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UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA UNIDAD ACADÉMICA DE INGENIERÍA QUÍMICA, INDUSTRIAL, ALIMENTOS, BIOMOLECULAR, BIOCOMBUSTIBLES Y BIOFARMACIA FACULTAD DE BIOFARMACIA “Técnicas Básicas de la Biología Molecular”. Monografía previa a la obtención del título de Químico Farmacéuta. INVESTIGADOR: MARCELA PATRICIA VALVERDE PERALTA DIRECTOR: ING. RENÉ SARMIENTO CUENCA - ECUADOR 2010 Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. DEDICATORIA: El presente trabajo dedico con sincero cariño y humildad a Dios por haberme dado la vida y haberme permitido culminar mis estudios lo que he conseguido con esfuerzo y abnegación; esfuerzo que también ha costado a mis padres por lo que este trabajo también dedico de todo corazón a Tarquino y Nancy pilar fundamental en mi vida y de manera muy especial a mi hija Daniela Xiomara que es el centro de mi vida y la razón para seguir luchando con más ahincó. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular II Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. AGRADECIMIENTO “Mi reconocimiento y gratitud:” A Dios por haberme dado la fuerza y perseverancia para culminar este trabajo. A la “Universidad Católica de Cuenca”, UNIDAD ACADÉMICA DE INGENIERÍA QUÍMICA, INDUSTRIAL, ALIMENTOS, BIOMOLECULAR, BIOCOMBUSTIBLESY BIOFARMACIA, Facultad de Biofarmacia, en la persona de su decano Ing. Santiago Gómez y a sus maestros; por haberme abierto las puertas de este prestigioso Centro Educativo y así posibilitar mi profesionalismo como Químico Farmaceuta. A mi Director de monografía, Ing. René Sarmiento por su acertada dirección, que supo proporcionarme para la culminación exitosa de esta investigación. A mis padres que de una y otra forma me apoyaron y confiaron en mí en el transcurso de mis estudios para culminar el sueño de mi profesión. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular III Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. JUSTIFICACIÓN El tema planteado es de gran relevancia pues hoy en día hay un gran desconocimiento acerca de las técnicas básicas de la Biología Molecular, pudiendo ser de gran utilidad en la medicina moderna, el conocimiento de esta tecnología es necesario ya que es la base de la investigación, diagnóstico, pronóstico y tratamiento de muchas enfermedades, siendo uno de los temas que actualmente está tomando la punta ya que tiene mucha relevancia, tanto en el campo científico, humano y contemporáneo. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular IV Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. ÍNDICE DE CONTENIDOS PRELIMINARES_______________________________________PÁGINAS CARÁTULA……………………….…………………………………………………………………….……………………I DEDICATORIA………..…..…………………………………………………………………….………….................II AGRADECIMIENTO……………………………………..…………………………………………………………….III ÍNDICE……………………………………………………………………………………………………………………...IV INTRODUCCIÓN…………..…………………………………………………………………………………………VIII OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………………………….…..X CAPÍTULO ‘I’.......................................................... .¡Error! Marcador no definido. CONCEPTOS BÁSICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR¡Error! definido. Marcador no 1.1. HISTORIA Y ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR.¡Error! Marcador no definido. 1.1.1. LOS PRIMEROS PASOS...................... ¡Error! Marcador no definido. 1.1.2. ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR¡Error! definido. Marcador no 1.2. DISCIPLINAS QUE FORMAN PARTE DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR. ¡Error! Marcador no definido. 1.3. INFORMACIÓN GENÉTICA Y EL GENOMA. ¡Error! Marcador no definido. 1.3.1. EL GENOMA ....................................... ¡Error! Marcador no definido. 1.3.2. MATERIAL GENÉTICO ..................... ¡Error! Marcador no definido. 1.3.3. CROMATINA Y LOS CROMOSOMAS ¡Error! Marcador no definido. 1.3.4. LOS GENES ........................................ ¡Error! Marcador no definido. 1.4. TIPOS Y COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS.¡Error! Marcador no definido. 1.4.1. ÁCIDO NUCLÉICO ............................. ¡Error! Marcador no definido. 1.4.2. NUCLEÓSIDOS Y NUCLEÓTIDOS ... ¡Error! Marcador no definido. 1.4.3. LOS DINUCLEOTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS¡Error! no definido. Marcador 1.5. FUNCIONES Y ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS. ................ ¡Error! Marcador no definido. 1.5.1.ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO …………………………………..¡Error! Marcador no definido. O ADN 1.5.2. ÁCIDO RIBONUCLEICO O ARN ....... ¡Error! Marcador no definido. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular V Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 1.6. DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR¡Error! definido. Marcador no 1.6.1. LA TRANSCRIPCIÓN ......................... ¡Error! Marcador no definido. 1.6.2. LA TRADUCCIÓN Y EL CÓDIGO GENÉTICO¡Error! Marcador no definido. 1.7. ENZIMAS Y VECTORES USADOS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR........ ¡Error! Marcador no definido. 1.7.1. CONCEPTO DE ENZIMA ................... ¡Error! Marcador no definido. 1.7.2. USOS DE LAS ENZIMAS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR ........ ¡Error! Marcador no definido. 1.7.3. CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE ENZIMAS ................. ¡Error! Marcador no definido. 1.7.4. ACOMPAÑANTES NO PROTEICOS DE LAS ENZIMAS .............. ¡Error! Marcador no definido. CAPÍTULO II ........................................................... ¡Error! Marcador no definido. OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO . ¡Error! Marcador no definido. 2.1. ETAPAS DE LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO ...... ¡Error! Marcador no definido. 2.1.1. PRINCIPIOS DE LAS TÉCNICAS CON ÁCIDOS NUCLEICOS ..... ¡Error! Marcador no definido. 2.1.2. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO¡Error! Marcador no definido. 2.2. CLONADO DEL GEN. ...................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.2.1. PRINCIPIOS DE CLONACIÓN MOLECULAR¡Error! Marcador no definido. 2.2.2. PASOS A SEGUIR PARA UNA CLONACIÓN MOLECULAR ....... ¡Error! Marcador no definido. 2.3. ELECTROFORESIS.......................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.3.1. FUNDAMENTO DE LA ELECTOFORESIS¡Error! definido. 2.4. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN DEL ADN¡Error! definido. Marcador Marcador no no 2.4.1. EXTRACCIÓN DE ADN ..................... ¡Error! Marcador no definido. 2.4.2. ALMACENAMIENTO DEL ADN ...... ¡Error! Marcador no definido. 2.4.3. CONSERVACIÓN DEL ADN EN TEJIDO FRESCO¡Error! no definido. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Marcador Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular VI Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 2.5. NORMAS EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR. ............ ¡Error! Marcador no definido. 2.5.1.POSIBLES CONTAMINACIONES EN EL LABORATORIO DE .................. BIOLOGIA MOLECULAR ................... ¡Error! Marcador no definido. 2.5.2.ORGANIZACIÓN ESPACIAL DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA ......... MOLECULAR ....................................... ¡Error! Marcador no definido. 2.5.3. OBTENCIÓN DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS . ..... ¡Error! Marcador no definido. CAPÍTULO III ......................................................... ¡Error! Marcador no definido. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN........................ ¡Error! Marcador no definido. 3.1. PASOS PREVIOS A LA HIBRIDACIÓN ........... ¡Error! Marcador no definido. 3.2. MÉTODOS HIBRIDACIÓN DE LABORATORIO¡Error! definido. Marcador no 3.2.1. EL MÉTODO DE HIBRIDACIÓN SOUTHERN ¡Error! Marcador no definido. 3.2.2. NORTHERN O NORTHERN BLOT .. ¡Error! Marcador no definido. 3.2.3. WESTERN BLOT ............................... ¡Error! Marcador no definido. 3.2.4. DOT BLOT Y SLOT BLOT .................. ¡Error! Marcador no definido. 3.2.5. HIBRIDACIÓN IN SITU (HIS) .......... ¡Error! Marcador no definido. 3.2.6. CHIP DE ADN .................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.2.7. SONDAS DE PNA (PEPTIDE NUCLEIC ACID)¡Error! Marcador no definido. 3.2.8. HIBRIDACIÓN DE COLONIAS BACTERIANAS¡Error! Marcador no definido. 3.2.9. MAPAS DE RESTRICCIÓN ............... ¡Error! Marcador no definido. 3.2.10. HIBRIDACIÓN DE ADN O RAMIFICADO (BRANCHED DNA) ¡Error! Marcador no definido. 2.3.11. cDNA MICROARRAY ....................... ¡Error! Marcador no definido. 3.3. PASOS DE LA HIBRIDACIÓN ........................ ¡Error! Marcador no definido. 3.3.1. FUNDAMENTO DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS .. ¡Error! Marcador no definido. 3.4. APLICACIONES DE LA HIBRIDACIÓN ......... ¡Error! Marcador no definido. 3.4.1. INGENIERÍA GENÉTICA .................. ¡Error! Marcador no definido. 3.4.2. MEDICINA FORENSE ....................... ¡Error! Marcador no definido. 3.4.3. BIOINFORMÁTICA ........................... ¡Error! Marcador no definido. 3.4.4. NANOTECNOLOGÍA DE ADN .......... ¡Error! Marcador no definido. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular VII Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 3.4.5. HISTORIA Y ANTROPOLOGÍA......... ¡Error! Marcador no definido. CAPÍTULO IV .......................................................... ¡Error! Marcador no definido. TÉCNICA DIRECTA DE LA AMPLIACIÓN DEL ADN MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)¡Error! Marcador no definido. 4.1. FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. ¡Error! Marcador no definido. 4.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA REALIZAR LA PCR.¡Error! Marcador no definido. 4.3. CICLOS DURANTE LA PCR. ........................... ¡Error! Marcador no definido. 4.4. APLICACIONES. .............................................. ¡Error! Marcador no definido. 4.4.1. INVESTIGACIÓN ............................... ¡Error! Marcador no definido. 4.4.2. MEDICINA ........................................ ¡Error! Marcador no definido. CAPÍTULO V ........................................................... ¡Error! Marcador no definido. TÉCNICA DIRECTA DE LA SECUENCIACIÓN¡Error! definido. Marcador no 5.1. FUNDAMENTO DE LA SECUENCIACIÓN. .... ¡Error! Marcador no definido. 5.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA LA SECUENCIACIÓN. ................. ¡Error! Marcador no definido. 5.3. CONDICIONES UTILIZADAS DURANTE LA SECUENCIACIÓN. ............ ¡Error! Marcador no definido. 5.4. SECUENCIADORES DE ADN. ........................ ¡Error! Marcador no definido. 5.5. APLICACIONES. .............................................. ¡Error! Marcador no definido. CAPÍTULO VI .......................................................... ¡Error! Marcador no definido. CONCLUCIONES Y BIBLIOGRAFÍA .............. ¡Error! Marcador no definido. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular VIII Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. INTRODUCCIÓN El tema planteado pretende dar a conocer las técnicas básicas usadas en Biología Molecular que se utilizan en la investigación biomédica. Además, es sumamente importante que todos los profesionales de la salud conozcan el porqué, para que y la importancia que tienen estas técnicas, herramienta primordial para el área médica, por tanto, es indispensable y necesario, que en la actualidad los químicos farmacéuticos, licenciados y tecnólogos, conozcan los alcances tecnológicos para ayudar a la población con una alternativa de vida al paciente. La Biología Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares, que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en los nuevos individuos. Este conocimiento ha permitido cruzar barreras naturales entre especies y colocar genes de cualquier organismo, en un organismo hospedador no relacionado mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética. Una de las consecuencias importantes derivadas, fue la producción de fragmentos de ácidos nucleicos a gran escala, abriendo las puertas a la secuenciación de los ácidos nucleicos, y por ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia génica o la obtención de organismos superiores recombinantes. El surgimiento y consolidación de la ciencia experimental constituye, sin lugar a dudas, uno de los grandes logros de la humanidad al convertirse en poderosas herramientas para modificar la realidad natural. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular IX Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Estos hechos son reflejados en las siguientes palabras del científico y divulgador de las ciencias Bertrand Russell (1872-1970): “Ciento cincuenta años de ciencia han resultado más explosivos que cinco mil años de cultura precientífica.” Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular X Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos,Biomolecular, Biocombustiblesy Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL: El objetivo general es fortalecer los conocimientos obtenidos en el seminario de graduación los cuales me permiten analizar y demostrar la importancia de las ¨Técnicas básicas de la Biología Molecular¨ y sus aplicaciones mediante la recopilación bibliográfica y científica, con el fin de obtener el título de Químico Farmaceuta otorgado por la Universidad Católica De Cuenca al culminar el cuarto año de la carrera. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Conocer el origen de la biología molecular, y las Disciplinas científicas que forman parte de la misma. Definir e identificar las Etapas en la obtención de un organismo transgénico. Diferenciar los Métodos de Hibridación en un laboratorio de biología molecular. Aprender a diferenciar correctamente los Ciclos que se dan durante la PCR. Profundizar los conocimientos sobre la Técnica directa de la secuenciación y la utilidad que nos brinda. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular XI Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. CAPÍTULO ‘I’ CONCEPTOS BÁSICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular -1- Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 1.1. HISTORIA Y ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR. 1.1.1. LOS PRIMEROS PASOS Desde hace muchísimos años, tantos que no podría precisarse el momento exacto, el hombre busca descubrir un orden para el Universo y ubicarse a sí mismo dentro de ese orden. Es la búsqueda de un lugar en esa vastedad la que originó fábulas, mitos y leyendas que asignaban a uno o varios dioses la creación y el mantenimiento de todo lo existente. Es esa misma búsqueda, casi desesperada, la que animó a muchos hombres a cuestionar estas explicaciones y encontrar otras, que no delegaran el poder de la existencia, en definitiva, de la vida y la muerte, en fuerzas sobrenaturales o seres mitológicos. La Biología aparece en Grecia antigua nos da cuenta de ese esfuerzo por encontrar, desde el que hacer filosófico, las respuestas a viejas y nuevas preguntas.1 La historia de la Biología tradicionalmente ha sido dividida en tres etapas de desarrollo, cada una de estas se caracteriza por una serie de descubrimientos y propuestas, un desarrollo tecnológico y una forma de organizar el pensamiento; estas etapas son: antigua, moderna y molecular.2 1.1.1.1. BIOLOGÍA ANTIGUA La Biología como un conjunto de conocimientos organizados se inicia hacia el año 500 A.C. en Grecia; muchos de los resultados obtenidos en esta época se fundamentaban en la observación y en el pensamiento lógico, el método científico como herramienta para la investigación aun no se conocía. Hacia el año 500 antes de nuestra era, surgen los Filósofos naturalistas, establecieron que el comportamiento de la naturaleza no dependía del estado de ánimo de un o varios dioses; consideraban que los fenómenos naturales podían ser comprendidos por el hombre si los observaba cuidadosamente, esta observación sistemática permitiría, además, predecir la ocurrencia de dichos fenómenos. El Filósofo naturalista más destacados fue Aristóteles (384-322 A.C.) quien estableció el primer método de investigación y aportó las primeras ideas sobre el origen de la vida o “teoría de la generación espontánea”. 1 2 http://www.alipso.com/monografias/origenes_biologia_celymolec/ http://www.elergonomista.com/biologia/historia.htm Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular -2- Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Algunos otros investigadores de la época se interesaron por la anatomía y la fisiología, entre ellos podemos mencionar a: Galeno (130 - 200 años D.C.). Considerado el primer anatomista griego y aún cuando en su época no se permitían las disecciones humanas, describió nuestra anatomía. Andreas Vesalius (1514–1565). Médico originario de Bruselas, Bélgica, practicó disecciones humanas y describió de una mejor manera la anatomía humana. Sus resultados se encuentran en un libro llamado “Corpori Humani Fabrica”. Hieronimus Fabricius (1537 – 1619). Contribuyó a explicar la circulación sanguínea, al demostrar que las venas presentan una serie de “puertas” o “válvulas” que impiden que la sangre se regrese por un mismo vaso. William Harvey (1578 – 1657). Médico y científico inglés, descubrió que el corazón era el encargado de bombear la sangre y además, descubrió el sentido de la circulación sanguínea. Para concluir con este período de poco más de 2000 años, podemos decir que durante la etapa de Biología antigua surgieron las primeras ideas sobre el origen de la vida, se empieza a describir la anatomía y fisiología humana, así mismo, surgen la botánica, la zoología y la taxonomía. 1.1.1.2. BIOLOGÍA MODERNA Esta etapa se inicia a mediados del siglo XVII y se extiende hasta poco antes del año 1920. Uno de los inventos más importantes de esta época, es sin lugar a dudas el microscopio, ya que con su ayuda se empezaron a observar estructuras biológicas que a simple vista no era posible hacerlo. La historia no establece claramente quien inventó el microscopio; algunos historiadores piensan que Giovanni Farber lo inventó en 1550; otros opinan que le corresponde a Zaccharias Jannsen en 1590. Entre los primeros microscopistas destacados podemos citar a los siguientes: Marcello Malpighi (1628 – 1694) Jan Swammerdam (1637 – 1680) Anton van Leeuwenhoek (1632 – 1723) Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular -3- Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Dentro de esta época, destacan algunos investigadores que establecieron la importancia de la célula en la estructura de los organismos, entre ellos: Robert Hooke (1635 – 1703), fue el primero en utilizar la palabra “célula”. Marie Francois Bichat (1771 – 1802), establece que los órganos estaban formados por subunidades a las que llamó tejidos; también estableció que dentro de los tejidos existía un nivel más bajo de organización (células). Robert Brown en 1831 estableció que todos los tipos de célula tienen núcleo. Theodor Schwann y Mathias Schleiden en 1838, biólogos alemanes establecieron que la célula era la unidad anatómica y estructural de los seres vivos. Estos son dos de los postulados de la Teoría Celular. Rudolf Virchow, en 1858 propone el tercer postulado de la teoría celular al puntualizar que la célula es la unidad de origen. Otros investigadores, destacan al explicar la historia evolutiva de las especies, el origen de la vida y los mecanismos de la herencia; entre ellos: Charles Darwin (1809 – 1882), autor del libro “El Origen de las Especies” en él expuso sus ideas sobre la evolución de las especies por medio de la selección natural. Esta teoría originó, junto con la teoría celular y la de la herencia biológica, la integración de la base científica de la biología actual. Luis Pasteur (1822–1895), demostró la falsedad de la hipótesis de la generación espontánea al comprobar que un ser vivo procede de otro. Asentó las bases de la bacteriología, investigó acerca del cólera de las gallinas y desarrolló la vacuna del ántrax para el ganado y la vacuna antirrábica. Gregor Johann Mendel (1822–1884), estudió la herencia biológica, de padres a hijos, con lo que asentó las bases de la Genética. Como conclusión a este período de unos 300 años: etapa caracterizada por un método de trabajo experimental y por la tentativa de relacionar a las estructuras celulares con su función, surgen nuevos campos de la biología como la microbiología, citología, genética y evolución entre otras. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular -4- Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 1.1.1.3. BIOLOGÍA MOLECULAR Se inicia aproximadamente en 1920 y se caracteriza por el estudio de la estructura celular y sus funciones, tanto a nivel fisiológico como a nivel molecular. Otro hecho importante dentro de esta época, es el establecer que tipo de sustancias químicas intervienen en la estructura de la célula, también se explica cual es la función que desempeña cada una de estas sustancias dentro de la misma. A partir de la descripción de Watson y Crick se produjo una creciente acumulación de descubrimientos, especialmente en la década de 1960, que nos permiten hoy tener las herramientas necesarias para estudiar agentes infecciosos a nivel molecular. Friedrich Meischer 1869, realizó por primera vez el aislamiento de la molécula de ADN, a partir de núcleos aislados de linfocitos humanos y se denominó "nucleina". Albrecht Koseel en 1879, demostró que la nucleina estaba compuesta por 4 bases orgánicas, adenina, guanina, timina y citosina. En 1924, Fuegel desarrolló un marcador químico para demostrar por microscopia de luz que el ADN estaba en el núcleo de todas las células de distintas especies. En 1944 Oswald T Avery, Colin M. MacLeod y Maclyn McCarty demostraron que en el ADN estaba la información responsable de la herencia. En 1950 Erwin Chargaff demostró que la composición química del ADN variaba entre un organismo y otro, pero siempre existía una concentración molar equivalente entre A-T y C- G. Watson y Crick en 1953, utilizando datos de difracción de rayos X, propusieron el modelo de doble hebra para la estructura del ADN. En 1957, Kronberg aisló y purificó la enzima responsable de la replicación del ADN, la ADN polimerasa. Este descubrimiento es la base para todos los métodos de síntesis de ADN in vitro como la PCR. En 1961, Doty et al y Marmur descubrieron las propiedades de hibridación del ADN. En 1962, Arber aisló y purificó enzimas que cortaban el ADN en secuencias específicas. La función de estas enzimas es proteger a las bacterias de infecciones Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular -5- Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. virales degradando el ADN viral. El descubrimiento de enzimas como la ADN ligasa dio origen a moléculas de ADN recombinante. Se crearon las primeras moléculas de ADN recombinante dando origen a la ingeniería genética. En 1966 Nirenberg, Ochoa, Khorama, descubrimiento del código genético. En 1967 Gellert, aislamiento y purificación de la enzima ADN ligasa. En 1972 Boyer, Cohen y Berg, desarrollo de las técnicas de clonación de ADN. En 1975, Southern desarrolló un método para fijar ADN digerido por enzimas de restricción a un soporte sólido y realizar en él, la hibridación con sondas específicas. La técnica desarrollada se llamó Southern-blot y la extensión de esta metodología a ARN se denominó Northern-blot y a proteínas, Western-blot. Otras variaciones de este método, que no utilizan la separación electroforética, se denominan dot-blot. En 1977, Sanger et al y Maxam y Gilbert, desarrollaron métodos de secuenciación del ADN. Ambos métodos difieren en que uno permite leer el código genético rompiendo la molécula de ADN en nucleótidos específicos y el otro, incorporando nucleótidos que bloquean la extensión de la síntesis de ADN (más utilizado). En 1981 Palmiter y Brinster, primeros animales transgénicos. En 1985, Mullis reunió algunas metodologías para realizar síntesis de ADN in vitro en forma exponencial (PCR), considerada como una revolución dentro la biología molecular ya que con la amplificación exponencial es posible el análisis de moléculas de ADN o ARN, a partir de mínimas cantidades de muestras. En 1997 Tomb, Cole y Parkill, secuenciación de genomas bacterianos completos. En el 2001, Venter y Collins, secuenciación del genoma humano. 1.1.2. ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR El término de Biología Molecular fue acuñado por W. Weaver de la Rockefeller Foundation en (1938). Pero el término Biología Molecular no se consolidó a la terminación de la Segunda Guerra Mundial. Desde el primer momento surgieron dos escuelas que se disputaron la hegemonía. G. S. Stent en 1968 las ha descrito como: Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular -6- Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Escuela informacionista, americana, era hostil a la Bioquímica. La Biología podía proporcionar contribuciones significativas al progreso de la Física. Escuela estructuralista, plenamente integrada a la Bioquímica. La Física podía hacer aportaciones muy valiosas a la Biología. 3 1.1.2.1. ESCUELA INFORMACIONISTA Esta escuela tuvo su antecedente en las ideas primero de Niels Bohr y después de Max Delbrück Bohr elaboró la noción de que algunos fenómenos biológicos no se podrían explicar completamente en términos de la Física convencional. En 1935 Max Delbrück afirmó que la genética era el dominio de la investigación biológica en que las explicaciones físicas y químicas podían resultar insuficientes en el sentido expresado por Bohr, de modo que concluyo que: “la genética es autónoma y no se debe mezclar con concepciones fisicoquímicas”. En 1945 Edwin Schrödinger con su libro “What is life?” se convirtió en una especie de revolución biológica. Y además centró la atención sobre el tema del material genético. El libro lo leyó también Watson (1966) quedó polarizado hacia el objetivo de desentrañar el secreto del gen. Avery, MacCarthy y MacLeod, probaron que el factor de transformación es DNA. E. Chargaff en 1950 y su grupo realizaron una extensa determinación de la composición de DNA de las fuentes biológicas más variadas y mostraron variación en la composición dependiendo del origen de la muestra. Watson y Crick en 1953 quienes convencidos de que el DNA es el material genético llegaron a la estructura de la doble hélice. 1.1.2.2. ESCUELA ESTRUCTURALISTA La escuela tiene sus orígenes en los estudios por difracción de rayos X de proteínas que se presentan en forma de fibras en que hay suficiente regularidad. W. H. Bragg y su hijo W. L. Bragg inventaron la cristalografía de rayos X en 1912 y luego 3 http://www.alipso.com/monografias/origenes_biologia_celymolec/ Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular -7- Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. fundaron la escuela de cristalógrafos que convirtió al Reino Unido en la patria de la estructura molecular. John Desmond Bernal demostró en 1939 que el virus del mosaico del tabaco, TMV, consiste en una asociación de centenares de subunidades proteínicas idénticas. W. C. Astbury en 1945. En el DNA las bases forman una pila compacta, que es perpendicular al eje de la molécula. Pauling et al, propone la existencia de los elementos de estructura secundaria, denominados hélice alfa y hoja beta. En 1937 Max Perutz se propuso establecer la estructura en el espacio de la molécula de la proteína hemoglobina, por difracción de rayos X. En 1959 junto con M. Rossman, A. F. Cullis, H. Muirhead y T.C.T. North lograban resolver la estructura. En 1953 Sanger y Thomson ya habían completado la secuencia de las cadenas A y B de la hormona. Dos años después lograron establecer la posición de los puentes disulfuro en la molécula de la insulina. 1.2. DISCIPLINAS QUE FORMAN PARTE DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR. La Biología es una disciplina que pertenece a las Ciencias Naturales (abarcan todas las disciplinas científicas como; biología, la física, la química, la geología y la astronomía, que se dedican al estudio de la naturaleza, de los aspectos físicos de la realidad, a diferencia de las ciencias sociales que estudian los factores humanos.)4 La palabra biología está formada por dos vocablos griegos: bios (“vida”) y logos (“estudio o tratado”) y significa “estudio de la vida”. Se trata de una de las ciencias naturales cuyo principal objetivo es el estudio del origen, de la evolución y de las propiedades que poseen todos los seres vivientes de esta manera establecer las leyes generales que rigen la vida orgánica. 4 http://www.encuentros-multidisciplinares.org/Revistan%C2%BA3/Miguel%20A%20Fuertes%2020Jos%C3%A9%20M%20P%C3%A9rez.pdf Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular -8- Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. La biología es una disciplina científica que abarca un amplio espectro de campos de estudio que, a menudo, se tratan como disciplinas independientes. Todas ellas juntas, estudian la vida en un amplio rango de escalas. La vida se estudia a escala atómica y molecular en biología molecular, en bioquímica y en genética molecular. Desde el punto de vista celular, se estudia en biología celular o citología, y a escala pluricelular se estudia en fisiología, anatomía e histología. Desde el punto de vista de la ontogenia o desarrollo de los organismos a nivel individual, se estudia en biología del desarrollo. Las poblaciones interdependientes y sus hábitats se examinan en la ecología y la biología evolutiva, y la que trata el comportamiento de los grupos, la etología. 5 1.2.1. DISCIPLINAS CIENTÍFICAS QUE FORMAN PARTE DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR. El estudio mediante métodos fisicoquímicos de la materia viva y los procesos biológicos engloba una serie de disciplinas científicas que pueden considerarse dentro del concepto general de Biología Molecular. La teoría biológica general sugiere que cualquier sistema genético (genotipo) que pueda evolucionar por selección natural requiere un almacenamiento de memoria bastante estable, y en consecuencia será poco reactivo, aunque el fenotipo del organismo esté más dispuesto a reaccionar con el medio ambiente. 1.2.1.1. BIOQUÍMICA ESTRUCTURAL. Trata del conocimiento de la naturaleza química de los constituyentes celulares que en su mayor parte es idéntico al de la “química orgánica de los productos naturales”. En las últimas décadas ha ido adquiriendo mayor importancia en el conocimiento de las sustancias naturales de alto peso molecular, el estudio de la constitución y estructura de las proteínas y de los ácidos nucleicos. 5 http://hnncbiol.blogspot.com/2008/01/biologia-ciencias-biologicas.html Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular -9- Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 1.2.1.2. BIOQUÍMICA INORGÁNICA O“QUÍMICA INORGÁNICA BIOLÓGICA” La tendencia inicial se refleja aún en la división de la química en orgánica e inorgánica. Ahora esta distinción es artificial y no tiene base científica. Así, los 25 elementos químicos que libres en forma de iones, o combinados en macrocomplejos, regulan espacial y temporalmente muchas de las interacciones entre biomoléculas. 1.2.1.3. BIOQUÍMICA METABÓLICA Y ENZIMOLOGÍA. La “Bioquímica Metabólica” tiene como objetivo el estudio de las reacciones químicas que suceden continuamente en los seres vivos. Estas reacciones químicas se efectúan gracias a la regulación catalítica de los enzimas, cuyo estudio, ocupa un amplio lugar dentro de la Bioquímica en la disciplina denominada “Enzimología”. 1.2.1.4. FISIOLOGÍA MOLECULAR. El estudio de la regulación de los procesos químicos que tienen lugar en las estructuras de la célula y que constituyen la verdadera función de dichos elementos estructurales es el objetivo de la “Fisiología Molecular”. 1.2.1.5. BIOLOGÍA MOLECULAR Y QUÍMICA FÍSICA. Muchos de los procesos biológicos fundamentales, han podido ser explicados gracias a la aplicación de técnicas de investigación fisicoquímicas dando lugar a la disciplina científica denominada Biología Molecular. La Química Física describe la naturaleza en términos de átomos, moléculas y energía, el carácter interdisciplinario de la Biología Molecular se hace aún más patente teniendo en cuenta que su ciencia madre, la Química Física, utiliza como herramienta de trabajo las matemáticas. 1.3. INFORMACIÓN GENÉTICA Y EL GENOMA. 1.3.1. EL GENOMA El genoma es la información genética con que cuentan los seres vivos contenido en las células presente en un organismo en particular, la cual está almacenada en los genes y estos a su vez en los cromosomas. Prácticamente todos los genomas (con excepción de los de algunos virus) están formados por ADN, una doble hélice compuesta por dos hebras de nucleótidos. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 10 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. La secuencia de nucleótidos del ADN es la que determina la información contenida en los genes. Fig. 1.1. El secreto de la vida del cromosoma a los genes6 En el caso de organismos eucariotas, la mayor parte del genoma está contenida en el núcleo, pero algunos orgánulos celulares, como mitocondrias y cloroplastos, también contienen material genético, constituido por moléculas de ADN. El genoma nuclear de la célula eucariota puede ser diploide (2n, siendo n el número de cromosomas), si está formado por dos series de cromosomas en cada núcleo; o haploide (n), si solo existe una serie cromosómica por núcleo. Los biólogos tienen un gran interés en el estudio e identificación de los genes y han completado la secuenciación del genoma (conjunto de genes) humano en abril de 2003, que actualmente permite identificar y hacer terapias para las enfermedades que se trasmiten genéticamente como: enanismo, albinismo, hemofilia, sordera, etc. El genoma humano contiene cerca de 3 billones de nucleótidos (pares de bases, pb) presentes en 46 cromosomas (22 autosomas y 2 cromosomas sexuales). En los seres humanos el sexo del recién nacido depende del tipo de espermatozoide que realice la fecundación. Si el espermatozoide que fecunda el óvulo es portador del cromosoma X el cigoto resultante dará lugar a una niña (XX) y si el espermatozoide que fecunda al óvulo es portador del cromosoma Y el cigoto dará lugar a un niño (XY). El espermatozoide y el óvulo humano son las células responsables de la 6 Biología celular, 4º ESO. i.e.s. "la rábida" departamento de biología y geología. http://www.juntadeandalucia.es/averroes/manuales/materiales_tic/Cell_anim_archivos/Cell_anim_arch ivos/DELCROMOSAGENES.jpg Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 11 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. transmisión de los caracteres hereditarios. Poseen una compleja estructura que les permite llevar a cabo el transporte del material genético y la formación del cigoto que dará origen al nuevo individuo con las características de los progenitores. Fig. 1.2. Cromosomas Humanos y el Material Genético. 7 1.3.3. MATERIAL GENÉTICO El material genético se emplea para guardar la información genética de una forma de vida orgánica. Para todos los organismos conocidos actualmente, el material genético es casi exclusivamente ácido desoxirribonucleico (ADN o DNA). Algunos virus usan ácido ribonucleico (ARN o RNA) como su material genético. Las células modernas usan el ARN principalmente para construir proteínas de las instrucciones del ADN, en la forma de ARN mensajero, ARN ribosómico y ARN de transferencia. 1.3.4. CROMATINA Y LOS CROMOSOMAS El DNA nunca está desnudo. En eucariotas interacciona con una gran variedad de proteínas, se espiraliza y condensa para formar la cromatina y los cromosomas. Los cromosomas constituyen el orden superior de empaquetamiento del DNA y se pueden visualizar al microscopio óptico como un ovillo formado por una hebra de 1,7 a 8,5 cm de longitud y esta formada por una unidad estructural que es la cromatina que se visualiza al microscopio electrónico (fibras que contienen aprox. 60% proteína y 35% DNA y 5% RNA). Está compuesta por 6-7 nucleosomas por vuelta. Cada nucleosoma es un disco formado por un octámero de proteínas básicas 7 i.e.s. "la rábida", departamento de biología y geología, Biología celular, 4º ESO. http://www.juntadeandalucia.es/averroes/manuales/materiales_tic/Cell_anim_archivos/Cell_anim.htm Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 12 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. denominadas histonas, donde exteriormente se enrolla el DNA. Todo el ovillo de ADN de la célula forma una esfera de un radio inferior a 2 milésimas de milímetro. Fig. 1.3. La Célula, el cromosoma y el ADN.8 Lo que hace el ADN capaz de producir copias es que al igual que el viviente completo, tiene una estructura simétrica duplicada: es una molécula de doble cadena en forma de escalera en espiral. 1.3.4.1. MORFOLOGÍA DEL CROMOSOMA METAFÁSICO Los cromosomas se ven como estructuras delgadas y alargadas. Tienen un brazo corto y otro largo, separados por un estrechamiento o constricción primaria, llamada centró mero. El brazo corto se designa como p y el largo como q. El centrómero es el punto de unión del huso mitótico y es parte integral del cromosoma. Es esencial para el movimiento y segregación normales del cromosoma durante la división celular. Con frecuencia tienen constricciones secundarias (NOR) en los brazos cortos, conectando trozos muy pequeños de ADN llamados satélites, que contienen genes que codifican el RNA ribosómico. Las cromátides son estructuras idénticas en morfología e información ya que contienen cada una molécula de ADN. Las cromátidas están unidas por el centrómero. Morfológicamente se puede decir que el cromosoma es el conjunto de dos cromátidas y genéticamente cada cromátida tiene el valor de un cromosoma. Los telómeros se encuentran al extremo de cada brazo del cromosoma. El ADN de los telómeros no se transcribe. 8 This entry was posted on Martes, Abril 28th, 2009 at 17:22 Filed under Biolgía and. You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. http://www.profesorenlinea.cl/Ciencias/cromosomas.htm Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 13 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Los cromosomas metafásicos tienen cuatro formas básicas y se pueden clasificar de acuerdo con la longitud de los brazos corto y largo, así como por la posición del centrómero. Los cromosomas metacéntricos tienen los brazos corto y largo de aproximadamente la misma longitud, con el centrómero en el punto medio. Los cromosomas submetacéntricos tienen los brazos corto y largo de longitudes desiguales, con el centrómero más próximo a uno de los extremos. Los cromosomas acrocéntricos tienen el centrómero my cerca de un extremo, con un brazo corto muy pequeño. En los telocéntricos el centrómero está en un extremo del cromosoma y éste tiene un solo brazo. Fig. 1.4. ADN empaquetada hasta constituir un cromosoma9 y Morfología del cromosoma (1nm = 0,001 mm = 1 x 10 mm = 1 x 10 mm). 10 1.3.5. LOS GENES Gen es la unidad de herencia, partícula de material genético o hereditario que determina la herencia de una característica determinada, o de un grupo de ellas. En términos moleculares puede definirse como la secuencia lineal de nucleótidos considerada como unidad de almacenamiento de información, y físicamente está 9 Ficha de trabajo de la Dra. Andrea Albarenga Julio del 2010 Niveles de compactación del ADN en eucariotas. http://biologia-lacienciadelavida.blogspot.com/2010/07/ciclo-celular-ficha-de-trabajo-para4.html 10 Genética - Técnicos para Bioterio by Gabriel Robledo is licensed under a Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported License.http://geneticabioterio.wordpress.com/cromosomas/ Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 14 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. formado por un segmento del ADN del cromosoma localizado en el núcleo celular y se disponen en línea a lo largo de cada uno de ellos. Cada gen ocupa en el cromosoma una posición, o locus (plural: loci). Atendiendo al aspecto que afecta a la herencia, esa unidad básica recibe también otros nombres, como recón, cuando lo que se completa es la capacidad de recombinación (el recón será el segmento de ADN más pequeño con capacidad de recombinarse), y mutón, cuando se atiende a las mutaciones (y, así, el mutón será el segmento de ADN más pequeño con capacidad de mutarse). Los genes no están situados siempre de forma contigua en el ADN, sino que separando los genes existe una gran cantidad de ADN (región intergénica). En términos generales, un gen es un fragmento de ADN que codifica una proteína o un péptido. El ADN contiene la información genética de todos los seres vivos. Es como el código de barra de todos los organismos vivos que existen en la tierra, que está formado por segmentos llamados genes. El conjunto de todos los caracteres transmisibles, que vienen fijado en los genes, recibe el nombre de genotipo y su manifestación exterior en el aspecto del individuo el de fenotipo. Se llama idiotipo al conjunto de posibilidades de manifestar un carácter que presenta un individuo. La combinación de genes es específica para cada organismo y permite individualizarnos. Estos genes provienen de la herencia de nuestros padres y por ello se utiliza los tests de ADN para determinar el parentesco de alguna persona. La genética (del término "Gen", que significa "descendencia") es el campo de las ciencias biológicas que trata de comprender cómo la herencia biológica es transmitida de una generación a la siguiente, y cómo se efectúa el desarrollo de las características que controlan estos procesos. 