Download Molecular Basis of comorbidity - Master en Bioinformática y Biología

Exploración de las bases moleculares de la
comorbilidad entre cáncer y enfermedades
del sistema nervioso central
Estudiante: Jon Sánchez Valle
MÁSTER EN BIOINFORMÁTICA Y BIOLOGÍA COMPUTACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE SALUD- INSTITUTO DE SALUD CARLOS III
2013-2014
Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO)
Grupo de Biología Computacional Estructural
Director: Alfonso Valencia Herrera
Tutora: Ana María Rojas Mendoza
Fecha: (17/09/2014)
ÍNDICE
Agradecimientos
Resumen
Objetivos
1. Introducción
1.1. Comorbilidad
1.1.1. Antecedentes
1.1.2. Análisis a realizar
1.1.3. Enfermedades del Sistema Nervioso Central
1.1.3.1. Enfermedad de Alzheimer
1.1.3.2. Enfermedad de Párkinson
1.1.3.3. Esquizofrenia
1.1.3.4. Esclerosis múltiple
1.2. Métodos Meta-analíticos
2. Materiales y Métodos
2.1. Conjuntos de datos, pre-procesado y meta-análisis
2.2. Análisis de rutas enriquecidas
3. Resultados
4. Discusión
5. Conclusiones
6. Perspectivas Futuras
7. Bibliografía
1
2
3
4
4
4
6
7
7
8
8
9
9
18
18
24
25
38
41
42
43
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer en primer lugar al Máster de Bioinformática y Biología
Computacional del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) y al Centro Nacional de
Investigaciones oncológicas (CNIO) la oportunidad que me han brindado de realizar
este proyecto Fin de Máster. Agradecer al Dr. Alfonso Valencia por permitirme trabajar
en el grupo de Biología Computacional Estructural del CNIO y por proponerme el tema
objeto del proyecto y efectuar el seguimiento del mismo.
Asimismo, quiero agradecer la inconmensurable ayuda que me han prestado
José Luis Portero, Federico Abascal y Rafael Tabarés Seisdedos, guiándome y
aconsejándome a lo largo de todo el proyecto, proponiendo siempre nuevas ideas.
De manera especial, me gustaría agradecer a Kristina Ibañez todo el apoyo que
me ha brindado a lo largo de estos 3 meses, compartiendo conmigo todos los datos de
los estudios previos, proponiendo nuevos rumbos, ayudándome a solucionar todos los
problemas que surgían y en especial por escuchar todas mis preocupaciones.
En cuarto lugar, y no por ello menos importante, quiero agradecer a mi familia
todo el apoyo que me han otorgado a lo largo no solo del desarrollo del proyecto Fin de
Máster, sino de todo el Máster en general, relajándome en los periodos de máximo
estrés y animándome en los momentos de debilidad, financiándome la estancia en
Madrid y haciéndome la vida más fácil.
Por último, quiero agradecer a mis compañeros de piso, Máster, laboratorio y
amigos en general el haber estado a mi lado durante todo este recorrido y el haberse
interesado por la evolución de mi trabajo.
1
RESUMEN
En el presente trabajo se ha llevado a cabo un meta-análisis de datos de
microarrays de expresión de 4 enfermedades del Sistema Nervioso Central (Alzheimer,
Párkinson, esquizofrenia y esclerosis múltiple) y 11 tipos de cánceres (astrocitoma,
glioblastoma, oligodendroglioma, cáncer de mama, colon, riñón, hígado, pulmón,
ovario, páncreas y próstata), utilizando para ello el modelo de efectos fijos y el modelo
de efectos aleatorios, con intención de analizar los solapamientos entre los genes
diferencialmente expresados en cada una de las enfermedades (mediante un test de
Fisher). Mediante dicho análisis, se han confirmado los resultados obtenidos por Ibañez
et al., 2014, donde detectaron evidencias de comorbilidad inversa entre Alzheimer,
Párkinson y Esquizofrenia con cáncer de colon, pulmón y próstata, y además se han
detectado evidencias de comorbilidad directa entre astrocitoma, glioblastoma y
oligodendroglioma con las enfermedades de Alzheimer y Párkinson. Así mismo,
mediante el análisis de las rutas de cáncer de KEGG, se ha observado un solapamiento
importante en las rutas de señalización, como MAPK, entre tumores cerebrales y
Alzheimer.
Como resultados complementarios al estudio, se ha comprobado que la mayoría
de los genes en astrocitoma, glioblastoma y oligodendroglioma se comportan igual, que
las similitudes entre Alzheimer y Párkinson son enormes, comprobadas mediante
solapamiento de genes, indicando que el Párkinson podría incluirse como un sub-tipo de
Alzheimer, y que se da una fuerte variación en los patrones de expresión génica en una
misma enfermedad dependiendo de la zona del organismo que se estudie.
A partir de todas las relaciones de encontradas entre las distintas enfermedades,
resultaría interesante, de cara a futuros estudios, centrarse en el reposicionamiento de
fármacos, haciendo hincapié en las rutas compartidas por las distintas enfermedades.
Además, sería interesante también tratar de localizar aquellos genes con
comportamiento inverso que puede ser responsables de un estado de muerte celular
(Alzheimer) a un estado de proliferación descontrolada (tumores cerebrales).
2
OBJETIVOS
-
Estudiar la existencia de comorbilidad entre diferentes enfermedades del sistema
nervioso central (Alzheimer, Párkinson, Esquizofrenia y Esclerosis múltiple) y
cánceres de distintas localizaciones (cerebro, colon, pulmón, próstata, mama,
ovario, páncreas, riñones e hígado).
-
Confirmar los resultados obtenidos previamente por Ibañez et al., 2014,
añadiendo nuevos conjuntos de datos a los ya existentes previamente, y
confirmar los presentados por Catalá-López et al., 2014 tras su meta-análisis.
-
Analizar los genes que se comportan de manera similar en los 3 tipos de tumores
cerebrales (astrocitoma, glioblastoma y oligodendroglioma).
-
Estudiar las diferencias entre Alzheimer y tumores cerebrales, las cuales pueden
ser responsables de un paso de muerte celular (Alzheimer) a crecimiento
descontrolado (cáncer).
-
Evaluar las diferencias y similitudes entre las enfermedades a nivel funcional
(análisis de rutas de KEGG).
-
Comprobar la existencia de diferencias al analizar la misma enfermedad
tomando muestras de 2 localizaciones distintas (estudiar la esclerosis múltiple y
las muestras tomadas de líquido cefalorraquídeo y sangre periférica).
-
Confirmar los casos particularmente relevantes obtenidos con un análisis
detallado de la bibliografía.
3
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Comorbilidad
La comorbilidad se define como la presencia de enfermedades adicionales en
relación a una enfermedad en un individuo. La comorbilidad o la multimorbilidad
(presencia de varias enfermedades en un individuo), es un problema médico universal
debido a que son muy comunes los pacientes con varios desórdenes médicos en un
momento determinado (algunos investigadores consideran que 9/10 pacientes tiene más
de un problema de salud crónico) (Tabarés-Seisdedos et al., 2011).
Existen 2 tipos de comorbilidad, la directa y la inversa. La comorbilidad directa
implica que los pacientes que presentan una determinada enfermedad tienen una
probabilidad mayor de la esperada de sufrir otros tipos de enfermedades, mientras que
la inversa implica justo lo contrario, es decir, que los pacientes con una determinada
enfermedad tienen una probabilidad menor de la esperada de sufrir otras enfermedades
(entendiendo que la presencia de una enfermedad puede otorgar una defensa frente a
otros tipos de enfermedades).
Existen 3 maneras de que enfermedades diferentes estén presentes en el mismo
individuo en un preciso momento: por azar, sesgo de selección (es más probable
detectar más de una enfermedad a las personas que presentan una y están bajo revisión
médica que a las que no lo están) o asociaciones causales. En el caso de tratarse de
asociaciones causales, puede deberse a que la presencia de una causa la presencia de la
otra o a que los factores de riesgo de una enfermedad están correlacionados con los de
la otra (Valderas et al., 2009). Respecto a esto, hay muchos factores diferentes y no
mutuamente excluyentes relacionados con la genética, comportamiento, ambiente y
cuidado de la salud que pueden ser responsables de una co-ocurrencia disminuida entre
desórdenes médicos (Tabarés-Seisdedos et al., 2011).
Tal y como se ha comentado en el apartado objetivos, en el presente estudio se
va a realizar un meta-análisis para estudiar la presencia de comorbilidades directas e
inversas entre diferentes enfermedades del Sistema Nervioso Central y distintos tipos de
cánceres.
1.1.1. Antecedentes
Catalá-López et al., 2014 llevaron a cabo un meta-análisis para evaluar la
presencia de comorbilidades directas e inversas entre diferentes enfermedades del
Sistema Nervioso Central (CNSd) y distintos tipos de cánceres, para lo cual utilizaron
datos de 50 estudios observacionales que incluían un total de 577.013 participantes. Las
CNSd que se estudiaban en los artículos eran: Alzheimer (AD), Párkinson (PD),
Esquizofrenia (SCZ), Esclerosis Múltiple (MS), Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS),
Enfermedad de Huntington (HD), Síndrome de Down (DS) y autismo. En la Figura 1 se
representan, a modo de resumen, las comorbilidades encontradas entre las distintas
enfermedades en el citado estudio, que se desarrollan de una manera resumida en el
siguiente párrafo.
En este estudio, los autores identificaron que aquellos enfermos con AD,
presentaban una ocurrencia menor de la esperada de distintos tipos de cánceres de una
4
manera generalizada (los estudios analizados no se centraban en cánceres específicos).
También mostraban que aquellos pacientes con PD presentaban una menor probabilidad
de sufrir cáncer de próstata, colon y pulmón, pero una mayor probabilidad de tener
cáncer de cerebro o de mama. Respecto a los pacientes con MS, se apreciaba una coocurrencia mayor de la esperada de tumores cerebrales, pero una co-ocurrencia menor
de la esperada de sufrir cáncer de pulmón, próstata y melanoma. En lo referente a los
pacientes con SCZ, se daba una mayor co-ocurrencia de cáncer de mama y una menor
co-ocurrencia de cáncer de próstata y melanoma, no encontrando asociación alguna
entre la enfermedad y tumores cerebrales, cáncer colorrectal o cáncer de pulmón. En el
caso de los pacientes con DS, se observaba que había una mayor frecuencia de casos
con cáncer testicular o con leucemia. Por último, los pacientes con HD presentaban
menores tasas de cáncer de mama, cánceres gastrointestinales, cáncer de pulmón y
linfomas.
Figura 1. Representación del tipo de comorbilidad detectada entre enfermedades del Sistema Nervioso
Central y distintos tipos de cánceres. En verde se indican los casos de comorbilidad inversa y en rojo los
de comorbilidad directa. Imagen cedida por el Dr. Rafael Tabarés Seisdedos.
En un estudio publicado el mismo año, Ibañez et al., 2014, utilizando datos de
microarrays de expresión, llevaron a cabo un meta-análisis en el que buscaban
evidencias moleculares de comorbilidad inversa entre CNSd y distintos tipos de
cánceres. En este caso, estudiaron AD, PD y SCZ por parte de las CNSd y cáncer de
pulmón, próstata y colon por parte de los cánceres. Además, decidieron estudiar la
relación de estas 6 enfermedades con 5 enfermedades control (asma, VIH, malaria,
5
distrofia y sarcoidosis), para probar que efectivamente no se observaban comorbilidades
entre ellas.
Como resultado de este estudio, observaron que realmente existían evidencias de
comorbilidad inversa entre los 3 tipos de cánceres y los 3 tipos de CNSd, reflejo de la
gran cantidad de genes con un comportamiento inverso entre los dos tipos de
enfermedades (es decir, los genes que estaban sobre-expresados en las CNSd estaban
sub-expresados en los distintos tipos de cánceres y viceversa).
Además, en este estudio se llevó a cabo un análisis funcional, con intención de
conocer las funciones en las que estaban enriquecidas las listas de genes sub-expresados
y sobre-expresados en las distintas enfermedades, permitiendo obtener una visión más
global del problema a estudio. Mediante este análisis, observaron que el 89% de las
rutas de KEGG en las que estaban enriquecidas las listas de genes que estaban sobreexpresados en cáncer y sub-expresados en CNSd estaban relacionadas con el
metabolismo y el procesado de la información genética, mientras que las rutas con el
comportamiento inverso estaban relacionadas con la comunicación de las células con su
ambiente.
1.1.2. Análisis a realizar:
Tras revisar los estudios anteriores, se planteó realizar un meta-análisis con
datos de expresión como el realizado por Ibañez et al., 2014, añadiendo nuevas
enfermedades al estudio, tanto por parte de las CNSd como de los cánceres.
