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Métodos de análisis biomédicos
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Métodos de análisis biomédicos
Comprenden métodos de análisis a nivel de DNA, RNA y
proteínas que permitan tener un mayor conocimiento de una
enfermedad dada, que puedan ser utilizados para desarrollar
un diagnóstico seguro de la misma, un seguimiento de su
evolución, una terapia y prevención (vacunas).
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Dada una enfermedad, interesa determinar:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
El agente causante
El gen afectado
Los mecanismos de acción que operan en una enfermedad
Los parámetros que caracterizan la enfermedad en distintos estadios
El blanco para drogas
Otros posibles estrategias de terapia
Diseño de vacunas
El efecto de la terapia sobre la progresión de la enfermedad
La susceptibilidad de un individuo a tener una determinada
enfermedad
La susceptibilidad a tener una reacción favorable a un tratamiento
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Historicamente el estudio de un estado patológico consistió:
Observación del enfermo
El desarrollo de la microscopía , el cultivo “in vitro” de microorganismos y la
inmunología permitieron un avance en el conocimiento del agente causal
Avance en el conocimiento del ADN
Desarrollo de los Acs monoclonales y las técnicas de hibridación del ADN (Southern blot).
Impacto en el diagnóstico, estudio de la evolución e influencia de una terapia
Permitió contar con una cantidad ilimitada
de Acs y con especificidad a determinado
epitope
Avance en el desarrollo de inmunoensayos:
determinación de Ag y Ac en fluídos o
extractos o en el tejido in situ
(Inmunohistoquímica). Citometría de flujo.
Permitió detectar el total del ADN extraído
de una muestra, la presencia o la alteración
de una molécula de ADN determinada
También desarrollo en la tecnología de hibridación
“in situ” (detección de ADN específico en células
intactas por hibridación con sonda marcada y
observación microscópica o autoradiografía)
Avance en la tecnología de marcadores no isotópicos
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El 2do anticuerpo puede estar marcado con:
Fluoróforos
Enzima
Biotina
Streptavidina conjugada a Enzima
Digooxigenina
Ac anti Digo conjugado a
Enzima
Las enzimas más usadas: peroxidasa y la
fosfatasa alcalina
Los sustratos pueden ser cromóforos o pueden
ser quimioluminiscentes.
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Historicamente el estudio de un estado patológico consistió:
Observación del enfermo
El desarrollo de la microscopía, el cultivo “in vitro” de microorganismos y la
inmunología permitieron un avance en el conocimiento del agente causal
Desarrollo de los Acs monoclonales y las técnicas de hibridación del ADN (Southern blot).
Impacto en el diagnóstico, estudio de la evolución e influencia de una terapia
Permitió contar con una cantidad ilimitada
de Acs y con especificidad a determinado
epitope
Avance en el desarrollo de inmunoensayos:
determinación de Ag y Ac en fluídos o
extractos o en el tejido in situ
(Inmunohistoquímica). Citometría de flujo.
Permitió detectar el el total del ADN
extraído de una muestra, la presencia o la
alteración de una molécula de ADN
determinada
También desarrollo en la tecnología de hibridación
“in situ” (detección de ADN específico en células
intactas por hibridación con sonda marcada y
observación microscópica o autoradiografía)
Avance en la tecnología de marcadores no isotópicos
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Obtención de sonda marcada
Marcación mediada por actividad enzimática
A partir de DNA o cDNA: Introducción de nucleótido modificado mediante el método de Random
Primer, Nick traslation, por actividad de la deoxinucleotidil transferasa ó
durante la amplificación por PCR (utilizando dNTP marcado o
oligonucleótidos cebadores marcados).
Incorporación de 32P al extremo 5´ por acción de la T4 DNA kinasa.
