Download Q. F. B. Daniel Alberto Montes Galindo D. en C. Iván Delgado

Facultad de Medicina
Generación de un vector adenoviral oncolítico selectivo para
neoplasias sobre-expresoras de STAT3
TESIS
Que para obtener el grado de:
Maestro en Ciencias Médicas
Presenta:
Q. F. B. Daniel Alberto Montes Galindo
Asesores:
D. en C. Iván Delgado Enciso
SNI I
Profesor-Investigador Titular A
Facultad de Medicina
Universidad de Colima
D en C. Bertha Alicia Olmedo Buenrostro
Profesora Investigadora Titular A
Facultad de Enfermería
Universidad de Colima
Colima, Colima Febrero de 2011
Agradecimientos
Al consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca de posgrado con el número
de registro 293697.
A la Universidad de Colima, mi Alma mater.
A ECOES por el apoyo de mi movilidad.
1
Dedicatoria
A mi familia por todo el apoyo en estos dos años de esfuerzo.
A mis Asesores por la paciencia y su tiempo.
A Citlalli por todo su Amor y dedicación.
A mi hijo(a).
2
ÍNDICE
1Resumen…………………………………………………………………..………….....1
1.2 Abstract……………………………….………………………………………..2
1.3 Introducción…………………………………….……………………………..3
2 Antecedentes…………….………………………………………………………..……5
2.1 Cáncer………………………………………………..……………………….5
2.2 Terapia Génica…………..………………………………………...…….…..6
2.3 Viroterapia……………………………………………………………............7
2.4 Adenovirus…………………………………………………………………...9
2.4.1 El Gen E1A………………………………………….....................9
2.5 Vectores Adenovirales Oncolíticos……………………………...…….......10
2.6 Uso en la Clínica de Vectores de Terapia Génica……………………….11
2.7 STAT3………………………..…………………………………..…………...11
2.8 STAT3 y Cáncer……………………………………………………………12
2.9 Vector Adenoviral Oncolítico Dirigido por el
Promotor de STAT3…………………………………..…...……………………13
3 Planteamiento del Problema……………………………………………..………...15
3.1 Justificación………………………………………………………………..15
3.2 Objetivo General………………...………………………………………...16
3.2.1 Objetivos Específicos……………..…………………………....….…....16
3.3 Hipótesis………………………………………………………….………...16
3.3.1Hipotesis Nula...…………………………………………….........16
4 Metodología…….…………………………………………………………………….17
3
4.1 Tipo de Investigación………………………………………………........17
4.2 Descripción de Variables………………………………………………..17
4.3 Estrategia General...…………………………………………………......18
4.4 Construcción del Vector Adenoviral…………………………………...19
4.4.1 Obtención y Aislamiento de la Secuencia del
Promotor de STAT3…………………………………………………..19
4.4.2 Construcción del Plásmido Acarreador……………………..20
4.4.3 Generación de los Genomas Virales………………………..20
5 Resultados ……………...……..…………………………………………………..22
6 Discusión…………………………………………………………………………...26
7 Conclusiones………………………………………………………………………28
8 Perspectivas………………………………………………………………………..29
9 Glosario……………………………………………………………………………..30
10 Anexos……………………………………………………………………………..36
A……………………………………………………………………………….36
B………………………………………………………………………………38
C………………………………………………………………………………39
11 Bibliografía……………..………………………………………………………....42
4
1 Resumen
Introducción: Sin duda, una de las enfermedades más importantes a nivel mundial
por su mortalidad es el cáncer. Ante esto, la búsqueda de nuevas alternativas de
tratamiento para combatir esta patología es de gran importancia. Actualmente se ha
demostrado que la proteína STAT3, es potencialmente oncogénica y su sobreexpresión ha sido asociado en diferentes tipos de cáncer. Fabricar un vector de
terapia génica oncolítico que elimine preferentemente a células sobre-expresoras de
STAT3 podría plantearse como una nueva estrategia que ayude a combatir el
cáncer. Metodología: Se planteó un estudio experimental, en el campo de la biología
molecular. Se construyó un plásmido acarreador en el cual se introdujo un fragmento
de la región promotora del gen de STAT3 flanqueado por las regiones adenovirales
ITR e E1A (pSTAT3). Este plásmido acarreador fue co-transformado en bacterias
calcio-competentes E. coli recA + BJ5183 con el esqueleto adenoviral pAd5
linearizado (Cla I) para generar mediante recombinación homóloga el genoma
adenoviral del vector de replicación selectiva AD-pSTAT3. Resultados: La cotransformación de pSTAT3 y pAd5 resulto en una recombinación homologa que
generó el genoma adenoviral del vector de replicación selectiva AD-pSTAT3. Se
utilizó la enzima Hind III para realizar la caracterización del genoma adenoviral,
obteniéndose el patrón de restricción correcto. Conclusión: Se generó el genoma de
un nuevo vector de terapia génica adenoviral con replicación selectiva para
neoplasias sobre-expresoras de STAT3.
5
1.2 Abstract
Introduction: Cancer is one of the most important diseases worldwide for mortality.
Given this, the search for new treatments alternatives is of great importance in
combating this disease. STAT3 is potentially oncogenic and its over-expression has
been correlated in various types of cancer. An oncolytic gene therapy vector that
preferentially eliminates cells that express STAT3 on-could be viewed as a new
strategy to help fight cancer. Methodology: We propose an experimental study in the
field of molecular biology. We constructed a plasmid in which the carrier introduced a
fragment of the STAT3 gene promoter region flanked by adenoviral ITR and E1A
(pSTAT3). Results: pSTAT3 was subsequently co-transformed into calciumcompetent bacteria E. coli recA + BJ5183 with the adenoviral backbone PAD5
linearized (Cla I) to generate the genome by homologous recombination adenoviral
vector AD-pSTAT3 selective replication. We used Hind III enzyme for proper
assembly characterization of adenovirus genome. Conclusion: We generated a
replication-selective adenoviral vector for tumors over-that express STAT3.
6
1.3 Introducción
La terapia génica se define como el tratamiento o prevención de una
enfermedad a través de la incorporación a la célula de secuencias nucleotídicas
(generalmente genes) que corrigen o incorporan una función. Las secuencias
génicas funcionales son colocadas en vectores, los cuales sirven como vehículos
que transportarán estas secuencias al interior de la célula. Los adenovirus son uno
de los vectores más usados en la actualidad, sobre todo en la lucha contra el cáncer.
Una de las estrategias más prometedoras de terapia génica adenoviral, es
usar la replicación viral selectiva, la cual permite eliminar células neoplásicas a través
de una infección limitada al tumor. Para ello se controla la expresión del gen E1A
adenoviral, pues la expresión de este gen desencadena la replicación viral y su
ausencia la impide. Así pues, donde se exprese el gen E1A adenoviral, habrá
replicación y lisis celular. Tras la administración de un vector adenoviral oncolítico
selectivo éste infectará las células tumorales blanco, las cuales poseen las
condiciones moleculares determinadas que permitirán que se active la expresión del
gen E1A (a través de la activación de un promotor específico). A partir de aquí se
lleva a cabo la replicación adenoviral y consecuentemente aparece el efecto
oncolítico.
