selección de fragmentos (tercer experimento) La concentración se estimó utilizando una curva estándar de lambda. Condiciones de corrida agarosa 1% en O.5x TBE, 70 V, 30 min de corrida Tinción con bromuro de etidio. DISCUSIÓN El segundo paso crítico en la construcción de una biblioteca genómica es la preparación del ADN de alto peso molecular parcialmente di.gerido (Frijters eí a/., 1997) Por lo tanto, se debe tener especial cuidado para obtener suficiente cantidad y alta calidad de ADN. Las hojas del banano contienen altos niveles de poljfenoles y polisacáridos (Vilarinhos eí a/., 2002) por lo que se modificó la preparación del material vegetal y de los núcleos. En el caso del materia vegetal las plantas de Calcutta 4 se sometieron a oscuridad durante 72 para reducir la cantidad de carbohidratos como se ha reportado para Loíus /.aponí.cus (Men eí al., 2001) También el método de extracción fue ligeramente modificado,. se añadió PVP40 al amohiguador de extracción de núcleos ya que este componente reduce la co-precipitación de los polifenoles con los núcleos. Esta mi.sma modificación se realizó en la construcción de la biblioteca genómica de manzana debi.do al alto contenido de compuestos fenólicos en sus hojas (Vinazer eí a/., 1998). A pesar de que los plugs luvieron una coloración ligeramente café, posi.blemente debido a la oxidación del remanente de polifenoles, no se afectó la digestión del ADN de alto peso molecular. Por otra parte, en la construcción de la biblioteca de sorgo se reportó que llevando a cabo una segunda selección de fragmentos se podían eliminar los insertos de tamaño pequeño (Woo eí a/.,1994) En la construccjón de la biblioteca de arroz se observó que con una segunda selección de los fragmentos de ADN se incrementó, de un 60 % a un 80%, Ia proporción de insertos mayores que 120 kb (Zhang eí a/., 1996). Estos resultados indican que una doble selección de fragmentos de ADN 61 resulta necesaria y crucial para incrementar el tamaño promedio de los insertos en la biblioteca a construir. La segunda selección permite eliminar fragmentos pequeños de ADN y obtener insehos de tamaño más uniforme En los experimentos realizados en Texas con el ADN de Calcutta 4 se efectuó una primera selección de fragmentos debido a que se estaba estableciendo el protocolo y era necesario saber si el sistema estaba funcionando baio las condiciones indicadas por el Dr. Zhang. Posteriormente se realizó una segunda selección de fragmentosde ADN para aumentar el tamaño promedio de inserto. En los experimentos realizados en CICY se efectuó directamente la segunda selección de fragmentos a partir de la digestión con la enzima Hmdlll, debido a que ya se sabia que este sistema funcionaba en banano. De los fragmentos obtenidos por la digestión con BamHl, se observó que en el primer experimento, en donde se realizó la primera selección, la concentración de ADN fue alta para F1 (8 ng/Hl ) y F2 (6 ng/ul) mientras que en el segundo experimento, en donde se realizaron dos selecciones secuenciales, se obtuvo menos ADN; 3 ng/Lil para F1, y 1 ng/Lil para F2. En el tercer experimento (fragmentos obtenidos por la digestión con Hi.ndlll) se pudo recuperar más ADN (20 ng/ Hl en Fl y 15 ng/Hl en F2,) debido a que en la electroelución (2), se añadió solamente 200 Lil de TBE O.5x. En cuanto a la selección del sitio (BamHl o H/.ndlll) para construir la biblioteca, cabe mencionar que, estudiando el centrómero del minicromosoma de Beía w/gar/.s se demostró que existe un sesgo en la representatividad de regiones centroméricas al digerir el ADN de 8 w/gari.s con la enzima BamHl e hibridar con sondas específicas para satélites que se encuentran en esta zona (pTS5) (Gindullis et al 2001). Se sugirió que la posible causa de esto podría ser que las secuencias repetidas de los satélites centroméricos se encuentran relativamente conservados y homogéneos o que BamHl fue inhibida por la metilación de los satélites, puesto que una alta proporción de citosina metilada ha sido previamente encontrada en esta familia, en particular en el pTS5 (Heslop-Harrison ef a/., 1999). Por otra parte, se obtuvieron fragmentos de restricción que contenían al satélite pTS5 con un tamaño menor a 150 kb en las digestiones con EcoRl y H/.ndlll, y con BamHl se produjeron fragmentos de hasta 340 kb. De estas er`zimas, H/.ndlll fue la única que produjo fragmentos de restricción en el rango de 120 kb cuando fueron hibridados con las dos sondas (pTS4.1 y pTS5). Esto demostró que es mejor construir una biblioteca con H/'nc/lll ya que produce fragmentos de restricción que incluyen las regiones centroméricas, por lo tanto, hay una mejor representativtdad del genoma en estudio (Gindullis eí a/., 2001 ). En este capítulo se presentaron los resultados de las digestiones parciales del ADN de Calcutta 4 con la enzima BamHl o con Híndlll, de tal forma que el protocolo para desarrollar la biblioteca con cualquiera de ellas está establecido, y en un futuro pueden ser ambas construidas, complementándose una con otra y evitar se tenga algún sesgo en la representatividad del genoma. 62 REFERENCIAS Birren, 8. and Lai, E. (1993). Pulsed field gel eletrophoresis, A Practical Guide Academic Press, lNC. Frijlers, A. C., Zhang, H-B., van Dame, M., Wang, G-W., Ronald, P.C. and Michelmore, R. W. (1997). Construc(ion of a bacterial artificial chromosome containing large EcoRl and Hindlll genomics fragments of leftuce. Theoretjcal and Applied genetics, 94, pp 390-399 Gindullis, F., Dechyeva, D. and Schmjdl,T. (2001 ). Construction and caracterization of a BAC library for the molecular dissection of a single wild beet centromere and sugar beet (Befa w/gan.s) genome analysis. 