1.4. TIPOS Y COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS. 1.4.1. ÁCIDO NUCLÉICO Los ácidos nucleicos son macromoléculas, polímeros formados por la repetición de monómeros llamados nucleótidos, es decir, unidos mediante enlaces fosfodiéster. Se forman, así, largas cadenas o polinucleótidos, lo que hace que algunas de estas moléculas lleguen a alcanzar tamaños gigantes (de millones de nucleótidos de largo). La información contenida en los ácidos nucleicos es transcripta y luego Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 15 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. traducida a las proteínas. Son las proteínas las moléculas que finalmente ejecutarán las "instrucciones" codificadas en los ácidos nucleicos. A las unidades químicas que se unen para formar los ácidos nucleicos se les denominan nucleótidos. 11 1.4.1.1. TIPOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS Existen dos tipos de ácidos nucleicos: ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico). En los eucariotas la estructura del ADN es de doble cadena helicoide, mientras que la estructura del ARN es polinucleótido lineal monocatenaria, aunque puede presentarse en forma extendida, como el ARNm, o en forma plegada, como el ARNt y el ARNr. La masa y el peso molecular del ADN es generalmente mayor que la del ARN. El ADN contiene la información genética de todos los seres vivos. Ambos ácido nucleicos, se encuentran simultáneamente en organismos eucariotas y procariotas (bacterias, etc.), y sólo uno de ellos en los virus. 1.4.1.2. COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Los ácidos nucleicos polímeros de alto peso molecular constituidos por unidades elementales denominadas nucleótidos.Cada nucleótido es una molécula compuesta por tres unidades: a) Molécula de azúcar o glúcido de tipo pentosa (monosacárido de cinco átomos carbonos), puede ser: D-ribosa (R), en el caso del RNA D-2- desoxirribosa (dR), en el caso del DNA Ambas son aldopentosas y las encontraremos en los nucleótidos como ßfuranosas. Conviene destacar que la única diferencia entre ambas está en que en el carbono 2 de la desoxirribosa hay un hidrógeno (-H) en lugar del grupo alcohol (-OH). 11 Microsoft ® Encarta ® 2009. © 1993-2008 Microsoft Corporation. Reservados todos los derechos. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 16 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. b) Base orgánica nitrogenada, son compuestos orgánicos cíclicos, que incluyen dos o más átomos de nitrógeno y son la parte fundamental de los ácidos nucleicos. Biológicamente existen cinco bases nitrogenadas, que se clasifican en: Las Bases Purínicas, derivadas de la estructura de las Purinas (con dos anillos): la Guanina (G) y la Adenina (A). Ambas se encuentran tanto en el ADN como el ARN. Las Bases Pirimidínicas, derivadas de la estructura de las Pirimidinas (con un anillo): la Timina (T), Citosina (C) y Uracilo (U). La timina sólo se encuentra en la molécula de ADN, el uracilo sólo en la de ARN y la citosina, en ambos tipos de macromoléculas. Fig. 1.5. Composición Química de los Ácidos Nucleicos.12 Además de las bases nitrogenadas descritas, se han encontrado otras en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de ARNs. Entre las bases púricas son: Hipoxantina, Xantina, 2-metiladenina, 6-metil-aminopurina; las bases pirimidínicas la 5-metilcitosina (propia del ADN) y la 5-hidroximetil citosina (HMC) que sustituye a la citosina en los fagos T-pares. En los ARN transferentes (ARN-t) que intervienen en el proceso de traducción de proteínas se encuentran la Ribotimidina, Dihidrouridina, Seudouridina e Inosina (I). 12 Biología COU- Anaya. Bloque 1. Tema 6: Composición química de los Ácidos Nucleicos. http://www.iesbanaderos.org/html/departamentos/biogeo/Apuntes/Bio/T%206%20Ac%20Nucleicos/2%20Composicion.htm Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 17 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. c) Grupos o radical fosfato, uno o varios derivados del ácido fosfórico (H 3PO4-). En la cadena de ácido nucleico une dos pentosas a través de una unión fosfodiester. 1.4.2. NUCLEÓSIDOS Y NUCLEÓTIDOS El azúcar y la base nitrogenada se unen entre si formando un nucleósido. El enlace se forma entre el carbono anomérico (C1) del azúcar (pentosa) y uno de los nitrógenos de las posiciones 3 (pirimidinas) o 9 (purinas) de las bases nitrogenadas mediante un enlace de tipo N-glucosídico. En la unión se forma una molécula de agua. La unión mediante un enlace éster o fosfoéster entre el nucleósido y el ácido fosfórico da lugar al nucleótido. Es una unión entre un OH del ácido fosfórico y el OH situado en el carbono 5 del azúcar, con formación de una molécula de agua. Los nucleótidos son las unidades o monómeros utilizados para construir largas cadenas de polinucleótidos. Tanto los nucleótidos como los nucleósidos pueden contener como azúcar la D-ribosa (ribonucleótidos y ribonucleósidos) o la pentosa 2-desoxi-D-ribosa (desoxirribonucleótidos y desoxirribonucleósidos). Además, los nucleótidos pueden tener 1, 2 ó 3 grupos fosfato unidos al carbono 5’ de la pentosa, existiendo por tanto, nucleótidos 5’ monofosfato, nucleótidos 5’ difosfato y nucleótidos 5’ trifosfato según el número de grupos fosfato que posea. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 18 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Se denomina nucleótido-monofosfato (como el AMP) cuando hay un solo grupo fosfato, cuando lleva unido una unidad de fosfato al carbono 5' de la ribosa o desoxirribosa y dicho fosfato sirve de enlace entre nucleótidos, uniéndose al carbono 3' del siguiente nucleótido; nucleótido-difosfato (como el ADP) si lleva dos y nucleótido-trifosfato (como el ATP) si lleva tres. La terminología empleada para referirse a los nucleósidos y nucleótidos es la siguiente: BASE NITROGENADA NUCLEÓSIDO NUCLEÓTIDO Adenina Adenosina Ácido Adenílico Guanina Guanidina Ácido Guanílico Citosina Citidina Ácido Citidílico Timina Timidina Ácido Timidílico Uracilo Uridina Ácido Uridílico 1.4.3. LOS DINUCLEOTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS Dos nucleótidos van a poder unirse entre sí mediante un enlace ésterfosfato (fosfoéster). Un dinucleótido en el que se unieron un nucleótido con la base A con un nucleótido con la base G y el enlace fosfodiester se formó entre el OH (hidroxilo) del azúcar del carbono 3'del nucleótido con base A y entre un OH del ácido fosfórico del carbono 5'del nucleótido con base G con formación de una molécula de agua, se representa simplemente como AG. Si a este dinucleótido se le agrega otro nucleótido en el carbono 3' y este nucleótido tiene una base T, el trinucleótido resultante se representará por AGT. Ésta es la forma simplificada en que se acostumbra representar los polinucleótidos. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 19 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. La unión de otros nucleótidos dará lugar a un polinucleótido. Es de destacar que en toda cadena de polinucleótidos el nucleótido de uno de los extremos tendrá libre el OH del azúcar en posición 3, éste será el extremo 3' de la cadena. El ácido fosfórico del nucleótido que se encuentre en el extremo opuesto también estará libre, éste será el extremo 5'. Esto marca un sentido en la cadena de polinucleótidos. Toda cadena podrá considerarse bien en sentido 3'-5' o en sentido 5'-3' y así habrá que indicarlo. Estructura de un polirribonucleótido 1.5. FUNCIONES Y ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS. Así como las proteínas están formadas por cadenas largas de aminoácidos, los ácidos nucleicos están formados por cadenas largas de nucleótidos. Un nucleótido, sin embargo, es una molécula más compleja que un aminoácido. El DNA y el RNA desempeñan papeles biológicos muy diferentes. El DNA es el constituyente primario de los cromosomas de las células y es el portador del mensaje genético. La función del RNA es transcribir el mensaje genético presente en el DNA y traducirlo a Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 20 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. proteínas. Los nucleótidos, además de su papel en la formación de los ácidos nucleicos, tienen una función independiente y vital para la vida celular. Cuando un nucleótido se modifica por la unión de dos grupos fosfato, se convierte en un transportador de energía, necesario para que se produzcan numerosas reacciones químicas celulares.13 1.5.1. ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO O ADN El ácido desoxirribonucleico, es un tipo de ácido nucleico, una macromolécula , que forma parte de todas las células. Contiene las instrucciones o información genéticas usadas en el desarrollo y el funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y también de los virus, excepto algunos cuyo material genético es ARN (los retrovirus), siendo el responsable de su transmisión hereditaria. Dentro de las células, el ADN está organizado en estructuras llamadas cromosomas. Estos cromosomas se duplican antes de que las células se dividan, en un proceso llamado replicación de ADN. Las proteínas cromáticas, como las histonas, comprimen y organizan el ADN dentro de los cromosomas. Estas estructuras compactas dirigen las interacciones entre el ADN y otras proteínas, ayudando al control de las partes del ADN que son transcritas. 1.5.1.1. TIPOS DE ADN Acorde a las evidencias, sólo una pequeña parte del ADN constituye genes (menos del 10 %). Existen diferentes tipos que los podemos dividir en: ADN de copia única (el 57 % del total) formados por segmentos de aproximadamente 1000 pares de nucleótidos longitud, una pequeña parte de este ADN contiene los genes. ADN repetitivo (20 %) son unidades de aproximadamente 300 pares de nucleótidos que se repiten en el genoma unas 105 veces (Unidades de repetición). Se intercalan con el ADN de copia única. ADN satélite (altamente repetitivo: 28 %) son unidades cortas de pares de nucleótidos que se repiten en el genómico. Son característicos en cada especie 13 http://es.wikipedia.org/wiki/Hibridaci%C3%B3n_(biolog%C3%ADa_molecular) Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 21 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. y pueden ser separados por centrifugación. Constituyen la heterocromatina y no se le conoce función. Según su estructura se distinguen los siguientes tipos de ADN: Monocatenarios o de una cadena; por ejemplo los de algunos virus. Bicatenarios, con dos hebras o cadenas (algunos virus, las bacterias y los eucariotas). Esta doble cadena puede disponerse en forma lineal (ADN del núcleo de las células eucarióticas) o en forma circular (ADN de las células procarióticas, así como de las mitocondrias y cloroplastos eucarióticos). 1.5.1.2. PROPIEDADES DEL DNA Insolubles en soluciones diluidas de NaCl Soluble en soluciones concentradas de NaCl Insoluble en alcohol Puede ser disociado de la proteína por tratamiento con un detergente o un fenol Químicamente, el ADN es un largo polímero de unidades simples llamadas nucleótidos con un armazón hecho de azúcares y grupos de fosfato unidos alternativamente entre sí mediante enlaces de tipo éster. Unido covalentemente a cada azúcar se encuentra una base nitrogenada: adenina, timina, citosina o guanina. La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la información. Esta información es interpretada usando el código genético, que especifica la secuencia de los aminoácidos de las proteínas, según una correspondencia de un triplete de nucleótidos (codón) por cada aminoácido. Entonces el ADN son polinucleótidos constituidos por d-AMP, d-GMP, d-CMP y dTMP. También existen otras bases nitrogenadas (las llamadas bases nitrogenadas minoritarias), derivadas de forma natural o sintética de alguna otra base mayoritaria. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 22 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Lo son por ejemplo la hipoxantina, relativamente abundante en el tRNA, o la cafeína, ambas derivadas de la adenina; otras, como el aciclovir, derivadas de la guanina, son análogos sintéticos usados en terapia antiviral; otras, como una de las derivadas del uracilo, son antitumorales. 1.5.1.3. CARACTERISTICAS DEL ADN Es una doble hélice enrollada helicoidalmente “a derechas” (sentido dextrorso). Por lo común su estructura tridimensional posee giro hacia la derecha (ß-ADN, dextrogiro) que es la forma más estable y ocasionalmente posee giro ha la izquierda (z-ADN, levógiro) Fig. 1.6. Enrollamiento del AND.14 Cada hélice es una serie de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster en los que un grupo fosfato forma un puente entre grupos OH de dos azúcares sucesivos (posiciones 3’ de un azúcar y 5’ del siguiente). Las dos hélices se mantienen unidas mediante puentes o enlaces de hidrogeno producidos entre las bases nitrogenadas de cada hélice. Siguiendo los datos de Chargaff (1959), la Adenina de una hélice aparea con la Timina de la hélice complementaria mediante dos puentes de hidrógeno. Igualmente, la Guanina de una hélice aparea con la Citosina de la complementaria mediante tres puentes de hidrógeno. 14 http://heliotropodeluz.wordpress.com/2008/06/14/la-clave-esta-en-el-adn/ Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 23 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. El diámetro independientemente de la especie de la doble hélice es de 20Å. Las bases nitrogenadas son estructuras planas perpendiculares al eje de la doble hélice y están apiladas unas sobre otras a una distancia de 3,4 Å, el cual está constituido por 10 residuos de nucleótidos. Cada 10 bases, cada 34 Å se produce una vuelta completa de la doble hélice (360º). El tamaño de la molécula de ADN de doble hélice se expresa en miles de bases o Kb. La longitud de 1kb es entonces 0.34 micras. Una molécula de ADN de un milímetro de longitud estará formado de 3 mil Kb o sea tres millones de bases. Las bases se encuentran en sus configuraciones cetónicas, cumpliendo así las reglas de apareamiento A-T y G-C. La secuencia de bases nitrogenadas puede ser cualquiera, no existe ninguna restricción. 1.5.1.4. ESTRUCTURA DEL ADN El ADN es una molécula por lo general bicatenaria, formada por dos cadenas dispuestas de forma antiparalela y con las bases nitrogenadas enfrentadas. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 24 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. El ADN existe en muchas conformaciones. Sin embargo, en organismos vivos sólo se han observado las conformaciones ADN-A, ADN-B y ADN-Z. La conformación que adopta el ADN depende de su secuencia, la cantidad y dirección de superenrollamiento que presenta, la presencia de modificaciones químicas en las bases y las condiciones de la solución, tales como la concentración de iones de metales y poliaminas. De las tres conformaciones, la forma "B" es la más común en las condiciones existentes en las células. Las dos dobles hélices alternativas del ADN difieren en su geometría y dimensiones. La forma "A" es una espiral que gira hacia la derecha, más amplia que la "B", con una hendidura menor superficial y más amplia, y una hendidura mayor más estrecha y profunda. La forma "A" ocurre en condiciones no fisiológicas en formas deshidratadas de ADN. Los segmentos de ADN en los que las bases han sido modificadas por metilación pueden sufrir cambios conformacionales mayores y adoptar la forma "Z". En este caso, las hebras giran alrededor del eje de la hélice en una espiral que gira a mano izquierda, lo opuesto a la forma "B". Fig. 1.7. De izquierda a derecha, las estructuras de ADN A, B y Z.15 Estas estructuras poco frecuentes pueden ser reconocidas por proteínas específicas que se unen a ADN-Z y posiblemente estén implicadas en la regulación de la transcripción. 1.5.1.5. REPLICACIÓN DEL ADN La replicación del ADN es el proceso por el cual se obtienen copias o réplicas idénticas de una molécula de ADN. La replicación es fundamental para la 15 Wikipedia. Estructuras en doble hélice de ADN. http://es.wikipedia.org/wiki/ADN-A. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 25 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. transferencia de la información genética de una generación a la siguiente y, por ende, es la base de la herencia. El mecanismo consiste esencialmente en la separación de las dos hebras de la doble hélice, las cuales sirven de molde para la posterior síntesis de cadenas complementarias a cada una de ellas. El resultado final son dos moléculas idénticas a la original. Este tipo de replicación se denomina semiconservativa debido a que cada una de las dos moléculas resultantes de la duplicación presenta una cadena procedente de la molécula madre y otra recién sintetizada. Todas las funciones del ADN dependen de sus interacciones con proteínas. También pueden unirse enzimas, entre las cuales son particularmente importantes las polimerasas, que copian la secuencia de bases del ADN durante la transcripción y la replicación. La replicación del DNA en la naturaleza donde obtienen dos moléculas hijas exactamente iguales consiste en: 1. Separación de las dos cadenas que forman la doble hélice, de lo cual se encargan enzimas y proteínas que se encuentran en la célula eucariótica. 2. Unión de los cebadores ('primers' o iniciadores) de DNA en una de las hebras separadas. 3.Unión de la polimerasa a los lugares donde se encuentra el "primer" para comenzar a copiar de manera progresiva la hebra de DNA, ya que la polimerasa necesita un cebador que le indique dónde empezar, por ser incapaz de copiar DNA monocatenario. El sentido de la síntesis es siempre 5'- 3'. 4. Constitución de las nuevas copias siempre formadas por una hebra madre y otra hija, por lo que al proceso se le denomina replicación semiconservativa del DNA. Según la Horquilla replicativa del DNA con todas las enzimas implicadas se sigue el siguiente proceso. Es necesaria la existencia de un "primer" para que la DNA polimerasa de E. coli inicie cadenas de novo. Este "primer" es proporcionado por una RNA polimerasa llamada primasa, la cual en asociación con un complejo de proteínas llamado primosoma sintetiza una cadena corta de RNA. La DNA polimerasa III puede utilizar este "primer" para continuar la síntesis de DNA. Una proteína llamada helicasa (originalmente llamada rep) es necesaria para desenlazar y abrir la hélice de DNA Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 26 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. para permitir la replicación. Las proteínas de enlace a DNA se encargan de estabilizar las regiones de simple cadena que se forman transitoriamente durante el proceso de replicación. Fig.1.8.Horquilla Replicativa16 La DNA polimerasa puede sintetizar DNA en la dirección 5' - 3', por lo que una de las hebras debe ser sintetizada discontinuamente, esto lleva a la formación de cortas cadenas de DNA con huecos entre ellas que deben ser completados por la acción de la DNA polimerasa I y unidos por la acción de una DNA ligasa. 1.5.1.6. FUNCIONES BIOLÓGICAS DEL ADN El ADN es el portador de la información genética y a través de ella puede controlar, en forma indirecta, todas las funciones celulares. Debemos recordar aquí que las enzimas son proteínas que catalizan todas las funciones biológicas y se sintetizan en las células de acuerdo a la información genética. Los segmentos de ADN que llevan la información genética se llaman genes. Podemos considerar el DNA como el cerebro celular que regula el número y naturaleza de cada tipo de estructura y composición celular, transmitiendo la información hereditaria y determinando la estructura de las proteínas, que a través de enzimas determinará el resto de funciones celulares. 1.5.2. ÁCIDO RIBONUCLEICO O ARN Esta macromolécula representa alrededor del 7% del peso de una célula, constituida por largas cadenas de ribonucleotidos, unidos por enlaces fosfodiester. Estos se 16 http://www.editoriallapaz.org/ateismo_ADN_acetatos_files/image010.gif Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 27 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. forman por la unión de un grupo fosfato, ribosa (una aldopentosa cíclica) y una base nitrogenada unida al carbono 1’ de la ribosa, que puede ser C, G, A y U. En general los ribonucleótidos se unen entre sí, formando una cadena simple, excepto en algunos virus. La cadena simple de ARN puede plegarse y presentar regiones con bases apareadas, de este modo se forman estructuras secundarias del ARN, que tienen muchas veces importancia funcional, como por ejemplo en los ARNt (ARN de transferencia). 