A pesar de esta extraordinaria capacidad de los vectores en contra de
neoplasias, el panorama no siempre refleja una especificidad total, por tal motivo es
importante buscar e implementar estrategias que perfeccionen los procedimientos
que regulen la actividad y replicación adenoviral. De esta manera se buscaría que los
vectores expresen el gen E1A únicamente en células diana.
7
Para combatir el problema y hacer más seguros a los vectores adenovirales
replicativos (oncolíticos) se ha buscado una alternativa que mejore la eficacia y
seguridad de estos vectores. Para ello, en el presente proyecto se propuso utilizar
una estrategia con un promotor de STAT3. Como la replicación adenoviral depende
de la expresión del gen E1A, si bloqueamos esta expresión de manera específica en
células que no presenten sobre-expresión STAT3, tendríamos una replicación
reprimida. Para lograr lo anterior, se ubico un promotor de STAT3 en sustitución del
promotor natural de E1A. El promotor específico de STAT3 sería capaz de iniciar la
producción de E1A luego de que el adenovirus llegue a una célula que sobreexprese
STAT3 (generalmente células cancerosas), lo cual impediría que el VARS exprese
sus genes y se replique de manera no específica en células que no lo hagan. De esta
manera, se genera una nueva estrategia de selectividad replicativa, al dirigir
específicamente la replicación adenoviral.
8
2 Antecedentes
2.1 Cáncer
El cáncer surge cuando las células de alguna parte del cuerpo comienzan a
crecer sin control. Aunque existen muchos tipos de cáncer, todos comienzan debido
al crecimiento sin control de células anormales. Las células normales del cuerpo
crecen, se dividen y mueren en una forma ordenada. Durante los primeros años de
vida de una persona, las células normales se dividen con más rapidez hasta que la
persona alcanza la edad adulta. Posteriormente, las células normales de la mayoría
de los tejidos sólo se dividen para reemplazar las células desgastadas y para reparar
las lesiones (Meza-Junco, 2006).
Debido a que las células cancerosas continúan creciendo y dividiéndose, son
diferentes de las células normales. En lugar de morir, viven más tiempo que las
células normales y continúan formando nuevas células anormales. Las células
cancerosas surgen como consecuencia de daños en el ADN. Esta sustancia se
encuentra en todas las células y dirige sus funciones. La mayoría de las células en
las que su ADN se daña, la célula muere o ésta puede reparar el ADN. En las células
cancerosas el ADN no se repara. Las personas pueden heredar ADN dañado, que es
responsable de los tipos de cáncer hereditarios (5-10% de las neoplasias). Sin
embargo, en la mayoría de las ocasiones el ADN de las personas se daña como
consecuencia de alguna exposición ambiental, como el fumar o exponerse a
químicos o a radiaciones (Meza-Junco, 2006).
9
Los diferentes tipos de cáncer pueden comportarse de maneras variables. Por
ejemplo, el cáncer del pulmón y el cáncer del seno son enfermedades muy distintas.
Crecen a distinta velocidad y responden a distintos tratamientos (Meza-Junco, 2006).
Las enfermedades oncológicas en México representan gastos millonarios para
los diversos institutos y sistemas de salud que brindan atención médica, debido a
que en el país no existe una verdadera cultura de prevención.
A partir de la década de los noventa, los tumores malignos son una de las
principales causas de muerte en el país después de las enfermedades
cardiovasculares y la diabetes mellitus. De acuerdo con cifras de la Secretaria de
Salud en el 2005, en México el cáncer cérvico-uterino ocasionó 4,270 defunciones.
Aunque estas cifras pueden variar año tras año, algo que es claro es que el cáncer
cérvico-uterino, junto con el cáncer mama, son las dos neoplasias más importantes
en las mujeres.
Aunque
los
programas
de
detección
temprana
están
ampliamente
implementados en nuestro país, la mayoría de los canceres aún son diagnosticadas
en estadios invasores, en muchos de los cuales la intervención quirúrgica o curativa
ya no es una opción terapéutica recomendable.
2.2 Terapia Génica
La terapia génica se define como el tratamiento o prevención de una
enfermedad a través de la incorporación a la célula de secuencias nucleotídicas
(generalmente genes) que corrigen o incorporan una función. Las secuencias
génicas funcionales son colocadas en vectores, los cuales sirven como vehículos
que transportarán estas secuencias al interior de la célula. Los vectores pueden ser
no virales (ADN desnudo, ADN envuelto en lípidos catiónicos, ADN condensado en
10
partículas) o pueden ser virus modificados y sin capacidad replicativa como herpes,
adenovirus, adeno-asociados, lentivirus, retrovirus, (Rojas-Martinez, et. al., 2002).
Habitualmente la finalidad de esta transferencia de material genético es
restablecer una función celular que estaba abolida o defectuosa, introducir una nueva
función o bien interferir con una función existente. La única modalidad de terapia
génica en desarrollo es la dirigida a células somáticas, no germinales, lo que asegura
que la transferencia sólo afecte al individuo en tratamiento y no a su descendencia.
Las distintas estrategias de la terapia génica se basan en la combinación de tres
elementos claves, el material genético a transferir, el método de transferencia y el
tipo celular que incorporará dicho material genético (Blaese, et. al., 1995).
Cada vector
tiene diferentes características, variando en su tropismo,
duración de la expresión génica (integración o no a cromosomas celulares),
inmunogenicidad, entre otras, lo cual permite seleccionar al vector que mejor cumpla
las metas terapéuticas en una enfermedad en particular (Mountain, 2000).
2.3 Viroterapia
La terapia génica contra el cáncer generalmente utiliza vectores virales que
transportan genes para re-convertir las células neoplásicas a un fenotipo no maligno
(corrección fenotípica), para estimular su eliminación por el sistema inmune
(inmunoterapia), inhibir la neoangiogénesis tumoral, para eliminarlas por un efecto
directo producido por genes tóxicos o pro-apoptóticos, citotoxicidad. Sin embargo,
inicialmente la terapia génica en contra del cáncer presentó varios inconvenientes en
su eficiencia terapéutica (Cervantes-García, et. al., 2008).
Una de sus principales limitantes fue la poca diseminación intratumoral de los
vectores virales no replicantes. Con el objetivo de superar esta limitación, en la última
11
década ha tomado auge una nueva estrategia terapéutica, denominada viroterapia o
terapia viral oncolítica. La viroterapia usa una gran variedad de vectores virales, pero
a diferencia de la terapia génica con vectores de primera generación, en donde los
vectores virales no se replican, en la viroterapia se emplean vectores virales con
capacidad replicativa y la muerte de la célula neoplásica sobreviene por efecto de la
propia replicación viral (Nettelbeck y Curiel, 2003).
La principal característica de la viroterapia es la utilización de vectores virales
que puedan replicarse de manera preferencial en un tejido tumoral, bajo condiciones
moleculares muy específicas y exclusivas de la célula neoplásica. Esta característica
permite eliminar a las células tumorales mediante un proceso infeccioso y citolítico
limitado, con escasos efectos colaterales, al usar dosis dentro de una ventana
terapéutica determinada para cada vector (Delgado-Enciso, et. al., 2008).
Adicionalmente, la replicación amplifica la dosis de entrada de los virus
oncolíticos y ayuda a tener una mejor diseminación del agente hacia las células
tumorales vecinas, con posibilidad de alcanzar metástasis. El efecto oncolítico
también podría potenciarse por la generación de una respuesta inmune en contra del
vector y de las células infectadas por éste (Heise y Kirn, 2000).