Por parte de las enfermedades del Sistema Nervioso Central, además de las
enfermedades estudiadas en el trabajo anterior por Ibañez et al., 2014 (Alzheimer,
Párkinson y Esquizofrenia), se decidió añadir al estudio datos de Esclerosis Múltiple,
para los que se encontraron datos obtenidos a partir de muestras con 2 localizaciones
diferentes: líquido cefalorraquídeo y células mononucleares de sangre periférica (se
consideró interesante introducir ambos tipos de muestras por separado, para tratar de
comprobar si la localización de la muestra influía en la variación de los niveles de
expresión entre individuos sanos y enfermos). No se pudo añadir datos de la
enfermedad de Huntington, autismo, Esclerosis Lateral Amiotrófica ni Síndrome de
Down porque, o bien no se encontraron datos obtenidos en las plataformas utilizadas
para el análisis (HG_U133A y HG_U133Plus2), o la cantidad de estudios localizados
no era suficiente.
Por parte de los distintos tipos de cánceres, además de los 3 analizados por
Ibañez et al., 2014 (cáncer colorrectal, de pulmón y próstata), se decidió estudiar casos
de tumores cerebrales, ya que resultaba realmente interesante tener un punto de
contraste con un cáncer en el mismo tejido que las CNSd estudiadas (para los que se
encontraron datos de astrocitomas, glioblastomas y oligodendrogliomas, que fueron
estudiados por separado, ver Materiales y Métodos), pudiendo así también evaluar la
existencia de evidencias de comorbilidad directa entre este tipo de tumores y PD y MS,
mencionada por Catalá-López et al., 2014. Además, Lehrer, 2010 proponía que AD y
glioblastoma compartían alguna ruta de tejido periférica, aún desconocida, que podía
promover la progresión de ambas enfermedades (en el presente trabajo se trata de
probar esta hipótesis). Además, se añadieron datos de estudios de cáncer de mama
(también analizados por Catalá-López et al., 2014) y otros tumores que no se
6
mencionaban en estudios previos (cáncer de hígado y de riñón) como cánceres que
presentasen comorbilidad, fuese del tipo que fuese, con enfermedades del sistema
nervioso central.
1.1.3. Enfermedades del Sistema Nervioso Central:
Con objeto de conocer un poco acerca de las distintas CNSd analizadas en
nuestro estudio, se añade a continuación una breve información acerca de cada una de
ellas:
1.1.3.1.Enfermedad de Alzheimer:
Es una enfermedad neurodegenerativa, caracterizada por una disfunción de la
memoria y la cognición, como resultado de la formación en el cerebro de placas seniles
que contienen ß-amiloide (Aß), y ovillos neurofibrilares que poseen tau hiperfosforilada asociada a microtúbulos (Kim et al., 2010). Como consecuencia de la
enfermedad, se da una pérdida irreversible de neuronas, particularmente en el córtex y
el hipocampo (Nussbaum et al., 2003).
La proteína precursora de amiloide (APP) es una proteína integral de membrana,
que es escindida secuencialmente por α-, ß- (BACE1) y -secretasas para producir
proteínas de Aß amiloidogénicas y no-amiloidogénicas (ver Figura 2). El Aß noamiloidogénico (forma no tóxica para las neuronas) se genera por la rotura de APP en el
aminoácido 83 mediada por la α-secretasa, mientras que el Aß amiloidogénico se
produce por una rotura de APP en el aminoácido 99 mediada por la ß-secretasa
(Querfurth et al., 2010). Aß42, un péptido con 42 aminoácidos, forma fibrillas tóxicas
insolubles que se acumulan en las placas seniles, siendo su principal componente en los
cerebros de pacientes con AD. Aunque la mayoría de las proteínas Aß son secretadas al
medio extracelular, se ha visto que el Aß42 inicia estrés oxidativo en la célula, que está
implicado también en la patogénesis de AD.
Figura 2. Representación esquemática de Aß, obtenida de Querfurth et al., 2010, donde se puede apreciar
tanto el procesamiento no-amiloidogénico del APP como el amiloidogénico.
Los ovillos neurofibrilares, característicos también de pacientes con AD, son
inclusiones filamentosas en las neuronas piramidales. El principal componente de estos
ovillos es una forma de la proteína tau hiper-fosforilada y agregada, insoluble y que
7
carece de afinidad por los microtúbulos, asociándose a las estructuras de filamentos
helicoidales apareados (Querfurth et al., 2010).
El aumento del estrés oxidativo, el impedimento del plegamiento de proteínas en
el retículo endoplasmático y la eliminación deficiente de las proteínas dañadas, mediada
por el proteosoma o autofagia, aceleran la acumulación de proteínas TAU y Aß en AD.
Entre los genes más estudiados de esta enfermedad se encuentran: APP, APOE, PSEN1
y PSEN2.
1.1.3.2. Enfermedad de Parkinson:
Es el trastorno neurodegenerativo del movimiento más común, originado por la
muerte prematura de neuronas que contienen dopamina en la sustancia negra (medio del
cerebro), afectando particularmente al componente ventral de la pars compacta,
originando temblores y rigidez muscular entre otros síntomas (Devine et al., 2011). El
estudio genético de esta enfermedad se ha centrado en el sistema ubiquitinaproteosoma, responsable de la proteólisis intracelular y otros procesos que mantienen la
viabilidad celular. Entre los genes más estudiados de esta enfermedad se encuentran:
SNCA, PARK2, UCHL1, PINK1, PARK7, LRRK2, ATP13A2, GBA y FBXO7.
Esta enfermedad se caracteriza, entre otras cosas, por los cuerpos de Lewy, que
son inclusiones de α-sinucleina inmunoreactiva malformada, proteínas
neurofilamentosas y proteínas proteolíticas, entre las que se incluyen ubiquitinas
(proteínas de shock-térmico que juegan un papel importante señalando proteínas para su
descomposición). Las mutaciones en el gen α-sinucleina (SNCA) son responsables de
algunas formas hereditarias/familiares de PD, y su acumulación en los cuerpos de Lewy
están muy relacionada con la pérdida neuronal característica de esta enfermedad (Davie
et al., 2008).
Se ha visto que mutaciones en la proteína Parkin (ubiquitina ligasa E3, proteína
que facilita la unión de ubiquitina (ubiquitinación) a otras proteínas como α-sinucleina,
dando lugar a la formación de cuerpos de Lewy) producen un síndrome parkinsoniano
en casos juveniles.
Se ha visto que otra de las posibles causas de esta enfermedad es la inhibición
del complejo I de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, que provoca un
aumento de la producción de radicales libres y Ca++ por una disminución del ATP.
Moskvina et al., 2013, llevaron a cabo un estudio para evaluar el posible
solapamiento patológico entre AD y PD, ya que hay evidencias patológicas de
deposición de cuerpos de Lewy en pacientes con AD, especialmente de tipo familiar, y
también las hay de fuertes asociaciones en el área que contiene el gen MAPT. Con sus
resultados, vieron que los loci que aumentan el riesgo de AD y PD no están
generalizados y que el solapamiento podría darse aguas abajo de los genes de
susceptibilidad principales que aumentan el riesgo de cada enfermedad.
1.1.3.3. Esquizofrenia:
Es una enfermedad psiquiátrica crónica severa que afecta al 1% de la población
mundial (Takahashi, 2012, Berry et al., 2003). A pesar de que las causas de la
esquizofrenia siguen sin ser claras, las evidencias de familia, gemelos y estudios de
8
adopción demuestran claramente que se agrega en familias, siendo el agrupamiento
atribuible más a temas genéticos que ha factores ambientales o culturales. Sin embargo,
se ha visto que la herencia per se no implica más que una susceptibilidad a la
enfermedad, pareciendo necesarios los factores ambientales para la manifestación de la
enfermedad en muchos, si no todos los casos (Berry et al., 2003). Mediante estudios con
gemelos, se ha establecido que la esquizofrenia presenta una heredabilidad del 80%
(Riley et al., 2006, Takahashi, 2012). Sin embargo, la detección de posibles mutaciones
para la patogénesis está inhibida por la heterogeneidad de la enfermedad, pudiendo
verse dicha heterogeneidad al revisar los artículos que se han ido publicando a lo largo
de los años, de manera que genes que al inicio eran considerados responsables de la
enfermedad han sido rechazados en estudios más recientes, y viceversa (Takahashi,
2012).
Recientemente, Merenlender-Wagner et al., 2013, señalaron la autofagia como
una de las causas de la enfermedad (se ha visto que la autofagia, un proceso muy
regulado con un impacto crucial en la homeostasis celular, es particularmente
importante en las neuronas, donde es responsable de la supervivencia celular
preservando el balance entre síntesis y degradación y el reciclado de componentes
celulares). En este estudio encontraron niveles bajos de beclin 1 en el hipocampo de
pacientes con esquizofrenia y una descompensación de la regulación
ADNP/ADNP2/Bcl2 como posibles responsables de la enfermedad.
1.1.3.4. Esclerosis múltiple:
La esclerosis múltiple es una enfermedad inflamatoria crónica del sistema
nervioso central, que da lugar a la desmielinización y degeneración axonal acompañado
por un deterioro neurológico (Goldenberg et al., 2012). La contribución genética a la
susceptibilidad de desarrollar la enfermedad es innegable. Mientras que el efecto más
grande se encuentra en la región clase II del antígeno leucocitario humano (HLA), se
han encontrado más loci de riesgo independientemente en dicha región. Sin embargo,
no están claros los mecanismos por los que los alelos HLA afectan a la susceptibilidad
de la enfermedad (Gourraud et al., 2012). En 2007 identificaron que genes que
codificaban el receptor
de la interleuquina 7 (IL7R ) e IL2R estaban
significativamente asociados con la enfermedad. Otro gen, CYP27B1, asociado con el
metabolismo de la vitamina D, se encuentra entre las nuevas asociaciones con la
enfermedad (se ha sugerido que la vitamina D regula más del 80% de los genes
asociados con MS).
1.2. Métodos meta-analíticos
Actualmente, podemos encontrar gran cantidad de estudios transcriptómicos
disponibles para la misma enfermedad o enfermedades relacionadas, cada una de ellas
con un tamaño muestral relativamente pequeño, lo cual implica un limitado poder
estadístico (Chang et al., 2013). Esta cantidad de conjuntos de datos transcriptómicos
cada vez más grande puede contener las claves para nuevos descubrimientos, dando
lugar al desarrollo de nuevos fármacos o terapias (Taminau et al., 2014). Además,
debido a la falta de estándares para los experimentos de microarrays, se generan
9
conjuntos de datos heterogéneos con los que no se puede hacer una comparación directa
(Choi et al., 2003), pudiendo diferir unos estudios de otros en la plataforma utilizada,
las características de las muestras o en los juegos de sondas, provocando que, pese a
estudiar una misma enfermedad, los resultados puedan variar de unos a otros (Shi et al.,
2011). Por ello, una posible solución para aumentar la sensibilidad, validar las
conclusiones y evitar el peligro de descubrimientos o artefactos estudio-específicos, es
combinar la información de estos estudios independientes que han sido diseñados para
estudiar el mismo problema biológico. Dicha integración de la información genómica es
similar al clásico meta-análisis en estadística, donde se combinan los resultados de
múltiples estudios de una hipótesis de investigación similar para encontrar resultados
concluyentes. El meta-análisis se puede definir como el uso de los métodos estadísticos
para integrar cuantitativamente los resultados de un conjunto de estudios empíricos
sobre un mismo problema de investigación (Sánchez-Meta et al., 2006).
En el caso de que todos los estudios en el análisis fuesen igualmente precisos, se
podría computar simplemente la media de los tamaños del efecto, pero como no es así, y
algunos son más precisos que otros, resulta lógico tratar de otorgar un mayor peso a
aquellos que aportan más información
En lo referentes a los métodos de integración de la información de estudios
genómicos, existen dos tipos (ver Figura 3): los análisis integrativos genómicos
verticales, que combinan diferentes eventos moleculares, generalmente en la misma
cohorte de muestras (por ejemplo: perfil transcriptómico, genotipos, variación en el
número de copias, microRNA, proteoma y fenoma, como pueden ser las bases de datos
como el “The Cancer Genome Atlas” (TCGA)), y los meta-análisis genómicos
horizontales, que combinan diferentes cohortes de muestras para el mismo evento
molecular (Tseng et al., 2012).
Figura 3. Tipos de análisis integrativos genómicos.
Dentro de los meta-análisis genómicos horizontales, en el caso de trabajar con
datos de microarrays, que son técnicas de alto rendimiento para medir los niveles de
expresión en cientos de genes simultáneamente, se pueden tomar 2 enfoques diferentes:
10
el meta-análisis propiamente dicho, por el que recibe el nombre este tipo de análisis de
integración de la información genómica, y el enfoque de fusión (ver Figura 4), que
integra datos de microarrays a nivel de valores de expresión tras transformar los valores
de expresión en medidas numéricamente comparables (Taminau et al., 2014).
Figura 4. Representación esquemática de los 2 enfoques de análisis integrativos de microarrays
(orientados a la identificación de genes diferencialmente expresados). A la izquierda está el enfoque
meta-analítico, donde primero se obtienen los resultados de los estudios individuales y luego se combinan
dichos resultados. A la derecha el enfoque de fusión, donde primero se combinan los datos y luego se
obtienen resultados a partir de dicho conjunto de datos mayor. Obtenida de Taminau et al., 2014.