1.5.2.1. TIPOS DE ARN Se conocen tres tipos principales de ARN y todos ellos participan de una u otra manera en la síntesis de las proteínas. Ellos son: ARN MENSAJERO (ARNm) Consiste en una molécula lineal de nucleótidos (monocatenaria), cuya secuencia de bases es complementaria a una porción de la secuencia de bases del ADN. El ARNm dicta con exactitud la secuencia de aminoácidos en una cadena polipeptídica en particular. Las instrucciones residen en tripletes de bases a las que llamamos codones, los cuales determinan el aminoácido que debe incorporarse en la proteína que se va a sintetizar. Son los ARN más largos y pueden tener entre 1000 y 10000 nucleótidos. En los eucariontes los ARNm derivan de moléculas precursoras de mayor tamaño que se conocen en conjunto como ARN heterogéneo nuclear (hnARN), el cual presenta secuencias internas no presentes en ARN citoplasmáticos. El nombre mensajero deriva de su papel el intermediario: actúa como vehículo de transporte de información genética entre el ADN y las proteínas. ARN RIBOSOMAL (ARNR) Este tipo de ARN una vez transcripto, pasa al nucléolo donde se une a proteínas. De esta manera se forman las subunidades de los ribosomas. Aproximadamente dos Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 28 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. terceras partes de los ribosomas corresponde a sus ARNr. Los ribosomas, formados por proteínas y ARN ribosomal y participan activamente en la lectura de la molécula de ARN mensajero para sintetizar las proteínas contenidas en la secuencia de codones del ARN mensajero. Diagrama de un ribosoma Procarionte ARN DE TRANSFERENCIA (ARNt) Este es el más pequeño de todos y el más abundante en las células, tiene aproximadamente 75 nucleótidos en su cadena, además se pliega adquiriendo lo que se conoce con forma de hoja de trébol plegada. El ARNt se encarga de transportar los aminoácidos libres del citoplasma al lugar de síntesis proteica. En su estructura presenta un triplete de bases complementario de un codón determinado, lo que permitirá al ARNt reconocerlo con exactitud y dejar el aminoácido en el sitio correcto. A este triplete lo llamamos anticodón. Molécula de ARNt Estos tres tipos de ARN están implicados en el pasaje de información del lenguaje de los nucleótidos del ADN al de los aminoácidos de las proteínas, en un proceso conocido como; “El dogma central de la biología”. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 29 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. ARN PEQUEÑO NUCLEAR (ARNpn O snRNA) En eucariontes encontramos un grupo de seis ARN que están en el núcleo, el ARN pequeño nuclear, estos desempeñan cierto papel en la maduración del ARNm. Existen, aparte de los naturales, algunos ácidos nucleicos no presentes en la naturaleza sintetizados en el laboratorio: Ácido nucleico peptídico Morfolino y ácido nucleico bloqueado (lna en inglés). Ácido nucleico glicólico. Ácido nucleico treósico. 1.5.2.2. PROPIEDADES DEL RNA Soluble en soluciones diluidas de NaCl Insoluble en alcohol Puede ser disociado de las proteínas por tratamiento con un detergente o fenol. 1.5.2.3. FUNCIÓN DEL ARN Un gen está compuesto, como hemos visto, por una secuencia lineal de nucleótidos en el ADN, dicha secuencia determina el orden de los aminoácidos en las proteínas. Sin embargo el ADN no proporciona directamente de inmediato la información para el ordenamiento de los aminoácidos y su polimerización, sino que lo hace a través de otras moléculas, los ARN. 1.6. DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR 1.6.1. LA TRANSCRIPCIÓN Durante la transcripción la enzima ARN polimerasa, copia la secuencia de una hebra del ADN y fabrica una molécula de ARN complementaria al fragmento de ADN transcripto. El proceso es similar a la replicación del ADN, pero la molécula nueva que se forma es de cadena simple ARN. La información del DNA es transferida al RNAm, que es sintetizado utilizando como molde el DNA original y dirigido por la holoenzima RNA polimerasa. Este RNAm será transportado desde el núcleo a los ribosomas que se encuentran en el citoplasma. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 30 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 1.6.2. LA TRADUCCIÓN Y EL CÓDIGO GENÉTICO La factoría celular responsable de la síntesis de proteínas es el ribosoma. La molécula especifica que va a trasladar los aminoácidos (componentes elementales de las proteínas) siguiendo las pautas dictadas por el RNAm es el RNAt. Cada RNAt tiene un anticodón especifico (formado por tres bases denominados codones). La molécula del ARN mensajero se traslada a los ribosomas donde ocurre la etapa de traducción. A medida que el ribosoma lee la secuencia de codones va formando una proteína, a partir de la unión de aminoácidos. Según cuál es el codón que el ribosoma "lee" va colocando el aminoácido que corresponde. Si se considera la combinación de cuatro bases tomadas de a tres, existe un total de 64 codones posibles. Cada codón determina qué aminoácido se colocará en la proteína que se está fabricando. De los 64 codones, 61 corresponden a aminoácidos y 3 son codones de terminación (stop), responsables de la finalización de la síntesis proteica. La siguiente tabla es el código genético o "diccionario" que permite traducir la información escrita en el lenguaje de los ácidos nucleicos (nucleótidos) al lenguaje de las proteínas (aminoácidos), y es universal, válido para todos los seres vivos. Así, la secuencia ATG (AUG en el ARNm) codifica para la metionina, y el codón TTT (UUU en el ARNm) codifica para la fenilalanina en todos los organismos vivos. Como sólo existen 20 aminoácidos en la naturaleza, varios codones pueden codificar para el mismo aminoácido (por ejemplo, al aminoácido glicina le corresponden los codones GGU, GGC, GGA y GGG). Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 31 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Una proteína cargada denominada aminoacil tRNA sintetasa es la encargada de unir el aminoácido correcto correspondiente al anticodón a una posición de anclaje. De esta manera a partir de una señal de iniciación en el RNAm (codón ATG) comienza la síntesis, y el primer aminoácido transportado por el RNAt y correspondiente a este codón es la metionina. Este primer paso se denomina iniciación de la traducción y tiene lugar en una posición concreta del ribosoma denominada aminoacil (A). Posteriormente este RNAt junto con su aminoácido correspondiente salta a una posición contigua denominada peptidil (P) y llega un nuevo RNAt con el correspondiente aminoácido para anclarse en su codón y se sitúa en la posición A que ha quedado libre. Entre ambos aminoácidos se establece una unión peptídica y el RNAt de la posición P es liberado, comenzando el proceso de nuevo. Este proceso de elongación continúa hasta llegar a un codón de parada. Una vez sintetizada la proteína pueden haber modificaciones postranscripcionales (cortes por enzimas proteolíticas, fosforilaciones, glicosilaciones etc. Se deduce entonces que la Replicación, Transcripción y Traducción son los tres fenómenos sobre los que versa el Dogma Central de la Biología Molecular. La replicación consiste en la copia del ADN de una célula, antes de la división celular, para que la célula hija tenga el mismo ADN que la madre. La transcripción consiste en convertir la información contenida en el ADN en un formato “legible” para la maquinaria celular de síntesis de proteínas, el ARN. La traducción es el mecanismo por el que el mensaje que lleva el ARN se utiliza para sintetizar proteínas. Con estos tres mecanismos conseguimos extraer de la información genética (ADN) los materiales (proteínas) necesarios tanto funcional como estructuralmente para que una célula funcione. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 32 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 1.7. ENZIMAS MOLECULAR Y VECTORES USADOS EN LA BIOLOGIA 1.7.1. CONCEPTO DE ENZIMA Los enzimas son estructuras de carácter proteico, catalizadores biológicos muy potentes y eficaces, tienen una extraordinaria capacidad, tanto así, que permiten reacciones que sin ellas se tendrían que realizar en temperaturas, pH o presiones incompatibles con la vida. Existe un grupo particular de enzimas que tiene funciones a nivel de genético. Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución. 1.7.2. USOS DE LAS ENZIMAS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR Algunas son utilizadas en técnicas como PCR (taq polimerasa), enzimas de restricción para sondas de hibridación, plásmidos recombinantes, secuenciación de ADN, clonación, etc. (BAM H1, EcoRI, etc.), entre otras técnicas. 1.7.3. CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE ENZIMAS El nombre de una enzima suele derivarse del sustrato o de la reacción química que cataliza, con la palabra terminada en -asa. Por ejemplo, lactasa proviene de su sustrato lactosa; alcohol deshidrogenasa proviene de la reacción que cataliza que consiste en "deshidrogenar" el alcohol; ADN polimerasa proviene también de la reacción que cataliza que consiste en polimerizar el ADN. La Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular ha desarrollado una nomenclatura para identificar a las enzimas basada en los denominados Números EC. De este modo, cada enzima queda registrada por una secuencia de cuatro números precedidos por las letras "EC". El primer número clasifica a la enzima en base a su mecanismo de acción. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 33 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. A continuación se indican las seis grandes clases de enzimas existentes en la actualidad: 1.7.3.1. EC1 ÓXIDO-REDUCTASAS Reacciones de oxido-reducción: Si una molécula se reduce, tiene que haber otra que se oxide, catalizan reacciones de oxido reducción o redox. Precisan la colaboración de las coenzimas de oxido reducción (NAD+, NADP+, FAD) que aceptan o ceden los electrones correspondientes. Tras la acción catalítica, estas coenzimas quedan modificadas en su grado de oxidación, por lo que deben ser recicladas antes de volver a efectuar una nueva reacción catalítica. Ejemplos: Deshidrogenasas Amino oxidasa Deaminasas Catalasas. Peroxidasas. 1.7.3.2. EC2 (KINASAS) TRANSFERASAS Transferencia de grupos funcionales: grupos aldehídos grupos acilos grupos glucosilos grupos fosfatos Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura de ciertas moléculas) a otras sustancias receptoras. monosacáridos, Suelen aminoácidos, actuar en etc. procesos de Ejemplos: interconversión transaminasas, de quinasas, Transaldolasas, Transcetolasas. 1.7.3.3. EC3 HIDROLASAS Reacciones de hidrólisis, transforman polímeros en monómeros. Actúan sobre: enlace éster enlace glucosídico Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 34 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Catalizan reacciones de hidrólisis con la consiguiente obtención de monómeros a partir de polímeros. Actúan en la digestión de los alimentos, previamente a otras fases de su degradación. La palabra hidrólisis se deriva de hidro → 'agua' y lisis → 'disolución'. Ejemplos: glucosidasas, lipasas, esterasas, Peptidasas y Fosfatasas. 1.7.3.4. EC4 ISOMERASAS Actúan sobre determinadas moléculas obteniendo de ellas sus isómeros funcionales o de posición, es decir, catalizan la racemización y cambios de posición de un grupo en determinada molécula obteniendo formas isoméricas. Suelen actuar en procesos de interconversión. Ejemplo: Epimerasas (mutasa). Aldolasas Decarboxilasas 1.7.3.5. EC5 LIASAS Adición a los dobles enlaces: Entre C y C Entre C y O Entre C y N Catalizan reacciones en las que se eliminan grupos H2O, CO2 y NH3 para formar un doble enlace o añadirse a un doble enlace. Ejemplos: descarboxilasas, liasas, Isomerasas de azúcar, Epimerasas y Mutasas. 1.7.3.6. EC6 LIGASAS O SINTETASAS Formación de enlaces, con aporte de ATP Entre C y O Entre C y S Entre C y N Entre C y C Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 35 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Catalizan la degradación o síntesis de los enlaces denominados "fuertes" mediante al acoplamiento a moléculas de alto valor energético como el ATP. Ejemplos: sintetasas, carboxilasas, Peptidosintetasas. 1.7.4. ACOMPAÑANTES NO PROTEICOS DE LAS ENZIMAS 1.7.4.1. COFACTORES Son iones inorgánicos que se unen temporariamente a las enzimas Ejemplos: Hierro Fe 2+ o Fe 3+ Oxidación / reducción Cobre, Cu + o Cu 2+ Oxidación / reducción Cinc, Zn2+ Ayuda a unir el NAD 1.7.4.2. COENZIMAS Moléculas pequeñas que tiene carbono, interaccionan débilmente durante la catálisis. La mayor parte de las coenzimas son vitaminas, muchas de las cuales deben ser incorporadas con la dieta. Biotina: Transporta Coenzima A: -COO- Transporta -CH2-CH3 NAD y FAD Transportan electrones 1.7.4.3. GRUPOS PROSTETICOS Están permanentemente unidos a las enzimas Hemo: Une iones O2 y electrones, contiene el cofactor hierro Flavina: Une electrones Retinal: Cofactor en la absorción de la luz Las coenzimas reaccionan con la enzima de igual modo que el sustrato, uniéndose al sitio activo. Se mueven de una enzima a otra agregando o quitando grupos químicos del sustrato Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 36 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. CAPÍTULO II OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 37 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 2.1. ETAPAS DE TRANSGÉNICO LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO 2.1.1. PRINCIPIOS DE LAS TÉCNICAS CON ÁCIDOS NUCLEICOS Uno de los objetivos principales de la biotecnología moderna es lograr que una célula realice una tarea específica y útil de manera predecible y controlable. Por ejemplo, que las células de la planta de maíz produzcan una nueva proteína que sea capaz de eliminar a insectos que se alimentan de ella. Esto sería útil ya que permitiría reducir el uso de insecticidas químicos y aumentaría la productividad para el agricultor. En la actualidad, la biotecnología moderna permite lograr este tipo de maíz. La mayoría de estas técnicas permiten estudiar biomoléculas, en particular ADN, ARN y proteínas, y se las denomina técnicas de biología molecular. Por otra parte, se denomina ingeniería genética a las técnicas que se usan específicamente para transferir genes de un organismo a otro y construir fragmentos de ADN recombinante (combina ADN de diferentes organismos). Así, es posible obtener las proteínas recombinantes de interés y también mejorar cultivos y animales. Las técnicas de biología molecular y de ingeniería genética se basan en una característica particular que tienen los ácidos nucleicos: las bases A (adenina), T (timina), C (citosina) y G (guanina) que forman parte de las moléculas de ADN y de ARN tienen la capacidad de hibridar con bases complementarias siguiendo siempre la siguiente regla: A se une con T y C se une con G. Fig. 2.1. Estructura de una molécula de ARN de transferencia (ARNt) con regiones de bases complementarias (en círculos rojos). La molécula de ARN, si bien mayormente es una única hebra, tiene la posibilidad de aparearse con otra, e incluso de plegarse y formar regiones complementarias dentro de la misma molécula. 17 “Biología” de Helena Curtis y N. Sue Barnes, 6ta Edición (2000) Editorial Panamericana. Capítulo 16: “DNA recombinante: las herramientas del oficio”. 17 Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 38 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Así, si un investigador busca estudiar un gen de interés, basta con conocer al menos una parte de su secuencia, para poder construir una porción complementaria que permita “pescar” de algún modo a ese gen de interés. Esa porción pequeña de ácido nucleico se denomina “sonda” y al sintetizarla en el laboratorio se le suele poner alguna marca que permita visualizarla luego fácilmente (por ejemplo, fluorescencia), como se representa en la siguiente imagen. Fig. 2.2. Sonda de ADN marcada que hibrida con una secuencia de ADN complementaria 18. Otro principio subyacente en las técnicas de biología molecular es que el ADN, debido a su estructura química y molecular, es mucho más estable que el ARN, por lo cual la mayoría de las técnicas más fácilmente manipulables son con ADN. Por último, las enzimas que se usan para cortar y pegar fragmentos de ADN, o para sintetizar fragmentos de ADN, provienen de organismos. Estas enzimas se mejoran para que trabajen eficientemente en las condiciones de laboratorio. 2.1.2. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO La obtención de un transgénico implica la participación de un organismo que dona el gen de interés y un organismo receptor del gen que expresará la nueva característica deseada. Para el caso particular de la producción de una variedad de maíz que resista el ataque de insectos, el organismo dador es la bacteria del suelo denominada Bacillus thuringiensis (Bt corn) de la cual se extrae el gen que determina la síntesis de la proteína insecticida, y el organismo receptor del gen es la planta de maíz. Las etapas del trabajo son básicamente cinco que a continuación se detalla cada una de estas y las técnicas que involucran. 18 Sonda de ADN marcada que hibrida con una secuencia de ADN complementaria. Fuente: “Las sondas de ácidos nucleicos” por Rodolfo Wettstein en Ciencia Hoy, Volumen 4 -Nº 20- Setiembre /octubre 1992 Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 39 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 2.1.2.1. CORROBORAR QUE EXISTE UN GEN QUE CODIFICA PARA LA CARACTERÍSTICA DE INTERÉS Cuando se encuentra una característica en un organismo que resulta interesante para transferir a otro organismo debe verificarse que es producto de un gen. Para verificar que la característica de interés está codificada en el ADN y que no es resultado de la interacción con el medioambiente, se aplican técnicas de genética. Si la característica se atribuye a una proteína, que es producto directo de un gen, será más sencillo transferir esa característica a un organismo que no la tiene. 2.1.2.2. CLONADO DEL GEN Una vez que se determinó que el organismo donante posee un gen que codifica para la característica de interés, los biólogos moleculares se lanzan a la tarea de conseguir ese gen, es decir: “clonar” el gen. Clonar un gen significa tenerlo puro en el tubo de ensayos, o mejor aún, dentro de un vector (una molécula mayor de ADN que permite guardar fragmentos de ADN en forma estable y práctica por más tiempo). La tarea de clonar involucra varias técnicas que se describen a continuación: a) Extracción de ADN. Las extracciones de ADN de todos los organismos guardan cierta similitud y consisten en romper las células para liberar su contenido y separar el ADN liberado del resto de los componentes celulares. b) Búsqueda de un gen entre la mezcla de genes del ADN. Si se conoce una pequeña porción de la secuencia del gen que se está buscando, es posible construir una sonda que permita “pescar” el fragmento de ADN que contiene esa misma secuencia. Una vez aislado ese fragmento se lo estudia más detalladamente. La técnica de PCR (siglas en inglés de Reacción en Cadena de la Polimerasa) permite amplificar la cantidad de ADN y esto facilita el clonado del gen de interés. La técnica de PCR se le estudia en el capítulo IV. c) Una vez terminada la PCR, se realiza una técnica conocida como “electroforesis en gel de agarosa” para visualizar los millones de fragmentos de ADN de interés. Esta técnica consiste en armar un gel de agarosa, con pequeños huecos en un extremo donde se deposita (“siembra”) el contenido del tubo de PCR. El gel es Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 40 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. sometido a corriente eléctrica de modo que el ADN, que es una molécula cargada negativamente, se desplaza por el gel hacia el polo positivo. Cuanto más pequeño es el fragmento de ADN más rápido se desplaza y llega hasta el extremo opuesto. Al preparar el gel se agrega la sustancia bromuro de etidio que se intercala entre las bases del ADN y permite visualizarlo al ser iluminado con luz UV. Las bandas luminosas corresponden a los fragmentos de ADN amplificados. d) Una vez que se visualizó el resultado del PCR en el gel de agarosa, la “bandita” del gel que contiene el ADN de interés se recorta y se purifica el ADN. Luego se realiza la secuenciación que consiste en conocer la cantidad y el orden en que se ubican los nucleótidos en el fragmento de ADN analizado. Actualmente se realiza en un secuenciador automático utilizando nucleótidos marcados fluorescentemente, que son leídos por un láser acoplado a una computadora. e) Construcción del vector recombinante: Esta etapa consiste en “recortar y pegar” ADN para insertar el gen de interés dentro de un vector. Para recortar el ADN se utilizan enzimas de restricción y para pegar fragmentos de ADN se utilizan enzimas ligasas. Como muestra la imagen el vector abierto y el fragmento de interés se agregan al tubo de ensayos en presencia de la enzima ligasa. Al fragmento de ADN dentro del vector se denomina “inserto” y el nuevo vector se conoce como “vector recombinante”.19 Sonda de ADN marcada que hibrida con una secuencia de ADN complementaria. Fuente: “Las sondas de ácidos nucleicos” por Rodolfo Wettstein en Ciencia Hoy, Volumen 4 -Nº 20- Setiembre /octubre 1992 19 Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 41 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 2.1.2.3. MODIFICAR EL GEN La ventaja de tener el gen clonado en un vector, es que se puede transferir a una bacteria que, al multiplicarse en el laboratorio, también multiplica al vector que porta. De esta forma se logra tener millones de copias del vector recombinante para poder modificar el inserto que lleva dentro. Modificar el inserto significa agregarle pequeñas secuencias de ADN, mediante el uso de ligasas, necesarias para que el gen funcione correctamente en el organismo receptor. Por ejemplo: si se clona un gen Bt de una bacteria para luego ponerlo en maíz, se debe agregar un promotor que funcione bien en plantas, es decir, que permita que las células vegetales expresen la proteína Bt. El promotor es una región fundamental del gen ya que determina cuándo y dónde se expresará el gen. 2.1.2.4. TRANSFERIR EL GEN AL ORGANISMO RECEPTOR El gen de interés se puede introducir en células vegetales o animales y dar lugar a la formación de un organismo genéticamente modificado (OGM) o transgénico. La introducción de nuevos genes por ingeniería genética en plantas origina los llamados cultivos transgénicos o genéticamente modificados (OGM). En la producción de estos cultivos hay una primera etapa en la que se introduce el gen de interés en las células vegetales. Este proceso también se denomina transformación. En muchas especies vegetales (especialmente en las dicotiledóneas) es posible introducir genes a través de una bacteria del suelo, llamada Agrobacterium tumefaciens. Para las monocotiledóneas se ha desarrollado un método alternativo, denominado “bombardeo con micropartículas”. La segunda etapa consiste en regenerar una planta completa a partir de la única célula transformada. El resultado es una planta completa que lleva el gen de interés en cada una de sus células. Por último se realiza el mejoramiento por cruzamiento para transferir el gen incorporado a variedades de alto rendimiento. Existen varias técnicas para transferir genes a células de mamíferos con el objetivo de que se integre al genoma. Una de ellas es la microinyección del ADN de interés directamente en un óvulo fecundado. Los cigotos así obtenidos son luego implantados en el útero de una madre adoptiva, o receptora, que ha sido preparada hormonalmente para poder llevar adelante la gestación. Otra técnica consiste en Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 42 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. transferir el gen de interés a las células de un embrión de mamífero que proliferan in vitro. Cuando el embrión sigue su desarrollo en el útero de una madre receptora, se forma un animal con células transgénicas. 