Por lo anterior la terapia viral oncolítica es actualmente una de las
herramientas terapéuticas más prometedoras en la lucha en contra del cáncer,
diversas compañías farmacéuticas ya están probando diversos vectores oncolíticos
en estudios clínicos (en humanos) fase I, II y III (Nettelbeck y Curiel, 2003;
Cervantes-García, et. al., 2008).
Se han ensayado diversos tipos de vectores virales oncolíticos, tales como los
virus herpes, el reovirus, el virus atenuado de la enfermedad de New Castle, el
12
poliovirus, el virus de la influenza, el virus de la estomatitis vesicular, el virus
atenuado de la rubéola y hasta ARN virus (llamados mumps), pero sin duda el vector
oncolítico más utilizado es el adenovirus humano tipo 5 (Russell, 2002).
2.4 Adenovirus
Los adenovirus son una familia de virus de ADN capaces de infectar células
que no están en división. Estos virus fueron aislados por primera vez en 1953 por
investigadores que trataban de establecer líneas celulares a partir de tejidos
provenientes de adenoides de niños (Shenk, 1996).
El genoma viral es lineal y tiene una longitud de aproximadamente 36 kpb, los
genes expresados durante la fase temprana se organizan en cuatro regiones del
genoma adenoviral, designadas como E1 a E4. Los genes tempranos, llamados así
porque se expresan de seis a ocho horas después de la infección, previo a la
replicación del ADN, E1, E2, y E4 codifican proteínas regulatorias esenciales que
inducen la replicación del ADN viral. En la región E1 se encuentra la señal de
empaquetamiento viral, donde E1A y E1B poseen capacidad de transactivación, y
E2A y E2B se encuentran involucradas en la replicación viral mientras que E3 no es
un gen esencial (Lundstrom, 2004).
2.4.1 El gen E1A
Los dos procesos más importantes en la replicación adenoviral son la
progresión hacia la fase S del ciclo celular y la síntesis de productos virales que
intervienen en la replicación. Para que estos dos procesos se lleven a cabo, se
13
requiere que la proteína E1A active a la mayoría de los genes adenovirales. La
expresión del gen E1A es controlada por un promotor constitutivo muy activo
denominado “repetición invertida terminal”, localizado en el extremo 5´ del genoma
adenoviral (ITR-5’, por sus siglas en inglés). La falta de expresión o la deleción del
gen E1A hacen que un adenovirus sea incompetente para la replicación (Chiou y
White, 1997).
2.5 Vectores Adenovirales Oncolíticos
La construcción de un vector adenoviral de replicación selectiva se logra
sometiendo la actividad de los genes E1A y E1B bajo el control de un promotor
tejido-especifico o mediante mutaciones en los mismos genes (Heise y Kirn, 2000).
Como la proteína E1A es esencial para la replicación adenoviral, el comando
de su expresión permite el control de la replicación viral. En algunos estudios se ha
reemplazado al promotor natural (denominado ITR 5' o nativo) de E1A por un
promotor tejido-especifico. En uno de ellos se utilizó el promotor prostático
específico, el cual demostró expresión de E1A y replicación viral solo en células
prostáticas (Rodríguez, et. al., 1997).
El promotor de E1A ha sido reemplazado por el promotor de DF3/MUC1
(Kurihara, et. al., 2000) y por el promotor de respuesta a receptores de esteroides,
los cuales están sobre-expresados en cáncer de mama, para dirigir la replicación
viral a las células neoplásicas mamarias (Hernández-Alcoceba, et. al., 2000).
Recientemente se reportó un VARS en el cual el promotor URR de VPH-16
condiciona la expresión de E1A exclusivamente en células neoplásicas de cérvix, con
alentadores resultados en fase pre-clínica (Delgado-Enciso, et. al., 2007).
14
2.6 Uso en la Clínica de Vectores de Terapia Génica
Es importante recordar las diversas etapas por las que debe pasar un fármaco
o estrategia terapéutica para que deje de ser experimental y se encuentre a la venta.
Las primeras etapas incluyen experimentos en cultivo celular y animales de
laboratorio. Si los resultados son satisfactorios, la terapia se prueba por primera vez
en humanos, en las llamadas fases clínicas. Se comienza con la fase I estudiando
muy pocos pacientes y se culmina la etapa experimental en la fase III, donde se
incluye un gran número de pacientes en estudios multicéntricos, En la fase IV, el
fármaco ya está a la venta, aunque sus efectos benéficos y adversos siguen siendo
monitorizados. Hasta septiembre del 2008, solo han sido iniciados 1,472 ensayos
clínicos de terapia génica, siendo el 60% fase I, 36% fase II o I/II, 1% fase II/III, y el
3% fase III. El 65% son ensayos clínicos para enfermedades neoplasicas (MartinezDavila y Delgado-Enciso, 2010).
Después de que en 1986 comenzaran los ensayos clínicos en humanos, el
primer vector en el comercio fue el Gendicine, usado para tumores de cabezo y
cuello en China en el 2003. Gendicine es un vector adenoviral de primera generación
(no replicativo) y portador de gen terapéutico p53. De los vectores oncolíticos, el
H101 (Oncorine) ha sido el primero a la venta, lo cual sucedió en China en el año
2005. Estos vectores han sido empleados en monoterapia o junto con quimioterapia.
Hasta la fecha en ningún otro país, fuera de China, se ha aprobado la venta de
vectores de terapia génica, aunque los ensayos clínicos en fase experimental se
están realizando en prácticamente todos los países del mundo desarrollado.
(Martinez-Davila, Delgado-Enciso, 2010).
2.7 STAT3
La muerte celular programada, apoptosis, juega un papel importante en una
amplia variedad de procesos fisiológicos. La desregulación de este mecanismo
15
fisiológico de muerte celular ha sido implicada en diversos padecimientos desde
cáncer hasta enfermedades autoinmunes (Turkson, 2000).
STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription-3, por sus siglas en
ingles) es una proteína involucrada en la carcinogénesis (Buettner, 2002). Se ha
demostrado que la sobre-expresión de STAT3 está presente en múltiples tipos de
cáncer tales como el de mama, próstata, carcinoma renal, adenocarcinoma
pancreático, carcinoma ovárico, melanoma, cáncer de pulmón, carcinoma urotelial,
cáncer hepatocelular, cáncer cervico-uterino, entre otros (Turkson, 2000).
La activación de STAT3 responde a un estimulo celular por parte de factores
de crecimiento o de ciertas citocinas, que se unen a receptores de unidos a
membrana. Esta señal propicia la fosforilación de STAT3 mediante proteínas
tirocinasas citoplasmáticas, lo cual favorece la formación de dímeros de STAT3.
Unas vez llevada a cabo la dimerización, las moléculas de STAT3 se translocan del
citoplasma hacia el núcleo, donde se unirá a secuencias consenso del ADN de genes
blanco y posteriormente activar la actividad de transcripción (Fletcher, 2009). Entre
los genes blancos de STAT3, como factor de transcripción, se encuentran genes
relacionados con la supervivencia celular y la proliferación, tales como BCL-2, BCLXl, MCL-1, ciclina D y c-Myc (Choi, 2009).