Una de las aplicaciones más frecuentes de los meta-análisis, al trabajar con datos
de microarrays, es la detección de genes diferencialmente expresados (Shi et al., 2011).
Existen 4 categorías de métodos para combinar información genómica para la detección
de genes diferencialmente expresados, de los cuales 3 son métodos meta-analíticos y 1
es un método de fusión (Tseng et al., 2012):
· Meta-análisis:
-
Combinar p-valores. Una de las grandes ventajas de estos métodos es que
permiten la estandarización de las asociaciones de estudios genéticos a una
escala común, además de su simplicidad y extensibilidad para diferentes tipos de
variables resultantes (Wang, 2011). Tipos:
11
-
-
o Fisher. Este método suma los p-valores transformados a logaritmos
obtenidos a partir de estudios individuales. Los p-valores menores
contribuyen con mayores valores al estadístico de Fisher.
o Stouffer. Suma el inverso de los p-valores transformados normales.
Menores p-valores contribuyen más al valor de Stouffer, pero en menor
magnitud.
o Fisher ponderado adaptativamente (AW). Este método asigna diferentes
pesos a cada estudio individual y busca entre todos los posibles pesos
para encontrar el mejor peso adaptativo con el menor p-valor derivado.
Una de las grandes ventajas de este método es que tiene la capacidad de
indicar que estudios contribuyen a la agregación de evidencias y elucidar
la heterogeneidad en el meta-análisis.
o P-valor mínimo. Toma el p-valor mínimo entre los K estudios como el
test estadístico. Este método detecta genes diferencialmente expresados
siempre que exista un p-valor bajo en cualquiera de los K estudios.
o P-valor máximo. Toma el p-valor máximo como el test estadístico. Se
centra en genes diferencialmente expresados que tienen un p-valor
pequeño en todos los estudios.
Combinar tamaños del efecto. Muchos métodos meta-analíticos se han basado
en la asunción de que los tamaños del efecto estandarizados son combinables
entre los estudios. Estos métodos otorgan información acerca de la magnitud y
dirección de la expresión de genes, y son más restrictivos en sus asunciones que
la categoría anterior (Wang, 2011). Para combinar tamaños del efecto existen
principalmente 2 enfoques (se da más información sobre cada uno de ellos en el
siguiente apartado):
o Modelo de Efectos Fijos (FEM)
o Modelo de Efectos Aleatorios (REM)
Combinar rangos. Una posible desventaja de los métodos anteriores es que los
resultados pueden estar dominados por valores atípicos. A diferencia de los pvalores o los tamaños del efecto, los rangos de evidencia de genes
diferencialmente expresados se calculan para cada gen en cada estudio,
calculando después como test estadístico el producto, media o suma equivalente
de todos los estudios.
o RankProd & RankSum. Se basan en la creencia biológica común de que
si un gen está, de manera repetida, en el top de las listas ordenadas por el
cambio de sobre- o sub-expresión en experimentos replicados, es más
probable que el gen esté diferencialmente expresado.
o Producto de rangos & Sumatorio de rangos. Estos métodos aplican un
producto o sumatorio “ingenuo” de los rangos de evidencia de expresión diferencial a lo largo de los estudios.
· Fusión:
-
Fusionar directamente después de normalizar (mega-análisis). Pese a la
preocupación por la heterogeneidad a lo largo de los estudios, muchas
aplicaciones de meta-análisis de microarrays eligen normalizar a lo largo de los
12
estudios y fusionar directamente los conjuntos de datos para detectar genes
diferencialmente expresados. Este tipo de aplicación suele restringir la selección
de estudios a plataformas de microarrays similares, lo que puede permitir el preprocesado mediante RMA (model-based robust multi-array). Hay que tener
cuidado con este tipo de metodología, ya que la normalización no garantiza
eliminar todas las discrepancias entre estudios.
Comparando las 3 primeras categorías (combinar p-valores, combinar tamaños
del efecto y combinar rangos), cabe decir que mediante la combinación de los tamaños
del efecto (ya sea mediante FEM o REM) se identifican automáticamente genes que
están consistentemente sobre- o sub-expresados en todos los estudios, lo cual no ocurre
en el caso de los métodos que combinan p-valores o rangos si los p-valores y los rangos
se obtienen mediante el testeo de hipótesis bilateral. En este último caso, la sobre- y
sub-expresión se considera una evidencia igual de fuerte, y por ello, un gen puede ser
detectado en el meta-análisis con una evidencia fuerte de sobre-expresión en un estudio
y una evidencia fuerte de sub-expresión en otro estudio, dando lugar a conclusiones
confusas.
Considerando un meta-análisis de K estudios de perfiles de expresión de genes,
siendo x gs la intensidad de expresión génica de un gen g y una muestra s en un estudio
, con n muestras perteneciendo a un grupo control y n + m a un grupo enfermo,
normalmente la hipótesis nula para cada gen g se considera como:
H0:
g1
= ··· =
gk
= 0,
Donde gk representa el efecto génico del gen g en el estudio . En base al
trabajo de Birnbaum y Li y Tseng, los métodos meta-analíticos pueden ser clasificados
en 2 configuraciones de hipótesis complementarias: HSA y HSB (Chang et al., 2013),
dependiendo de la naturaleza del experimento en el que se obtienen los efectos del gen
( gk):
HSA:{H0 vs HA: gk 0, 1 ≤ ≤ K},
HSB:{H0 vs HB: al menos un gk 0, 1 ≤ ≤K},
Además, es posible usar diferentes métodos para considerar explícita o
implícitamente diferentes sub-grupos o variaciones de las 2 hipótesis alternativas:
HSA2: {H0 vs HA2:
gk
0,
gk
~ N ( g,
2
)},
Para evitar la confusión, se usa la notación HA para hacer referencia al espacio
de parámetros de la hipótesis alternativa correspondiente. Pese a que HA contiene HB,
representan dos familias de interpretaciones complementarias. Bajo H A, el gen g es
identificado solo cuando está diferencialmente expresado en todos los estudios (el
objetivo es detectar genes diferencialmente expresados que tienen tamaños del efecto
distintos de 0 en todos los estudios). Bajo HB, el gen g es seleccionado solo si está
diferencialmente expresado en uno o más estudios (el objetivo es detectar genes
13
diferencialmente expresados que tienen tamaños del efecto distinto de 0 en al menos un
estudio).
Desde el punto de vista biológico, el diseño experimental y los objetivos del
meta-análisis determinan la lista de biomarcadores de interés. Por ejemplo, si
trabajamos con 2 grupos de muestras (sanas y enfermas) de 3 regiones del cuerpo
diferentes, como pueden ser pulmón, corazón y páncreas, en caso de querer ver la lista
de genes que están expresados de una manera consistente en todos los tejidos, esta
podría definirse como GA (lista de marcadores que se expresan invariablemente en los
diferentes tejidos), cuyo análisis correspondería a la familia de hipótesis alternativas HA.
Si, por el contrario, se quisiese asumir una fisiología tejido-específica que modifica los
niveles de expresión, el tipo de análisis a realizar debería formar parte de la familia de
hipótesis alternativas HB, generándose una lista de biomarcadores tejido-específicos GB.
En el caso de realizar un meta-análisis trabajando con conjuntos de datos de un único
tejido del cuerpo, como podría ser estudiar muestras de tejido de próstata normal vs
próstata con cáncer, sería recomendable realizar análisis basados en la familia de
hipótesis alternativas HA, ya que es claramente de mayor interés biológico, dado que
pueden darse diferencias entre los estudios debido a la heterogeneidad de la población
de muestras o diferencias en protocolos experimentales (Li et al., 2011)…
En la Tabla 1 se presenta una lista de los métodos meta-analíticos usados
habitualmente para estudios de microarrays, sus hipótesis alternativas correspondientes
y biomarcadores dianas (obtenido de Li et al., 2011, Tseng et al., 2012 y Chang et al.,
2013).
14
Tabla 1. Lista de métodos meta-analíticos utilizados para estudios de microarrays, sus hipótesis
alternativas correspondientes y biomarcadores diana:
Métodos
Suma ponderada
equitativamente
de log(p-valores)
P-valor mínimo
Valor máximo al
lado izquierdo y
derecho de
Fisher
Suma adaptativa
ponderada de
log(p-valores)
RankSum
RankProd
Modelo de
efectos fijos
P-valor máximo
Modelo de
efectos
aleatorios
Enfoque
Bayesiano PI
Enfoque
Bayesiano SEI
Abreviatura
Hipótesis
alternativa
Lista de
biomarcadores diana
EW
HB
GB
minP
HB
GB
PR
HB
GB
AW
HB
GB
RS
RP
HB
HB
GB
GB
FEM
HB
GB
maxP
HA
GA
REM
HA2
GA
PI
NA
GA
SEI
NA
GA
Tamaño del Efecto:
Cohen define el tamaño del efecto como el grado o magnitud en el que el
fenómeno bajo estudio está presente en la población de estudio (Cohen, 1988). Esta
medida indica lo fuerte que es la falsedad de la hipótesis nula (que afirma la ausencia de
efecto), sin implicar por ello afirmaciones de tipo causal. Es uno de los componentes
que posee mayor relevancia para el análisis del poder estadístico (medida que indica la
fuerza con la que el investigador está evitando equivocarse con un error de tipo II)
(Macbeth et al., 2007). Además, el tamaño del efecto presenta varias características que
ofrecen ventajas para ser aplicadas a los datos de microarrays, entre ellas:
- Otorga un índice estandarizado. Debido a que los microarrays de expresión solo
informan acerca del cambio en la expresión de los genes en relación a una
referencia (rara vez estandarizada), obtener los tamaños del efecto ofrece la
comparación directa entre los resultados de diferentes medidas.
- Se basa en un marco de trabajo estadístico bien establecido para combinar
resultados diferentes. El objetivo principal de calcular los tamaños del efecto en
lugar de estadísticas tradicionales es sacar una conclusión sintética a partir de
15
-
varios estudios, pudiendo integrar de manera eficiente datos de microarrays de
diferentes orígenes.
Es superior a otros métodos meta-analíticos en lo referente al manejo de la
variabilidad entre estudios. Ya que el modelado correcto de la variación entre
estudios es un factor clave para la elaboración de un meta-análisis exitoso
(especialmente importante al trabajar con microarrays donde se suelen dar
diferencias entre estudios), esto supone una ventaja para ser aplicado a datos de
microarrays.
Para medir la expresión diferencial de un gen, una de las posibilidades es utilizar
la diferencia de medias estandarizadas como un índice del tamaño del efecto. Para ello,
se puede usar la fórmula:
d = (Xt – Xn) / Sp
Donde Xt y Xn representan las medias de los grupos tumorales y normales
(control, libre de tumor) respectivamente, y Sp indica una estima de la desviación
estándar combinada. Cuando un estudio consta de n muestras, la estima no sesgada se
obtiene como d´ = d – 3d/(4(n-2)-1), que indica la corrección para el sesgo del tamaño
de muestra. La varianza estimada del tamaño del efecto no sesgado viene dado como:
d2
= (nt-1 + nn-1) + d2(2(nt + nn))-1
Donde nt y nn son el tamaño de muestra de cada grupo y d es el tamaño del
efecto no sesgado, que indica la precisión de la medida que otorga cada grupo.
Siendo µ la media global e yi el tamaño del efecto observado para estudios
independientes, el modelo general viene dado como:
yi = i +
i=µ +
,
i,
i
~ N (0, Si2),
2
),
i ~ N (0,
i
Donde la varianza entre estudios τ2 representa la variabilidad entre estudios
mientras que la varianza intra-estudios Si2 representa el error de muestreo
condicionada en el i-ésimo estudio . En esta aplicación, yi y Si2 vienen dadas por d y
d2 descritos arriba. Por lo tanto, µ es la medida promedio de expresión diferencial
a lo largo de los conjuntos de datos para cada gen.
Modelo de Efectos Fijos (FEM):
Un modelo de efectos fijos se asume que hay un verdadero tamaño del efecto
que es compartido por todos los estudios incluidos, µ, siendo el error aleatorio dentro de
los estudios la única fuente de error (con esto aquellos estudios con un tamaño muestral
elevado tendrán un error cercano a 0), lo cual implica que τ2 = 0, y como consecuencia
yi ~ N (µ, Si2) (Choi et al., 2003). Los efectos observados se distribuyen alrededor de µ
con una varianza 2, que depende principalmente del tamaño muestral de cada estudio.
16
De esta manera, se pueden asignar pesos a todos los estudios basándose completamente
en la cantidad de información que proporciona el estudio, de manera que un estudio con
un tamaño muestral elevado recibirá más peso y uno con un tamaño pequeño podría
llegar a ser ignorado (Borenstein et al., 2007).
Figura 5. El efecto observado en el estudio 1 (T 1) es calculado como el efecto común µ más el error
dentro de los estudios ( 1).