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En {odas las ligaciones en donde se han utilizado fragmentos de ADN seleccionados, el vector V41 siempre mos{ró una eficiencia de clonación simi.Iar a los vectores BAC y BIBAC. La eficienci.a de transformación de las diferentes ligacjones obtenidas fueron de 100 a 10 000 colonias blancas por microlitro de ligación y el rango del tamaño promedio de los insertos obtenidos osciló entre 50 y 150 kb (Wu ef a/., 2000). Estas diferencias reflejan la influencia del método de preparación del ADN de alto peso molecular, de la digestión parci.al, de la selección de fragmentos de determinado tamaño y de la concentración y calidad del ADN que se va a clonar. Dentro de estos factores, la digestión parcial del ADN resulta ser el paso más crítico y difícil de controlar. Una óptima digestión parcial debe producir en su mayoría fragmentos de ADN entre 200-500 kb, con una concentración de aproximadamente 1.5 ng/Hl. Cuando el tamaño de los fragmentos de ADN genómico son muy grandes (> 500 kb) o la concentración es muy baja (< 0.1 ng/HI), se obtienen muy pocas clonas recombinantes (Wu eí a/., 2000). La cantidad de los fragmentos de ADN utilizados para llevar a cabo la ligación es tan importante como la calidad del mi.smo Se requiere de una gran cantidad de ADN genómico parcialmente digerido (2L10 ng/HI) para compensar la baja eficiencia de tran§formación que se obtiene al in{roducir el vector portando los insertos de gran tamaño (Frijters eí a/., 1997). Un sol)recargo de ADN en el gel durante la electroforesis, con la finalidad de incrementar la cantidad a recuperar del ADN parcialmente digerido, puede resultar en la co-migración de fragmentos pequeños de ADN atrapados dentro de los grandes. Además, Ios fragmentos pequeños se ligan preferentemente al vector y las transformaciones con estos resultan más eficientes, por lo que la bi.blioteca resultaría con i.nsertos de tamaño promedio menor que 80 kb, lo cual no es recomendable porque implicaría elevar más los costos y el tiempo que se invertiría en construir la bibli.oteca. Con la finalidad de incrementar la cantidad y la calidad del ADN que se usará como inserto, se ha propuesto realizar una segunda selección de los fragmentos producidos durante la digestión parcial Esto removerá los fragmentos pequeños de ADN que queden atrapados entre los fragmentos grandes obtenidos en la primera selección e incrementará el tamaño promedio de los inseftos clonados. Sin embargo, es importante mencionar que la eficiencia de transformación se reduce drásti.camente 65 cuando se introduce el vector ponando los insenos obtenidos de la segunda selección (Woo ef a/.,1994). Para incrementar la eficiencia de transformación se han propuesto realizar diferentes modificaciones, como el llevar a cabo una pseudo segunda selección qiie consiste brevemente en la selección del ADN a través de tres etapas en el mismo gel. 1) se permite que el ADN de alto peso molecular depositado en los pozos migre al extremo superior del gel (1 cm después del pozo) para llevar a cabo este paso el gel se tuvo que invertir, 2) después que los fragmentos pequeños fueron sacados del gel, se invierte a su posición normal, esto es, a favor de la corriente eléctrica, para que el ADN de alto peso molecular migre y regrese a su posición en el pozo, 3) finalmente se corre una electroforesis como cualquier otra segunda selección para separar las fracciones de ADN en el rango de 150 a 500 kb. Esta metodología fue efectiva para remover los fragmentos pequeños de ADN atrapados, sin afectar la calidad ni la cantidad del ADN; este experimento fue llevado a cabo con ADN de ratón (Osoegawa et a/., 1998) Este mismo procedim.iento ha utilizado también con ADN de 8. Wapus, obteniéndose resultados similares, esto es, incrementando el tamaño de los insertos (Wu eí a/„ 2000). La principal limitación en la construcción de una biblioteca altamente representativa es el número de transformaciones requeridas para generar el número de clonas necesarias. Si el propósito es el mapeo físico y la secuenciación del genoma completo, entonces es necesario tener una redundancia muy elevada del genoma paraconstruircontiguos(contigs)completos(Osoegawaeía/.,1998). En la construcción de bibliotecas genómicas BAC o BIBAC, la cepa de E. co//' DHIOB es la más ampliamente utilizada debido a que posee las siguientes particularidades.. a) una mutación en hsdRMS, endonucleasa endógena, que bloquea la restricción de ADN foráneo, b) una mutación que bloquea la restricción de ADN metilado (mcrA, mcm, mc¢ y mm), c) una mutación que bloquea la recombinación (recA1 ) y d) permite incorporar ADN de gran tamaño (deoR). En el presente capítulo se describen las ligaciones del vector pCLD04541 con los fragmentos de ADN (Fl y F2) procedentes de la digestión con BamHl o H/.ndlll, la transformación de células de E. co// DH10B con el vector recombinante y el análisis de las clonas para determinar el tamaño promedio de los insehos y el número de clonas vacías (sin inserto) de cada ligación realizada. MATERIALES Y METODOS LIGACIÓN DEL VECTOR V41 CON LOS SELECCIONADOS EN LAS FRACCIONES FI Y F2 FRAGIVIENTOS DE Fragmentos de ADN procedentes de la digestión con BamHI (Texas) Primer experimento 66 ADN Se procedió a llevar a cabo la ljgación del vector desfosforilado con los fragmentos correspondientes a las fracci.ones Fl y F2, empleando una razón molar de 1 :2 (inseho:vector). La mezcla de reacción para la fraccjón Fl consisti.Ó en. 695 HI H20 bidestilada, 350 Hl de F1 (2 800 ng), 47 Hl de vec{or V41 (940 ng), 280 ul de amortiguador 5x y 28 Ltl de T4 ligasa de 1 U/ul (lnvitrogen), volumen final 1 400 ttl. La mezcla para F2 consistió en: 516 HI H20 bidest , 400 Hl de F2 (2 400 ng), 20 Hl de vector V41 (800 ng), 240 Hl de amortiguador 5x y 24 Hl de T4 Iigasa de 1 U/ul (Invitrogen),. volumen final de 1 200 HI Se realizó la mezcla de los componentes con extremo cujdado, esto es, girando el tubo eppendorf en posición semi-horizontal. Posteriormente, se incubó a 16 °C durante 8.5 h. Se realizó una prueba de ligación, para confirmar la actividad de la T4 Iigasa, mezclando 1 ul de lambda/H/.ndlll con 10 Hl de la mezcla de ligación procedente de la Fl o F2 (bajo las condiciones de incubación antes mencionadas). Es importante mencionar que el ADN (inserto) y el vector se deben pipetear con puntas cortadas para evitar daño mecánico. Segundo experimento Se llevó a cabo la ligación del vector con los fragmentos de la segunda selección (Fl y F2) en una razón molar 1:2 (inserto.vector). La mezcla de reacción consistió para la fracción Fl de. 71. Ltl H20 bidestilada, 140 Hl de F1 (420 ng), 7 Hl de vector V41 (140 ng), 56 Hl de buffer 5x y 6. Hl de T4 ligasa de 1 U/Hl (Invitrogen); volumen final 280 ul. La mezcla para F2 consistió en 0. HI H20, 160 Hl de F2 (160 ng), 2.7 Hl de vector V41 (54 ng), 41 Hl de buffer 5x y 4 Hl de T4 li.gasa de 1 lJ/til (lnvitrogen), volumen final 207.7 HI Los componentes se mezclaron como se descnbió previamente. Fragmentos de ADN procedentes de la digestión con H/.ndlll (CICY) Tercer experimento Se llevó a cabo la ligación del vector con los fragmentos de la segunda selección (Fl y F2) en dos razones molares 1,.2 y 1 : 4 (inserto.vector). Razón molar 1 :2 La mezcla de reacción consistió para la fracción Fl de: 92| HI H20 bidestilada, 100 Hl de F1 (2 Hg),19 Hl de vec{or V41 (665 ng), 266.67 Hl de buffer 5x y 26.66 Hl de T4 ligasa de 1 U/Ltl (Invitrogen),. volumen final 1333.33 Hl. La mezcla para F2 consistió en: 887.67 HI H20,133.33 ul de F2 (2 Hg),19 Lil de vector V41 (665 ng), 266.67. ul de buffer 5x y 26.66. Hl de T4 ligasa de 1 U/HI (Invitrogen), volumen final 1333.33 Hl. Los componentes se mezclaron como se describió previamente. 