2.8 STAT3 y Cáncer
Las elevaciones en los niveles de la proteína STAT3 puede activar genes que
promuevan la protección de la célula de la apoptosis o muerte (BCL-2), por tal
motivo, una gran variedad de tumores sobre-expresan STAT3 como parte de los
cambios moleculares que favorecen su crecimiento acelerado y diseminación, tales
como el cáncer cérvico-uterino (Choi, 2009).
16
En el cáncer cérvico-uterino se ha observado que la expresión de STAT3
incrementa en relación directa con el grado de neoplasia cervical intra-epitelial (Yue,
et. al., 2009; Chen, et. al., 2007). Todo lo anterior indica que el promotor de STAT3,
que es el responsable de la expresión de este gen, está muy activo en las células
neoplásicas del cáncer cérvico-uterino.
En estudios recientes se han explorado diversas estrategias de terapia génica
que tienen como blanco a STAT3. Estos estudios incluyen el uso de un vector
oncolítico que es capaz de silenciar a STAT3 en múltiples líneas celulares y en un
modelo in vivo (Han, 2009).
Además, se ha utilizado un ARN de interferencia para lograr el silenciamiento
de la expresión de mARN de STAT3, así como a su proteína, en un modelo de
carcinoma hepatocélular in vivo. De esta manera se demuestra el papel tan
importante que juega STAT3 en la biología molecular del cáncer (Jing, 2009).
Recientemente se demostró que un siRNA de STAT3 es capaz de inducir
apoptosis en las células B16, que corresponden a melanoma, tanto de manera in
vitro como en un modelo animal (Alshaman, 2010).
2.9 Vector adenoviral oncolítico dirigido por el promotor de STAT3
Las alteraciones moleculares que contribuyen a la transformación y
proliferación de las células cancerosas pueden servir para destruirlas de manera
selectiva. Actualmente existen trabajos en los que se expone la utilización de STAT3
como un buen blanco para este tipo de terapias (Han, 2009). Este proyecto planteó
construir un vector adenoviral de replicación selectiva en el cual el promotor de
17
STAT3 dirija la actividad replicativa del gen E1A exclusivamente en las células
neoplásicas que sobre-expresen la proteína STAT3.
De esta manera se podría aprovechar, que el promotor de STAT3 está muy
activo en las células neoplásicas para que en ellas, cuando entre el adenovirus
experimental, ocurra una gran producción de E1A y por ende una infección y lisis
celular selectiva. Lo anterior tiene como finalidad generar una nueva opción
terapéutica que ayude en el tratamiento de pacientes con neoplasias que sobreexpresen STAT3.
18
3 Planteamiento del Problema
¿Se puede generar un vector adenoviral con replicación dirigida por el promotor de
STAT3 que es capaz de lisar células neoplásicas sobre-expresoras de STAT3?
3.1 Justificación
Sin duda, una de las enfermedades más importantes a nivel mundial por su
mortalidad es el cáncer. La fisiopatología de este padecimiento es múltiple y muy
compleja; sin embargo actualmente se reconoce que esta enfermedad surge
después de la acumulación de diversas alteraciones en diferentes genes en las
células somáticas a lo largo del tiempo. En la mayoría de los casos las neoplasias
son diagnosticadas en estadios avanzados, en cuyo caso el tratamiento quirúrgico,
único potencialmente curativo, ya no es una opción recomendable. De esta manera
sólo se pueden utilizar la quimioterapia. Estos últimos, además de ser únicamente
paliativos en la mayoría de los casos, pueden no ser eficaces en el control de la
enfermedad y suelen ser acompañados de efectos adversos que interfieren con la
calidad de vida del paciente. Ante esto, la búsqueda de nuevas alternativas de
tratamiento es de gran importancia para combatir este desorden. La familia de
proteínas STAT son claves en el control de intermediarios que controlan la apoptosis
o muerte celular programada. La proteína STAT3, que desempeña un papel de
regulación de biomoléculas anti-apoptosis, es potencialmente oncogénica y su sobreexpresión ha sido asociada con neoplasias, como el cáncer cérvico-uterino, entre
otros. Fabricar un vector de terapia génica oncolítico que elimine preferentemente a
células sobre-expresoras de STAT3 (neoplásicas), podría plantearse como una
19
nueva estrategia terapéutica que ayude a combatir el cáncer, lo cual justifica, por los
antecedentes presentados, realizar este proyecto de investigación.
3.2 Objetivo General
Generar un vector adenoviral con replicación selectiva para neoplasias sobreexpresoras de STAT3
3.2.1 Objetivos Específicos
Aislar el promotor de STAT3 a partir de genoma humano mediante reacción en
cadena de la polimerasa.
Generar un plásmido acarreador con promotor de STAT3 y regiones de
homología.
Generar el genoma del vector adenoviral con replicación selectiva dirigida por
el promotor de STAT3.
3.3 Hipótesis
Es posible generar un vector adenoviral con replicación dirigida por promotor
de STAT3.
3.3.1 Hipótesis Nula
No es posible generar un vector adenoviral con replicación dirigida por
promotor de STAT3.
20
4 Metodología
4.1 Tipo de Investigación
Estudio experimental, en el campo de la biología molecular.
4.2 Descripción de variables
La clasificación de las variables del estudio se muestra en la Tabla 1
Tabla 1. Clasificación de la Variable
Variable
Generación del
vector adenoviral
para células sobreexpresoras de
STAT3
Interrelación
Dependiente
Naturaleza
Cualitativa
Nivel de
Medición
Nominal
dicotómica
Indicador
Patrón de
restricción
correcto
Si/No
21
4.3 Estrategia general
La figura 1 muestra esquemáticamente la secuencia general del trabajo que se
desarrolló en el presente proyecto.
Figura 1. Plandel
de trabajo
general.
Aislamiento
Promotor
de STAT3
Obtención y aislamiento de la
región promotora de STAT3
Construcción del plásmido
acarreador
Generación del genoma del
vector adenoviral
Análisis del patrón de
restricción del genoma
adenoviral
22
4.4 Construcción de los vectores adenovirales.
La construcción del vector adenoviral tuvo varias fases, las cuales se pueden
dividir de manera general en:
3.4.1 Obtención y aislamiento de la región promotora de STAT3.
3.4.2 Construcción del plásmido acarreador.
3.4.3 Generación y producción de los vectores adenovirales.
4.4.1 Obtención y aislamiento de la secuencia promotora de STAT3.
Se obtuvo la región promotora del gen STAT3 a partir de DNA de la línea
celular HeLa (VPH-18) utilizando la Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR, por
sus siglas en inglés). El fragmento amplificado corresponderá a la fracción con mayor
actividad promotora (Kato, 2000) comprendida entre las -1 y -529 pares de bases
(pb) (Figura 2) (Anexo A). Cabe señalar que el producto amplificado posee en sus
extremos adaptadores XhoI, introducidos por medio de los iniciadores (usados para
amplificar a la región promotora). El producto de interés fue separado mediante
electroforesis (Anexo B) y fue purificado.
Figura 2. Representación gráfica del fragmento amplificado del promotor de STAT3.
