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TECO DIAGNOSTICS
ALANINA AMINOTRANSFERASA
(ALT) TGP MÉTODO CINÉTICO
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(TGP) ALT-ALANINA AMINOTRANSFERASA
Método cinético.
Para la determinación cuantitativa de Alanina Aminotransferasa en suero
humano.
INTRODUCCIÓN.
La enzima Alanina Aminotransferasa esta ampliamente reportada en una
variedad de tejidos. La mayor fuente de ALT es de origen hepático y ha llevado
a la aplicación de la determinación de ALT para el estudio de enfermedades
hepáticas. Los niveles elevados en suero se encuentran en hepatitis, cirrosis e
ictericia obstructiva. Los niveles de ALT se elevan ligeramente en pacientes que
han sufrido infarto al miocardio1.
Los métodos UV para la determinación de ALT fueron desarrollados por
Wroblewski y LaDue en 19562. El método se basaba en la oxidación de NADH
por Lactato Deshidrogenasa (LDH). En 1980, la Federación Internacional de
Química Clínica recomendó un método de referencia para la medición de ALT
basado en el procedimiento de Wroblewski y La Due3. El reactivo de ALT va de
acuerdo a la formula recomendada por la IFCC.
PRINCIPIO
La secuencia de la reacción enzimática es la siguiente:
INTERFERENCIAS
El piridoxal fosfato puede elevar los niveles de ALT activando la forma
apoenzimática de la transaminasa5. El piridoxal fosfato se puede encontrar en
agua contaminada con crecimiento microbiano.
Los niveles elevados de piruvato pueden también interferir con el desempeño de
la prueba. Young et.al. ha publicado una lista de drogas y otras sustancias que
hacen interferencia con la determinación de ALT 6.
MATERIALES REQUERIDOS PERO NO PROPORCIONADOS
1.- Instrumentos de pipeteo precisos.
2.- Tubos de ensayo/gradilla.
3.- Reloj.
4.- Espectrofotómetro 340 nm (UV)
5.- Cubeta térmica (37°C)
INSTRUCCIONES GENERALES
El reactivo para ALT se diseñó para uso como un procedimiento automatizado
en instrumento de química, o como un procedimiento manual en un
espectrofotómetro adecuado.
PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO
Vea instrucciones en la aplicación específica del instrumento.
L-Alanina + α-Cetoglutarato ALT Piruvato + L-Glutamato
Piruvato + NADH + H+ LDH
Lactato + NAD+ + H2O
El piruvato que se forma en la primera reacción se reduce a lactato en presencia
de lactato deshidrogenasa y NADH. La actividad de ALT se determina midiendo
la oxidación de NADH a 340 nm. El piruvato endógeno de la muestra se
convierte en lactato por la acción de LDH durante la fase de reposo antes de la
medición.
COMPOSICION DEL REACTIVO
Cuando se reconstituye como se indica, el reactivo ALT contiene lo siguiente:
(La concentración se refiere al ALT reconstituido):
α- Cetoglutarato 13 mM, L-Alanina 400 mM, NADH 0.2 mM, LDH 800 U/L,
Buffer 100 mM, pH 7.5, preservativos y estabilizadores no reactivos.
PRECAUCIONES.
1.- Para diagnostico in Vitro solamente.
PRECAUCION: Los reactivos para diagnostico in Vitro deben considerarse
peligrosos. Manéjense de acuerdo a las buenas prácticas de laboratorio las cuales
indican evitar la ingestión, y el contacto con ojos y piel.
2.- Los especimenes se deben considerar infecciosos y se deben tratar con
cuidado.
3.- Use agua destilada o desionizada donde se indique.
ALMACEN Y ESTABILIDAD DEL REACTIVO
1.- El reactivo seco se debe almacenar de 2-8°C antes de reconstituirse.
2.- Después de la reconstitución, el reactivo es estable por 30 días en
refrigeración 2-8°C y por 24 horas a temperatura ambiente.
DETERIORO DEL REACTIVO.
No se use si:
1.- Se ve turbio. La turbidez puede ser un signo de contaminación.
2.- Ha penetrado humedad al frasco y se ha endurecido.
3.- El reactivo no iguala la linearidad indicada o no registra los valores
control dentro del rango establecido.
4.- El reactivo reconstituido tiene una absorción menor a 0.8 a 340 nm.
COLECTA Y ALMACENAJE DE LA MUESTRA.
La prueba esta diseñada para determinación en suero. Los reportes indican que la
ALT permanece estable en suero de 4 - 8 °C por un mínimo de siete (7) días4.
Los especimenes hemolizados no se deben usar ya que los eritrocitos contienen 7
veces la actividad de ALT en suero.
PROCEDIMIENTO MANUAL.
1.- Reconstituya los reactivos de acuerdo a las instrucciones.
2.- Lleve a cero el espectrofotómetro a 340 nm con agua destilada.
3.- Pipetee 1.0 ml de reactivo en los tubos y permita que se equilibren a 37°C.
Si el espectrofotómetro que se esta utilizando requiere un volumen mayor de 1.0
ml, consulte el PROCEDIMIENTO ALTERNO.
4.- Agregue 0.10 ml (100 µL) de muestra (estándar o suero) a un tubo a la vez.
Mezcle suavemente.
5.- Mantenga la solución a 37°C. Después de 60 segundos lea la absorbancia a
340 nm.
6.- Tome dos lecturas más a intervalos de 1 minuto. Determine el cambio de
ΔAbs/min.