67 Razón molar 1 :4 La mezcla de reacción consistió para la fracción Fl de. 902 L.l H20 bidestilada, 100 ul de F1 (2 Lig), 38 til de vector V41 (133 Lig), 266.67 ul de buffer 5x y 26.66 Lil de T4 ligasa de 1 U/Lil (lnvitrogen); volumen final 1333.33 LLl. Los componentes se mezclaron como se describió previamente. Transformación de E. co/i. (cepa DHIOB) con el ADN recombinante Una alícuota de 1.5 HI Ó 2 Lil de la ligación se mezcló con 20 Lil de células competentes de E co//. DH10B (BRL Gibco). La mezcla se depositó en celdas de electroporación de 0.15 cm (distancia entre los electrodos). Las condiciones de electroporación fueron voltaje de 350 V, capacitancia de 330 LiF, impedancia a nivel bajo, carga rápida, resistencia 4 Q. Una vez transformadas, Ias células DH10B se recuperaron adicionando 1 ml de medio SOC (anexo) e incubándolas a 37 °C en agitación (250 rpm) durante 50 min. Posteriormente, se plaqueó todo el mililitro en cajas de petri de 15 cm, conteniendo medio LB, tetraciclina 15 Lig/ml, lpTG 12 Lig/ml y X-GAL 60 Lig/ml. Las cajas se incubaron a 37 °C durante 24-37 h. La eficiencia de transformación del lote de células de E co//. DH10B cuando se utilizó al plásmido control pUC 19 fue de 9 x 109 cfu/ug. Digestión con la enzima Wod y deteminación del tamaño promedio del inser(o La extracción del ADN recombinante se realizó aplicando la técnica de minipreparación y siguiendo el protocolo reponado por Zhang (2000). El plásmido aislado se digirió con la enzima Wofl con el fin de liberar los insehos. La mezcla de reacción utilizada en la digest.ión con la enzima Nofl fue de.12.75 Hl de ddH20, 5 Lil de ADN (vector-inserto), 2 Hl amortiguador 10x NEB, 0 2 Hl de 10 mg/ml de BSA, 0.05 Hl de Wofl (10 U/Hl, BioLabs) volumen final 20 Hl. La reacción se incubó a 37 °C durante 3 h, posteriormente (a cada muestra) se le añadió un décimo de volumen del colorante de carga 10x (anexo 1) y se incubó a 65 °C por 10 min para separar los extremos pegajosos e inmediatamente se transfirieron a hielo Las reacciones se depositaron en un gel y se utilizó el equipo ECP para separar los fragmentc>s, productos de la digestión Finalmente se analizó y se determinó el tamaño de los insenos comparando con el marcador de lambda de 50 kb. RESULTADOS Prueba de ligación La figura 20 corresponde a los resultados de la prueba de ligación para los fragmentos obtenidos en la primera selección (Fl y F2); en el control de ligación los fragmentos pequeños de lambda fueron ligados, esto es, no se observaron bandas libres en los carriles 1 y 2, en comparación con el control sin ligasa (carril 1), indicando que la ligasa T4 se encontraba en condiciones Óptimas de actividad. 68 lambda/H/.ndlll FI F2 12 23kb _ Figura 20 Prueba de ligación empleando el ADN seleccionado en las fracciones F1 (100-250 kb) y F2 (250 a 400 kb) Para esta prueba se mezcló ILtl de lambda/H/ndlll con 10 Ltl de reacción de ligación de F1 (carTil 1 ) y F2 (carril 2). El análisis de la ligación se realizó empleando electroforesis estándar Las condiciones de corrida fueron: agarosa 1 %, 0.5x TBE, 70 V, 30 min de corrida. Tinción con bromuro de etidio. Ligación del vector V41 con los fragmentos de ADN seleccionados en la§ fracciones Fl y F2 lnsertos obtenidos en el primer experimento El número de colonias blancas obtenidas en la ligación correspondiente a la fracción Fl fue de 230 y para la fracción F2 fue de 5 colonias blancas. Debido a que en la fracción F2 se obtuvieron muy pocas colonias recombinantes se decidió no analizar esta fracción La eficiencia de transformación obtenida para la fracción F1, no pudo ser evaluada debido a que solo se registro el número de colonias blancas. La figura 21 A muestra el análisis de 37 clonas BIBAC de la ligación de la fracción F1. El tamaño promedio estimado de los insehos fue de 93 kb, se observaron insenos entre 9 kb y 220 kb, agrupándose el 70.27 % entre 9 y 100 kb y sólo un 29 72 % mayores que 100 kb, no se presentó ninguna clona sin inserto En la figura 21 8 se muestra la distribución de los insehos, la mayoría de estos se agrupó entre 9 kb y 80 kb_ lnser(os obtenidos en el segundo experimento El número de colonias blancas obtenidas en la ligación empleando la fracción Fl fue de 100 colonias y para la fracción F2 fue de 15 colonias. Debido a que en la fracción F2 se obtuvieron muy pocas colonias recombinantes se decidió no analizar 69 esta fracción. La eficiencia de transformación obtenida para la fracción F1, no pudo ser evaluada debido a que solo se registro el número de colonias blancas. La figura 22 A muestra el análisis de 19 clonas BIBAC (de 36 analizadas) de la ligación con la fracción F1. El tamaño promedio estimado de inseno fue de 125 kb; se observaron insertos entre 70 kb y 175 kb, de estos el 28 °/o se agrupó entre 70 y 100 kb y el 72 % con insertos mayores que 100 kb, no hubo ninguna clona vacía. En la figura 22 8 se muestra la distribución de los insertos, la mayoría de estos se agruparon entre 101 kb y 120 kb. 37 Clonas seleccionadas al azar 1455kb + 97.Okb - 485kb - V41- v41_ V41- 9-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 181-200 201-220 F`ango de tamaño de los inseitos (kb) Figura 21. A) Análisis por ECP de 37 clonas BIBAC procedentes del primer experimento. El asterisco indica una inserto menor a 10 kb 8) Distribución de los insertos en base a su tamaño Los plásmidos recombinantes (clonas BIBAC) se digirieron con la enzima Woíl. Las condiciones de la ECP fueron. agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida. V41, vector pCLD04541 ; M, escalera de lambda Tinción con bromuro de etidio 70 M 145.5kb 19 muestras tomadas al azar + 97_Okb _ 48.5kb _ - V41_ V41 v41_ 70-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 F`ango del tamaño de los insertos (kb) Figura 22. A) Análisis por ECP de 36 clonas BIBAC (solo 19 de éstas se muestran) procedentes del segundo experimento 8) Distribución de los insenos de 36 clonas en base a su lamaño. Los plásrnidos fueron digeridos con la enzima ~ofl Las condiciones de la ECP fuercm agarosa 1%, 0 5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12 5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida M, escalera de lambda; V41, vector pCLD04541. Tinción con bromuro de etidio. 