En la obtención del cDNA: introducción de nucleótido modificado durante la reacción sobre el
mRNA con la Transcriptasa Reversa ó durante la amplificación por RTPCR.
dNTP
Biotina
Streptavidina-Enzima
Fluoróforo
Marca radioactiva
Digooxigenina
AntiDigo-enzima
Ej.: 12-dUTP o 14-dATP fluoresceína
Cy3-dCTP, Cy5-dCTP, biotin11-dUTP
Aminohexil derivado de dATP
Marcación química:
Marcación con Psoraleno derivatizado con grupo amino unido a biotina, fluoróforo o digooxigenina
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Desarrollo de la Tecnología de ADN recombinante
Clonado del gen en cuestión
amplificación
(Vectores de clonado)
Técnicas de secuenciación
Clonado en vectores de expresión
Genoma
Diagnóstico
Utilización como sonda
Obtención de la proteína en un sistema heterólogo
en grandes cantidades
Estudio de polimorfismos
Utilización como Ag en
inmunoensayos
Producción de vacunas
Obtención de Acs policlonales o monoclonales
Para utilizar en inmunoensayos
Otros desarrollos importantes:
Detección e identificación de ARN: Northern blot
Detección e identificación de proteínas: Western blot
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Secuenciación: Método de Sanger
DNA templado
Oligonucleótido
dNTPs (uno marcado)
ddNTP: 4 reacciones, cada una con un ddNTP distinto
Fragmento klenow de la ADN Polimerasa
5'-GAATGTCCTTTCTCTAAG
GGAGACTTACAGGAAAGAGATTCAGGATTCAGGAGGCCTACCATGAAGATCAAG-5'
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Automatización
Oligonucleótido marcado con fluorescente
Terminador de cadena marcado con fluorescente
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Geles de acrilamida
Electroforesis capilar y detección
Cromatograma
Desventaja: el ADN secuenciado tiene que estar en alta concentración (la amplificación puede producir errores)
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Pirosecuenciación
ADN simple cadena
ADN polimerasa
dNTP (agregados por orden)
Enzimas que permiten la emisión de luz por cada base incorporada
La polimerasa elonga base por base la hebra complementaria.
Por cada base incorporada se emite luz. Se controla la adición de
las dNTP a la reacción. A partir del patrón de luz emitido se
decodifica la secuencia.
1)
2)
3)
APS:adenosina 5´ fosfosulfato
4)
dATPαS por dATP
Secuenciación por microarray
Secuenciación por tecnología de nanoporos
Microscopía de fuerza atómica
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SBS (secuenciación por síntesis) (Illumina)
Secuenciación en fase sólida con terminadores reversibles.
Permite secuenciación masiva en paralelo de miles de fragmentos
Utilización de los 4 dNTP marcados con marcadores fluorescentes mezclados
A T
A T
C G
T
C
G
A
T
T
A
C
G
A
A
C
T
C
G
A
T
T
T
G
A
A
A T
A T
C G
A T
A T
C G
T A
T A
C G
C
G
T
CG
Se une el complementario
y fluoresce
A
T
G
C
T
A
Hasta que no se cliva
no se puede unir el
siguiente
G
A
T
C
T
A
G
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Tecnología de ADN recombinante
Clonado del gen en cuestión
amplificación
Técnicas de secuenciación
Clonado en vectores de expresión
Genoma
Diagnóstico
Utilización como sonda
Obtención de la proteína en un sistema heterólogo
en grandes cantidades
Estudio de polimorfismos
Utilización como Ag en
inmunoensayos
Producción de vacunas
Obtención de Acs policlonales o monoclonales
para utilizar en inmunoensayos
Otros desarrollos importantes:
Detección e identificación de ARN: Northern blot
Detección e identificación de proteínas: Western blot
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1985: Gran impacto, el desarrollo de la técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)
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PCR: amplificación específica de ADN
Por su alta sensibilidad, rapidez y especificidad es el método de mayor aplicación actual tanto para la
detección, identificación, tipificación y cuantificación de patógenos así como para el estudio y detección
de enfermedades genéticas.
También se utiliza para la obtención de sondas marcadas para ensayos de hibridación
Se marca durante la reacción utilizando dNTP u oligos marcados o se marca el
producto de la reacción.