23
4.4.2 Construcción del plásmido acarreador.
Como plásmido acarreador usamos al Psp-E1A (Donado por el Dr. Augusto
Rojas, Facultad de Medicina de la UANL), el cual fue linearizado con la enzima de
restricción Xho I. Esta digestión fue separada por electroforesis en gel de agarosa y
purificada, para después ser sometida junto con el producto amplificado del promotor
STAT3 (previa digestión con XhoI) a una reacción de ligación con T4 DNA ligasa
(invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción de ligación fue
transformada en bacterias E. coli DH5α. Las clonas resultantes fueron tamizadas por
PCR para seleccionar a la clona que contenga la construcción correcta del nuevo
plásmido acarreador (Figura 3).
Figura 3. Esquema que representa la obtención del plásmido acarreador.
4.4.3 Generación de los genomas virales.
El plásmido acarreador fue co-transformado en bacterias calcio-competentes
E. coli recA + BJ5183 con el esqueleto adenoviral pAd5 (contiene el genoma de
adenovirus tipo 5)
linearizado con la enzima Cla I (donado por el Dr. Ramón
Alemany, Instituto Catalan de Oncología, Barcelona, España) para generar mediante
24
recombinación homóloga (Figura 4) el genoma adenoviral del vector de replicación
selectiva Ad-pSTAT3 (Figura 4).
Figura 4. Transferencia de las secuencias de interés del pSTAT3 (promotor STAT3 controlando a
E1A) al genoma adenoviral por recombinación homóloga.
25
5 Resultados
Se procedió a la estandarización de la PCR (Anexo A), de la que se obtuvo el
fragmento de interés de la región promotora del gen de STAT3 (Figura 5).
Figura 5. Gel de agarosa al 1% teñido con SybrGreen. Se observa un gradiente de temperatura entre
los 45, 50, 55, 60 C (Carriles 2, 3, 4, 5), utilizado para realizar la estandarización de la PCR y obtener
el fragmento de interés (529 pb). MTM (Marcador de talla molecular en el carril 1, 1kb DNA Ladder
nvitrogen®).
Para llevar a cabo la generación del plásmido acarreador se realizó la
manipulación de bacterias calcio-competentes E. coli. DH5α, las cuales fueron
utilizadas para llevar a cabo la clonación del pSTAT3 en el plásmido PSP-E1A, esto
se logró mediante reacciones con la enzima Xho I. Para determinar la integridad de
los plásmidos PSP-E1A y pAd5, se hizo una caracterización mediante la enzima de
restricción EcoRV, la cual nos muestra el patrón de corte característico para este
plásmido (Figura 6).
26
Figura 6. Gel de agarosa al 1% teñido con SybrGreen. Se observa la caracterización de los
plásmidos PSP-E1A (Carril 1 y 2) y pAd5 (Carril 3). La caracterización se realizó con la enzima de
restricción EcoRV, Invitrogen®.
Una vez comprobada la integridad y la calidad de los plásmidos se continuó
con la clonación del fragmento de interés en el plásmido PSP-E1A y la posterior
transformación de las bacterias DH5α calcio-competentes, para su producción en
masa. De las clonas obtenidas se extrajo el ADN plasmídico y fue digerido con la
enzima EcoRI para la liberación del fragmento de interés y comprobar que la
clonación se llevó a cabo de manera correcta (Figura 7).
27
Figura 7. Gel de agarosa al 1% teñido con SybrGreen. Se observa la caracterización enzimática de
las clonas. (KpnI-SmaI, 214-4288 pb) Los carriles 6, 8, 12, 15 y 16 contienen la construcción correcta
del plásmido acarreador, pues liberan un fragmento de DNA del tamaño esperado (Marcador de talla
molecular 1kb DNA Ladder Invitrogen®).
Una vez concluida esta etapa se continuó con la obtención del genoma
adenoviral modificado Ad-pSTAT3. Para ello se realizo una co-transformación,
utilizando bacterias calcio-competentes E. coli recA + BJ5183, con el esqueleto
adenoviral pAd5 linearizado con la enzima Cla I y el plásmido acarreador. Se utilizó
la enzima Hind III para realizar la caracterización del armado correcto de los
genomas adenovirales (Figura 8).
La figura 8 muestra que finalmente se generó el genoma del vector adenoviral
oncolítico propuesto.
28
Figura 8. Gel de agarosa al 1% teñido con SybrGreen. Se observa la caracterización
enzimática (Hind III) de los genomas adenovirales. Los carriles 2, 3, 5, 6 contienen la arquitectura
correcta de los genomas adenovirales. Los carriles 7, 8, 9, 10 muestran el control negativo a ensayo
(transformación de plásmido acarreador sin pAd5). (Marcador de talla molecular 1kb DNA Ladder
Invitrogen®).
29
6 Discusión
Existen diversas terapias que ayudan a combatir el desarrollo del cáncer
cérvico-uterino, sin embargo, estas llegan a ser agresivas con el paciente
disminuyendo su calidad de vida. Actualmente en todo el mundo se está llevando a
cabo una búsqueda para desarrollar nuevas alternativas terapéuticas que resulten
más amables con las pacientes y que a su vez sean efectivas. Dentro de estas
nuevas alternativas en desarrollo se encuentra la terapia génica viral oncolítica, la
cual consiste en utilización de vectores virales que puedan llevar a cabo su acción de
manera selectiva en un tejido tumoral, en un ambiente molecular muy específico y
exclusivo de la célula neoplásica (Delgado-Enciso, 2008). El ambiente molecular,
tanto intracelular como extracelular, es complejo, sin embargo se ha demostrado que
una desregularización en las vías de señalización medidas por la familia STAT
participan en el desarrollo, progresión, metástasis y resistencias de múltiples tumores
(Fletcher, 2009).
Debido a esto, esta familia de proteínas, específicamente STAT3, han sido
objeto de múltiples estudios que postula a esta biomolécula como un buen candidato
como blanco terapéutico (Choi, 2009). En estudios recientes se han explorado
diversas estrategias de terapia génica que tienen como blanco a STAT3. Han et al en
el 2009 llevaron a cabo estudios sobre un vector oncolítico que es capaz de silenciar
a STAT3 en múltiples líneas celulares y en un modelo in vivo. Este vector fue
construido con el cDNA de STAT3 colocado de manera contraria al sentido de la
transcripción del adenovirus tipo 5, para generar un RNA antisentido. En este estudio
se observo un crecimiento tumoral menor en el grupo que fue tratado con el vector
30
oncolítico con respecto al grupo control. Este vector también produce un 60% de
apoptosis en células MDA-MB-231 (cáncer de mama), HCT-8 (carcinoma colorectal),
PC3M-1E8 (cáncer de próstata) y MKN-45 (cáncer gástrico) a las 96 hora de
exposición y es significativamente más eficaz que los vectores utilizados como
control (Han, 2009).
Además, se ha utilizado un ARN de interferencia para lograr el silenciamiento
de la expresión de mARN de STAT3, así como a su proteína, en un modelo de
carcinoma hepatocélular in vivo. En este estudio se logro una disminución del
crecimiento tumoral, así como una disminución de la expresión de génica y proteica
de aquellos genes relacionados con la progresión celular, VEGF, survivina, c-myc y
un aumento de esta en los genes relacionados con la apoptosis, como la caspasa 3 y
p53. De esta manera se demuestra el papel tan importante que juega STAT3 en la
biología molecular del cáncer y su potencial uso como blanco terapéutico (Jing,
2009).