71 lnsertos obtenidos en el tercer experimento Para determinar que ligación proporcionaba el mayor número de insertos con tamaños mayores que 100 kb y sin insertos menores que 10 kb, se estimó el tamaño promedio de inserto de 18 a 20 clonas de cada transformación, para después seleccionar la mejor ligación y evaluar aproximadamente 100 clonas. Tran§formaciones a) Razón molar 1:2,1.5 Hl de ligacjón para la transformación El número de colonias blancas obtenidas en la transformación empleando la ligación de la fracción Fl fue de 187 colonias (61.5 %) y 117 colonias azules que representan el 38.4 %. Para la fracción F2 fue de 30 colonias. Estas últimas no se analizaron por las razones antes mencionadas. La eficiencia de transformación cfu/ug de ADN obtenida para la fracción 1 fue de 1.05 x 105cfu/Hg (cfu= unidade de colonias formadas). La figura 23 A muestra el análisis de 19 clonas BIBAC de la ligación con la fracción F1. El tamaño promedio estimado de inseno fue de 115 kb, se observaron insenos entre 63 kb y 150 kb, agrupándose el 16.66 °/o por tamaños entre 60 y 100 kb y el 83 33 % mayores que 100 kb; no hubo ninguna clona vacía. En la figura 23 8 se muestra la distribución de los insertos, la mayoría de estos se agruparon entre 101 kb y 120 kb. b) Razón molar 1 :4, 1.5 ul de ligación para la transformación El número de colonias blancas obtenidas en la transformación empleando la ligación de la fracción Fl fue de 271 colonias (55.4 %) y 218 colonias azules que representan el 44.5 %. No se evaluó la fracción F2. La eficiencia de transformación obtenida para la fracción 1 fue de 1 30 x 105 cfu/Hg La figura 24 A muestra el análisis de 20 clonas BIBAC de la ligación con la fracción F1. El tamaño promedio estimado de inseno fue de 111.25 kb; se observaron insehos entre 10 kb y 196 kb, agrupándose el 30 % entre 9 y 100 kb y el 70 °/o mayores que 100 kb, no hubo ninguna clona vacía. En la figura 24 8 se muestra la distribución de los insertos , la mayoría de estos se agruparon entre 101 kb y 140 kb. 72 M 19 muestras tomadasal azar 145.5kb + 970kb 485kb - V41_ v41_ V41_ =:..:. L.`l 60-80 81-100 F 101-120 121-140 141-160 Rango del tamaho de los insertos (kb) Figum 23 A) Distribución por ECP de las 19 clonas BIBAC procedentes del experimento 3 a El asterisco indica una clona en donde no se digirió bien el plásmido 8) Análisis de los insenos en base a su tamaño Los plásmidos fueron digeridos con la enzima Woíl. Las condiciones de la ECP fueron: agarosa 1%, 0 5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12 5 ac, 80 rpm (bomba),16 h de corrida M, escalera de lambda de 50 kb, V41, vector pCLD04541 Tinción con bromuro de etidio 73 20 muestras tomadas al azar M -- 145.5kb + 97.0 kb 48_5 kb V41- v41_ V41- 9-80 81-100 101-120 121-140 141-200 Rango del tamaño de los inserto§ (kb) Figura 24. A) Análisis por ECP de 20 clonas BIBAC (clonas procedentes del tercer expe mento, 3b). Los asteriscos muestran las dos clonas con insertos de aproximadamente de 10 kb. 8) Distribuclón de los insertos en base a su tamaño. Los plásmidos fueron digerídos con la enzima ~oÍI Las condiciones de la ECP fueron: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida M, escalera de lambda de 50 kb, bromuro de etidio. 74 V41, vector pCLD04541 Tinción con c) Razón molar 1 :4, 2 Lil de ljgación para la transformación El número de colonias blancas obtenidas en la transformación empleando la ligación de la fracción Fl fue de 316 colonias (37.5 %) y 526 colonias azules que representan el 62.4 %. No se evaluó la fracción F2. La eficiencia de transformación obteni.da para la fracción 1 fue de 1.68 x 105 cfu/LLg La figura 25 A muestra el análisis de 18 clonas BIBAC de la ligación con la fracción F1. El tamaño promedio estimado de inseho fue de 125.8 kb; se observaron jnsertos entre 10 kb y 172 kb, agrupándose el 11.11 % de estos por tamaños entre 9 y 100 kb y el 88.88 % mayores que 100 kb, no hubo ninguna clona vacía En la figura 25 8 se muestra la distribución de los insertos, la mayoría de estos se agruparon entre 101 kb y 140 kb. En el cuadro 2 se resumen los resultados obtenidos en los tres experimentos. En el tercer experimento, las ligaciones 3b y 3c (cuadro 2) presentaron una eficiencia de transformación elevada, con respecto al número de colonias blancas, esto es, 271 y 316 clonas respectivamente; sin embargo estas ligaciones no se consideran Óptimas para la construcción de la biblioteca por la presencia de insertos pequeños de aproximadamente 9 kb . La ligación 3a (cuadro 2), proporcionó la mayor cantidad de insenos mayores que 100 kb; además no presentó insertos pequeños, por lo que se decidió evaluar mas clonas de esta transformación hasta completar aproximadamente 100 clonas. Al analizar 94 clonas para completar un total de 112 clonas (94 + 18 = 112), el tamaño promedio de inserto aumento a 122.27 kb; no se encontró ninguna clona con tamaño de inserto de 9 kb, como en los otros experimentos. El rango del tamaños de los insertos estuvo entre 27-190 kb y solo hubo una clona sin inserto; agrupándose el 14.28 % de estos insertos entre 27 kb y 100 kb. De este grupo, se encontraron dos clonas, una con un inseho de 27 kb y la otra con un inseno de 43 kb (insertos más pequeños); el resto de clonas tuvieron insertos mayores que 60 kb; el 85.71 % de los insenos fueror` mayores que 100 kb. En la figura 26 A se muestra el análisis de 41 clonas de un total de 112 analizadas y en la figura 26 8 se muestra la distribución de los inseitos en base a su tamaño de las 112 clonas. Se ha observado que en el genoma de las plantas monocotiledóneas se tiene una mayor frecuencia de sitios de reconocimiento Wofl, comparado con las plantas dicotiledóneas, por lo tanto, no es raro observar en el análisis de clonas más de una banda procedentes de los insertos. El vector pCLD04541 posee 5 sitios de restricción para Wofl, obteniéndose 5 fragmentos de los cuales solo tres son visibles en el gel; los otros dos se salen del gel por las condiciones de la corrida electroforética. 