Modelo de Efectos Aleatorios (REM):
Mediante el modelo de efectos aleatorios, se permite que el verdadero tamaño
del efecto pueda variar entre estudios (se trata de estimar la media de una distribución
de efectos verdaderos). Este modelo postula que cada tamaño del efecto es el reflejo de
una distribución con una media estudio-específica i y varianza Si2. De hecho, se asume
que cada i es un reflejo de alguna superpoblación con la media global µ y varianza τ2,
con lo que yi ~ N ( i , Si2) y i ~ N (µ, τ2) (Choi et al., 2003). De esta manera, estudios
grandes pueden generar estimaciones más precisas que los pequeños, asegurándose de
que la media se calcula usando todos los tamaños del efecto (con lo que lo pesos que se
asignan están más balanceados que en el modelo de efectos fijos, siendo menos
probable que los estudios grandes dominen el análisis y los pequeños sean excluidos).
En este modelo existen 2 fuentes de error, el número de sujetos por estudio y el número
de estudios (Borenstein et al., 2007).
Figura 6. El efecto observado T 1 (cuadrado) se obtiene de una distribución de efectos verdaderos
2
. El efecto verdadero 1, de manera sucesiva, se obtiene de una distribución con
1 y varianza
media µ y varianza τ2.
17
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Conjuntos de datos, pre-procesado y meta-análisis:
Según Ramasamy et al., 2008, hay 7 cuestiones diferentes que han de ser
resueltas para llevar a cabo un meta-análisis de conjuntos de datos de microarrays (ver
Figura 7).
El primer paso, identificar los
conjuntos de datos de microarray adecuados,
implica plantearse los objetivos del metaanálisis que se va a llevar a cabo. En nuestro
caso, como bien se ha comentado en el
apartado anterior, se trata de localizar genes
diferencialmente expresados en distintas
enfermedades del Sistema Nervioso Central
(SNC) y distintos tipos de cánceres, que se
cree pueden presentar comorbilidad directa
o inversa.
Las enfermedades que se han
considerado interesantes a estudiar son las
analizadas por Catalá-López et al., 2014,
mencionadas también en el apartado
anterior. Para analizar dichas enfermedades,
se ha planteado, al igual que en el estudio
anterior elaborado por Ibañez et al., 2014,
utilizar conjuntos de datos de microarrays de
expresión obtenidos a partir de 2
plataformas concretas, HG_U133A y
HG_U133_Plus, con 14.538 y 23.945 genes
identificados respectivamente, y que son
similares entre sí (la segunda contiene las Figura 7. Representación esquemática de los
mismas sondas que la primera y 9.407 pasos a seguir a la hora de llevar a cabo un
Meta-análisis de conjuntos de datos de
sondas más, ver Figura 8). La búsqueda de microarrays de expresión génica, sacado de
los conjuntos de datos se ha realizado en Ramasamy et al., 2008.
diferentes repositorios públicos online como
NCBI GEO ómnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) y ArrayExpress
(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/), y en otros pertenecientes a universidades u
hospitales, como por ejemplo la base de datos genómica online del Stanley Medical
Research Institute (https://www.stanleygenomics.org).
De todas las enfermedades consideradas de interés para analizar la posible
existencia de comorbilidad, solo se han encontrado conjuntos de datos suficientes, en
las plataformas deseadas, para: Alzheimer, Esquizofrenia, Párkinson y Esclerosis
múltiple (para la cual se han encontrado datos obtenidos a partir líquido cefalorraquídeo
por un lado y de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)) por parte de las
enfermedades del sistema nervioso central, y cáncer de pulmón, mama, próstata, colon y
18
cerebro por parte de los diferentes tipos de cánceres. Además, se han encontrado y
añadido al estudio conjuntos de datos de cáncer de ovario, hígado y riñones, por si se
pudiese observar alguna relación interesante, pese a no haberse descrito previamente en
la literatura casos de comorbilidad con estos tipos de cánceres (para ver los conjuntos de
datos utilizados y sus referencias ver Tablas 2 y 3 y datos suplementarios). En lo
referente a los tumores cerebrales, los conjuntos de datos utilizados, o bien no
presentaban una cantidad suficiente de muestras control, o bien los controles utilizados
no se consideraban adecuados por tratarse de cerebros con epilepsia. Para solventar este
problema se utilizaron como control muestras provenientes de estudios de Alzheimer.
En el segundo paso, extraer datos de los estudios, es recomendable extraer los
datos en formato .CEL, sin que hayan sido previamente pre-procesados, para evitar
diferencias entre estudios. Esta parte es vital y limitante, ya que, pese a que actualmente
es obligatorio tener accesibles los datos crudos con los que se ha realizado el estudio,
hace unos años no lo era, de manera que se pueden encontrar gran cantidad de estudios
que muestran únicamente las listas de genes diferencialmente expresados (en el caso de
estudio se ha prescindido de este tipo de estudios, a fin de tratar de ser lo más
homogéneos posibles en lo que al procesado de datos se refiere, es decir, se han
seleccionado únicamente aquellos estudios que tenían los datos “crudos” disponibles,
pese a que esto haya disminuido la cantidad de estudios a incluir en el meta-análisis).
Como parte principal del
tercer paso, preparar los conjuntos
de datos de las diferentes
plataformas, hay que convertir los
datos crudos en un matriz de datos
de expresión de genes (preprocesado), que representa un
resumen de la expresión de genes
de todas las sondas y muestras. El
paso
del
pre-procesado
es
realmente importante, dado que
afecta directamente a las medidas
de expresión de genes y por lo
tanto a los pasos siguientes.
Debido a que en el paso 1
se han seleccionado solo aquellos
Figura 8. Diagrama de Venn que refleja el
estudios cuyos datos de expresión
solapamiento de los genes identificados en las
se habían obtenido mediante 2
plataformas HG_U133A y HG_U133Plus2.
plataformas de microarrays de la
empresa Affymetrix, que además son muy similares, se ha podido utilizar el mismo
algoritmo de pre-procesado (evitando insertar mayor variabilidad en los estudios). Esto
es ventajoso ya que existen pocos algoritmos de pre-procesado que puedan ser aplicados
de manera universal a los datos de plataformas diferentes (Ramasamy et al., 2008). El
proceso de normalización de los datos se ha llevado a cabo utilizando “frozen Robust Multiarray Analysis” (fRMA) (McCall et al., 2012), del paquete Affy de R (Gautier et
19
al., 2004).
En el diseño de sondas de microarrays se utilizan regiones de interés de los
genes, dado que el uso de la secuencia completa de los mismos puede dar lugar a
uniones no específicas. Por ello, diferentes plataformas suelen presentar sondas
diferentes para un mismo gen. Como consecuencia de esto, es necesario identificar que
sondas representan un gen concreto dentro y entre los conjuntos de datos, lo cual se
trata de realizar en el cuarto paso. En el caso de estudio, al usarse 2 plataformas muy
similares, tanto que una contiene a la otra, las sondas utilizadas en ambas son idénticas,
con lo que este paso no entraña ningún problema. Sea como sea, lo que se suele hacer
para afrontar este problema es transformar los nombres de sondas en identificadores de
genes, como pueden ser los de UniGene, RefSeq, Entrez Gene ID o Gene Symbol (en
este estudio se le ha asignado a cada sonda su Gene Symbol correspondiente).
Dado que los conjuntos de datos de expresión pueden presentar números
diferentes de genes y estar ordenados de manera diferente, mediante la función
MetaDE.merge del paquete de R MetaDE (Wang et al., 2012), se han extraído los genes
comunes a lo largo de los estudios, permitiéndonos trabajar con los mismos genes en el
mismo orden.
Otro de los problemas que hay que solventar es que hay gran cantidad de
plataformas en las que hay más de una sonda para un mismo gen, lo cual puede
fragmentar la información disponible para el meta-análisis. En el quinto paso se trata de
solucionar este problema, para el cual existen diferentes soluciones, como por ejemplo
reemplazar las sondas que se relacionan con un mismo gen por el identificador de dicho
gen, que asegura que el software use toda la información disponible de manera que se
evita perder información relevante. Sin embargo, Ramasamy et al., 2008 recomienda
resumir todas las sondas en un único valor representativo por gen en cada estudio. Una
de las soluciones para resumir esta información es trabajar con medidas estandarizadas
como p-valores o tamaños del efecto, pudiendo elegir los valores más extremos que son
los que son menos probables que ocurran por azar. En nuestro caso, mediante la función
MetaDE.match del paquete de R MetaDE (Wang et al., 2012), se han seleccionado
aquellas sondas que presentan un mayor rango intercuartílico (una mayor cantidad de
información). Tras resolver este problema, queda un estadístico por identificador del
gen por estudio.
Una vez realizado este paso, hay que decidir si usar todas las sondas disponibles
en el array o si se va a realizar un filtrado de las sondas. En este caso, utilizando la
función MetaDE.filter del paquete de R MetaDE (Wang et al., 2012), se filtraron los
genes que presentaban niveles de expresión bajos a lo largo de la mayoría de los
estudios (calculando la intensidad media de cada gen a lo largo de todas las muestras de
cada estudio y eliminando aquellos con un porcentaje alfa menor) y aquellos genes que
variaban poco (reemplazando la intensidad media por la desviación estándar y
eliminando los que menos porcentaje beta presentaban). Es importante mencionar que,
en el marco de trabajo publicado por Ramasamy et al., 2008, el proceso de filtrado se
llevaba a cabo en el paso 3, pero nosotros hemos decidido seguir el mismo
procedimiento que Ibañez et al., 2014, realizando el filtrado únicamente con los genes
comunes a todos los estudios y que otorgan una mayor cantidad de información.
20
Como penúltimo paso, hay que elegir una técnica meta-analítica. La búsqueda
de genes diferencialmente expresados es una comparación entre dos clases (en este caso
enfermedad vs sano). De las 4 categorías mencionadas en el apartado 1.2., se considera
que la mejor opción es combinar los tamaños del efecto, debido a que:
- Requiere datos individuales a nivel de pacientes.
- Considera la información de todos los genes disponibles y no únicamente los
declarados significativos en los estudios originales.
- Dado que se estudiarán más algunos genes que otros a lo largo de los estudios,
es preferible usar una técnica que trate los genes estudiados a lo largo de todos
los estudios y los genes raramente estudiados de una manera equivalente. El
estudio de los tamaños del efecto calcula la media ponderada de dichos tamaños.
- Produce resultados en una escala mucho más fina.
- Es computacionalmente rápido, lo que permite incluir un mayor número de
estudios.
- Otorga una medida de discriminación biológicamente interpretable.
- Es la única técnica que pondera la contribución de cada estudio en base a su
precisión, que está relacionado con el tamaño muestral de cada estudio.
- Permite utilizar un “forest plot” para investigar de una manera visual las contribuciones de los estudios individuales y la cantidad de heterogeneidad a lo
largo de los conjuntos de datos.
Por todo esto, se ha decidido estudiar el tamaño del efecto estudio-específico
para cada gen y luego compararlos entre estudios, utilizando el modelo de efectos fijos
y el modelo de efectos aleatorios, ambos explicados en el apartado 1.2. de la
introducción.
El séptimo y último paso consiste en analizar, presentar e interpretar los
resultados para tratar de obtener conclusiones biológicas.
Como resultado de todo este proceso se obtienen, para cada enfermedad, 2 listas
de genes, una con los genes que están significativamente sobre-expresados (FDR <
0.05) y otra con los genes que están significativamente sub-expresados.
Para analizar si realmente existe comorbilidad entre las enfermedades de los 2
tipos (SNC y cáncer), se compararon las listas de genes diferencialmente sobre- y subexpresados de cada CNSd con las listas de cada uno de los diferentes tipos de cáncer,
evaluando la significancia de los solapamientos entre los genes diferencialmente
expresados mediante el test exacto de Fisher de una cola, corregido para testeo múltiple
mediante Bonferroni (q-valor < 0.05). Para poder realizar el test de Fisher se estableció
que el número de genes de fondo era 14.538, que es el número de gene symbols que se
estudian mediante la plataforma HG_U133A (la más pequeña de las 2 utilizadas).