2.1.2.5. CARACTERIZAR EL ORGANISMO RECEPTOR TRANSFORMADO. Una vez obtenido el OGM, se debe demostrar, entre otras cosas, si tiene una (o más) copias del transgén, y cómo y en qué tejidos se expresa el gen. Para lograrlo se extrae el ADN del organismo y se lo analiza. La técnica de PCR, ya explicada, permite amplificar el transgén, si es que está en el genoma del organismo, y es una técnica rápida para verificar si el organismo ha sido transformado o no. Para estimar cuántas copias del gen se insertaron en el genoma del organismo se utiliza la técnica denominada Southern Blotting que se representa en la siguiente ilustración: Representación esquemática de la técnica de Southern Blot. En este ejemplo se analiza la presencia de un cierto gen en ADN de tres individuos. Esta técnica consiste en extraer ADN del organismo en estudio, fragmentar el ADN en forma aleatoria con enzimas de restricción, someter los fragmentos de ADN a electroforesis en gel de agarosa, y transferir los fragmentos de ADN desde el gel a una membrana (de nitrocelulosa o nylon). Luego, para detectar cuántas copias del transgén quedaron integradas al genoma del organismo, se utilizan sondas marcadas (radioactivamente, con fluorescencia, u otros métodos). La membrana se baña en una solución que contiene la sonda y se “revela” (como una radiografía) para ver si quedó marca en algún fragmento de ADN. En la ilustración las tres muestras de ADN poseen al menos una copia del gen transferido. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 43 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Para analizar en qué tejido, momento y cantidad se expresa el gen se analiza la presencia del ARN mensajero y de la proteína codificados por el transgén (proteína recombinante), mediante técnicas específicas denominadas Northern blot (para el ARNm), y Western blot y ELISA (para las proteínas). 2.2. CLONADO DEL GEN. 2.2.1. PRINCIPIOS DE CLONACIÓN MOLECULAR La denominación "ADN recombinante" se refiere a combinaciones muevas de ADN creadas entre secuencias o fragmentos de esta molécula y moléculas de ADN bacteriano (o de otra clase) capaces de duplicarse indefinidamente en el laboratorio (Freifelder, 1983). En este proceso, primero se obtiene un fragmento del ADN de interés denominado inserto, el cual se une a otra molécula de ADN (generalmente de mayor tamaño) llamado vector. Posteriormente se lleva a cabo el proceso de clonación molecular en sí, en el cual se introduce el ADN recombinante en una célula receptora y esta finalmente al multiplicarse da lugar a nuevas células con similares características a ella; obteniéndose de esta manera lo que se denomina un clon. Por consiguiente un clon no es más que un grupo grande de células, moléculas de ADN o bacterias que surge de una célula o molécula ancestral y son idénticas a esta; y clonación es el proceso que le da origen. Las células receptoras del ADN híbrido pueden ser tanto procariotas como eucariotas y el proceso de introducción del mismo se denomina transformación para las primeras y transfección para las segundas. 2.2.2. PASOS A SEGUIR PARA UNA CLONACIÓN MOLECULAR 2.2.2.1. UNA FUENTE ADECUADA DE ADN Las fuentes más importantes de ADN para clonación son el ADN genómico (cromosómico) que contiene los genes completos y lo que se conoce como ADN complementario (ADNc) que se obtiene a partir del ARN mensajero (ARNm) bajo la acción de la enzima transcriptasa reversa o transcriptasa inversa. Esta enzima es capaz de sintetizar ADN a partir del ARN el cual le sirve como molde. El empleo de una u otra fuente depende de los objetivos que se persigan con el estudio a realizar. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 44 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 2.2.2.2. VECTORES DE CLONACIÓN (ADN RECOMBINANTE) Un vector de clonación es una molécula pequeña de ADN que puede replicarse de manera autónoma en un huésped (células bacterianas o de levaduras), a partir de las cuales es posible aislarlo en forma pura para el análisis. Los vectores se utilizan para clonación porque pueden seguir su desarrollo normal a pesar de que secuencias adicionales de ADN sean incorporadas en su material genético; se autorreplican utilizando la maquinaria enzimática de la célula huésped, y en este proceso, no se mezclan con el ADN genómico de la célula. Debido a que los vectores de clonación pueden generar un gran número de copias por célula, ya que los huéspedes bacterianos o de levaduras pueden crecer indefinidamente en el laboratorio, es posible obtener grandes cantidades de secuencias del ADN de interés. Cierto número de vectores se utiliza de modo común para este propósito, cada uno con ventajas y limitaciones y dentro de ellos tenemos: PLÁSMIDOS: Son moléculas circulares de ADN de doble cadena que se replican de modo extracromosómico en bacterias, o menos comúnmente en levaduras. En ellos se encuentran genes que le confieren al organismo que los posee resistencia a algunos antibióticos, así como genes involucrados en la producción de toxinas y la degradación de productos naturales. BACTERIÓFAGOS: Son virus que infectan a las bacterias y están constituidos, según su clase, por un núcleo de ADN o ARN y una cubierta proteica; algunos presentan una cola, y son incapaces de replicarse autónomamente por lo que necesitan infectar a la célula para poder hacerlo. Dentro de los fagos más utilizados como vehículos moleculares de clonación, se encuentran la lambda y sus derivados. CÓSMIDOS: Son básicamente plásmidos que emplean la habilidad de las partículas infecciosas del bacteriófago para "empaquetar" de manera eficiente grandes piezas lineales de ADN e introducirlas en las células bacterianas. Estos vectores se reproducen de igual manera que los plásmidos en las bacterias. "CROMOSOMAS ARTIFICIALES" DE LEVADURA: Además de los vectores anteriormente mencionados, existe otro tipo que permite clonar hebras de ADN de gran tamaño y que se conocen como cromosomas artificiales de levadura. Este tipo de vector es capaz de replicarse en el huésped Saccharomyces cerevisiae (levadura Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 45 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. común usada en panadería) y tiene la estructura semejante a los cromosomas de levadura normales. ENZIMA: Permitan la escisión o corte en sitios específicos del fragmento de ADN a clonar y su posterior fusión con el vector: Existe un grupo de enzimas con funciones diferentes que tienen gran aplicación en ingeniería genética; de ellas ya se ha mencionado a la transcriptasa inversa. Nos referiremos con más detalle ahora a las endonucleasas de restricción o enzimas de restricción y a la ADN ligasa como útiles herramientas en el proceso de clonación de genes. 2.2.2.3. MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN O TRANSFECCIÓN CELULAR: Una vez obtenido el ADN recombinante, el próximo paso es introducirlo dentro de una célula huésped que le ofrezca la maquinaria necesaria para su autorreplicación los más empleados son: electroporación, transfección mediada por calcio-fósforo o DEAE-dextrán, empleo de polibreno, fusión de protoplastos, empleo de liposomas, microinyección directa al núcleo, uso de virus, entre otros. 2.2.2.4. MÉTODOS PARA ANALIZAR LOS CLONES RESULTANTES HASTA LA IDENTIFICACIÓN DEL QUE CONTIENE EL GEN DE INTERÉS . Un importante paso en el proceso de clonación es la identificación de aquel clon o clones que contienen el ADN recombinante. Aún en las mejores condiciones los plásmidos se mantienen de forma estable sólo en una minoría de la población bacteriana. Para identificar estos transformantes se emplean varios métodos, los cuales también solamente serán mencionados. Así tenemos los ensayos de hibridación, los métodos inmunológicos (anticuerpos radiactivos, inmunoprecipitación), el empleo de marcadores de selección, etc. Entonces la Clonación consiste en la obtención de un gran número de fragmentos idénticos a partir de uno original. Para ello se aísla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc.) que tras introducirlo dentro de una célula va a permitir su replicación por cultivo. Una vez replicado considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 46 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran número de copias del fragmento de interés. 2.3. ELECTROFORESIS 2.3.1. FUNDAMENTO DE LA ELECTOFORESIS Esta técnica permite separar fragmentos de ADN en función de su tamaño al aplicar una corriente eléctrica a un gel en el interior del cual se ha introducido una mezcla de fragmentos. Éstos comienzan a moverse desde el polo negativo al polo positivo de tal modo que los fragmentos más pequeños se mueven más rápido que los más grandes. Cuando la corriente cesa, los fragmentos de ADN se han distribuido a lo largo del gel, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un código de barras. Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamaño determinado. Adicionalmente puede utilizarse una secuencia complementaria de un ADN como sonda para buscar un fragmento específico en el patrón de bandas. Por ejemplo, los científicos pueden usar el ADN encontrado en la sangre presente en la escena de un crimen como sonda para buscar fragmentos complementarios en electroforesis conteniendo ADN obtenido de diversas personas sospechosas. Esta separación se realiza en un gel, que es una malla compleja de moléculas poliméricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el rango desde unos Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 47 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 pares de bases. La poliacrilamida es preferible para la separación de fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos. El fundamento de esta separación está basado en que las moléculas de ácidos nucleicos están cargadas negativamente (al pH y condiciones del tampón en el que se encuentran) y al someterlas a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo de este a través del gel, a velocidades que dependen de sus tamaños: una molécula pequeña puede seguir su camino a través del gel más fácilmente que una molécula grande. Las velocidades de migración de las moléculas de ácidos nucleicos, son inversamente proporcionales a los logaritmos de sus pesos moleculares. La detección tras la migración se realiza fácilmente gracias al empleo de un colorante intercalante (se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos) que contiene el propio gel y es visualizado al emitir luz visible cuando el gel se ilumina con luz ultravioleta. Un factor a tener en cuenta para valorar la migración de los ácidos nucleicos en un gel además de su tamaño es la configuración espacial que adopte la molécula. El peso molecular de los ácidos nucleicos se mide con las siguientes unidades: DNA: en pares de bases o bp. RNA: en nucleótidos o nt. Proteínas: en Daltons o Da. 2.3.1.1. ELECTROFORESIS DEL ADN EN GEL DE AGAROSA. Electroforesis a través de geles de agarosa es el método estándar para separar e identificar fragmentos de ADN. La técnica es simple, rápida y capaz de resolver fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otro procedimiento. La localización del ADN dentro del gel puede ser determinada directamente por tinción con el agente intercalador fluorescente Bromuro de Ethidium; bandas que contienen cantidades tan pequeñas como 10 ng de ADN, Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 48 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. pueden ser detectadas a simple vista examinando el gel bajo luz ultravioleta. La corrida electroforética se realiza colocando el gel que contiene el ADN en un campo eléctrico, y las moléculas migran a una velocidad que es inversamente proporcional al log10 de su talla en pares de bases. Esta velocidad de migración está también afectada por la concentración de la agarosa en el gel, la conformación del ADN, el voltaje, la composición de bases, la presencia de agentes intercalantes, la temperatura y la composición del tampón de corrida. Los plásmidos con exacto número de bases pero con diferente conformación, tienen velocidades de migración diferentes. 2.4. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN DEL ADN 2.4.1. EXTRACCIÓN DE ADN Para la extracción del ADN humano se pueden tomar diferentes fuentes: Sangre, Saliva, Semen, Hisopado vaginal, Restos de fluidos en ropa, Orina, Piel, Bulbo piloso, Muestras de biopsias de órganos/tejidos, Material cadavérico (ej. huesos), etc. 2.4.2. ALMACENAMIENTO DEL ADN Se separa el ADN de otras fases orgánicas celulares y se almacena de la siguiente manera: El ADN purificado refrigerado a 4 ° C se conserva hasta 3 años. Aquellas muestras que necesitan mantenerse más de 3 años deberán congelarse a -70 ° C. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 49 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 2.4.3. CONSERVACIÓN DEL ADN EN TEJIDO FRESCO Si se trata de tejido fresco (semen, biopsias, sangre, sedimento urinario, líquidos, heces, etc.), un máximo de: 3 meses un refrigeración, 5 años a -20ºC, o 10 años a -80ºC. Si se trata de material en parafina, no necesita refrigeración porque se encuentra ya fijado con formol. Si se trata ya de ADN o ARN deben almacenarse a -20ºC, si se mantiene en condiciones óptimas sin pasar por cambios de temperatura, congelamientos y descongelamientos numerosos, la muestra estará vigente por más de 10 años. NOTA: el tiempo de validez de la muestra dependerá de su finalidad, en caso de muestras para diagnóstico lo óptimo es su utilización inmediata pero si se trata de investigación, el tiempo puede ser más amplio. Para evitar una degradación tanto de las muestras como de los reactivos, se debe trabajar siempre sobre hielo así como de alicuotar todo el material para evitar los sucesivos descongelamientos. 2.5. NORMAS EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR. 2.5.1. POSIBLES CONTAMINACIONES EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Las reacciones moleculares al ser sumamente sensibles, necesitan un tratamiento especial para evitar cualquier tipo de contaminación.La manipulación con guantes limpios es primordial para garantizar que el material genético de las diferentes muestras no se degrade por la acción de nucleasas (DNAsas y RNAsas) presentes en la piel y mucosas del operario. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 50 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Cada muestra debe ser procesada de manera individual y con material desechable y no hablar o pasar las manos y el material sobre las muestras con los tubos abiertos. Las muestras deben ser debidamente rotuladas el momento mismo en el que lleguen al laboratorio y mmantener la cadena de frío para evitar degradación de muestras. 2.5.2. ORGANIZACIÓN ESPACIAL DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Instrumentos totalmente necesarios para que cada una de las áreas funcione de forma autónoma e independiente. Entre dichos instrumentos estarán aquellos dedicados a: 1. la correcta preparación de tampones, sales, soluciones de lisis o soluciones de purificación del ADN /ARN, 2. la obtención y cuantificación del ADN/ARN a partir de distintas muestra biológicas, 3. la amplificación en solución e “in situ” de ADN/ARN, 4. hibridación de ADN/ARN, 5. separación de las moléculas de ADN/ARN en geles de agarosa o de poliacrilamida y, 6. visualización de las moléculas de ADN/ARN una vez separadas en gel. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 51 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 2.5.3. OBTENCIÓN DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN. A un laboratorio de Biología Molecular de tipo clínico llegan distintos tipos de muestras, cada una con sus peculiaridades a la hora de analizar y obtener su ADN “A priori” se plantean dos situaciones diferentes. Si lo que se pretende es conocer la ubicación física del ADN/ARN de interés en un corte histológico se deberá proceder a estudios “in situ”, mientras que si no es necesario conocer dicha ubicación será suficiente con obtener el ADN celular en solución. El ADN en solución es una mezcla de ADN mitocondrial, nuclear eucariota y viral/bacteriano si estuvieran presentes en la muestra virus/bacterias. Centrándose en la obtención de ADN en solución existen diferentes métodos de lisis: lisis diferencial, lisis neutra... Una vez realizada la lisis, la solución de ADN obtenida no siempre es apta para utilizar en las reacciones posteriores de amplificación, restricción, marcaje o secuenciación, por lo que es conveniente por un lado separar el ADN del resto de macromoléculas que lo acompañan, preferentemente proteínas, proceso que suele realizarse con ayuda de solventes orgánicos (fenol y cloroformo) y, por otro separar el ADN de aquellas moléculas de pequeño tamaño con actividad inhibidora presentes en la solución de ADN. El ADN una vez limpio de proteínas y/o pequeñas moléculas puede ser utilizado directamente, si bien en la mayoría de las situaciones es necesario concentrarlo mediante ultrafiltración o precipitación con alcohol. El sistema de valoración de la concentración de ADN será función de cuales han sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza del ADN obtenido. Pueden emplearse desde métodos altamente sensibles y exactos como la espectrofotometría y fluorometría, hasta métodos aproximativos, tales como la comparación del grado de fluorescencia respecto a un control de concentración conocida. Una vez conocida la concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el propósito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR. En ciertos casos la simple detección del fragmento amplificado tiene valor diagnóstico por sí mismo. La metodología empleada para la detección puede ser: Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 52 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 1. separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o poliacrilamida (Ej. detección de infección por virus de la hepatitis, SIDA, HPV oncogénicos...). En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de características conocidas (Ej. movilidad de un exón mutado del gen supresor p53 en relación al mismo exón normal...), o bien, 2. detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimétrico o quimioluminiscente. Por el contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas: 1. Corte con enzimas de restricción. Los fragmentos generados en la restricción se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificación HPV, genotipado ApoE...). 2. Hibridación. Los fragmentos generados en el PCR se separan en gel de agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN sonda marcada (Ej. Tipificación de los genes HLA Clase II...). 