75 18 muestrastomadas al azar M 145.5kb + 97.Okb - 48.5kb - V41- v41- 9-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 Rango del tamaño de los insertos (kb) Figura 25` A) Análisis por ECP de las 18 clonas BIBAC. 8) Distribución del tamaño de insenos de 18 clonas pro®dentes del ter®r experimento, 3c El asterisco muestra un fragmento de aproximadamente 10 kb, la flecha señala una clona sin inserto` Los plásmidos fueron digericlos con la enzima ~oíl. Las condiciones de la ECP fueron: agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final i5 s, 6V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida M, escalera de lambda; V41, vector pCLD04541. Tinción con bromuro de etidio 76 A M 41 clonas seleccionadas al azar M 1455kb + 970kb + 48.5kb - v41+ V41+ v41+ 27-80 81-100 101-120 121-140 141-200 201-250 Rango del tamaño do inserto (kb) Figura 26. A) Análisis por ECP de 41 clonas BIBAC de un total de 112 analjzadas, procedentes del primer experimento, 3a. 8) Distribución de los insertos en base a su tamaño de las 112 clonas antes mencionadas` Los plásmidos recombinantes (clonas BIBAC) se digirieron con la enzima WoÍI Las condiciones de la ECP fueron. agarosa 1%, 0.5x TBE, pulso inicial 5 s, pulso final 15 s, 6V/cm,12.5 °C, 80 rpm (bomba),16 h de corrida. V41, vector pCLD04541, M, escalera de lambda. Tinción con bromuro de etidio. 77 Cuadro 2 Resumen de los resultados obten idos en los tres experimentos Experimento Enzim a Razón molar 1a de (inserto:vector) selección 23a3b BamHl BamHlHindlll 1 .2 11 2:2 S SS 3c H ind'll H lndlll 1.4 •1 5 pl de ligación 1 ul de ligac]ón no no evaluado S S %deinseftos enel de selección transformaclóncfu/uq colonias blancas colonlas colonias azules analizadas enel rango 9- 1 00kb NO 230. ne 37 70.27 SS 100,187* ne117 3618 - de número de 1.01 x 10- 1:4 %deln§ertos 2a restricclón 1 número número de Eficiencia S 1 30 x 10' 27r 218 20 30 S 1 68 x 1 0' 316_ 526 18 11.11 rango 60-100kb %de Tamaño insertos mayor promedio que100kb de lnserto(kb)93125 29.722.22 27.7716.66 7.83.33 11511125 70 8888 1258 lllllIL- Se ha observado que en el genoma de las plantas monocotiledóneas se tiene una mayor frecuencia de sitios de reconocimiento ~ofl, comparado con las plantas dicotiledóneas, por lo tanto, no es raro observar en el análisis de clonas más de una banda procedentes de los insertos. El vector pCLD04541 posee 5 sitios de restricción para Woíl, obteniéndose 5 fragmentos de los cuales solo tres son visibles en el gel; los otros dos se salen del gel porque son fragmentos más pequeños. Número de colonjas necesarias para tener una biblioteca representativa El cálculo del número de colonias necesarias para construir una biblioteca representativa se realiza utilizando la siguiente ecuación: N= In (1-P)/ln (1-L/G) Donde: N= número de colonias en la biblioteca P= probabilidad de tener cualquier secuencia de interés L= longitud promedio de inseíto en pares de bases G= longitud del genoma haploide en pares de bases. Con esta fórmula, si se tiene un 99 % de representatividad, el número de clonas calculadas representa 5 veces el genoma haploide. Aplicando la ecuación con diferentes valores de tamaño promedio de inseno y considerando que el genoma haploide de Calcufta 4 es 600 Mpb tenemos a) con tamaño promedio de fragmentos de 125 kb (2° expto.). N= ln (1-.99)/ln (1-1.25xl05/6 xlo8) = 22 000 clonas b) con tamaño promedio de fragmentos de 122 27 kb (3er. expto.) N= ln (1-.99)/ln (1-1.2227 xl05/6 xl08) = 22 609 clonas DISCUSIÓN En el desarrollo del protocolo para la construcción de la biblioteca genómica de Calcufta 4 utilizando un vector binario (pCLD04541), fue necesario empezar con una primera selección de fragmentos para establecer las condiciones debido a que no se tenía información previa para banano. El tamañc> promedio de los insertos provenientes de la digestión con BamHI cuando se realizó únicamente la primera selección de los fragmentos de ADN, fue de 93 kb, agrupándose el 72.2 % en el rango de 9 a sO kb; no estando satisfechos con la 79 distribución del tamaño de los insertos, se decidió no considerar esta ligación para la construcción de la biblioteca de Calcutta 4 (puesto que la mayoría de las bibliotecas reportadas presentan la mayoría de insertos con tamaños mayores que 100 kb) (Lijavetzky eí a/, 1999; Wu eí a/, 2000; Luo eí a/, 2001 ; Gindullis eí a/ 2001 ). Con la finalidad de aumentar el tamaño de los insertos se prosiguió a realizar una segunda selección de los fragmentos de ADN (Woo eí a/., 1994, Zhang eí a/., 1996). Cuando se realizaron dos selecciones consecutivas el tamaño promedjo de inserto incrementó a 125 kb, y el 72 % se agrupó entre 101 kb y 120 kb. Esta diferencia (93 kb y 125 kb) se debió a que en la primera selección los fragmentos pequeños que quedaron atrapados entre los más grandes, fueron más fácilmente ligados al vector, reduciendo así el tamaño promedio de los insertos en las clonas. En la segunda selección la mayoría de los fragmentos pequeños fueron eliminados, por lo que el tamaño promedio de los insertos aumentó, haciendo que esta ligación fuera adecuada para la construcción de la biblioteca de Calcufta 4. Es imponante remarcar que además de analizar el tamaño promedio de inserto en la muestra seleccionada, es necesario apoyar este dato con el análisis de cómo se distribuyen los insenos en base a su tamaño para determinar la calidad de la bibll'oteca. Se ha reportado que la construcción de una biblioteca de una especie con una sola enzima de restricción puede traer problemas en la representatividad del genoma, por el sesgo que puede haber debido a la distribución no uniforme de los sitios de restricción (Wu eí a/., 2000, Tao eí a/., 2002; Yim