Siguiendo la línea de los iRNA, se demostró que un siRNA de STAT3 es
capaz de inducir apoptosis en las células B16, que corresponden a melanoma, tanto
de manera in vitro como en un modelo animal (Alshaman, 2010).
En el presente trabajo se logro generar el genoma de un vector adenoviral que
controla su replicación con el promotor de STAT3. Existe evidencia que soporta la
hipótesis que un vector adenoviral de replicación preferencia en células sobreexpresoras de STAT3, será capaz de lisarlas y de esta manera aportar un paso más
31
hacia el desarrollo de nuevas alternativas terapéuticas para el cáncer cérvico-uterino
u otras neoplasias que sobre-expresen STAT3.
32
7 Conclusiones
Se generó un vector adenoviral con replicación selectiva para neoplasias
sobre-expresoras de STAT3.
Se logró aislar el promotor de STAT3 a partir de genoma humano mediante
reacción en cadena de la polimerasa.
Se realizó la generación del plásmido acarreador con promotor de STAT3 y
regiones de homología.
Se obtuvo el genoma del vector adenoviral con replicación selectiva dirigida
por el promotor de STAT3.
33
8 Perspectivas
E siguiente paso del presente trabajo son las pruebas del vector generado,
tanto in vitro,
así como en un modelo animal. Para ello hay que llevar a cabo
experimentos en líneas celulares normales para determinar la seguridad del vector, a
la vez realizar en células de diferentes tipos de cáncer, para explorar la eficacia de
este vector en células con un ambiente molecular distinto. También se proponen
llevar a cabo estudios en los que se determine la expresión génica y proteica de
genes relacionados con las rutas metabólicas de STAT3, esto para aportar
información que ayude a elucidar la manera en que se están alterando las vías de
señalización una vez que el vector a introducido su información al interior de la
célula.
34
9 Glosario
Ácido Desoxirribonucleico (ADN): ácido nucleico formado por nucleótidos en los
que el azúcar es desoxirribosa, y las bases nitrogenadas son adenina, timina,
citosina y guanina. Excepto en los retrovirus que tienen ARN, el ADN codifica la
información para la reproducción y funcionamiento de las células y para la replicación
de la propia molécula de ADN. Representa la copia de seguridad o depósito de la
información genética primaria, que en las células eucarióticas está confinada en la
caja fuerte del núcleo.
ADN desnudo: ADN desprovisto de cubierta proteínica o lipídica. Para la
transferencia de genes, suele estar constituida por un plásmido bacteriano que
contiene el gen a transferir. Se inyecta directamente en el tejido objetivo donde se
expresa generalmente sin integrarse en el genoma de las células huésped.
ADN recombinante (ADNr): Molécula de ADN formado por recombinación de
fragmentos de ADN de orígenes diferentes. La (o las) proteína que codifica es una
proteína recombinante. Se construye mediante la unión de un fragmento de ADN de
origen diverso a un vector, como, por ejemplo, un plásmido circular bacteriano. El
vector se abre por un sitio específico, se le inserta entonces el fragmento de ADN de
origen diverso y se cierra de nuevo. El ADN recombinante se multiplica en una célula
huésped en la que puede replicarse el vector.
Ácido Ribonucleico (ARN): Ácido nucleico formado por nucleótidos en los que el
azúcar es ribosa, y las bases nitrogenadas son adenina, uracilo, citosina y guanina.
35
Actúa como intermediario y complemento de las instrucciones genéticas codificadas
en el ADN. Existen varios tipos diferentes de ARN, relacionados con la síntesis de
proteínas. Así, existe ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ARNr), ARN de
transferencia (ARNt) y un ARN heterogéneo nuclear (ARN Hn). El ARN es
normalmente el producto de la transcripción de un molde de ADN, aunque en los
retrovirus el ARN actúa de plantilla y el ADN de copia.
ARN mensajero (ARNm): Molécula de ARN que representa una copia en negativo de
las secuencias de aminoácidos de un gen. Las secuencias no codificantes (intrones)
han sido ya extraídas. Con pocas excepciones el ARNm posee una secuencia de
cerca de 200 adeninas (cola de poli A), unida a su extremo 3' que no es codificada
por el ADN.
Adenovirus: virus con ADN desprovistos de cubierta, que comprende 47 subtipos la
mayoría de los cuales atacan preferentemente las vías respiratorias aunque no son
muchos los que resultan patógenos para el hombre. Los vectores derivados de los
serotipos 2 y 5 se utilizan para la terapia génica in vivo.
Citotoxicidad: constituye uno de los procesos por el cual un determinado grupo de
células especializadas del sistema inmunitario o agentes patógenos interactúan con
tipo específico de células blanco y las destruye.
Electroforesis: es la técnica por la cual mezclas complejas de moléculas como
proteínas, ADN o ARN se separan en un campo eléctrico de acuerdo al tamaño y a
su carga eléctrica. La electricidad empuja las moléculas a través de los poros de un
gel, que es una sustancia firme como la gelatina. El gel puede hacerse de manera
36
que sus poros tengan distintas dimensiones para separar las moléculas según un
rango específico de tamaños y formas. Las moléculas más pequeñas migran más
rápido que las más grandes.
Expresión génica: es un proceso altamente específico en el cual un gen se
"enciende" en un momento determinado y comienza la producción de su proteína.
Gen: unidad física y funcional del material hereditario que determina un carácter del
individuo y que se transmite de generación en generación. Su base material la
constituye una porción de cromosoma (locus) que codifica la información mediante
secuencias de ADN.
Hibridación: proceso de generación de una molécula, célula u organismo combinado
con material genético procedente de organismos diferentes. En las técnicas
tradicionales, los híbridos se producían mediante el cruzamiento de variedades
distintas de animales y plantas por alineación o apareamiento de bases de dos
moléculas de ADN de cadena sencilla que son homólogas o complementarias. La
tecnología de fusión celular y la manipulación transgénica son las nuevas
modalidades de hibridación introducidas por la manipulación genética.
Ingeniería genética: conjunto de técnicas utilizadas para introducir un gen extraño
(heterólogo) en un organismo con el fin de modificar su material genético y los
productos de expresión.
37
Intrón: es una secuencia no codificadora de ADN que separa a dos exones. El intrón
inicialmente se transcribe en la molécula de ARN mensajero pero después es
eliminado durante el proceso de maduración del ARN.
Oncogén o gen transformante: gen que produce la transformación morfológica de
células hísticas en cultivo o formación tumoral en animales. Se han identificado
oncogenes en retrovirus de transformación aguda o en ensayos de transfección de
ADN de tumores. Los oncogenes están presentes en todas las especies animales e
intervienen en los procesos de diferenciación y crecimiento celular. En condiciones
normales
están
inactivos
(protooncogenes)
pero
pueden
activarse
como
consecuencia de mutaciones o de infecciones por virus oncogénicos. Las
alteraciones cromosómicas, como roturas y deleciones, pueden activar los
oncogenes.
Plásmido: forma no celular de vida, fragmento circular de ADN bicatenario que
contienen unos cuantos genes y se encuentran en el interior de ciertas bacterias.