7.- Multiplique ΔAbs/min por -1768 para calcular IU/L de la Actividad de ALT.
8.- Las muestras con valores superiores a 500 IU/L se deben diluir 1:1 con
salina, evalúe de nuevo y multiplique el resultado por dos (2).
Nota:
Si el espectrofotómetro que se esta usando esta equipado con cubeta térmica, la
mezcla de reacción se puede dejar en la cubeta mientras se toman las lecturas
de absorbancia.
NOTAS DEL PROCEDIMIENTO MANUAL:
Las muestras turbias o ictéricas pueden dar lecturas en que la absorbancia inicial
exceda la capacidad del espectrofotómetro. Se pueden obtener resultados mas
exactos usando 0.05 ml (50µL) de muestra y multiplicando el resultado por dos
(2).
CALCULOS:
Una unidad Internacional (IU) se define como la cantidad de enzima que cataliza
la transformación de un micromol de sustrato por minuto en condiciones
especificas.
ALT (IU/l)= ΔAbs/min x 1.10 x 1000= ΔAbs/min x -1768
6.22 x 0.1 x 1.0
ΔAbs/min = Promedio del cambio de Absorción por minuto
1.10=Volumen total de la reacción (ml)
1000= Conversión de UI/ml a IU/L.
6.22 = Absorción milimolar del NADH.
0.1 = Volumen de muestra en ml.
1.0 = Trayecto de la luz en cm.
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ALANINA AMINOTRANSFERASA
(ALT) TGP MÉTODO CINÉTICO
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UNIDADES SI
Para resultados en Unidades SI (nkat/L) multiplique IU/L x 16.67
Nota: Si cualquiera de los parámetros se altera, se debe calcular un nuevo
factor usando la formula anterior.
PROCEDIMIENTO ALTERNO
1.- Reconstituya los reactivos de acuerdo a las instrucciones.
2.- Pipetee 2.8 ml de reactivo en los tubos y permita que se equilibren a 37°C.
3.- Agregue 0.2 ml (200 µL) de muestra (estándar o suero) a un tubo a la vez.
Mezcle suavemente.
4.- Mantenga la solución a 37°C. Después de 60 segundos lea la absorbancia a
340 nm (A1)
5.- Después de tres (3) minutos exactamente, lea y registre la absorbancia (A2)
6.- La diferencia en absorbancia entre lecturas (A1-A2) se multiplica por el
factor 803.
CALCULOS ALTERNOS.
REFERENCIAS.
1. Henry, J.B.: Clinical Diagnosis and Management by
Laboratory Methods, W.B. Saunders and Co., Philadelphia,
PA.p 332-335 (1974).
2. Wroblewski, F. and LaDue, J.S.: Proc. Soc. Exper. Biol. and
Med.91: 569 (1956).
3. International Federation of Clinical Chemistry, J. Clin.
Chem.Clin.Bio.18:5231(1980).
4. Henry, R.J.: Clin. Chem. Principles and Techniques 2nd Ed.,
Harper and Row,New York.p.822 (1974).
5. Rej, R., et al.: Clin. Chem. 19:92 (1973).
6. Young, D.S., et al.: Clin. Chem. 21:5 (1975).
7. Henry, R.J., et al.: Amer. J. Clin. Path. 34:381 (1960).
8. Tietz, N.W.: Fundamentals of Clinical Chemistry.
W.B. Saunder Co., Philadelphia, PA p. 682 (1976).
A525: 10/01
Fabricado por:
ALT (IU/L)= (A1-A2) X 3.0 X 1000= (A1-A2) X 803
3 X 1 X 6.22 X 0.2
(A1 – A2)= Cambio de absorbancia
NOTA: Si alguno de los parámetros anteriores están alterados, se debe calcular
un factor nuevo con el uso de la formula.
LIMITANTES DEL PROCEDIMIENTO
El reactivo es linear hasta los 500 IU/L. Las muestras con valores superiores a
500 IU/L se deben diluir 1:1 con salina, evaluarse de nuevo y multiplicar el
resultado por dos (2).
CONTROL DE CALIDAD.
Se recomienda que se incluyan controles en cada grupo de pruebas. Se pueden
usar controles comerciales con valores establecidos para ALT. El valor
asignado del material de control se debe confirmar con la aplicación
seleccionada. Si no se pueden obtener los resultados dentro del rango apropiado
de valores, es indicio de deterioro de reactivo, descompostura de instrumentos o
errores del procedimiento.
CORRECCION DE TEMPERATURA7.
1.- Si la prueba se realiza a 37°C pero se reporta a 30°C, multiplique el resultado
por 0.7.
2.- Si es lo inverso, multiplique el resultado por 1.43.
VALORES ESPERADOS8.
Hasta 26 IU/L a 30°C.
Hasta 38 IU/L a 37°C.
Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango normal.
CARACTERISTICAS DE DESARROLLO.
1.- Linearidad: 500 IU/L.
2.- Comparación: Un estudio realizado utilizando otro procedimiento enzimático
dio una correlación de 0.99 con una ecuación de regresión de Y= 0.98 x + 1.32
Precisión:
Dentro de pruebas
Media (IU/L)
23.6
82.6
Entre pruebas
Media (IU/L)
23.4
82.4
D.E.
1.8
2.1
% C.V.
7.9
2.5
D.E.
1.9
1.9
% C.V.
8.0
2.3
Distribuido por:
Grupo Tecnología y Laboratorios S.A de C.V.
T. (81) 8370 7992
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