eí a/ , 2002). Es por esto que se decidió realizar otra ligación utilizando ADN genómico digerido con la enzima H/'ndlll. Como ya se había mencionado antes, los experimentos utilizando a la enzima Hi.ndlll se realizaron en el CICY. De las dos ligaciones obtenidas, esto es, variando la proporción inserto:vector (1.2 o 1:4), la que presentó el mejor tamaño promedio de inseho y la mejor distribución de estos (la mayoría con insertos mayores que 100 kb) fue la ligación apli.cando la razón molar 1.2 (experimento 3a), de la cual posteriormente se analizaron 94 clonas más para completar 112 clonas analizadas. Se pudo observar que el tamaño promedio de inserto incrementó de 115 kb a 122.27 kb; aunque con este tamaño de muestra se obtuvieron dos insertos pequeños (27 y 43 kb) la gran mayoría de los insertos se encontró por arriba de 100 kb. Con respecto a la cantidad de ligación (1.5 Hl o 2 Hl) para la transformación de bacterias por electroporaclón, cuando se utilizó la razón molar 1 :4 y se transformó con 1.5 Lil o 2 Hl de ligación, el número de clonas recombinantes aumentó de 271 a 316 repectivamente con respecto al experimento 3a (187 clonas) Sin embargo, se presentaron fragmentos menores de 10 kb, lo cual es una desventaja desde el punto de vista económico y práctico, porque al tener insertos pequeños estos reducen el tamaño promedio de inserto de la ligación y se requerirán más clonas para cubrir n veces el tamaño haploide; esto trae como consecuencia un incremento en los costos y un incremento en el tiempo necesario para la construcción de la biblioteca. Esta es la 80 segunda razón por lo que la llgación del experimento 3a resultó ser la más adecuada, aunque se obtuvo un número de clonas recombinantes menor (187 colonias). exper,m::togse:xeir:!'c::/H°gbsdeewÁDUNn):,:a¿:aFfi¿::nnc:+ae::ntr,:n:::roT::':nene|atitde::tj:: (Fritjers eí a/.,1997; Wu eí a/., 2000; Vinazer eí a/.,1998). De aquí la importancia de iniciar con un ADN genómico de la más alta calidad y con una concentración ::::'uean:: é#| ::g (ext |a:to `cg,:,5u); áseí Á:i:? puá'::za:o:é;:'::a,e',eact;oa::mep,:ct,::tc:: :: transformación obtenida, no solamente por el tamaño de inserto clonado (mayores que 100 kb), sino también por utilizar vectores de tamaño grandes (29 kb) como es nuestro caso. Cabe mencionar que después de analizar el porcentaje de clonas recombinantes (blancas) y no recombinantes (azules), se puede observar es que hay un gran porcentaje de clonas azules en cada transformación (del 40 al 60 %), esto podría indicar que el vector no se encontraba completamente linearizado, ya que la prueba de desfosforilación realizada indicaba que la desfosforilación fue buena (95 °/o de recombinantes). Estos resultados indican que habría que realizarle una purificación al vector linearizado y desfosforilado para eliminar aquel vector que se encuentre circular, esto se puede llevar a cabo utilizando electroforesis convencional para separar el vector lineal del circular y posteriormente recuperar el vector linearizado por electroelución. Las dos ligaciones procedentes con los fragmentos de ADN de la segunda selección (una procedente de fragmentos obtenidos de la digestión con BamHl y la otra con H/.ndlll) resultaron ser mejores en cuanto al tamaño promedio de inser(o (125 kb y 122.27 kb respectivamente), sj se cx)mparan con algunas de las bibliotecas construidas con el mismo vector (pCLD04541 ), como por ejemplo la de Goss)ip/.um h/.rsuíum, 120 kb (biblioteca-H/.ndlll, Dong eí a/., 1999); LoÍus /.apon/.cus, 94 kb (biblioteca-H/.ndlll, Men eí a/„ 2001) o Bras/.ca napus,105 kb (biblioteca-HÍ.nd]H, Wu eí a/_, 2000). Cuando se aisló la parte del gel en la región donde el tamaño de los fragmentos de ADN era muy alto (250400 kb o F2), el número de clonas recombinante se redujo drásticamente. En la construcción de bibliotecas como la de papa, trigo, arroz y papaya (Song eí a/., 2000; Lijavetzky eí a/.,1999; Tao eí a/., 2002; Mng eí a/., 2001) se encontró también un bajo número de recombinantes en la zona con fragmentos de ADN mayores que 250 kb. Se propuso que se puede deber a que los insertos ligados son muy grandes y no fue posible transformar eficientemente E. co/i', aún siguiendo el método de electroporación. Se ha visto también que hay un alto número de clonas sin inserto en estos casos. La región Fl del gel permite la construcción de bibliotecas con un tamaño promedio de inseno aceptable, que va de 100 kb a 250 kb. Sin embargo, la localización de esta región es variable, ya que con solo cambiar ligeramente la concentración del ADN también cambia su movilidad durante la electroforesis, de tal 81 forma que el marcador de tamaño de ADN no proporciona una indicación exacta del tamaño de los fragmentos (Vinazer eí a/.,1998). En el análisis de las clonas positivas digeridas con la enzima Wofl, es posible observar en el gel teñido con bromuro de etidio y expuesto a rayos UV, múltiples bandas que pueden reflejar verdaderos sitios Wofl dentro de los insertos (figura 26 A) o una digestión incompleta con la enzima. Para diagnosticar si se debe a una digestión incompleta es necesario comparar la intensidad de la o las bandas del inserto con respecto a las bandas del vector. Debido a que el rendimiento del ADN plasmídico aislado de diferentes clonas BIBAC es bastante comparativo, la intensidad de la fluorescencia en la banda del vector debe ser relativamente uniforme de una clona a otra. Si no son visibles las bandas del vector en la zona esperada y se observa una gran banda intensa, se debe asumir que la digestión fue incompleta; esta banda corresponderá al vector y al inseno unidos. Las clonas BIBAC pueden no producir bandas visibles en el gel que correspondan al inserto después de su digestión con Woíl, debido a que el inserto se fragmenta en tamaños pequeños por lo que se salen durante la corrida o porque son débilmente teñidos. Alternativamente pueden haber vectores sin insertos, los cuales fueron purificados de clonas que resultaron de una alteración en el sitio de clonación debido a contaminación con nucleasas, lo que usualmente ocasiona una deleción, y como consecuencia un desfasamiento del marco de lectura del gen reportero . En resumen, con las dos ligaciones obtenidas se pueden construir dos bibliotecas BIBAC del