Actúan y se replican de forma independiente al ADN bacteriano y pueden pasar de
unas bacterias a otras. Igual que los provirus no producen enfermedades pero
inducen pequeñas mutaciones en las células. Se utilizan como vectores en
manipulación genética.
Primer o cebador: una secuencia corta de oligonucleótidos que se une en forma
complementaria específica a una cadena única de ácido nucleico e inicia la síntesis
de esa cadena en presencia de ADN polimerasa y nucleótidos en una reacción de
PCR.
38
Promotor: es la parte de un gen que contiene la información necesaria para activarlo
o desactivarlo. El proceso de transcripción se inicia en el promotor.
Reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés): técnica de
análisis del genoma mediante la amplificación ilimitada de porciones específicas del
ADN, aunque sean minúsculas. Es un método revolucionario de amplificación
exponencial del ADN por la intervención de una enzima termoestable, la Taq
polimerasa, inventado por el americano Kary Mullis en 1985 por lo que se le concedió
en 1993 el premio Nobel. Es el proceso fundamental para la secuenciación del
Proyecto Genoma Humano.
Replicación: proceso por el que una molécula de ADN o ARN origina otra idéntica a
la preexistente. En general, duplicación del ácido nucleico.
Terapia génica: conjunto de los procesos destinados a la introducción in vitro o in
vivo de un gen normal en células, germinales o somáticas, en las que el mismo gen,
anormal, provoca una deficiencia funcional, origen de una enfermedad, o la de un
gen codificador de una proteína, por ejemplo, con una acción antitumoral en las
células cancerosas, o antivírica en células infectadas por un virus patógeno.
Vector: portador, que transfiere un agente de un huésped a otro. Sistema que
permite la transferencia, la expresión y la replicación de un ADN extraño en células
huésped para una posterior clonación o transgénesis. Se trata de una molécula de
ADN (plásmido bacteriano, microsoma artificial de levadura o de bacteria) o de un
39
virus defectuoso. Por extensión, un vector designa todo sistema de transferencia del
gen, por ejemplo, un sistema sintético como el de los liposomas.
40
10 Anexos
ANEXO A
Técnicas Moleculares
Amplificación
La reacción en cadena de la polimerasa (RCP) es un método in vitro de
síntesis de ADN con el que un segmento particular de éste es específicamente
amplificado al ser delimitado por un par de iniciadores que lo flanquean. Su copiado
se logra en forma exponencial a través de ciclos repetidos de diferentes periodos y
temperaturas de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa
termoestable. Así se obtienen en cuestión de horas millones de copias de la
secuencia deseada del ADN (Rodríguez-Sánchez, 2004). Las secuencias de
iniciadores empleados en el presente trabajo se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Nombre y secuencia de los iniciadores utilizados.
Nombre
Secuencia
Tamaño de
Fragmento
Amplificado
pSTAT3-3X-F
5’-GACTCCTGCCTGAAGCTTTACATA-3’
5’-GAGTTAATGGGTGCAGCACA-3’
529
pSTAT3-3X-R
Para llevar a cabo la amplificación del fragmento de interés, se empleó una
mezcla con 50 ng de ADN molde, 2 mM de MgCl 2, 0.2 μl de cada dNTPs, 2 pmol de
cada uno de los iniciadores, solución amortiguadora 1X y 0.4 U de ADN polimerasa
TaqPlatinium®. El volumen final de la mezcla fue de 20 μl.
Las condiciones de amplificación (Figura 6) fueron un periodo de
desnaturalización de dos minutos de duración, seguido de 40 ciclos consistentes en
41
30 segundos a 94 C, 40 segundos a 56 C y 20 segundos a 72 C, y una extensión
adicional de 8 minutos.
72 C
5'
94 C
2'
72 C
25"
94 C
30''
40X
50 C
40"
Figura 6. Condiciones de amplificación de PCR.
42
ANEXO B
Electroforesis
La electroforesis es un método analítico, en el que se separan biomoléculas
en dependencia en otros factores de su carga/masa y bajo la acción de un campo
eléctrico (Ausubel, 2002).
Para visualizar los fragmentos de amplificación se realizo una electroforesis
horizontal en geles de agarosa al 1%, mezclando 7 µL del producto amplificado con
1.3 µL de azul de bromofenol. Como referencia para distinguir el tamaño molecular
de los fragmentos, se utilizó un marcador de talla molecular de 100 o 1000 pares de
bases. El corrimiento se llevó a cabo utilizando una corriente eléctrica de 90 V
durante 1:30 hr. y los geles se tiñeron con SayberSafe ®(Ausubel, 2002).
Para preparar un gel de 30 mL se mezclaron 3 gramos de agarosa con 30 mL
de solución amortiguadora TBE 1X. La mezcla fue calentad en microondas el tiempo
suficiente para que la turbidez desaparezca. Se dejó polimerizar 20 minutos. Una vez
finalizada la polimerización el gel fue colocado en una cámara de electroforesis con
solución amortiguadora TBE 1X (Ausubel, 2002).
Para efectuar el revelado del gel, se sumergió durante 10 minutos en una
solución de SybrSafe® al 1% evitándose la exposición a la luz. Después el gel se
coloco en papel absorbente y una vez seco se coloco en el transilunimador en donde
fue expuesto a una fuente de luz ultravioleta (Ausubel, 2002).
43
Anexo C
Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002,
son considerados residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI) aquellos que se
generan durante las actividades asistenciales a la salud de humanos o animales en
los centros de salud, laboratorios clínicos o de investigación, bioteros, centros de
enseñanza e investigación, principalmente; que por el contenido de sus componentes
puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente. Durante el desarrollo de la
investigación se generarán los siguientes RPBI:
Sangre
La sangre y los componentes de ésta, sólo en su forma líquida, así como los
derivados no comerciales.
Cultivos y cepas de agentes biológico-infecciosos
Los cultivos generados en los procedimientos de investigación, así como los
generados en la producción y control de agentes biológico-infecciosos.
Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar
cultivos de agentes biológico-infecciosos.
Residuos no Anatómicos
Son residuos no anatómicos los recipientes desechables que contengan
sangre líquida. Los materiales de curación, empapados, saturados, o goteando
sangre.
44
Objetos Punzocortantes
Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras
biológicas durante el diagnóstico y tratamiento, únicamente: tubos capilares, navajas,
lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hipodérmicas, de sutura, de
acupuntura y para tatuaje, bisturís y estiletes catéter, excepto todo material de vidrio
roto utilizado en el laboratorio, el cual deberá desinfectar o esterilizar antes de ser
dispuesto como residuo municipal.
Depósito
Los cultivos y cepas de agentes biológico-infecciosos y los residuos no
anatómicos se almacenan en bolsas rojas de polietileno translucidas marcadas con
el símbolo universal de riesgo biológico y la leyenda Residuos Peligrosos BiológicoInfecciosos
Los objetos punzocortantes resultantes de la punción venosa son depositados
en un recipiente rígido de polipropileno de color rojo marcado con el símbolo
universal de riesgo biológico y la leyenda Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos
Los contenedores, tanto bolsas como recipientes rígidos, se deben de llenar
sin saturar, el caso de las bolsas anudar o en el de los recipientes cerrar
perfectamente. Los contenedores llenos se depositaran temporalmente en el lugar
especificado dentro del laboratorio no más de 30 días. Antes de cumplir este periodo
serán trasladados al Hospital Regional Universitario de la ciudad de Colima donde
serán colocados en el almacén de RPBI a la espera de la empresa encargada del
tratamiento y deposito final.