3. Secuenciación. Los fragmentos generados durante la reacción de secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej. Secuenciación de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas enfermedades...). Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 53 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. CAPÍTULO III TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 54 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 3.1. PASOS PREVIOS A LA HIBRIDACIÓN Podemos clasificar las metodologías de análisis del ADN en aquellas que buscan su multiplicación, ya in vivo, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ya in vitro, como la clonación, y aquellas que explotan las propiedades específicas de elementos concretos, o de genomas adecuadamente clonados. Es el caso de la secuenciación de ADN y de la hibridación con sondas específicas ("southern blot" y chips de ADN).La hibridación molecular es uno de los pilares de la mayor parte de las metodologías que se utilizan en el laboratorio de biología molecular. Un grupo de estas técnicas se ha diseñado para identificar determinadas secuencias en los ácidos nucleicos. La hibridación se refiere al apareamiento específico que ocurre entre cadenas de ácidos nucleicos con secuencias complementarias, proceso que es análogo a la reacción antígeno-anticuerpo, pero con la diferencia de que en la hibridación en lugar de anticuerpos se emplean las llamadas sondas. Las sondas no son más que fragmentos cortos de ADN o ARN sintetizados in vitro y que se marcan con sustancias radiactivas fluorescentes o de otro tipo a fin de hacer posible su posterior detección y de esta manera la identificación de la secuencia de ADN o ARN de interés. Para poder realizar Hibridación en una muestra de ADN se necesitan realizar los siguientes pasos Previos a la Hibridación: 1. Separación de fragmentos Extracción de ADN Fragmentar el ADN en porciones más pequeñas (Enzimas de restricción) Separar los fragmentos realizando una corrida electroforética usando como sustrato de migración un gel (separación por tamaño) 2. Inmovilización de los fragmentos en soporte sólido Desnaturalización con solución alcalina (simple cadena) Transferencia a soporte sólido (membrana de nylon / nitrocelulosa): Por capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana Se agrega solución (NaCl) para evitar rehibridación previa a colocar la sonda. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 55 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 3.2. MÉTODOS HIBRIDACIÓN DE LABORATORIO Existen hibridaciones que son muy empleadas en Biología Molecular: experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en las técnicas de laboratorios: Tipo Southern o Southern blot, para uniones ADN-ADN (DNA cortado con enzimas de restricción e hibridado con una sonda de DNA) y Tipo northern o Northern Blot, para uniones ADN-ARN (RNA separado e hibridado con sondas de DNA o RNA). Estas técnicas consisten en una separación inicial de las moléculas en base a su peso molecular mediante electroforesis, trasferencia capilar de estas moléculas a un filtro de papel o de nylon, fijación, hibridación con la sonda de interés y detección. Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físicoquímico, bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida. A continuación se señalan diferentes procedimientos de laboratorio que utilizan el principio de hibridación y en los que la variación está dada por el tipo de ácido nucleico utilizado, el soporte en que se lleva a cabo la hibridación y la forma de colocar los ácidos en la membrana. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 56 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 3.2.1. EL MÉTODO DE HIBRIDACIÓN SOUTHERN O SOUTHERN BLOT: El método recibe su nombre en honor a su inventor, el biólogo inglés Edwin M. Southern en 1975. Sirve para la detección de genes específicos en el ADN celular o secuencias específicas de ADN. Debido a que la transferencia del ADN del gel a la membrana se produce por capilaridad, con el mismo principio utilizado por años para limpiar manchas con papel secante, el proceso se conoce en inglés como blotting; Southern propuso utilizar el término blot (secado) o blotting para referirse a esta técnica y actualmente se conoce como Southern blot. Para llevar a cabo hibridaciones de este tipo, se aísla el ADN de un tejido o línea celular, luego se purifica, y se digiere con enzimas de restricción específicas. Los fragmentos generados se separan mediante electroforesis y después son transferidos a la membrana que sirve de soporte (gel de agarosa). Este proceso se lleva a cabo colocando el gel de agarosa sobre papel filtro previamente remojado en una solución llamada de transferencia (solución salina concentrada). A continuación se sitúa la membrana sobre el gel y encima de esta una pila de papel filtro seca, y por capilaridad la solución de transferencia es atraída a la pila de papel filtro, arrastrando consigo al ADN hacia la membrana, donde queda inmovilizado conservando la misma posición relativa que ocupaba en el gel. Luego, el ADN puede ser hibridado en la membrana con una sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo. La sonda está situada en el filtro en la posición del fragmento de secuencia complementaria, que es una posición fija fácilmente localizable en el gel. Esta técnica se ha empleado para el diagnóstico y caracterización de diversas inmunodeficiencias, la distrofia muscular de Duchenne, la hipoplasia adrenal congénita, la deficiencia de glicerol-quinasa, la distrofia miotónica severa y en análisis de mutaciones de genes en células B de leucemia linfoblástica crónica, entre otras enfermedades. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 57 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 3.2.2. NORTHERN O NORTHERN BLOT Es una variante del método anterior, el procedimiento que se sigue es similar al Southern en el lugar de utilizar ADN como sustrato de estudio, se emplea ARN. Se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el método Northern sirve para identificar ARN. El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica. Esta técnica se ha aplicado en estudios de la modulación de la síntesis de interleucina 6 en pacientes con artritis reumatoide, en el análisis de expresión de receptores que participan en la síntesis de moléculas en cultivos celulares, en análisis de mutaciones y alteraciones del RNAm de enzimas, y en la regulación de la expresión génica de marcadores moleculares de células leucémicas humanas y moléculas del reconocimiento inmunológico. 3.2.3. WESTERN BLOT También se han desarrollado técnicas semejantes que permiten la detección de secuencias dadas de ARN o de proteínas específicas (técnica Western, basada en el uso de anticuerpos). No es un método de análisis directo de los ácidos nucleicos, sino del producto de la expresión de los genes, o sea las proteínas. Aunque difiere de los anteriores en cuanto a que no existe hibridación, sino que la identificación de las proteínas se realiza con anticuerpos marcados, sí se mantiene el principio de la transferencia a la membrana que sirve de soporte posterior a la electroforesis y previo a la identificación, y por lo cual siguiendo el juego de palabras ha sido denominado de esta manera. Esta técnica permite el desarrollo de pruebas para diferenciar tipos de virus que infectan a células, se ha aplicado en estudios de la variabilidad individual de los niveles de determinadas enzimas, en la caracterización molecular de genes, etc. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 58 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 3.2.4. DOT BLOT Y SLOT BLOT Son procederes similares al Northern con la diferencia de que el ARN no es sometido a electroforesis sino que se sitúa directamente sobre la membrana. Este tipo de análisis requiere de un molde asociado a succión con vacío para colocar el ARN que puede producir círculos o puntos (dot blot) o hendiduras (slot blot). Este tipo de prueba es muy útil cuando se quieren estudiar gran número de muestras, pero tienen la limitante de no ofrecer información sobre el tamaño de las bandas del ARN hibridado. 3.2.5. HIBRIDACIÓN IN SITU (HIS) Es un método histoquímico que emplea a la biología molecular de la misma manera que la inmunohistoquímica utiliza los métodos de la inmunología. La especificidad de la hibridación in situ (HIS) se basa en la unión recíproca de una secuencia de oligonucleótidos (la sonda), con una secuencia complementaria de nucleótidos presente en las moléculas de ARN o ADN dentro del tejido. Entre las ventajas de esta técnica están su alto grado de resolución espacial que permite la localización de secuencias génicas a escala cromosómica, con lo que se pueden detectar translocaciones y otras alteraciones, así como también el estudio de expresión génica a escala celular y subcelular. Otra de sus ventajas es que se puede realizar en material fijado e incluido en parafina lo que permite realizar estudios retrospectivos en material de archivo. Por otra parte la cantidad de tejido requerido para realizar un estudio de HIS es mínima en comparación con otras técnicas de biología molecular. Permite la detección de genes o expresión de genes dentro del contexto morfológico de la célula o tejido. Para conseguirlo se requiere que el ácido nucleico sea liberado de su entorno celular para tener acceso la sonda, pero preservando la morfología para la consiguiente interpretación y análisis. Para ello se emplean fijadores especialmente de entrecruzamiento, como la formalina, paraformaldehido, glutaraldehido. Entre las principales aplicaciones de la HIS tenemos la detección de ARN o ADN de origen viral, el análisis de la expresión génica (detección de ARNm) y los análisis cromosómicos. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 59 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su observación al microscopio, junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo northern ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material orgánico utilizando técnicas imunohistoquímicas se puede conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas. También en esta categoría destaca el FISH, técnica de hibridación in situ, donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma, con la que comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un microscopio electrónico. La HIS con fluorescencia (FISH) es una importante herramienta de uso rutinario en investigación y con grandes posibilidades de aplicación en el diagnóstico de enfermedades neoplásicas, genéticas, estudios a nivel cromosómico, etc. Es una técnica desarrollada recientemente en la que un segmento de DNA marcado (una sonda), específico para una zona determinada de un cromosoma, se hibrida con preparaciones de cromosomas en metafase, profase o interface y luego se visualiza bajo un microscopio de fluorescencia Fig. 3.1. Hibridación in situ con fluorescencia. 20 20 Clinical Cytogenetics, Part 1, Mary Beth Dinulos, M.D. HuBio 554 Medical Genetics, Fall 1997, Dr. Marshall Horwitz, Univ. Washington. http://biomodel.uah.es/citogene/horwitz/cytogen1.htm Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 60 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 3.2.6. CHIP DE ADN El siguiente paso en el desarrollo de técnicas de hibridación ha llevado a la miniaturización de los filtros de nitrocelulosa y a la utilización de matrices microscópicas en forma de chip de ADN. De esta manera se pueden colocar en una matriz una inmensa cantidad de copias génicas diferentes y mediante un proceso de hibridación detectar todas aquéllas que tienen una secuencia parecida. Modificando las características de las moléculas presentes en la matriz así como cambiando las sondas utilizadas, las posibilidades de análisis de expresión que proporcionan los chip de ADN son enormes. 3.2.7. SONDAS DE PNA (PEPTIDE NUCLEIC ACID) Fueron inventadas en 1990 por un grupo de científicos daneses (Buchardt, Berg, Nielsen, Egholm). Son una nueva clase de sondas híbridas entre ácido nucleico y proteínas, diseñadas para la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos. Su estructura esta formada por una cadena de aminoácidos que forman el esqueleto principal, y a los cuales se les unen las bases nitrogenadas, siguiendo los parámetros conformacionales descritos por Watson y Crick. Las bases (A, T, C, G) están colocadas a la misma distancia que en el DNA Esta estructura hibrida le confiere una serie de características especiales: Son moléculas de simple cadena No están cargadas siendo el esqueleto principal flexible. Sus hibridaciones son rápidas, específicas y sensibles. Presentan una especificidad y sensibilidad mas elevada que los oligomeros DNA/RNA Hibrida bajo condiciones donde el DNA no puede. Enlaces más fuertes Moléculas muy estables y no son degradadas por proteasas ni nucleasas. 3.2.8. HIBRIDACIÓN DE COLONIAS BACTERIANAS Es un método empleado para identificar colonias bacterianas que contengan determinada secuencia de ácidos nucleicos de interés. La metodología consiste en Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 61 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. sembrar los clones sobre placas de Petri con agar para después de crecidos transferirlos a membranas de nylon o nitrocelulosa y luego realizar la hibridación. 3.2.9. MAPAS DE RESTRICCIÓN Esta técnica se basa en el principio de la enzimología de restricción donde de una molécula de ADN dada se obtendrán siempre los mismos fragmentos cada vez que sea expuesta a una enzima de restricción particular. La complejidad del mapa depende del tamaño de la molécula (a mayor número de bases será mayor el número de sitios de restricción) y del número de enzimas utilizadas. De esta forma, dos moléculas de ADN del mismo tamaño pueden ser fácilmente diferenciadas por los mapas de restricción que producen al tratarlas con las mismas enzimas. Este mismo principio lo utiliza el procedimiento denominado análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), pero aprovechando el hecho de la existencia de variaciones en la constitución genética de la población (polimorfismo genético), que hace que se observen diferencias entre los individuos en cuanto al número y longitud de los fragmentos producidos. La existencia de los RFLPs es la base de la técnica que se ha denominado huellas digitales del ADN y que permite establecer inequívocamente la relación padres e hijos, entre otras aplicaciones. 3.2.10. HIBRIDACIÓN DE ADN O RAMIFICADO (BRANCHED DNA) La metodología de hibridación con ADN ramificado o branched DNA (bDNA) se basa en hibridaciones consecutivas de sondas que reconocen por una parte la secuencia de ADN o ARN en estudio y por otra, secuencias introducidas a la reacción para amplificar la señal de hibridación. En este método la visualización del ADN blanco no depende de un proceso enzimático, como en la reacción de polimerasa en cadena, sino de la amplificación de la señal de hibridación. Esta metodología es altamente reproducible y se utiliza clínicamente en la cuantificación de carga génica en pacientes portadores del VIH, VHB y VHC. 2.3.11. cDNA MICROARRAY La tecnología de cDNA microarray se basa en la incorporación en un chip, similar al utilizado en computación, de 5.000 a 8.000 sondas que representan la totalidad de Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 62 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. los genes expresados por un microorganismo. De este modo se puede identificar los patrones de expresión bacteriana de acuerdo a distintas condiciones fisiológicas o patológicas. El principio de cDNA microarray es la hibridación, pero a diferencia de los métodos tradicionales, se utilizan múltiples sondas, las que unidas a un sistema cuantitativo de análisis, permiten identificar patrones de expresión génica. Esta metodología, aunque aún se encuentra a nivel experimental, tiene una proyección tan importante en clínica como la PCR. Figura Método de ADN ramificado (branched DNA) para cuantificación de ácidos nucleicos. El proceso comienza con la hibridación de las sondas de captura a una fase sólida. A continuación se produce la reacción de hibridación entre las sondas de captura y el ADN o ARN en estudio, lo cual es seguido de la introducción de la sonda de amplificación que contiene múltiples sitios para las sondas de revelado. Estas últimas están conjugadas con moléculas quimioluminiscentes de modo que la cantidad de luz emitida es proporcional a la cantidad de ADN o ARN hibridado. 3.3. PASOS DE LA HIBRIDACIÓN Se agrega la sonda sobre la membrana y se incuba Se lava para quitar el máximo de hibridaciones inespecíficas Se revela por autoradiografía 3.3.1. FUNDAMENTO DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS La hibridación o renaturalización de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una única molécula de doble cadena, que Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 63 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm), la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energía, están totalmente expuestos a la fuente emisora de energía. Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T; A=U; C≡G; G≡C; T=A ó U=A Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra rápidamente. Por el contrario, debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos, una simple variación de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión. El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que contiene a la molécula. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno; por tanto, y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos, dicha energía se traduce en una mayor temperatura. El %GC no es igual para todas las especies, es más, el %GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial, lo que nos da bastante juego en los protocolos de extracción de ADN, según que tipo vamos a estudiar y esto es importante, entre otros motivos porque existen enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el ADN mit. ¿Qué es una sonda? Una sonda es un fragmento monocatenario de DNA o RNA marcado con una molécula reporter, y que se emplea para el reconocimiento específico de una Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 64 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. molécula determinada de ácido nucleico diana de cadena sencilla, en un proceso de hibridación. Existen tres tipos de sonda de ácidos nucleicos: Fragmentos de DNA Fragmentos de RNA Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas. ¿Qué son las moléculas reporter? Son moléculas químicas unidas a la sonda y que van a permitir la detección de esta tras un proceso de hibridación. Existen moléculas reporter de muchos tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimáticas (Fosfatasa, Peroxidasa...) y quimioluminiscentes (ésteres de acridina). ¿Qué factores afectan a la sensibilidad y especificidad de la reacción de hibridación? Concentración del ácido nucleico diana Complementariedad sonda-ácido nucleico diana Concentración de la sonda. Longitud de la sonda Actividad específica de la molécula reporter. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 65 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Condiciones de hibridación(pH, fuerza iónica, temperatura de hibridación, Tm) Acceso al ácido nucleico diana. Formato de hibridación ¿Cuales son los formatos de hibridación? Hibridación en solución: La sonda y el ácido nucleico diana se encuentran en una solución líquida. Las condiciones de hibridación deben ser rigurosas. La velocidad de formación del dúplex en estas condiciones es alta. El problema de este tipo de hibridación es la eliminación de la sonda que no ha reaccionado, empleándose entre otros métodos la nuclease S1-precipitación con tricloroacético o la hibridación protección assay. Hibridación en fase sólida: El ácido nucleico diana o bien la sonda se encuentran inmovilizados en filtros. Estos pueden ser de nitrocelulosa (fijación por calor) o de nylon (fijación por luz ultravioleta). Una vez realizada la fijación se añade la sonda marcada que buscará su secuencia complementaria en el ácido nucleico diana que queremos identificar. La sonda que no reacciona, híbridos inestables o uniones inespecíficas son eliminados mediante lavados. Su sensibilidad es menor que la hibridación en solución. Actualmente también se ha conseguido fijar los ácidos nucleicos al plástico de las placas de microtitulación. 