21
Tabla 2. Conjuntos de datos utilizados para estudiar las enfermedades del Sistema Nervioso Central (Alzheimer, Parkinson, Esquizofrenia y Esclerosis Múltiple), indicándose
su identificador, el tejido y la región de la que se han obtenido los datos, la plataforma para dicha obtención de datos, el repositorio online de donde han sido descargados, así
como el número de muestras para los casos y para los controles y el artículo de referencia a dichos datos (en caso de no haberlo se indica como “ -“). Enfermedad
Identificador
conjuntos de
datos
Tejido
GSE5281
Alzheimer
Cerebro
GSE48350
GSE4757
Parkinson
Esquizofrenia
Esclerosis
Múltiple
GSE7621
GSE20141
GSE20146
GSE4036
AltarA
AltarC
Bahn
Kato
Dobrin
Laeng
Kemether
GSE52139
E-MTAB-69
Región
Corteza Entorrinal
Hipocampo
Giro Temporal Medio
Cingulado Posterior
Giro Frontal Superior
Corteza Visual
Primaria
Corteza Entorrinal
Hipocampo
Giro Postcentral
Giro Frontal Superior
Plataforma
HG_U133Plus2
Repositorio
online
GEO
Cerebro
Mesencéfalo
(sustancia negra)
Globus pallidus interna
Cerebelo
Área de Brodmann 46
Hipocampo
Tálamo
Líquido
Cefalorraquídeo
20 (10/10)
HG_U133Plus2
HG_U133A
GEO
HG_U133Plus2
GEO
HG_U133A
Stanley
Medical
Research
Institute
HG_U133Plus2
GEO
-
HG_U133Plus2
ArrayExpress
Referencia
Liang et al., 2007
31 (19/12)
53 (14/39)
62 (19/43)
68 (25/43)
69 (21/48)
Corteza Entorrinal
Cerebro
Número de
muestras
(casos / control)
23 (10/13)
23 (10/13)
28 (16/12)
22 (9/13)
34 (23/11)
25 (16/9)
18 (10/8)
20 (10/10)
23 (11/12)
66 (32/34)
50 (21/29)
67 (34/33)
69 (35/34)
55 (30/25)
41 (20/21)
26 (14/12)
16 (8/8)
32 (14/18)
30 (12/18)
Blair et al., 2013
Dunckley et al.,
2006
Lesnick et al., 2007
Zheng et al., 2010
-
Brynedal et al.,
2010
22
Tabla 3. Conjuntos de datos utilizados para estudiar diferentes tipos de tumores (Astrocitoma, Glioblastoma, Oligodendroglioma, cáncer de colon, cáncer de pulmón y
cáncer de próstata), indicándose su identificador, el tejido del que se han obtenido los datos, la plataforma para dicha obtención de datos, el repositorio online de donde han
sido descargados, así como el número de muestras para los casos y para los controles y el artículo de referencia a dichos datos (en caso de no haberlo se indica como “-“). Identificador
conjuntos de datos
GSE4290
Astrocitoma
GSE15824
GSE4290
Glioblastoma
GSE15824
GSE4290
Oligodendroglioma
GSE15824
GSE4183
Cáncer de colon
GSE8671
GSE19188
Cáncer de pulmón
GSE19804
GSE7307
Cáncer de próstata
GSE17951
Enfermedad
Tejido
Plataforma
Repositorio
online
Cerebro
HG_U133Plus2
GEO
Colon
HG_U133Plus2
GEO
NSCLC
HG_U133Plus2
GEO
Próstata
HG_U133Plus2
GEO
Número de muestras
(casos / control)
20 (7/13)
21 (8/13)
39 (26/13)
25 (12/13)
34 (21/13)
20 (7/13)
53 (14/39)
64 (32/32)
144 (94/50)
120 (60/60)
30 (17/13)
154 (141/13)
Referencia
Sun et al., 2006
Grzmil et al., 2011
Sun et al., 2006
Grzmil et al., 2011
Sun et al., 2006
Grzmil et al., 2011
Guorffy et al., 2009
Sabates-Bellver et al., 2007
Hou et al., 2010
Lu et al., 2010
Wang et al., 2010
23
2.2. Análisis de rutas enriquecidas:
Con objeto de llevar a cabo un análisis funcional de los resultados obtenidos, en
lugar de realizar un análisis gen a gen, se ha decidido, igual que en el trabajo anterior
(Ibañez et al., 2014), realizar un análisis funcional de los genes diferencialmente
expresados en cada una de las enfermedades, de manera que podamos tener una visión
global de las funciones enriquecidas en cada una de las enfermedades.
Para llevar a cabo este proceso, se ha decidido utilizar la aplicación web: WEBbased Gene SeT AnaLysis Toolkit (http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/, Zhang et
al., 2005 & Wang et al., 2013). Esta herramienta web permite llevar a cabo análisis de
enriquecimientos funcionales, pudiendo estudiar 8 organismos diferentes (humano,
ratón, rata, perro, mosca, gusano, pez cebra y levadura), reconociendo 201 tipos de
identificadores diferentes que mapean con identificadores de genes de Entrez, y
disponiendo de 78.612 categorías funcionales donde poder clasificar los genes
diferencialmente expresados (Wang et al., 2013).
El funcionamiento de la herramienta web es considerablemente sencillo y se
puede resumir en los siguientes pasos:
- Introducir la lista de los genes diferencialmente expresados (ya sea pegando los
nombres directamente o subiendo un archivo de texto plano que contenga dicha
lista), seleccionar el organismo que se está estudiando y el tipo de identificador
de los genes que se ha introducido (en nuestro caso Gene Symbol, pero acepta
una gran diversidad de identificadores), los cuales se transformarán a
identificadores de genes de Entrez (el programa devuelve también aquellos
genes para los que no se ha encontrado identificador de genes Entrez).
- Seleccionar el tipo de análisis de enriquecimiento a realizar: GO, KEGG,
Wikipathways, Pathway Commons, dianas de Factores de Transcripción, dianas
de microRNAs, redes de interacción de proteínas, localización cromosómica,
asociación a enfermedades, asociación a fármacos, fenotipos o PheWAS.
- Seleccionar el conjunto de datos de referencia para el análisis de
enriquecimiento. En nuestro caso utilizamos como referencia la lista de gene
symbols que se analizan en la plataforma de arrays HG_U133A, indicando el
tipo de lista que estamos facilitándole.
- Seleccionar el método de ajuste para testeo múltiple (BH, BY, Bonferroni, holm,
hommel o ninguno) y el nivel de significancia, en nuestro caso Bonferroni y
0.05 respectivamente.
El método estadístico utilizado por esta herramienta para evaluar la significancia
del enriquecimiento en una función determinada es el test hipergeométrico:
donde n y m son el número de genes en el conjunto de genes de estudio y en el de
referencia respectivamente, y k y j son el número de genes del conjunto de genes de
estudio y del conjunto de genes de referencia respectivamente que pertenecen a una
categoría concreta.
24
3. RESULTADOS
Como ya se ha mencionado en el apartado de materiales y métodos, se ha
realizado un meta-análisis utilizando el modelo de efectos fijos y el modelo de efectos
aleatorios (por separado), comparando después, para cada uno de los modelos, las listas
de genes diferencialmente expresados obtenidas, utilizando el test exacto de Fisher de
una cola para dicha comparación, obteniendo los solapamientos de genes sobreexpresados en una enfermedad y sub-expresados en la otra, o los solapamientos de
genes que se comportan de la misma manera en 2 enfermedades distintas (genes sobreo sub-expresados en ambas enfermedades). Como consecuencia de introducir una
cantidad elevada de enfermedades para el estudio, incluyendo enfermedades para las
que no se habían obtenido resultados de comorbilidad en estudios anteriores y
enfermedades que introducían una gran variabilidad, los resultados obtenidos no
permitían una apreciación clara de los casos de comorbilidad, por lo que se ha realizado
un filtrado seleccionando aquellas enfermedades para las que se observaban
solapamientos significativos (para ver la tabla con los resultados del test de Fisher
incluyendo todas las enfermedades, ver datos suplementarios, Figura 1).
Las enfermedades para las que se ha observado una clara comorbilidad son:
Alzheimer y Párkinson por parte de las enfermedades del Sistema Nervioso Central, y
Astrocitoma, Glioblastoma, Oligodendroglioma, cáncer de colon, de pulmón y de
próstata por parte de los cánceres. Los valores de dicho solapamiento se presentan en las
Figuras 9 y 10 (solapamientos de las listas de genes diferencialmente expresados
obtenidas mediante FEM y REM respectivamente).
Astrocytoma_Down Glioblastoma_Down Oligodendroglioma_Down Colon_Down Lung_Down Prostate_Down
5110
5787
6076
Alzheimer_Up
3337
1267
Parkinson_Up
2.31e-08
1607
Alzheimer_Down
509
2.64e-142
5132
Parkinson_Down
2.49e-223
2421
5.75e-46
1872
2860
906
9.07e-290
3337
Parkinson_Up
Glioblastoma_Up
1607
Alzheimer_Down
5132
Parkinson_Down
1872
1709
656
533
1079
Oligodendroglioma_Up
4382
Colon_Up
5068
Lung_Up
5912
Prostate_Up
3035
7.31e-290
1991
5.13e-48
636
1096
6.24e-51
2910
4685
0
1.45e-36
1525
2.40e-27
2741
1.37e-119
4.48e-60
1083
3878
4345
1.74e-120
1.57e-196
2.50e-78
Astrocytoma_Up
Alzheimer_Up
3799
2.071e-77
1842
1.83e-32
766
2.07e-07
681
642
2.64e-67
2209
6.04e-06
724
1.26e-58
2448
2.87e-12
870
2.46e-120
1581
9.93e-67
669
Figura 9. Comparación de genes significativamente sobre- y sub-expresados (q-valor < 0.05) en
enfermedades del Sistema Nervioso Central (Alzheimer y Párkinson) y distintos tipos de cánceres
(Astrocitoma, Glioblastoma, Oligodendroglioma, cáncer de colon, de pulmón y de próstata), obtenidos
tras realizar el meta-análisis mediante el modelo de efectos fijos (FEM). En negrita se indican los valores
obtenidos mediante el test exacto de Fisher y en un tamaño de letra menor, dentro de la misma celda, se
indica el número de genes en común. En verde se indican aquellos casos en los que el solapamiento se da
entre genes que se comportan de la misma manera en ambas enfermedades, y en naranja el solapamiento
entre genes con comportamientos inversos. Las celdas blancas indican que no se está dando un
solapamiento significativo entre dichas enfermedades.
25
Astrocytoma_Down Glioblastoma_Down Oligodendroglioma_Down Colon_Down Lung_Down Prostate_Down
3590
3869
3832
Alzheimer_Up
2472
7.12e-49
2113
3.145
9.89e-57
597
Parkinson_Up
733
301
9.94e-71
3960
Parkinson_Down
1.203e-126
1360
3.68e-22
1185
1586
428
7.49e-142
2113
Glioblastoma_Up
1011
Alzheimer_Down
3960
Parkinson_Down
1185
831
Oligodendroglioma_Up
2495
Colon_Up
2616
Lung_Up
4089
Prostate_Up
1091
1.04e-142
1040
3.21e-26
278
443
2377
8.03e-204
1.59e-13
1398
1.14e-20
521
2677
Parkinson_Up
1.87e-61
4.38e-47
Astrocytoma_Up
Alzheimer_Up
158
6.75e-11
1011
Alzheimer_Down
686
1.308e-08
795
1.08e-14
365
1.801e-11
266
265
6.28e-14
857
6.68e-21
1.52e-53
1290
0.003
519
9.86e-15
373
160
Figura 10. Comparación de genes significativamente sobre- y sub-expresados (q-valor < 0.05) en
enfermedades del Sistema Nervioso Central (Alzheimer y Párkinson) y distintos tipos de cánceres
(Astrocitoma, Glioblastoma, Oligodendroglioma, cáncer de colon, de pulmón y de próstata), obtenidos
tras realizar el meta-análisis mediante el modelo de efectos aleatorios (REM). En negrita se indican los
valores obtenidos mediante el test exacto de Fisher y en un tamaño de letra menor, dentro de la misma
celda, se indica el número de genes en común. En verde se indican aquellos casos en los que el
solapamiento se da entre genes que se comportan de la misma manera en ambas enfermedades, y en
naranja el solapamiento entre genes con comportamientos inversos. Las celdas blancas indican que no se
está dando un solapamiento significativo entre dichas enfermedades.
Tras realizar el estudio de solapamientos mediante el test de Fisher, en lo
referente a los casos de comorbilidad entre los 3 tipos de tumores cerebrales y las 2
CNSd (comorbilidad directa), pese a variar los q-valores (disminuyendo para el caso de
REM (donde se tiene en cuenta tanto la variabilidad intra-estudios como la variabilidad
entre-estudios) respecto a FEM (donde solo se tiene en cuenta la variabilidad intraestudios)), se siguen obteniendo resultados considerablemente significativos, siendo en
ambos casos más significativos los solapamientos para el caso de glioblastomas (frente
a astrocitoma y oligodendroglioma) y Alzheimer (frente a Párkinson). Sin embargo, en
lo que respecta a las enfermedades que presentan comorbilidad inversa (cáncer de
colon, pulmón y próstata con Alzheimer y Párkinson), si bien la relación AD con los 3
tipos de cáncer se mantiene (fluctuando entre ambos modelos) y se siguen obteniendo
solapamientos significativos, no es así para el caso de Párkinson, manteniéndose
únicamente una relación de comorbilidad inversa plena (que se de solapamiento tanto
entre los genes sobre-expresados en una enfermedad y sub-expresados en la otra como
entre los genes sub-expresados en una enfermedad y sobre-expresados en la otra) en el
caso de cáncer de pulmón (ver Figuras 9 y 10). Tal y como hicieron Ibañez et al., 2014,
se ha trabajado con los datos obtenidos mediante FEM.