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RT-PCR
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PCR
PCR in situ
(IS-PCR)
(IS-RT-PCR)
Multiplex PCR
PCR cuantitativa
PCR en tiempo real
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Otros métodos de amplificación de nucleótidos (NAT)
LCR: Reacción en cadena de la ligasa
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Otros métodos de amplificación de nucleótidos (NAT)
LCR: Reacción en cadena de la ligasa
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Amplificacion mediada por transcripcion (TMA) (amplificación de RNA)
Isotérmica
Oligonucleotido complementario a blanco que esta unido a secuencia que codifica para promotor del fago T7
Transcriptasa reversa que usa como molde RNA o DNA y que tiene actividad
de RNAsa
T7 RNA polimerasa
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Isotérmica
SDA (strand displacement amplification)
4 primers, klenow, dNTPs
2 de los primers tienen sitio HincII en el extremo 5´
Amplificación exponencial
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Inmunoensayo con amplificación de ADN por círculo rodante (InmunoRCA)
También se puede amplificar oligo con PCR (InmunoPCR).
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Nanobiotecnología
Una tecnología que hace uso de un conjunto de nano-dispositivos y nano-objetos que permiten mediciones cualitativas
y cuantitativas usando volumenes más chicos, más rápidas y más sensibles.
Biosensores de afinidad
Tecnología para estudiar interacción entre moléculas en tiempo real. Esto puede aplicarse a
interacción ADN-ADN (ARN) o Ag-Ac, proteína-proteína.
Permite medir velocidad de interacción, cuantificación y diagnóstico.
Componentes
básicos de un
sensor.
Eventos importantes:
•
Reconocimiento molecular específico
•
Transdución (Generación de una señal)
•
Amplificación de la señal
•
Registro de la señal
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Biacore
Se captura uno de los interactantes sobre la
superficie del sensor. La muestra
conteniendo el otro interactante se inyecta
sobre la superficie. Una luz de determinada
longitud de onda se dirige a la superficie del
sensor y los eventos de unión biomolecular
se detectan como un cambio en el ángulo
de la luz reflejada. Este cambio es medido
continuamente obteniéndose un
sensograma. Se tiene así
un monitoreo del progreso de una
asociación o una disociación biomolecular.
Se aplica a unión entre
proteínas, ác. nucleicos, carbohidratos,
lípidos.
En esta tecnología se combina el desarrollo de
nano o microchips con el bio-material sensor
unido y la medición de la interacción de las
moléculas que se quieren cuantificar por
monitoreo de cambios en la superficie (resonancia
de superficie del plasmón / Biacore) o cambios en
en el peso (microbalanza de cuarzo) que se
traducen en señales ópticas, eléctricas ó
acústicas en función del tiempo.
Aplicaciones
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Nanotubos de carbón o de silicio
Muy sensibles a perturbaciones electrónicas
Aplicación en estudios de interacción ADN-ADN. Cambios en conductividad.
Los nanotubos forman una red entre los dos electrodos del chip. Se inmoviliza a los nanotubos la sonda desnaturalizada.
Se agrega el ADN target. La conductancia va a cambiar (disminuir) ante la presencia de ADN doble cadena en lugar del
simple cadena.
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Nanorods with bar-cods (nanocilindros con código de barras)
Ensayo múltiple
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Quantum Dots
Nanopartícula cristalina: consiste en un átomo artificial con electrones confinados en un pequeño
Espacio.
Una vez excitado la longitud de onda de la luz emitida dependerá del tamaño. Amplia paleta de colores
Util para ensayos múltiples, marcación in vivo
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Nanopartículas magnéticas
Micro/nanofluídica
ed
antibody
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Era postgenómica
Proteómica
Microarrays
Genoma
Genómica Funcional
Proteómica
Identificación sistematizada de las proteínas contenidas en una mezcla
compleja
determinación de la abundancia relativa de cada proteína al comparar dos
muestras (proteómica diferencial): estado sano vs enfermo en un
órgano o tipo celular determinado, efecto en el proteoma de un tejido la infección con determinado patógeno.
Estudio de interacción proteína-proteína
Proteómica estructural
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GELES 2D
Separación por carga y masa molecular
Identificación
Espectrometría de masa
y bases de datos de proteínas y
secuencias de genes.