3.4. APLICACIONES DE LA HIBRIDACIÓN Fig. 8. Potenciales microorganismos aplicaciones Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta clínicas de la secuenciación de genomas Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular de - 66 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 3.4.1. INGENIERÍA GENÉTICA La investigación sobre el ADN tiene un impacto significativo, especialmente en el ámbito de la medicina, pero también en agricultura y ganadería (donde los objetivos son los mismos que con las técnicas tradicionales que el hombre lleva utilizando desde hace milenios - la domesticación, la selección y los cruces dirigidos - para obtener variedades de animales y plantas más productivos). La moderna biología y bioquímica hacen uso intensivo de la tecnología del ADN recombinante, introduciendo genes de interés en organismos, con el objetivo de expresar una proteína recombinante concreta, que puede ser: aislada para su uso posterior: por ejemplo, se pueden transformar microorganismos para convertirlos en auténticas fábricas que producen grandes cantidades de sustancias útiles, como insulina o vacunas, que posteriormente se aíslan y se utilizan terapéuticamente. necesaria para reemplazar la expresión de un gen endógeno dañado que ha dado lugar a una patología, lo que permitiría el restablecimiento de la actividad de la proteína perdida y eventualmente la recuperación del estado fisiológico normal, no patológico. Este es el objetivo de la terapia génica, uno de los campos en los que se está trabajando activamente en medicina, analizando ventajas e inconvenientes de diferentes sistemas de administración del gen (virales y no virales) y los mecanismos de selección del punto de integración de los elementos genéticos (distintos para los virus y los transposones) en el genoma diana. En este caso, antes de plantearse la posibilidad de realizar una terapia génica en una determinada patología, es fundamental comprender el impacto del gen de interés en el desarrollo de dicha patología, para lo cual es necesario el desarrollo de un modelo animal, eliminando o modificando dicho gen en un animal de laboratorio, mediante la técnica ‘’knockout’’. Sólo en el caso de que los resultados en el modelo animal sean satisfactorios se procedería a analizar la posibilidad de restablecer el gen dañado mediante terapia génica. utilizada para enriquecer un alimento: por ejemplo, la composición de la leche (una importante fuente de proteínas para el consumo humano y animal) puede modificarse mediante transgénesis, añadiendo genes exógenos y desactivando Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 67 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. genes endógenos para mejorar su valor nutricional, reducir infecciones en las glándulas mamarias, proporcionar a los consumidores proteínas anti patógenas y preparar proteínas recombinantes para su uso farmacéutico. útil para mejorar la resistencia del organismo transformado: por ejemplo en plantas se pueden introducir genes que confieren resistencia a patógenos (virus, insectos, hongos…), así como a agentes estresantes abióticos (salinidad, sequedad, metales pesados…). 3.4.2. MEDICINA FORENSE Los médicos forenses pueden utilizar el ADN presente en la sangre, el semen, la piel, la saliva o el pelo en la escena de un crimen para identificar al responsable. Esta técnica se denomina huella genética, o también "perfil de ADN". Al realizar la huella genética, se compara la longitud de secciones altamente variables de ADN repetitivo, como los microsatélites, entre personas diferentes. Este método es frecuentemente muy fiable para identificar a un criminal. Sin embargo, la identificación puede complicarse si la escena está contaminada con ADN de personas diferentes. La técnica de la huella genética fue desarrollada en 1984 por el genetista británico Sir Alec Jeffreys, y fue utilizada por primera vez en medicina forense para condenar a Colin Pitchfork en los asesinatos de Narborough (UK) en 1983 y 1986. Se puede requerir a las personas acusadas de ciertos tipos de crímenes que proporcionen una muestra de ADN para introducirlos en una base de datos. Esto ha facilitado la labor de los investigadores en la resolución de casos antiguos, donde sólo se obtuvo una muestra de ADN de la escena del crimen, en algunos casos permitiendo exonerar a un convicto. La huella genética también puede utilizarse para identificar víctimas de accidentes en masa, o para realizar pruebas de consanguinidad. 3.4.3. BIOINFORMÁTICA La bioinformática implica la manipulación, búsqueda y extracción de información de los datos de la secuencia del ADN. El desarrollo de las técnicas para almacenar y buscar secuencias de ADN ha generado avances en el desarrollo de software de los ordenadores, para muchas aplicaciones, especialmente algoritmos de búsqueda de frases, aprendizaje automático y teorías de bases de datos. La búsqueda de frases o Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 68 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. algoritmos de coincidencias, que buscan la ocurrencia de una secuencia de letras dentro de una secuencia de letras mayores, se desarrolló para buscar secuencias específicas de nucleótidos. En otras aplicaciones como editores de textos, incluso algoritmos simples pueden funcionar, pero las secuencias de ADN pueden generar que estos algoritmos presenten un comportamiento de casi-el-peor-caso, debido al bajo número de caracteres. El problema relacionado del alineamiento de secuencias persigue identificar secuencias homólogas y localizar mutaciones específicas que las diferencian. Estas técnicas, fundamentalmente el alineamiento múltiple de secuencias, se utilizan al estudiar las relaciones filogenéticas y la función de las proteínas. Las colecciones de datos que representan secuencias de ADN del tamaño de un genoma, tales como las producidas por el Proyecto Genoma Humano, son difíciles de usar sin anotaciones, que marcan la localización de los genes y los elementos reguladores en cada cromosoma. Las regiones de ADN que tienen patrones asociados con genes que codifican proteínas – o ARN – pueden identificarse por algoritmos de localización de genes, lo que permite a los investigadores predecir la presencia de productos génicos específicos en un organismo incluso antes de que haya sido aislado experimentalmente. 3.4.4. NANOTECNOLOGÍA DE ADN La estructura de ADN de la izquierda (mostrada de forma esquemática) se autoensambla en la estructura visualizada por microscopía de fuerza atómica a la derecha. La nanotecnología de ADN es el campo que busca diseñar estructuras a nanoescala utilizando las propiedades de reconocimiento molecular de las moléculas de ADN. La nanotecnología de ADN utiliza las propiedades únicas de reconocimiento molecular del ADN y otros ácidos nucleicos para crear complejos ramificados autoensamblados con propiedades útiles. En este caso, el ADN se utiliza como un material estructural, más que como un portador de información biológica. Esto ha Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 69 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. conducido a la creación de láminas periódicas de dos dimensiones (ambas basadas en azulejos, así como usando el método de ADN origami), además de estructuras en tres dimensiones con forma de poliedros. 3.4.5. HISTORIA Y ANTROPOLOGÍA A lo largo del tiempo, el ADN almacena mutaciones que se heredan y, por tanto, contiene información histórica, de manera que comparando secuencias de ADN, los genetistas pueden inferir la historia evolutiva de los organismos, su filogenia. La investigación filogenética es una herramienta fundamental en biología evolutiva. Si se comparan las secuencias de ADN dentro de una especie, los genetistas de poblaciones pueden conocer la historia de poblaciones particulares. Esto se puede utilizar en una amplia variedad de estudios, desde ecología hasta antropología, como ilustra el análisis de ADN llevado a cabo para identificar las Diez Tribus Perdidas de Israel. Por otro lado, el ADN también se utiliza para estudiar relaciones familiares recientes. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 70 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. CAPÍTULO IV TÉCNICA DIRECTA DE LA AMPLIACIÓN DEL ADN MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 71 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 4.1. FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que permite la copia in vitro de secuencias específicas de DNA y que ha revolucionado el campo de la Biología Molecular. Conceptualmente, la PCR es una técnica sencilla, consiste en la separación por calor de las dos cadenas del DNA que se quiere amplificar, y su copia simultánea a partir de un punto, determinado por un fragmento de DNA artificial llamado cebador, mediante la acción de una enzima denominada DNA polimerasa. El resultado es la duplicación del número de moléculas de una secuencia concreta de DNA. Este proceso se repite un número determinado de veces o ciclos, generalmente 30, y se consigue un aumento o amplificación exponencial del número de copias del fragmento de DNA molde. Por tanto, si partimos de una molécula única de DNA en la muestra inicial, y en cada ciclo se duplica el número de moléculas, teóricamente, al final de los 30 ciclos, se obtendrán 230 moléculas idénticas, es decir 1073741824 moléculas. La gran ventaja de la PCR es que amplifica únicamente el fragmento de DNA que queremos aunque esté en cantidades mínimas (alta sensibilidad) o en presencia de grandes cantidades de otros DNA semejantes (alta especificidad). La reacción es eficaz incluso si se parte de muestras de DNA muy poco purificadas, en presencia de otros componentes. La PCR se aplicó inicialmente como una técnica de laboratorio de investigación, pero su gran especificidad y sensibilidad ha permitido el desarrollo de técnicas específicas basadas en la PCR en muchos campos de la investigación y el análisis. Así, la PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en campos tan diversos como la investigación (clonado de genes, detección de clones recombinantes, estudio de DNA de fósiles), medicina forense y criminalística (determinación de la paternidad, identificación de individuos, identificación sospechoso/evidencia en casos de asesinato, violación, etc.), sanidad animal y mejora genética (detección de enfermedades genéticas e infecciosas, pureza de razas, etc.) y medicina (diagnóstico de enfermedades). La PCR fue desarrollada por Kary Mullis en 1985, utilizando como DNA polimerasa el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli y lo llevó a cabo cambiando Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 72 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. los tubos de reacción en cada ciclo, entre dos baños que estaban a 94 ºC (desnaturalización) y 37 ºC (hibridación y extensión del cebador). Debido a que esta enzima se desnaturaliza a temperaturas superiores a 37 ºC, era necesario añadirla en cada uno de los ciclos tras el paso de desnaturalización, lo que convertía a la PCR en una técnica tediosa y costosa. La PCR mejoró vertiginosamente como herramienta de laboratorio a partir de 1988, gracias a dos hechos que hicieron que la técnica se pudiera automatizar: el primero de ellos fue la comercialización de la enzima denominada Taq polimerasa que es un enzima termoestable, por lo que permanece activa después de incubaciones prolongadas a 94 ºC, y no hay que añadirla en cada ciclo de amplificación. El segundo hecho fue la aparición en el mercado de los primeros termocicladores que realizaban los cambios de temperatura automáticamente, sin necesidad de distintos baños. La gran revolución que ha producido en la Biología Molecular la aparición de la PCR ha supuesto para su descubridor la concesión del Premio Nobel en el año 1993. La técnica de PCR se representa en la siguiente ilustración: Explicación de la imagen: la técnica de PCR permite obtener, a partir de una sola molécula de ADN, millones de copias de un fragmento de ADN particular. La base de esta técnica consiste en que la enzima polimerasa de ADN cumpla su función: sintetizar ADN a partir de un pequeño fragmento llamado cebador, y de los nucleótidos (A, C, G y T). Las nuevas moléculas de ADN sintetizadas en cada Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 73 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. ciclo sirven de molde para ciclos siguientes. Por lo tanto, la PCR es una reacción de amplificación de fragmentos de ADN en forma exponencial y al final del ciclo 35-40 en el tubo de ensayos existen millones de copias del fragmento de interés. 4.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA REALIZAR LA PCR. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR: del inglés Polymerase Chain Reaction).El propósito de este método es la obtención de gran número de copias de un fragmento de ADN de interés. El PCR es un método in vitro para sintetizar de manera enzimática secuencias específicas de ADN. La reacción utiliza dos oligonucleótidos (entre 15 y 40 pb) como cebadores que hibridizan en extremos opuestos de la secuencia que se quiere amplificar. La elongación de estos cebadores es catalizado por una ADN Polimerasa termoestable (Ej. Taq polimerasa). Una serie repetida de ciclos que involucra, la desnaturalización del molde, la hibridización de los cebadores y la elongación de los cebadores por la polimerasa, resulta en la acumulación exponencial del fragmento de ADN a amplificar (figura B). La especificidad de la reacción está dada por la secuencia de los oligonucleótidos cebadores y en esto radica el éxito y la gran utilidad de esta técnica. Los componentes de la reacción de PCR son los que siguen, los cuales deben mezclarse adecuadamente en el tubo de reacción. La cantidad y calidad de estos componentes influyen significativamente en la especificidad, calidad y rendimiento de esta reacción; igualmente influye el diseño de los ciclos de temperatura, como se describen más abajo. 1. El ADN molde del cual se quiere amplificar un fragmento 2. Los oligonucleótidos cebadores 3. ADN polimerasa Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 74 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 4. MgCl2 5. Desoxiribonucleótidos libres (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) 6. Tampón (pH, fuerza iónica y aditivos adecuados para la enzima empleada) 4.3. CICLOS DURANTE LA PCR. Hay tres etapas fundamentales en un PCR, las cuales son repetidas entre 30 y 40 veces. Esto es realizado en un termociclador automático que realiza estos cambios de temperatura en muy corto tiempo. 1. Desnaturalización (940C): La doble hebra del ADN se separa en dos cadenas independientes. En esta etapa todos los procesos enzimáticos están detenidos. 2. Hibridización o anneling (450C – 600C): Los oligonucleótidos se unen a sus secuencias específicas por complementación de bases, la polimerasa se une al ADN y usando el oligonucleótido como cebador comienza a polimerizar. 3. Extensión (720C): Es la temperatura ideal para que polimerase la enzima. La polimerasa adiciona los desoxiribonucleótidos (dNTPs) complementarios a la cadena molde de 5´ a 3´ (la cadena molde se lee de 3´ a 5´). 4.4. APLICACIONES. La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia básica, como herramienta de detección y/o generación de acervos de fragmentos de ADN de interés; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en sí mismo, por ejemplo en diagnóstico clínico. 4.4.1. INVESTIGACIÓN La PCR convencional se emplea como base para multitud de técnicas en el laboratorio debido a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar y detectar los fragmentos de ADN de interés. Clonación de un segmento de ADN mediante amplificación con cebadores que contienen una secuencia apta para la recombinación dirigida con un plásmido. Una aplicación de la PCR de extrema importancia es la clonación de secuencias de ADN en vectores, como pueden ser los plásmidos. Para ello, se emplean cebadores que contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la interacción Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 75 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. posterior con otra complementaria situada en el vector de clonación a emplear. Por ejemplo, se puede incluir una diana de restricción en dichos cebadores, de modo que, y si ésta no existía previamente en el fragmento y es única en el vector, pueda efectuarse una ligación mediante la ligasa de T4 tras la digestión con la enzima de restricción apropiada de ambos elementos. Otro método asimilable a esta vía es el empleo de la recombinación dirigida; esto es, se adapta al 5' de los cebadores una secuencia que faculta a una recombinasa la recombinación dirigida con un vector dado. 4.4.2. MEDICINA En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnosis: Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas características de tamaño o temperatura de fusión que permitan identificarlo de forma inequívoca. En el caso de infecciones virales que implican la integración del genoma del patógeno en el ADN del hospedador, como es el de la infección por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinación de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad. La PCR también se puede usar en revisiones médicas rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A través de esta técnica se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras aún están en el periodo de incubación. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el causante. El diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus correspondientes cebadores y posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 76 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 4.4.3. PALEONTOLOGÍA, ANTROPOLOGÍA BIOLÓGICA, Y CIENCIAS FORENSES Los campos de la paleontología, antropología biológica y la medicina y antropología forense se han visto enormemente beneficiados por esta técnica, puesto que todas ellas construyen con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas gracias a restos o huellas de seres vivos. Uno de los materiales biológicos que más información puede proporcionar es el ADN. La relativa estabilidad de éste permite que, aunque fragmentado, se conserve durante largos períodos si las condiciones son propicias. En ocasiones las muestras intactas con las que se puede contar son extraordinariamente pequeñas o están deterioradas. La PCR soluciona ambos problemas y proporciona cantidades útiles para posteriores pasos de análisis. En primer lugar aumenta la cantidad de material recuperado a partir de muestras escasas, puesto que como ya se dijo anteriormente, en teoría basta una sola molécula para que el proceso pueda tener lugar. También debido a la naturaleza de la técnica y su propósito de amplificación de fragmentos pequeños, esta fragmentación no impide que este ADN pueda ser empleado como molde para una reacción de PCR. En paleontología y Antropología la PCR permite recuperar las escasas cantidades de ADN que aún no se han degradado. Algunos lugares en que el ADN podría preservarse son la brea las cenizas volcánicas, el ámbar, hielos históricos polares o glaciares y ambientes áridos, sedimentos, así como en los cristales de apatita de restos de esqueleto, siendo posible de ese modo caracterizar cadáveres, fósiles u otros restos mediante genotipado por análisis de micro satélites o incluso genomas de taxones extintos, amplificados de este modo, como pueden ser los realizados mediante el ADN genómico del hombre de Neanderthal. El propósito sería utilizar este ADN amplificado para posteriormente realizar estudios filogenéticos o etnográficos o de poblaciones mediante la comparación de secuencias de ADN, o el estudio de las causas de la separación evolutiva de dos especies. En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiación de una persona o para obtener pruebas a partir de muestras mínimas dejadas por el autor de un crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 77 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 4.4.4. AGRONOMÍA Y DIVERSIDAD Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genéticas de individuos concretos, dentro del marco de la genética forense, existen métodos basados en la PCR que permiten discernir entre grupos infraespecíficos de cultivos de interés agronómico; por ejemplo, de cultivares. Para ello, se emplean oligonucleótidos de un tamaño lo suficientemente pequeño como para que ceben de forma relativamente inespecífica, aunque siempre de tal forma que produzcan un patrón de bandas discreto e interpretable. De este modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los fragmentos tiende a agrupar a los individuos de mayor semejanza, que poseen un comportamiento similar, de los que divergen... Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 78 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. CAPÍTULO V TÉCNICA DIRECTA DE LA SECUENCIACIÓN Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 79 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 5.1. FUNDAMENTO DE LA SECUENCIACIÓN. La secuenciación del ADN consiste en dilucidar el orden de los nucleótidos de un polímero de ADN de cualquier longitud, si bien suele dirigirse hacia la determinación de genomas completos, debido a que las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboración de científicos a escala mundial, han establecido la secuencia completa del ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos. El método de secuenciación de Sanger ha sido el más empleado durante el siglo XX. Se basa en la síntesis de ADN en presencia de didesoxinucleósidos, compuestos que, a diferencia de los desoxinucleósidos normales (dNTPs), carecen de un grupo hidroxilo en su extremo 3'. Aunque los didesoxinucleótidos trifosfatados (ddNTPs) pueden incorporarse a la cadena en síntesis, la carencia de un extremo 3'-OH imposibilita la generación de un nuevo enlace fosfodiéster con el nucleósido siguiente; por tanto, provocan la terminación de la síntesis. Por esta razón, el método de secuenciación también se denomina «de terminación de cadena». La reacción se realiza usualmente preparando un tubo con el ADN molde, la polimerasa, un cebador, dNTPs convencionales y una pequeña cantidad de ddNTPs marcados fluorescentemente en su base nitrogenada. De este modo, el ddTTP puede ir marcado en azul, el ddATP en rojo, etc. Durante la polimerización, se van truncando las cadenas crecientes, al azar, en distintas posiciones. Por tanto, se produce una serie de productos de distinto tamaño, coincidiendo la posición de la terminación debido a la incorporación del ddNTP correspondiente. Una vez terminada la reacción, es posible correr la mezcla en una electroforesis capilar (que resuelve todos los fragmentos según su longitud) en la cual se lee la fluorescencia para cada posición del polímero. EL DIAGNOSTICO DEL FUTURO Muestra Extracción de A.N. Amplificación de zona interés Secuenciación Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 80 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 5.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA LA SECUENCIACIÓN. Una vez que ha sido clonado un fragmento de ADN es necesario determinar su secuencia para conocer los genes que contiene y la secuencia exacta de las proteínas que codifica, así como los elementos reguladores que funciona en cis. La secuenciación del ADN es una técnica que no estuvo disponible hasta 1977 cuando Sanger, por un lado, Maxam y Gilbert, por otro, idearon dos estratégicas diferentes con esta finalidad. Aunque ambas técnicas son utilizadas en la actualidad para ciertos propósitos, es la idea de Sanger la que se utiliza de forma rutinaria al a hora de secuenciar moléculas de ADN. Mientras que la técnica de Maxam y Gilbert esta basada en la degradación química del ADN, la de Sanger tiene como base la terminación de la síntesis de una cadena de ADN por una polimerasa mediante la utilización de nucleótidos que no solamente carecen del grupo oh en posición 2, característica de todos desoxirribonucleotidos, sino que también les falta el grupo OH en posición 3. En la siguiente figura se muestra el esquema de cómo funciona la técnica de secuenciación. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 81 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 5.3. CONDICIONES UTILIZADAS DURANTE LA SECUENCIACIÓN. Ya que en los secuenciadores actuales permiten secuenciar hasta 96 muestras simultáneamente, la reacción se lleva a cabo en placas microtiter de 96 pocillos. Una vez mesclados en cada pocillo todos los componentes de la reacción (ADN, cebador y una mezcla de tampón, dNTPs, ddNTPs fluorescente y polimerasa) en un volumen final de 10 micro litros, se lleva acabo la reacción en un termiciclador especial, que permite utilizar este tipo de placas microtiter. El termociclador realiza un total de entre 25 y 50 veces, en el caso de que se quiera secuenciar ADN plasmídico, una desnaturalización a 96C durante 10 seg, para obtener ADN de cadena sencilla, un anillamiento a 52C durante 10 seg, y una elongación de la cadena durante 4 min. Estas condiciones varían dependiendo del tipo de ADN molde que se quiere secuenciar. Al final del proceso tendremos que, a partir del cebador, se habrá originado una mezcla de cadenas de ADN de cadena sencilla y longitud variable, las cuales, todas poseen en el extremo 5 el oligonucleótido utilizado como cebador, y en el extremo 3 de un ddNTP fluorcente correspondiente a la base complementaria del ADN molde. Ya que cada ddNTP emite una luz de longitud de onda diferente, cada una de esas cadenas de ADN podrá ser interpretada como una base en la secuencia del ADN. 5.4. SECUENCIADORES DE ADN. Una vez realizada la reacción, es necesario realizar las mesclas de cadenas de ADN de cadena sencilla y reconocer la base correspondiente a cada posición. Para se emplean los secuenciadores de ADN. Los secuenciadores de ADN actuales, altamente sofisticados, permiten secuenciar 96 muestras simultáneamente, y admiten de 6 a 8 cargas al día. Si tenemos en cuenta que en cada reacción se puede obtener una secuencia superior a las 700 bases, nos encontramos con que es posible leer en un solo día más de 400.000 bases. Los secuenciadores de uso más común en los laboratorios utilizan para separar las cadenas de ADN de cadena doble un sistema de electroforesis capilar, que posee grandes ventajas respecto a los geles convencionales que se utilizan en el pasado. Una de ellas es que se evita la preparación del gel. Otra ventajas es que se pueden Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 82 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. aplicar voltajes superiores, ya que el calor generado puede ser disipado rápidamente gracias al pequeño diámetro de los capilares (entre 50 y 100 micras solamente), lo que acorta el tiempo necesario para separar la muestra. Además, ya que la muestra es leída al ir pasando las cadenas de ADN por el detector, no es necesario obtener ninguna imagen del gel, ni interpretar el resultado. El secuenciador esta también equipado con el dispositivo para emitir rayo laser y con la cámara necesaria para medir la longitud de onda que emiten las cadenas de oligonucleótidos al ser excitadas. A medida que va pasando la muestra, van apareciendo picos de emisión de luz de una determinada longitud de onda, que son recogidos por la cámara en forma de cromatogramas. Dichos cromatogramas son a su vez interpretados en un ordenador, el cual suministra directamente la secuencia. Los cromatogramas obtenidos en el secuenciador pueden ser observados utilizando programas informáticos diseñados para este fin. Uno de ellos es el denominado Chromas. 5.5. APLICACIONES. El conocimiento exacto de la secuencia abre la puerta a llevar a cabo manipulaciones en el ADN que permitan conocer funciones especificas, tales como muta génesis dirigidas, delecciones, expresión en sistemas heterógenas, etc.… Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 83 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. CAPÍTULO VI CONCLUCIONES Y BIBLIOGRAFÍA Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 84 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 6.1. CONCLUCIONES CONCLUCION GENERAL Luego de haber obtenido las conclusiones relacionadas con los objetivos específicos, queda demostrado el objetivo general de esta monografía que fue fortalecer los conocimientos obtenidos en el seminario de graduación los cuales me permiten analizar y demostrar la importancia de las ¨Técnicas básicas de la Biología Molecular¨ y sus aplicaciones mediante la recopilación bibliográfica y científica, con el fin de obtener el título de Químico Farmaceuta otorgado por la Universidad Católica De Cuenca al culminar el cuarto año de la carrera, por lo tanto, este documento es una guía para que el estudiante de biofarmacia se desenvuelva de buena manera frente a la práctica cotidiana que exige su profesión. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1. El origen de la biología molecular se puede rastrear hasta fines del siglo XIX; sin embargo, el descubrimiento de la estructura del ADN se considera como el inicio de esta disciplina. Los avances producidos por la biología molecular en la década ´60 nos permiten contar hoy con herramientas para el estudio de microorganismos a nivel molecular. Las Disciplinas científicas que forman parte de la Biología Molecular son; Bioquímica Estructural, Bioquímica Inorgánica, Bioquímica Metabólica y Enzimología, Fisiología Molecular, Química Física. 2. La obtención de un transgénico implica la participación de un organismo que dona el gen de interés y un organismo receptor del gen que expresará la nueva característica deseada. Las etapas en la obtención de un organismo transgénico son básicamente cinco: 1. Corroborar que existe un gen que codifica para la característica de interés. 2. Clonar el gen de interés. 3. Modificar el gen para que funcione mejor en el organismo receptor. 4. Transferir el gen al organismo receptor. 5. Caracterizar el organismo receptor transformado. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 85 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 3. Los diferentes procedimientos de laboratorio que utilizan el principio de hibridación la variación está dada por el tipo de ácido nucleico utilizado, el soporte en que se lleva a cabo la hibridación y la forma de colocar los ácidos en la membrana. a) Desnaturalización (94ºC): La doble hebra del ADN se separa en dos cadenas independientes. En esta etapa todos los procesos enzimáticos están detenidos. b) Hibridización o anneling (45ºC – 60ºC): Los oligonucleótidos se unen a sus secuencias específicas por complementación de bases, la polimerasa se une al ADN y usando el oligonucleótido como cebador comienza a polimerizar. c) Extensión (72ºC): Es la temperatura ideal para que polimerase la enzima. La polimerasa adiciona los desoxiribonucleótidos (dNTPs) complementarios a la cadena molde de 5´ a 3´ (la cadena molde se lee de 3´ a 5´). 4. La secuenciación del ADN consiste en dilucidar el orden de los nucleótidos de un polímero de ADN de cualquier longitud, las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 86 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 6.2. BIBLIOGRAFÍA: 1. KLUG William, CUMMINGS Michael, SPENCER Charlotte; CONCEPTOS DE GENÉTICA, Editorial Pearson Educación S.A, Edición 8ª, Madrid España 2006 2. KLUG William, CUMMINGS Michael, SPENCER Charlotte, “et al”, conceptos de genética, Editorial Pearson Educación S.A, Edición 8ª, Madrid España 2006. 3. BRUCE Alberts, (1938- ), JOHNSON, ALEXANDER, LEWIS, JULIAN; COLL Durfort, “et al”, Biología molecular de la célula, Ediciones Omega, S.A, 5ª ed., 1ª imp (07/2010) 4. LEÓN SERRANO, Javier, manual de genética molecular, Editorial Síntesis, S.A, 1. ed.(12/1990) 5. GONZÁLEZ HERNÁNDEZ A, Principios de bioquímica clínica y patología molecular, Ediciones Elsevier España, S.A, 1ª ed.(2010) 6. Nelson, David L.; Cox, Michael M.; Lehninger, Albert L., Lehninger: principios de bioquímica, Ediciones Omega, S.A, 1ª ed., 1ª imp.(07/2009). 7. Tymoczko, John L.; Berg, Jeremy M.; Stryer, Lubert, Editorial Reverte, 6(08/11/2007). 8. Williams, Bryan L.; Wilson, Keith, principios y técnicas de bioquímica experimental, Ediciones Omega, S.A, 1. ed.(02/1981). 9. Ramos Ruiz, Ricardo, Técnicas de investigación en biología molecular, Universidad Autónoma de Madrid, Servicio de Publicaciones,1ª ed., 1ª imp.(10/2000) 10. Tagu, Denis; Moussard, Christian, Fundamentos de las técnicas de biología molecular, Editorial Acribia, S.A, 1ª ed., 1ª imp.(04/2006). 11. Freifelder, D., Técnicas de bioquímica y biología molecular, Editorial Reverté, S.A, 1ª. ed. , 4ª. imp.(06/1981) Direcciones en internet: http://www.argenbio.org/xaga/h/biotecnologia/02_a4.php http://www.elergonomista.com/biologia/historia.htm http://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADa http://definicion.de/ciencias-naturales/ Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 87 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. ÍNDICE DE CONTENIDOS PRELIMINARES__________________________________PÁGINAS CARÁTULA……………………….………………………………………………………….……………………I DEDICATORIA………..…..………………………………………………………..………….................II AGRADECIMIENTO……………………………………..……………………………………………….III ÍNDICE…………………………………………………………………………………………………………...IV INTRODUCCIÓN…………..………………………………………………………………………………VIII OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………….…..X CAPÍTULO ‘I’............................................................................................................. .- 1 CONCEPTOS BÁSICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ..................................... - 1 1.1. HISTORIA Y ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR. ................................. - 2 1.1.1. LOS PRIMEROS PASOS......................................................................... - 2 1.1.2. ORIGEN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR .......................................... - 6 1.2. DISCIPLINAS QUE FORMAN PARTE DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR. ....... - 8 1.3. INFORMACIÓN GENÉTICA Y EL GENOMA. ................................................. - 10 1.3.1. EL GENOMA ........................................................................................ - 10 1.3.2. MATERIAL GENÉTICO ...................................................................... - 12 1.3.3. CROMATINA Y LOS CROMOSOMAS ................................................ - 12 1.3.4. LOS GENES ......................................................................................... - 14 1.4. TIPOS Y COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS. ...............................- 15 1.4.1. ÁCIDO NUCLÉICO ...............................................................................- 15 1.4.2. NUCLEÓSIDOS Y NUCLEÓTIDOS .................................................... - 18 1.4.3. LOS DINUCLEOTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS ............................. - 19 1.5. FUNCIONES Y ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS. ..................... - 20 1.5.1.ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO O ADN …………………………………..- 21 1.5.2. ÁCIDO RIBONUCLEICO O ARN ........................................................ - 27 1.6. DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR .................................... - 30 1.6.1. LA TRANSCRIPCIÓN .......................................................................... - 30 1.6.2. LA TRADUCCIÓN Y EL CÓDIGO GENÉTICO ................................... - 31 1.7. ENZIMAS Y VECTORES USADOS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR............. - 33 1.7.1. CONCEPTO DE ENZIMA .................................................................... - 33 1.7.2. USOS DE LAS ENZIMAS EN LA BIOLOGIA MOLECULAR ............. - 33 Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 88 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 1.7.3. CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE ENZIMAS ...................... - 33 1.7.4. ACOMPAÑANTES NO PROTEICOS DE LAS ENZIMAS ................... - 36 CAPÍTULO II ............................................................................................................ - 37 OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO ...... - 37 2.1. ETAPAS DE LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO TRANSGÉNICO ........... - 38 2.1.1. PRINCIPIOS DE LAS TÉCNICAS CON ÁCIDOS NUCLEICOS .......... - 38 2.1.2. ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE UN ORGANISMO ........................ - 39 2.2. CLONADO DEL GEN. ....................................................................................... - 44 2.2.1. PRINCIPIOS DE CLONACIÓN MOLECULAR ................................... - 44 2.2.2. PASOS A SEGUIR PARA UNA CLONACIÓN MOLECULAR ............ - 44 2.3. ELECTROFORESIS........................................................................................... - 47 2.3.1. FUNDAMENTO DE LA ELECTOFORESIS ........................................ - 47 2.4. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN DEL ADN .................................... - 49 2.4.1. EXTRACCIÓN DE ADN ...................................................................... - 49 2.4.2. ALMACENAMIENTO DEL ADN ....................................................... - 49 2.4.3. CONSERVACIÓN DEL ADN EN TEJIDO FRESCO .......................... - 50 2.5. NORMAS EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR. ................. - 50 2.5.1.POSIBLES CONTAMINACIONES EN EL LABORATORIO DE .................. BIOLOGIA MOLECULAR .................................................................... - 50 2.5.2.ORGANIZACIÓN ESPACIAL DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA ......... MOLECULAR .........................................................................................- 51 2.5.3. OBTENCIÓN DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS . .......... - 52 CAPÍTULO III .......................................................................................................... - 54 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN......................................................................... - 54 3.1. PASOS PREVIOS A LA HIBRIDACIÓN ............................................................ - 55 3.2. MÉTODOS HIBRIDACIÓN DE LABORATORIO ............................................ - 56 3.2.1. EL MÉTODO DE HIBRIDACIÓN SOUTHERN ................................. - 57 3.2.2. NORTHERN O NORTHERN BLOT ................................................... - 58 3.2.3. WESTERN BLOT ................................................................................ - 58 3.2.4. DOT BLOT Y SLOT BLOT ................................................................... - 59 3.2.5. HIBRIDACIÓN IN SITU (HIS) ........................................................... - 59 3.2.6. CHIP DE ADN ..................................................................................... - 61 3.2.7. SONDAS DE PNA (PEPTIDE NUCLEIC ACID) ................................. - 61 3.2.8. HIBRIDACIÓN DE COLONIAS BACTERIANAS ............................... - 61 Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 89 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. 3.2.9. MAPAS DE RESTRICCIÓN ................................................................ - 62 3.2.10. HIBRIDACIÓN DE ADN O RAMIFICADO (BRANCHED DNA) ..... - 62 2.3.11. cDNA MICROARRAY ........................................................................ - 62 3.3. PASOS DE LA HIBRIDACIÓN ......................................................................... - 63 3.3.1. FUNDAMENTO DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS ....... - 63 3.4. APLICACIONES DE LA HIBRIDACIÓN .......................................................... - 66 3.4.1. INGENIERÍA GENÉTICA ................................................................... - 67 3.4.2. MEDICINA FORENSE ........................................................................ - 68 3.4.3. BIOINFORMÁTICA ............................................................................ - 68 3.4.4. NANOTECNOLOGÍA DE ADN ........................................................... - 69 3.4.5. HISTORIA Y ANTROPOLOGÍA.......................................................... - 70 CAPÍTULO IV ............................................................................................................- 71 TÉCNICA DIRECTA DE LA AMPLIACIÓN DEL ADN MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ...................................- 71 4.1. FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA. ..... - 72 4.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA REALIZAR LA PCR........................... - 74 4.3. CICLOS DURANTE LA PCR. ............................................................................ - 75 4.4. APLICACIONES. ............................................................................................... - 75 4.4.1. INVESTIGACIÓN ................................................................................ - 75 4.4.2. MEDICINA ......................................................................................... - 76 CAPÍTULO V ............................................................................................................ - 79 TÉCNICA DIRECTA DE LA SECUENCIACIÓN ............................................... - 79 5.1. FUNDAMENTO DE LA SECUENCIACIÓN. .....................................................- 80 5.2. COMPONENTES NECESARIOS PARA LA SECUENCIACIÓN. ...................... - 81 5.3. CONDICIONES UTILIZADAS DURANTE LA SECUENCIACIÓN. ................. - 82 5.4. SECUENCIADORES DE ADN. ......................................................................... - 82 5.5. APLICACIONES. ............................................................................................... - 83 CAPÍTULO VI ........................................................................................................... - 84 CONCLUCIONES Y BIBLIOGRAFÍA ............................................................... - 84 - Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 90 - Universidad Católica de Cuenca Unidad Académica de Ing.Química, Industrial, Alimentos, Biomolecular, Biocombustibles y Biofarmacia. Monografía previa obtención del título de Químico Farmacéutico. Autora: Marcela Patricia Valverde Peralta Tema: Técnicas Básicas de la Biología Molecular - 91 -