Tras el análisis de solapamiento, queda patente también que las enfermedades
que presentan comorbilidad con Alzheimer lo presentan también con Párkinson, siendo
además el mismo tipo de comorbilidad. Esto nos llevó a plantearnos la cantidad de
genes compartidos por ambas enfermedades, más aun tras ver que algunos autores han
sugerido en estudios anteriores que el Párkinson podría clasificarse como un sub-tipo de
26
Alzheimer (Moskvina et al., 2013). Tras analizar la cantidad de genes compartidos por
ambas enfermedades, se vio que prácticamente la totalidad de los genes sub-expresados
en Párkinson están también sub-expresados en Alzheimer (84,34%), siendo lo mismo
para los genes sobre-expresados, aunque en menor medida (61,97%, ver Figura 12).
Al observar que los 3 tipos de tumores cerebrales presentan el mismo tipo de
comorbilidad, con valores muy elevados de solapamiento, se ha considerado interesante
analizar la cantidad de genes que se comportan igual entre los 3 tipos (ver Figura 11).
Figura 11. Representación en formato de diagramas de Venn de los genes que se comportan de la misma
manera (genes sub-expresados en la parte izquierda de la figura y sobre-expresados en la parte derecha)
en los 3 tipos de tumores cerebrales (astrocitoma, glioblastoma y oligodendroglioma).
Analizando el solapamiento entre los 3 tipos de tumores cerebrales, se ha visto
que la gran mayoría de los genes sub-expresados son comunes a los 3 tipos, con 4.363
genes compartidos entre los 3 para un máximo de 6.076 (oligodendroglioma), y para los
genes sobre-expresados, con 3.102 genes compartidos para un máximo de 4.685
(glioblastoma). A partir de este punto, todos los análisis se han realizado considerando
los 3 tumores cerebrales como un solo tipo de cáncer, trabajando solo con los genes
compartidos por los 3, a fin de simplificar un poco el análisis y poder generalizar, si
bien queda pendiente analizar las diferencias entre los 3.
27
Figura 12. Representación en formato de diagramas de Venn de los genes que se comportan de la misma
manera (genes sub-expresados en la parte izquierda de la figura y sobre-expresados en la parte derecha)
en Alzheimer (circunferencia verde) y Párkinson (circunferencia naranja).
En la realización del estudio, tal y como se ha mencionado en el apartado de
Materiales y Métodos, surgió un problema a la hora de recoger datos para analizar los 3
tipos de tumores cerebrales, ya que los conjuntos de datos disponibles o bien no
presentaban una cantidad suficiente de muestras control, o bien utilizaban como
muestras control datos de cerebros con epilepsia. Para poder estudiar la posible
existencia de comorbilidad en estos tipos de tumores se realizó una búsqueda de
conjuntos de datos de expresión de cerebros control. Surgió el problema de que en los
conjuntos de datos con muestras de casos de tumores cerebrales no se indica la región
del cerebro de la que se toman las muestras, cosa que si se hace en los conjuntos de
datos con muestras control del cerebro (principalmente estudios de Alzheimer). En el
estudio inicial se utilizaron como control datos de expresión de muestras obtenidas del
hipocampo. De cara a comprobar si los resultados obtenidos se debían al hecho de haber
seleccionado como muestras control aquellas obtenidas a partir del hipocampo, se
repitió el estudio utilizando como control diferentes regiones del cerebro (giro temporal
medio, cingulado posterior, giro frontal superior, córtex visual primario y córtex
entorrinal), obtenidas todas a partir de los conjuntos de datos utilizados para estudiar la
enfermedad de Alzheimer.
Como resultado se dicho análisis se ha visto que la tendencia es la misma
utilizando cualquiera de las regiones (variando únicamente la magnitud del q-valor)
salvo el córtex entorrinal, donde se dan solapamientos entre genes sobre-expresados en
los 3 tipos de tumores cerebrales y sub-expresados en Alzheimer y Párkinson (para esta
enfermedad no se observa esta relación con glioblastomas, pero sí con astrocitomas y
oligodendrogliomas), en lugar de darse solapamientos entre los genes sobre- o subexpresados en ambas enfermedades (ver Figura 13).
28
Alzheimer_Up
Parkinson_Up
Alzheimer_Down
Parkinson_Down
Astrocytoma_Down
1
1
2.64e-142
5.75e-46
Glioblastoma_Down
1
1
2.49e-223
2.50e-78
Hippocampus
Oligodendroglioma_Down
Astrocytoma_Up
1
9.07e-290
1
1.45e-36
1.57e-196
1
4.48e-60
1
Glioblastoma_Up
0
5.13e-48
1
1
Oligodendroglioma_Up
7.31e-290
1.83e-32
1
1
Medial_Temporal_Gyrus
Astrocytoma_Down
Glioblastoma_Down Oligodendroglioma_Down
Astrocytoma_Up
Glioblastoma_Up
Oligodendroglioma_Up
Alzheimer_Up
1
1
1
2.65516944418894e-249
0
6.21218001439691e-270
Parkinson_Up
1
1
1
6.69422090473943e-24 1.27283354202363e-40 6.65271650217351e-25
Alzheimer_Down 2.34290168001383e-91 2.62524939862229e-155 9.07221845130844e-130
1
1
1
Parkinson_Down 2.89468130924647e-22 1.5078282216725e-50
1.11311210887436e-32
1
1
1
Posterior_Cingulate
Astrocytoma_Down
Glioblastoma_Down Oligodendroglioma_Down
Astrocytoma_Up
Glioblastoma_Up
Oligodendroglioma_Up
Alzheimer_Up
1
1
1
9.89910522044001e-259 7.16808735577404e-296 8.41361627162041e-240
Parkinson_Up
1
1
1
4.05234424226145e-34 6.39499303598533e-47 4.76846497487909e-34
Alzheimer_Down 2.3621786490209e-105 2.47823067770062e-179 5.79714303556238e-159
1
1
1
Parkinson_Down 1.03944297447106e-36 9.61666885629715e-69 4.88889259105679e-55
1
1
1
Superior_Frontal_Gyrus
Astrocytoma_Down
Glioblastoma_Down Oligodendroglioma_Down
Astrocytoma_Up
Glioblastoma_Up
Oligodendroglioma_Up
Alzheimer_Up
1
1
1
3.47216021682221e-296 4.68373141360556e-315 8.7814158951891e-270
Parkinson_Up
1
1
1
5.91448673493984e-46 6.99405761636848e-59 1.47755413129375e-49
Alzheimer_Down 4.12581191909821e-81 3.79100997741102e-138 3.13500747173379e-102
1
1
1
Parkinson_Down 1.02742859216098e-11 3.17449562796378e-40 1.95612717086656e-18
1
1
1
Primary_Visual_Cortex
Astrocytoma_Down
Glioblastoma_Down Oligodendroglioma_Down
Astrocytoma_Up
Glioblastoma_Up
Oligodendroglioma_Up
Alzheimer_Up
1
1
1
4.22737838921789e-175 5.5083523192802e-205 1.21800599495283e-154
Parkinson_Up
1
1
1
4.21851993639764e-15 1.92225635850959e-21 3.92200514008679e-12
Alzheimer_Down 1.3816821100949e-81 5.55362386348789e-136 9.62608367013061e-106
1
1
1
Parkinson_Down 1.43095717562232e-24 1.58234849548828e-46 8.91509407048863e-32
1
1
1
Entorhinal_Cortex
Astrocytoma_Down
Glioblastoma_Down Oligodendroglioma_Down
Astrocytoma_Up
Glioblastoma_Up
Oligodendroglioma_Up
Alzheimer_Up
1
1
1
6.79368433581791e-129 2.6580052962257e-167 8.05139366379648e-121
Parkinson_Up
1
1
1
1.13603051198654e-30 1.27840359344385e-40 1.10479878722112e-26
Alzheimer_Down 6.16874174461925e-10 8.73712158160989e-33 8.28670679408704e-14
2.2604822706818e-09 0.00188009808087085 3.92619516534872e-10
Parkinson_Down
1
7.31733205430393e-07
1
0.000279660512676944
1
0.00016215704118281
Figura 13. Comparación de genes significativamente sobre- y sub-expresados (q-valor < 0.05) en
Alzheimer y Párkinson frente a astrocitoma, glioblastoma y oligodendroglioma, obtenidos tras realizar el
meta-análisis mediante el modelo de efectos fijos y utilizando como datos control para los casos de los 3
tumores cerebrales diferentes regiones del cerebro (hipocampo, giro temporal medio, cingulado posterior,
giro frontal superior, córtex visual primario y córtex entorrinal). En verde se indican aquellos casos en los
que el solapamiento se da entre genes que se comportan de la misma manera en ambas enfermedades, y
en naranja el solapamiento entre genes con comportamientos inversos. Las celdas blancas indican que no
se está dando un solapamiento significativo entre dichas enfermedades.
Con objeto de conocer mejor las funciones enriquecidas en los distintos tipos de
enfermedades, se ha realizado un análisis de enriquecimiento funcional, tal y como se
ha mencionado en el apartado de Materiales y Métodos. Tras este estudio, no se han
obtenido funciones enriquecidas para Párkinson con una significación menor de 0.05.
Entre las rutas en las que están enriquecidas las listas de genes sub-expresadas
en Alzheimer y tumores cerebrales y sobre-expresadas en cáncer de colon, pulmón y
próstata, encontramos las rutas “rutas en cáncer”, “adhesión focal”, “migración trasendotelial de leucocitos”, “diferenciación de osteoclastos” y la “regulación del citoesqueleto de actina” (ver Figura 14). Resulta curioso encontrar la ruta de KEGG
“rutas en cáncer” enriquecida en las listas de genes sobre-expresados en los tumores
cerebrales y en las listas de genes sub-expresados en cáncer de pulmón y próstata,
indicando que una cantidad elevada de estos genes se comporta de manera inversa
dependiendo del tejido en el que se desarrolle (este caso concreto se analiza en más
detalle en el apartado Discusión). Pese a que en el test de Fisher se obtienen
solapamientos significativos entre los genes sub-expresados en Alzheimer y los que
presentan el mismo comportamiento en los 3 tumores cerebrales, no se encuentra ni un
29
solo enriquecimiento en común entre los genes sub-expresados en Alzheimer y los subexpresados también en tumores cerebrales (ver Figura 15).
Focal_adhesion
Leukocyte_transendothelial_migration
Osteoclast_differentiation
Pathways_in_cancer
Regulation_of_actin_cytoskeleton
Staphylococcus_aureus_infection
B_cell_receptor_signaling_pathway
Cell_adhesion_molecules_(CAMs)
Cytokine-cytokine_receptor_interaction
Leishmaniasis
Malaria
NOD-like_receptor_signaling_pathway
Toxoplasmosis
Amoebiasis
Apoptosis
Chemokine_signaling_pathway
Chronic_myeloid_leukemia
Hematopoietic_cell_lineage
MAPK_signaling_pathway
Natural_killer_cell_mediated_cytotoxicity
Prostate_cancer
T_cell_receptor_signaling_pathway
TGF-beta_signaling_pathway
Acute_myeloid_leukemia
Allograft_rejection
Alzheimers_disease
Antigen_processing_and_presentation
Bacterial_invasion_of_epithelial_cells
Cell_cycle
Chagas_disease_(American_trypanosomiasis)
Colorectal_cancer
Complement_and_coagulation_cascades
ECM-receptor_interaction
Endocytosis
Fc_gamma_R-mediated_phagocytosis
Graft-versus-host_disease
Intestinal_immune_network_for_IgA_production
Neurotrophin_signaling_pathway
Pancreatic_cancer
Parkinsons_disease
Phagosome
Phosphatidylinositol_signaling_system
Primary_immunodeficiency
Rheumatoid_arthritis
Small_cell_lung_cancer
Systemic_lupus_erythematosus
Toll-like_receptor_signaling_pathway
Vascular_smooth_muscle_contraction
Viral_myocarditis
Alzheimer_Up Brain_Up Colon_Down Lung_Down Prostate_Down
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
-
Figura 14. Representación de las funciones en las que están enriquecidas los genes sobre-expresados en
Alzheimer y tumores cerebrales y sub-expresados en cáncer de colon, pulmón y próstata tras la
elaboración del meta-análisis. Un 1 indica que los genes diferencialmente expresados en una enfermedad
concreta están enriquecidos en una función determinada, mientras que un “-“ indica que no lo está. Las funciones más compartidas entre las listas de DEGs de las distintas enfermedades están ordenadas de
mayor a menor, de arriba abajo.