banano silvestre Calcutta 4; una sería construida con la ligación de BamHl y la otra con H/.ndlll, permitiendo ser ambas complementarias, de tal forma que se tenga una mejor representatividad y cobertura del genoma. Se tendrían que obtener 22 000 clonas de la ligación con tamaño promedio de inseno de 125 kb y 22 609 clonas de la ligación con tamaño promedio de inserto de 122.27 kb para tener una cobertura del genoma haploide de 10x. Estas serían las primeras bibliotecas construidas del banano silvestre Calcutta 4 con un vector binario con jnser(os listos para la transformación de plantas mediante A. Íumeraci'ens. REFElDong, J., Kohel, R J. Zhang, HB. And Yu, J. (1999). Bacterial artificial chromosome (BAC) libraries constructed from the genetic standard of upLand cottons. TMI BAC libraries. hftD://ars-aenome.comell`edu. (Fecha de consufta: dic/2002) Frijters, A. C., Zhang,11-8., van Dame, M., Wang, G-W., Ronald, P.C. and Michelmore, R W. (1997). Construction of a bacterial artificial chromosome containing large EcoRl and Hindlll genomti fragments of lettuce. Theoretical and Applied genetics, 94, pp. 390-399 Gindullis, F., Dechyeva, D. and Schmidt,T. (2001). 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Para optimizar la preparación del vector V41 se requirieron de dos pasos secuenciales de purificación con cloruro de cesio, en lugar de utilizar los métodos de purificación por columna que comúnmente son usados en la construcción de la mayoría de las bibliotecas BAC o BIBAC en plantas (Fritiers eí a/„ 1999; Mozo ef a/ , 1998; Wang eí a/.,1995 o Woo eí a/.,1994) o de combinar la purificación por columna con la purificación utilizando gradiente de cloruro de cesio (Luo ef a/., 2001, Woo ef a/.,1994; Fritjers eí a/.,1997) Siguiendo este procedimiento de doble purificación con cloruro de cesio se obtuvo un vector puro, que posteriormente fue linearizado (con BamHl o H/.ndlll) y desfosforilado para ser utilizado en el establecimiento de las condiciones óptimas de ligación para la construcción de la biblioteca de Calcutta 4. Junto con la preparación del vector, Ia cantidad y calidad de ADN genómico digerido parcialmente son los factores más críticos en la construcción de bibliotecas genómicas con insertos de gran tamaño (Fritjers ef a/ ,1997; Zhang et al 1995) Primeramente, el tratamiento que se le proporcione al material vegetal antes de la extracción de núcleos es muy importante, de esto depende en gran medida la obtención de ADN de alto peso molecular y de alta calidad. En el caso específico del banano se siguieron las recomendaciones reportadas en la literatura para otras especies. Se utilizaron plantas /.n v/.Íro provenientes de invernadero sometidas a un tratamiento de oscuridad total durante tres dias antes de la cosecha de las hojas jóvenes; esto último con la finalidad reducir el contenido de carbohidratos que interfieren durante la extracción de los núcleos (Men eí a/,, 2001, Vilarinhos eí a/., 2002). En el caso de plantas , como el banano que contienen altos niveles de polifenoles en sus hojas se ha recomendado adicionar componentes al amortiguador de extracción, como el PVP40, (Vinazer et al 1999) y/o ácido ascórbico (Kaufmann ef a/., 2003), que permitan atrapar los compuestos polifenólicos El método de obtención de ADN de alto peso molecular más frecuentemente utilizado es el de la extracción de núcleos reportado por Zhang y colaboradores (1995), debido a su versatilidad para el aislamiento de ADN de alto peso molecular de diferentes especies, a su sencillez, a su bajo costo y a su muy baja contaminación con ADN cloroplástico y mitocondrial. Es por estas razones que para el banano se decidió utilizar este método de extracción de núcleos, modificado con la adición de PVP40 al amortiguador de extracción para reducir la cantidad de polifenoles libres y obtener un ADN de alto peso molecular, fácil de digerir con las enzimas BamHl y H/'ndlll. De estas dos enzimas, la más comúnmente utilizada en la construcción de bibliotecas BAC o 81 BAC es Hi.ndl 11. 84 Se obtuvieron fragmentos en la zona del gel que contenía los fragmentos de ADN de 100 a 250 kb, de acuerdo a lo que se ha visto en el desarrollo de otras bibliotecas, esto es, que solo una zona del gel proporciona fragmentos de ADN con tamaño Óptimo de para ser clonados. Esta zona es detectada únicamente después de realizar las ligaciones de los fragmentos aislados de cada zona con el vector, y de transformar E. co// La ligación que proporcione el tamaño de insenos más elevada será la zona de fragmentos adecuada (Vinazer eí a/., 1998; Song eí a/., 2000; Fntjers eí a/.,1997; Lijavezky et al 1999; Mccubbin eí a/., 2000; Tao eí a/., 2002: Ming ef a/, 2001). Se observó también que a partir de la primera selección los fragmentos obtenidos y clonados al vector fueron muy pequeños; en el caso del experimento uno, la mayoría de éstos se agruparon en el rango de 9 a 100 kb. En el resto de los experimentos donde se realizó segunda selección de fragmentos, la mayoría se agrupó en el rango mayores que 100 kb Este dato confirma lo reportado en otras bibliotecas donde se recomienda realizar sjempre una segunda selección de los fragmentos de ADN para eliminar todos los fragmentos pequeños que queden atrapados con los fragmentos grandes durante la primera selección (Vinazer eí a/., 1998; Zhang eí a/.,1996; Woo ef a/.,1994). Las ligaciones en donde se aplicó una razón molar inseno:vector 1:2 y se utilizó 1.5 L.l para la transformación resultaron ser mejores en cuanto al tamaño promedio de inserto, esto es 125 kb con BamHl y 122.27 kb con H/.ndlll, respecto a otras bibliotecas de otras especies donde se ha utilizado el vector pCLD04541, como ejemplos tenemos, las bibliotecas de Goss}ip/.um h/`ffiuníum,120 kb (biblioteca-H/.ndlll, Dong eí a/., 1999), L. /.apon/'cus, 94 kb (biblioteca-H/'ndlll, Men eí a/., 2001) o napus,105 kb (biblioteca-H/'nc/lll, Wu eí a/„ 2000). 