45
Especial consideración merecen los productos químicos, los cuales serán
neutralizados y después desechados en la tarja.
46
11 Bibliografía
Alshamsan, A., Hamndy, S., Samuel, J., El-Kadi, A. O.S., Lavasanifar, A., Uludağ, H.
(2010). The Induction of Tumor Apoptosis in B16 Melanoma following STAT3
siRNA delivery with a Lipid-Substituted Polyethylenimine. Biomaterials; 31:
1420-1428.
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A.
(2002). Short protocols in Molecular Biology.5th. Edition.Wiley Canada.2-13.
Blaese RM, Culver KW, Miller AD, Carter CS, Fleisher T, Clerici M et al. (1995). T
lymphocyte-directed gene therapy for ADA- SCID: initial trial results after 4
years. Science; 270: 475-480.
Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, de Saint Basile G, Gross F, Yvon E, Nusbaum P
et al. (2000). Gene therapy of human severe combined immunodeficiency
(SCID)-X1 disease. Science; 288: 669-672.
Cervantes-García, D., Ortiz-López, R., Mayek-Pérez; N., Rojas-Martínez A. (2008).
Oncolyticvirotherapy. Annals of Hepatology; 7: 34-45.
Chen, C-L., Hsieh, F-C., Lieblein, JC., Brown, J ., Chan, C. Wallace, JA. (2007) Stat3
activation in human endometrial and cervical cancers. Journal of Cancer.
96:591–599
Chiou SK, White E. (1997). p300 binding by E1A cosegregates with p53 induction but
is dispensable for apoptosis. Journal of virology; 71:3515-3525.
47
Choi, H.-J. Lee, J. H., Park, S.-Y., Cho J. H., Han, J.-S. (2009). STAT3 is involved in
phosphatidic acid-induced Bcl-2 expression in HeLa cells. Experimental and
molecular Medicine; 2: 94-101.
Delgado-Enciso, I., Cervantes-García, D., Martínez-Dávila, I. A., Ortiz-López R.,
Alemany-Bonastre, R., Silva-Platas, et. al. (2008). A potent replicative delta-24
adenoviral vector driven by the promoter of human papillomavirus 16 that is
highly selective for associated neoplasms. The Journal of Gene Medicine; 9:
852–861.
Delgado-Enciso, I., Galván-Salazar, H. R., Coronel-Tene, C. G., Sánchez-Santillán C
F., Rojas-Martínez, A., et. al. (2008). Preclinical evaluation of the therapeutic
effect of adenoviral vectors in human papillomavirus-dependent neoplasisas.
Revista de Investigación Clínica; 60:1001-106.
Fletcher S, Drewry JA, Shahani VM, Page BD, Gunning PT. (2009). Molecular
disruption of oncogenic signal transducer and activator of transcription 3
(STAT3) protein. Biochemistry and Cell Biology; 87:825-33.
Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, McCormack MP, Wulffraat N,
Leboulch P, et. al. (2003). LMO2-associated clonal T cell proliferation in two
patients after gene therapy for SCID-X1.Science; 302: 415-419.
Han Z, Hong Z, Chen C, Gao Q, Luo D, Fang Y, et. al. (2009). A novel oncolytic
adenovirus selectively silences the expression of tumor-associated STAT3 and
exhibits potent antitumoral activity. Carcinogenesis. l.30:2014–2022.
Heise C, Kirn DH. (2000). Replication-selective adenoviruses as oncolytic agents.
European Journal of Clinical Investigation; 105:847-851.
48
Hernández-Alcoceba R, Pihalja M, Wicha MS, Clarke MF. (2000). A novel,
conditionally replicative adenovirus for the treatment of breast cancer that
allows controlled replication of E1A-deleted adenoviral vectors. Human Gene
Therapy; 11:2009-2024.
Jing, L., Piao, Y-F., Zheng, J., Li, C., Sun, H-B. (2009). Silencing of signal transducer
and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses
growth of human hepatocellular carcinoma in tumor-bearing nude mice. World
Journal of Gastroenterology; 21: 2602-2608.
Kato K, Nomoto M, Izumi H, Ise T, Nakano S, Niho Y, et. al. (2000). Structure and
functional analysis of the human STAT3 gene promoter: alteration of chromatin
structure as a possible mechanism for the upregulation in cisplatin-resistant
cells. Biochimica et Biophysica Acta; 2:91-100.
Kurihara T, Brough DE, Kovesdi I, Kufe D. (2000). Selectivity of a replicationcompetent adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1
antigen. European Journal of Clinical Investigation; 106:763-771.
Lundstrom, K. (2004). Gene Therapy Applications of Viral Vectors. Technology In
Cancer Research & Treatment; 3:467-477.
Martinez-Davila Irma A, Delgado-Enciso I. Gene Therapy for Cancer Treatment, In:
New Approaches in the Treatment of Cancer. Editors: Camen Mejia and
Samuel Navarro. 2010 Nova Science Publishers, Inc. ISBN 978-1-61728-3048. 2010.
Meza-Junco, J., Montaño-Loza, A., Aguayo-González, A. (2006). Bases moleculares
del cáncer. Revista de Investigación Clínica;58:56-70.
49
Mountain, A. (2000). Gene therapy: the first decade. Trends in Biotechnology;
18:119-128.
Nettelbeck DM, Curiel DT. (2003). Tumor-busting viruses. The Cancer Journal from
Scientific American; 289:68-75.
NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.
Rodríguez, R., Schuur, E.R., Lim, H.Y., Henderson, G.A., Simons, J.W., Henderson,
D.R. (1997). Prostate attenuated replication competent adenovirus (ARCA)
CN706: a selective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate
cancer cells. Advances in Cancer Research; 57:2559-2563.
Rojas-Martinez A, Martinez-Davila IA, Hernandez-Garcia A, Aguilar-Cordova E,
Barrera-Saldana
HA.
(2002).
Genetictherapyofcancer.
Revista
de
Investigación Clínica; 54:57-67.
Russell SJ. (2002). RNA viruses as virotherapy agents.Cancer. Gene Therapy.;
9:961-6.
Sánchez-Rodríguez, I.P., Barrera-Saldaña, H.A. (2004). La reacción en cadena de la
polimerasa a dos décadas de su invención. Ciencia UANL; 3: 323-334
Shenk T. (1996). Adenoviridae: The viruses and their replication. En Virology, 3rd
edition. Fields, BN (editor). Lippincott-Raven Publishers. Philadelphia, EE.UU.
pp. 2111-2148.
Turkson, J., Jove, R. (2000). STAT proteins: novel molecular targets for cancer drug
discovery. Oncogene. 19:6613-6626.
Young, M. O., Jong, K. K., Yongwook C., Seungjin C., Joo-Yeon Y., (2009).
Prediction and Experimental Validation of Novel STAT3 Target Genes in
Human Cancer Cells. PloS one; 9:e6911.
50
Yue, P., Turkson, J. (2009). Targeting STAT3 in cancer: how successful are we?
Expert Opinion on Investigational Drugs. 18: 45–56.
51