30
Alzheimers_disease
Huntingtons_disease
Metabolic_pathways
Oxidative_phosphorylation
Parkinsons_disease
Proteasome
Purine_metabolism
Ribosome_biogenesis_in_eukaryotes
Aminoacyl-tRNA_biosynthesis
Cardiac_muscle_contraction
Cell_cycle
DNA_replication
N-Glycan_biosynthesis
Peroxisome
Protein_processing_in_endoplasmic_reticulum
Pyrimidine_metabolism
RNA_transport
Spliceosome
Base_excision_repair
Bile_secretion
Calcium_signaling_pathway
Citrate_cycle_(TCA_cycle)
Collecting_duct_acid_secretion
Glycosaminoglycan_biosynthesis-heparan_sulfate
Homologous_recombination
Mismatch_repair
Neuroactive_ligand-receptor_interaction
Nucleotide_excision_repair
Olfactory_transduction
Phagosome
Propanoate_metabolism
Pyruvate_metabolism
RNA_polymerase
Salivary_secretion
Terpenoid_backbone_biosynthesis
Ubiquitin_mediated_proteolysis
Valine_leucine_and_isoleucine_degradation
Vibrio_cholerae_infection
Alzheimer_Down Parkinson_Down Brain_Down Colon_Up Lung_Up Prostate_Up
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
-
Figura 15. Representación de las funciones en las que están enriquecidas los genes sub-expresados en
Alzheimer, Párkinson y tumores cerebrales y sobre-expresados en cáncer de colon, pulmón y próstata tras
la elaboración del meta-análisis. Un 1 indica que los genes diferencialmente expresados en una
enfermedad concreta están enriquecidos en una función determinada, mientras que un “-“ indica que no lo está. Las funciones más compartidas entre las listas de DEGs de las distintas enfermedades están
ordenadas de mayor a menor, de arriba abajo.
De cara a analizar, de una manera más concreta los genes que se comportan de
manera inversa en distintos tipos de cánceres, se ha obtenido la ruta de KEGG “rutas en cáncer” a partir de la herramienta WEB-based Gene SeT AnaLysis Toolkit (ver Figura
16). Con intención de analizar dichos comportamientos inversos, se ha procedido a
solapar dicha ruta para cada una de las 3 enfermedades con sus respectivas proteínas
enriquecidas en las listas de genes. Resulta de especial interés el estudio a fondo de
aquellas proteínas cuyos genes están sobre-expresados en Alzheimer y tumores
cerebrales y sub-expresados en cáncer de pulmón, ya que en ellos se están dando casos
de comorbilidad directa (mayor probabilidad de presentar una enfermedad si tienes la
otra) por parte de Alzheimer y tumores cerebrales, y comorbilidad inversa (menor
probabilidad de presentar una enfermedad si tienes la otra) por parte de Alzheimer y
cáncer de pulmón. Se ha visto que 32 genes de los 131 por parte de los genes subexpresados en cáncer de pulmón están entre los 105 sobre-expresados en tumorescerebrales (suponiendo el 24,42 y 30,47% respectivamente). De cara a la discusión nos
hemos centrado en el entorno de la familia de proteínas RAF.
31
Figura 16. Rutas implicadas en cáncer obtenidas a partir de KEGG, en letra roja se resaltan aquellas proteínas cuyos genes están sobre-expresados en Alzheimer, en cajas rojas
aquellas cuyos genes están sobre-expresados en los 3 tumores cerebrales, en azul aquellas cuyos genes están sub-expresados en cáncer de pulmón y en marrón aquellas cuyos
genes están sobre-expresados en los 3 tumores cerebrales y sub-expresados en cáncer de pulmón.
32
De cara a verificar que los listados de genes diferencialmente expresados
obtenidos para cada una de las enfermedades mediante el meta-análisis no se debían a
artefactos o a un incorrecto tratamiento de los datos, se ha realizado una búsqueda
bibliográfica orientada a detectar si el comportamiento de determinados genes se
corresponde con lo descrito hasta el momento. Para ello, se ha considerado interesante
estudiar el caso de las proteínas de la familia Raf y su entorno que, en nuestro estudio,
están sobre-expresados en Alzheimer y los 3 tumores cerebrales y sub-expresados en
cáncer de pulmón (ver Figura 16).
Las rutas de señalización intracelular son líneas de comunicación entre el
ambiente extracelular y el genoma, y permiten la amplificación de las señales, de
manera que cambios pequeños de concentración de factores extracelulares pueden
implicar fuertes cambios en la células (Atkinson et al., 2010). Se ha visto que el exceso
de señalización por receptores de factores de crecimiento es esencial para la génesis de
muchos tumores cerebrales malignos. Actualmente, se puede identificar una sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en la mayoría de
glioblastomas primarios (en el 60% de los gliomas está sobre-expresado) y una sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR),
causada por un loop de estimulación autocrino (Hagemman et al., 2009), que está
asociado principalmente con glioblastomas secundarios (Puputti et al., 2006), aunque
también se ha visto en estudios anteriores que la supresión de PDGFRA da lugar a una
eliminación de la oligodendrogénesis (demostrando que está asociado a más de un tipo
de tumor cerebral).
Como resultado de esta sobre-expresión de EGFR se da una activación
constitutiva de las rutas de señalización Ras-RAF-MEK-ERK (ruta involucrada en la
regulación de un amplio rango de funciones celulares), evento común en gran cantidad
de cánceres humanos. En relación a esta ruta y a la sobre-expresión de PDGFRA, Chen
et al., 2014 sugieren que la expresión en superficie de la misma está regulada por la
actividad de MEK y ERK, lo cual tiene consecuencias en la proliferación y hace que
pueda ser manipulada para hacer frente a la proliferación en gliomas.
Tras la activación de EGFR se da una activación de los miembros de la familia
de proteínas Ras, un grupo de proteínas-G pequeñas, que se ha visto presentan al menos
un gen sobre-expresado (K-Ras, N-Ras o H-Ras) en aproximadamente el 30% de los
tumores cerebrales.
Una vez Ras está activo pasa a activar a las proteínas Raf. En mamíferos, existen
3 isoformas diferentes de la proteína Raf, que se originan a partir de 3 genes
independientes: Raf-1 (o c-Raf), B-Raf y A-Raf (Matallanas et al., 2011). Lyustikman et
al., 2008 demostraron que la señalización por Raf juega un papel importante en la
gliomagénesis, de hecho, la activación de Raf-1 coopera con la pérdida del supresor de
tumores Arf y/o la activación de Akt para inducir gliomas.
Además de la citada activación de Raf-1, se ha detectado en estudios anteriores
una sobre-expresión de las otras 2 isoformas de Raf a nivel mRNA en gliomas humanos
malignos, las cuales se ha visto tienen un efecto negativo en la supervivencia de
pacientes con gliomas. En relación a esto, se sabe que, en contraste con las células
normales, las células tumorales se han adaptado a condiciones de hipoxia cambiando su
33
metabolismo a una glicólisis anaerobia, que está caracterizada por elevadas tasas de
consumo de glucosa y tasas reducidas de fosforilación oxidativa, causando una elevada
producción de lactato incluso en presencia de oxígeno. Recientemente, se ha mostrado
que A-Raf se une directamente a la enzima glicolítica piruvato quinasa M2 (M2-PK),
induce su transición de la forma dimérica a la tetramérica, favorece la producción de
energía glicolítica y promueve la transformación celular y tumorigénesis. Como
consecuencia de esto, la sobre-expresión de A-Raf genera un efecto negativo sobre la
supervivencia de los pacientes.
En lo referente a Raf en Alzheimer, se ha visto que la ruta MAPK está activada,
y que juega un papel central en la señalización de estrés oxidativo, control del ciclo
celular (induciendo la apoptosis neuronal), así como la activación enzimática de las ß- y
-secretasas, así como la fosforilación y estabilización de APP (Kim et al., 2010). Se ha
visto que los agregados de Aß42 inducen la activación de macrófagos, que produce ROS
y citoquinas pro-inflamatorias como TNF- y IL-1ß, que estimulan la ruta MAPK. Mei
et al., 2006 demostraron en su estudio que había una fuerte asociación entre Alzheimer
y Raf-1, encontrando que se daba una mayor fosforilación en regiones críticas de
activación y que había mayor niveles de Raf-1 asociado a Ras. Estos resultados
confirman nuestro estudio, en el que se ha obtenida que Raf-1 estaba sobre-expresada.
Entre otros tantos procesos, se ha visto que la activación de Raf-1 puede
promover la activación de NF-kB. NF- B hace referencia a la familia Rel de factores de
transcripción, que consisten en 5 miembros: p65/relA, relB, REL (c-rel), p50/NFKB1 y
p52/NFKB2 (ver Figura 17). Existen 2 sub-grupos en la familia, 3 de las sub-unidades,
p65, relB y REL contienen dominios de activación de la transcripción en el c-terminal.
El p50 y p52 son escindidos proteolíticamente a partir de proteínas más grandes (p105 y
p100, respectivamente), y no contienen dichos dominios, actuando en su lugar como
supresores transcripcionales (Tilstra et al., 2011). El complejo NF-kB es responsable de
la expresión de IL-2, IL-6, TNF- , TNFß, c-Myc, Jun-b, APP, p53, PDGF…
Figura 17. Representación esquemática de los miembros de la familia NF- B. p65/RelA, c-Rel y RelB
contienen dominios de activación de la transcripción (TAD), mientras que P100/p52 (NFKB2) y
P105/p50 (NFKB1) no lo presentan. Figura obtenida de Tilstra et al., 2011.
34
Bajo la mayoría de las situaciones, NF- B está inactivado en el citoplasma
debido a la unión de I B a NF- B. Mediante la activación de IKK se da la disociación
del complejo NF- B/ I B como resultado de la fosforilación y degradación de I B por
IKK.
Como consecuencia de la sobre-expresión de EGFR o PDGFRA en casi el 50%
de los casos de glioblastoma primario, se da una activación de NF- B. En contra de los
resultados obtenidos en este estudio, donde se detecta una sobre-expresión de NFKBIA,
gen que da lugar a I B, Rinkenbaugh et al., 2011 detectaron que NFKBIA estaba
delecionado, lo cual podía promover el crecimiento celular descontrolado, ya que actúa
como supresor de tumores inactivando NF- B.
En lo referente a los patrones de expresión de estos genes en Alzheimer, es
importante decir que, mediante mapeo de motivos, se ha determinado que NF- B es el
factor de transcripción más asociado al envejecimiento. De hecho, las rutas biológicas
implicadas en el envejecimiento, incluyendo respuestas inmunes, senescencia celular,
apoptosis y metabolismo están todas reguladas al menos en parte por NF- B.
Se ha visto que, en pacientes de Alzheimer, se da un aumento de citoquinas
durante la enfermedad, posiblemente mediante la estimulación de la actividad NF- B en
la microglía (Tilstra et al., 2011). Se ha sugerido que NF- B juega un papel clave en la
formación de placas e incluso un papel más importante en la inflamación y señalización
de citoquinas en la progresión de la enfermedad.
De manera similar a la neurodegeneración en pacientes con AD, hay un aumento
en la señalización inflamatoria y señalización de citoquinas en Párkinson. En concreto,
se ha determinado que hay un aumento de 70 veces en la concentración de p65/RelA en
neuronas dopaminérgicas (neuronas que son centrales en la patología de la enfermedad),
comparando casos de PD con casos control de la misma edad.
A partir del análisis de la Tabla 4 se puede ver que, la única diferencia de
expresión entre Alzheimer y los tumores cerebrales se da en la isoforma NFKB2, por lo
que esta podría ser una de las diferencias que hacen que, pese a presentar solapamientos
de genes expresados en la misma dirección, sigue habiendo genes con comportamientos
inversos que pueden ser los últimos responsables del paso de una situación en la que se
está dando una muerte celular (Alzheimer), a una situación en la que se da una
proliferación descontrolada (tumores cerebrales).
STAT3 afecta a la transcripción de genes implicados en la apoptosis y el ciclo
celular, por lo que un control de la actividad de dicha proteína previene la
transformación de células. Como consecuencia de la sobre-expresión de EGFR se da
también un aumento directo en la actividad de STAT3 en las células de glioblastomas.
En un estudio previo Carro et al., 2010 demostraron que STAT3 es uno de los
principales reguladores de la transformación mesenquimática, dando lugar al fenotipo
mesenquimático característico de la agresividad de los glioblastomas.
En un estudio Lee et al., 2009 demostraron que STAT3 activado
constitutivamente mantiene la actividad constitutiva de NF- B en cánceres inhibiendo
que sea exportado del núcleo. Esto define una cooperatividad entre STAT3 y NF- B en
cáncer, y ayuda a explicar por que ambos factores de transcripción parecen estimular un
35
repertorio bastante solapante de genes angiogénicos, proliferativos y de supervivencia
(Atkinson et al., 2010).
En relación con STAT3 y NF- B, Garner et al., 2013 realizaron análisis de
microarrays y revelaron una des-regulación de la ruta de señalización de Notch. Vieron
que Notch1 estaba sobre-expresado y que algunos reguladores negativos de la ruta
Notch como CTBP1 estaban sub-expresados (igual que en los resultados de nuestro
análisis) en glioma.
En lo referente a STAT3 y Alzheimer, Wan et al., 2010 identificaron a STAT3
como un factor clave potencial en la patofisiología de la enfermedad. Vieron que la para
que se diese la fosforilación de STAT3 se requería la activación de una tiroxina quinasa
(Tyk2, sobre-expresada en nuestro análisis) para que se produjese la muerte celular de
las neuronas, características de esta enfermedad. En su estudio encontraron sobreexpresión de STAT3 (al igual que en el presente estudio).