Geles 2D
Sirve para resolver proteínas que sufrieron
modificaciones post-traduccionales
Desventajas: Proteínas muy hidrofóbicas no
entran al gel
No resuelve proteínas muy ácidas o muy
básicas (pI 3 o 10)
No detecta proteínas poco abundantes
Cromatografía líquida (CL) ó
Electroforesis capilar (EC)
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El análisis de proteínas o péptidos por MS
puede ser dividido en dos metodologías
:
Análisis del mapa de masas peptídicas de una proteína: los
péptidos obtenidos de la tripsinización de la proteína en cuestión
se cargan mediante el proceso de Maldi (matrix-assisted laser
desorption/ Ionization) y se someten al espectrómetro de masa
(análisis TOF) obteniendose un espectro de masas peptídicas que
se comparan con la masa de los péptidos que se obtendrían por la
Hipotética hidrólisis de las proteínas que se encuentran en la base
de datos.
Análisis de aminoácidos:conocido como espectrometría de masa
en tandem, MS-MS o espectrometría de masa por nanoelectrospray
Cada uno de los peptidos se fragmentaen péptidos más pequeños
Y a partir de las masas obtenidas se deduce la secuencia de aa.
La metodología de Maldi-TOF también se puede usar para análisis
de ácidos nucleicos
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Métodos de Proteómica diferencial
Determinación diferencial por
Electroforesis bidimensional
EN 2 GELES DIFERENTES
2D-DIGE
(en un mismo gel)
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ICAT
(isotope-coded affinity tag)
SILAC
(Stable isotop labeling with amino acid in celll culture
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Interactoma:
2 estrategias
Purificación del complejo y estudio del proteoma / co-inmunoprecipitación
Proteómica reversa: se prepara una proteína a partir de la expresión del gen o un set completo
de proteínas a partir de la expresión de todos los genes del genoma y se examina su interacción
con otras proteínas.
Ejemplos de técnicas para análisis de interacción
Etiquetar con moléculas
marcadoras reactivas
Pull down: proteína bait
Mezcla
Expresar la proteína como Muestra (pray)
Proteína de fusión
proteína prey
por purificación
Transcripción-traducción in vitro
Por expresión en
sistema heterólogo
bait
TAP
(etiquetado en tandem)
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Técnicas que se adaptan a la identificación de interacciones desconocidas en gran escala
Doble híbrido
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Phage Display
Microarrays
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Aplicaciones de estudios de interacción
Importancia para la identificación de interacciones entre componentes del organismo huésped
y del patógeno que puede constituir un blanco para una posible terapia
Identificación de epitopes que reaccionan con los anticuerpos generados ante una infección, para
diagnóstico.
Identificación de epitopes o anticuerpos que reaccionan con moléculas expuestas en células
cancerosas: para ser utilizadas en terapia o diagnóstico.
Proteómica estructural: Determinación de estructura y conformación tridimensional
de las proteínas identificadas. En base a modelos se pueden predecir estructuras a partir de la
secuencia de aa. La proteómica estructural permite estudiar la relación estructura-función y
diseñar inhibidores en base a la estructura.
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Aptámeros
Identificación de epitopes pero sin la utilización de Acs
Los aptámeros están constituídos por secuencias cortas de DNA o RNA que has sido
seleccionados in vitro a partir de bibliotecas de secuencias al azar por su capacidad de unirse
especificamente al target.
El proceso de selección de aptámeros se realiza por una técnica de enriquecimiento exponencial.
Una vez identificado un aptámero se puede obtener por síntesis química.
Si bien se han usado para diagnóstico de algún virus, principalmente se han usado para detección
de células cancerosas (nanopartículas magnéticas conjugadas a aptámeros para enriquecer y
nanopartículas fluorescentes conjugadas con aptámeros para detectarlas).
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Microarrays
Microarray o biochips:
Arreglo ordenado de muestras biológicas
tales como ADN genómico, cADNs,
oligonucleótidos, proteínas o tejidos sobre
una superficie (matriz bidimensional.)
Aplicación: en determinación de
polimorfismos y mutaciones en ADN,
tipificación, en estudio de expresión de
genes y en proteómica
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