8. Se ha visto que el rastreo o el escrutinio con una misma sonda, en dos bibliotecas de la misma especie pero construidas con diferentes enzimas de restricción, rara vez identifica el mismo número de clonas. Como ejemplo se pueden mencionar los estudio realizados en las bibliotecas de lechuga (Fritjers ef a/ , 1997) y betabel (Gindullis ef a/., 2001). Estas variaciones se pueden deber a diferentes factores que incluyen: la heterogeneidad en las secuencias, las diferencias en los contenidos de GC de los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción (BamHl, H/`ndlll o EcoRl), su distribución no al azar y el muestreo de los fragmentos de ADN durante la clonación Es por esta razón que se decidió utilizar dos enzimas de restricción diferentes para cortar el ADN genómico de Calcutta 4. Las siguientes bibliotecas son algunos ejemplos en donde se han utilizado más de una enzima de restricción para la construcción de bibliotecas complementarias: melón (Luo eí a/., 2001), arroz (Tao eí a/., 2002), maíz (Yim eí a/., 2002), soya (Meksem eí a/ , 2000) y Arab/.c/ops/'s (Mozo ef a/.,1999). Debido a los diferentes objetivos en la investigación de genomas compleios, se hace necesario tener bibliotecas, con insertos grandes, preparadas para la trasformación directa a plantas, ya que esto permitirá perfeccionar la clonación basada en el mapeo, el análisis funcional de las secuencias genómicas, la ingeniería del gen, 85 agrupados de genes, QTLs (Quantitative Trait Loci) y en el mejoramiento molecular de plantas (Tao ef a/., 2002). Con este trabajo se estableció por primera vez el protocolo para la construcción de dos bibliotecas del banano silvestre Calcutta 4, una biblioteca-BamHl y otra biblioteca-Híndlll utilizando el vector pCLD04541, con tamaños promedios de inserto adecuados, comparado a otras bibliotecas construidas con el mismo vector Para construir las bibliotecas físicamente, a partir de la transformación de E. co//' con la reacción de ligación, se tendrían que obtener 22 000 clonas con un tamaño promedio de inserto de 125 kb y 22 609 clonas con un tamaño promedio de inserto de 122 27 kb, para tener una cobertura del genoma haploide de 10x Estas serán las primeras bibliotecas construidas del banano silvestre Calcutta 4 en un vector binario, que estarán listas para la transformación de plantas mediado por A. íumeíac/.ens. REFERENCIAS Dong, J., Kohel, R. J. Zhang, H-B. And Yu, J.(1999). Bacterial ahificial chromosome (BAC) libraries constructed from the genetic standard of upland coftons. 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Este ADN fue de buena calidad y adecuado para ser digerido parcialmente por enzimas de restricción como la BamHl o la H/.ndHI. o Se estableció el protocolo para la obtención de fragmentos de ADN genómico, en promedio mayores que 100 kb, siendo las ligaciones con una relación molar inserto:vector de 1 :2, adecuadas para la construcción de bibliotecas binarias en el banano Calcu«a 4. 89 PERSPECTIVAS Los resultados presentados en este trabaio son la base y el primer paso dentro del proceso que involucra la construcción de la biblioteca BIBAC de Calcufta 4 Para construir y caracterizar cada biblioteca faltan realizar los siguientes puntos: • • Realizar todas las transformaciones necesarias para tener el numero de clonas que abarquen 10x el genoma haploide de Calcutta 4, tanto para la ligación de los fragmentos procedentes de BamHl como con los de H/.ndlll. Realizar una copia maestra de cada biblioteca y varias copias para trabajar en la preparación de membranas de Nylon de alta densidad de cada una de las bibliotecas construidas. Se hará el escrutinio de las membranas de cada biblioteca con sondas de cloroplasto y mitocondria, con la finalidad de determinar la calidad de la misma en cuanto a contaminación con ADN mitocondrial o cloroplástico; también se evaluará la presencia de algún gen de bajo número de copia para determinar la representatividad de la biblioteca. • A mediano plazo, se podrían utilizar genes de resistencia análogos para rastrear su presencia y localizar las clonas dentro de la biblioteca que posean estos genes, y confirmar la función de protección contra alguna(s) de esa(s) enfermedad(es). Otras aplicaciones: • Estudios básicos para la evaluación de la estabilidad del genoma receptor del megalocus, la expresión de los transgenes en las plantas transgénicas, el efeéto sobre ei fenotipio, etc. Evaiuando ia transformación de banano y también de otras especies vegetales. Transformación con fragmentos que contengan familias génicas, grupos de genes involucrados en una misma vía metabólica, etc. 90 ANEXO AMORTIGUADOR DE HOMOGENIZACIÓ" (HB) 10X (1 litro Reactivo Cantidad Trisma base 12-19 0.1M Cloruro de potasio 59.6 9 0.8M EDTA 37.2 9 0.1M Espermidjna-HCI 2.55 9 10mM Espermina-HCI 3.48 9 10mM Agua bidestilada para 1 litro Concentración final Ajustar a un pH de 9.4-9.5 con NaoH. Almacenar a 4 °C. AMORTIGUADOR DE HOMOGENIZACIÓN (HB) 1X íl litro Reactivo Cantidad HB 10 X 100 ml lx Sacarosa 171.15 9 0.5M Agua bidestilada para 1 litro Almacenara Concentración final 4°C. Antes de usarlo añadir P-mercaptoetanol 1.5 ml 0.15 % 20 % DE TRITON X-100 EN AMORTIGUADOR HB I X Í100 ml HB 10 X 10ml Sacarosa 171.15 9 Triton X-100 20ml Agua bidestilada para 100 ml 91 Almacenar a 4 °C AMORTIGUADOR DE LAVADO (HB I X MAS 0 5 % de TRITON X-100),1 litro. Concentración final Reactivo Cantidad HB 10 X 100 ml lx Sacarosa 171.15 9 0.5M Triton X-100 (Stock de 20 % 0.5% en HB I X) Agua bidestilada Almacenara 4°c. Antes de usarlo añadir P-mercaptoetanol 0.15 % 15ml AMORTIGUADOR DE LISIS (1 L) EDTA 500 ml del stock 1 M Na lauril sarcosina 500 ml del stock 2 % 0.5 M (pH 9.0-9.3) 1% Antes de usarla se añade 0.2 mg/ml Prote'r" K Medk) SOB (1 L\ Bacto triptona 2% 209 Bacto extracto de levadura 59 0_5% NacI 10 ml del stock 1 M 10mM KCI 2.5 ml del stock 1 M 2.5 mM Agua bkffilada para 980 ml Aiustar el pH a 7 y esterilrir. MEDIO SOC (1 L) Al medio SOB estéril se le añade los siguientes componentes: 92 Mgs04/Mgc12a Glucosab 10 ml del stock 2M lo ml del stock 2M 20 mM 20 mM a. esterilizar por filtración 2 M de Mg++ (1 M Mgc12-H20 + 1 M Mgs04-7H20) b: esterilizar por filtraci.Ón un stock de 2 M de glucosa. 4MORTIGUADORDECARGA10XÍ500mL} Reactivo Cantidad G'icerol 350 ml TBE 5 X 25m1 EDTA 0 5 M (pH 8) 20m' 20 % SDS Concentración final 35% 0.25 X 20mM 5ml O . 2 0/o 10 mg/ml de azul de bromofenol Agua bidestilada TE I X (1L| Reactivo Cantidad Tris-HCI 10 ml de un stock 1 M Concentración final EDTA 2 ml de un stock 0.5 M Agua bidestilada cbp 1 L Estermzarlo. 93 10mM 1.0 mM •D .T' `NVLVJm HG vL)idiLNmo NQDVDlisHANI Ha ouNHL) ÁOIO =1=