En la Tabla 4 se pueden observar los estados de expresión de la mayoría de las
proteínas y sus respectivos genes de los que se ha estado hablando en el apartado de
discusión. Todos estos datos permiten demostrar que mediante el meta-análisis se
obtienen resultados ya publicados en otros artículos, mostrándonos las posibles
relaciones entre enfermedades que presentan comorbilidad.
Con objeto de comprobar si los resultados obtenidos en nuestro estudio, que
indican una posible causa de comorbilidad inversa por presentar solapamientos entre
genes con comportamientos inversos en 2 enfermedades distintas (por ejemplo
Alzheimer y cáncer de pulmón) son correctos, se ha realizado una búsqueda
bibliográfica. Para ello, no hemos centrado en las proteínas Raf. En lo referente a la
situación de Raf-1 en cáncer de pulmón, que en el estudio realizado se ha visto que está
sub-expresado, se ha visto que su sobre-expresión en “Small Cell Lung Cáncer” (SCLC) da lugar a una disminución de la proliferación de los tumores, pero por desgracia no se
han encontrado datos en la bibliografía que hagan referencia a esta sub-expresión en
“Non Small Cell Lung Cáncer” (NSCLC), que es el tipo de cáncer de pulmón analizado en nuestro estudio (Ravi et al., 1998).
36
Tabla 4. Tabla resumen del estado de expresión de determinados genes implicados en tumores cerebrales
y Alzheimer.
Proteína
EGFR
PDGFRA
K-Ras
H-Ras
N-Ras
Raf-1
A-Raf
B-Raf
Stat3
Tyk2
p65/RelA
c-Rel
p100/p52 (NFKB2)
p105/p50 (NFKB2)
Estado
Sobre-expresado en Alzheimer, tumores
cerebrales y pulmón.
Sobre-expresado en Párkinson y tumores
cerebrales, sub-expresado en cáncer de
pulmón, colon y próstata.
Sub-expresado en Alzheimer y tumores
cerebrales, sobre-expresado en próstata.
Sub-expresado en Párkinson, Alzheimer y
tumores cerebrales, sobre-expresado en
cáncer de colon.
Sub-expresado en Alzheimer y cáncer de
colon, sobre-expresado en tumores
cerebrales .
Sobre-expresado en Párkinson, Alzheimer
y tumores cerebrales, sub-expresado en
cáncer de pulmón y próstata.
Sobre-expresado en Alzheimer y tumores
cerebrales, sub-expresado en cáncer de
pulmón.
Sub-expresado en Párkinson y Alzheimer,
sobre-expresado en tumores cerebrales.
Sobre-expresado en Alzheimer, tumores
cerebrales y cáncer de colon, subexpresado en cáncer de pulmón.
Sobre-expresado
en
Párkinson,
Alzheimer, glioblastoma y cáncer de
colon, sub-expresado en cáncer de
próstata.
Sobre-expresado
en
Alzheimer,
Párkinson, tumores cerebrales y cáncer de
colon.
Sobre-expresado en Alzheimer, tumores
cerebrales y cáncer de colon, subexpresado en cáncer de pulmón.
Sobre-expresado en Alzheimer y cáncer
de colon, sub-expresado en tumores
cerebrales y cáncer de pulmón.
Sobre-expresado en Alzheimer, párkinson,
tumores cerebrales y cáncer de colon, subexpresado en cáncer de pulmón.
37
4. DISCUSIÓN
En el presente estudio se ha observado que existe un solapamiento muy
significativo entre los genes que están sobre-expresados en Alzheimer y Párkinson y los
genes sobre-expresados en los 3 tipos de tumores cerebrales (astrocitoma, glioblastoma
y oligodendroglioma), ocurriendo lo mismo con los genes sub-expresados en las 5
enfermedades (Figura 9). El hecho de que se de el mismo tipo de solapamiento entre las
2 enfermedades del Sistema Nervioso Central y los 3 tipos de tumores cerebrales es
esperable al ver la gran cantidad de genes con el mismo comportamiento entre las
enfermedades del mismo tipo (el 84 y 62% de los genes sobre- y sub-expresados
respectivamente en Párkinson lo están también en Alzheimer, y el 66 y 71% de los
genes sobre- y sub-expresados respectivamente son comunes a los 3 tipos de tumores
cerebrales, ver Figuras 11 y 12). Estos datos parecen indicar, tal y como hipotetizaba
Lehrer, 2010, que los glioblastomas y la enfermedad de Alzheimer pueden compartir
rutas y presentar causas comunes. De hecho, estos solapamientos obtenidos tras el metaanálisis y el test de Fisher, pueden justificar la co-ocurrencia mayor de lo esperada entre
Párkinson y tumores cerebrales descrita por Catalá-López et al., 2014. Los resultados
obtenidos podrían indicar, de la misma manera que en lo referente a Párkinson y
tumores cerebrales, la existencia de una mayor probabilidad de presentar tumores
cerebrales en caso de sufrir Alzheimer, datos que no se indicaban en el estudio de
Catalá-López et al., 2014 debido a la falta de disponibilidad de datos que indicasen la
relación de la enfermedad con tipos específicos de cáncer. Esta explicación como
posible causa de la denominada “comorbilidad directa”, se basa en la interpretación molecular de que el riesgo de presentar una enfermedad cuando un paciente ya presenta
otra aumenta si los comportamientos de los genes son similares (están expresados en la
misma dirección).
De manera inversa, en lo que respecta a la relación entre Alzheimer y Párkinson
y cáncer de pulmón, colon o próstata (Figura 9), se han obtenido resultados idénticos a
los obtenidos por Ibañez et al., 2014 tras su meta-análisis (esperable teniendo en cuenta
que gran parte de los conjuntos de datos utilizados para estudiar las enfermedades eran
comunes a los 2 estudios).
Además de estas 2 CNSd, se analizaron los solapamientos de genes
diferencialmente expresados en esquizofrenia y esclerosis múltiple con los
diferencialmente expresados en distintos tipos de cánceres. En lo referente a
esquizofrenia, no se observaron patrones claros de solapamiento con las distintas
enfermedades, dándose solapamientos significativos de los genes sobre-expresados en
esquizofrenia y sobre-expresados en un cáncer concreto, por ejemplo glioblastoma, y a
la vez solapamientos significativos de los genes sub-expresados en esquizofrenia y los
sobre-expresados en glioblastoma (Figura 1 datos suplementarios). Esto puede deberse
a que, tal y como indica Takahashi, 2012, la esquizofrenia es una enfermedad muy
heterogénea a nivel genético y sintomático.
En lo referente a la esclerosis múltiple, tal y como se indicaba en los apartados
anteriores, se utilizaron, por separado, muestras de líquido cefalorraquídeo y muestras
de células mononucleares de sangre periférica, con objeto de analizar los solapamientos
38
de los distintos tipos de cánceres con los 2 tipos de muestras y comprobar si estas
relaciones fluctúan al usar muestras de distinta procedencia. Tal y como se puede
observar en la Figura 1 de los datos suplementarios, los solapamientos obtenidos
presentan, en gran parte de los cánceres, comportamientos inversos (los 3 tumores
cerebrales, cáncer de mama, colon, riñones, hígado…), indicando que hay una cantidad
importante de genes que se comportan de manera inversa dependiendo de la
localización de la muestra (para diagnosticar la enfermedad se realizan exámenes tanto
de sangre, para descartar afecciones similares, como de líquido cefalorraquídeo
mediante punción lumbar). Se plantea que estas diferencias podrían deberse a que,
debido a la barrera hematoencefálica, la sangre no entra en contacto con el cerebro, cosa
que si hace el líquido cefalorraquídeo. Pese a mostrar comportamientos inversos, el
solapamiento de genes sobre-expresados en los 3 tumores cerebrales y en las muestras
de líquido cefalorraquídeo (mismo caso para los genes sub-expresados en ambos tipos
de enfermedades) podrían estar indicando, al igual que en el caso de Párkinson
mencionado anteriormente, una relación causal de la comorbilidad directa mencionada
por Catalá-López et al., 2014.
Los solapamientos obtenidos entre los genes con mismos comportamientos
(sobre-expresados o sub-expresados en ambas enfermedades) entre Párkinson y
Alzheimer (Figura 12) concuerdan con lo mencionado por Moskvina et al., 2013, que
consideraban que pese a ser enfermedades clínicamente distintas, existía la posibilidad
de un solapamiento patológico. Para estudiar este posible solapamiento realizaron
estudios de asociación a lo largo del genoma, concluyendo que si bien los genes que
aumentan el riesgo de padecer cada una de las enfermedades no están generalizados,
puede darse un solapamiento aguas abajo de los principales genes de susceptibilidad (lo
cual concuerda con los solapamientos obtenidos, especialmente importante en los genes
sub-expresados).
En lo que respecta a las muestras utilizadas como control para el caso de los 3
tipos de tumores cerebrales (para los que se ha tenido que utilizar controles obtenidos a
partir de conjuntos de datos diferentes por la ausencia de una cantidad suficiente de los
mismos o porque no se consideraban adecuados), como ya se comentaba en el apartado
de Materiales y Métodos, nos hemos encontrado con el problema de elegir la región
para la obtención de dichas muestras (en los conjuntos de datos disponibles en la red no
está disponible la región concreta a partir de la que se obtienen las muestras, estando
indicadas todas como “brain tissue”). En un primer momento se utilizaron muestras
obtenidas a partir del hipocampo de individuos sanos, ya que múltiples autores
analizaban los gliomas de dichas región (Ali et al., 2014, Barreto et al., 2011). Con
intención de comprobar que los resultados obtenidos, reflejo de las posibles causas de la
comorbilidad directa observada en estudios anteriores, no se debían a la región
utilizada, se repitió el estudio, utilizando como control muestras obtenidas a partir de 6
regiones diferentes. Los resultados obtenidos (ver Figura 13) demuestran que, si bien la
significancia del solapamiento varía al utilizar unas regiones u otras, el tipo de
solapamiento es el mismo para todos los casos salvo para el que se utilizaron como
control muestras del córtex entorrinal, para los que los datos mostraban distintos tipos
de solapamientos. Estos resultados son esperables ya que los tumores cerebrales se dan
39
principalmente en la materia blanca, y el córtex está compuesto por materia gris, con lo
que no es una región habitual de origen gliomas.
En lo que respecta a las rutas enriquecidas, queda patente que las enfermedades
de Alzheimer y Párkinson presentan funciones similares, como consecuencia de los
fuertes solapamientos de genes que presentan, especialmente de genes sub-expresados.
No se ha encontrado ni una sola ruta que esté enriquecida en todas las enfermedades, lo
cual puede deberse a que la metodología empleada para el análisis estudiaba solo las
listas de genes significativamente diferencialmente expresados, obviando todos aquellos
genes diferencialmente expresados pero no de una manera suficientemente significativa.
Esto podría explicar que, en el estudio realizado por Ibañez et al., 2014, se obtuviesen
rutas concretas enriquecidas en las listas de genes diferencialmente expresados de las 6
enfermedades estudiadas y en nuestro estudio no, ya que dichos autores, para realizar el
análisis de enriquecimiento, utilizaron GSEA, que tiene en cuenta no solo los genes
significativamente diferencialmente expresados sino también aquellos que no llegan a
estar significativamente diferencialmente expresados.
Para terminar, se ha visto que, pese a que el Alzheimer presenta evidencias de
comorbilidad directa con los tumores cerebrales e inversa con los cánceres de colon,
pulmón y próstata, presentan una cantidad importante de genes con comportamientos
idénticos (Figuras 2 y 3, datos suplementarios), siendo en ocasiones incluso mayor el
número de genes con un mismo comportamiento. De hecho, se ha visto que, para el
caso de cáncer de pulmón, el 15,44% de sus genes sub-expresados lo están también en
Alzheimer y tumores cerebrales, comportándose solo el 6,2% de sus genes sobreexpresados de la misma manera en Alzheimer y tumores cerebrales (Figura 4, datos
suplementarios).
40
5. CONCLUSIONES
Mediante el presente estudio se han detectado nuevas evidencias sobre la
relación de comorbilidad directa que presentan Alzheimer y Párkinson con astrocitoma,
glioblastoma y oligodendroglioma.
Ha quedado demostrado que los resultados obtenidos son correctos, ya que se
corresponden con datos publicados previamente, lo cual valida la técnica utilizada, y
permite analizar en conjunto las evidencias moleculares responsables de cada una de las
enfermedades.
Tras el análisis de los genes que forman parte de las rutas de señalización
celular, ha quedado patente la importancia de los mismos en la enfermedad de
Alzheimer y en los tumores cerebrales.
Se ha visto que, pese a tratarse de tumores distintos, astrocitoma, glioblastoma y
oligodendroglioma comparten un gran porcentaje de genes con un mismo
comportamiento.
41
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
De cara a completar el presente trabajo, tal vez orientado a una posible
publicación, resultaría de alto interés analizar aquellas pequeñas diferencias existentes a
nivel de rutas entre los 3 tipos de tumores cerebrales (astrocitoma, glioblastoma y
oligodendroglioma, tal y como se ha realizado en este estudio entorno a la familia de
proteínas Raf).
Como trabajo a realizar en el futuro, sería interesante analizar la situación en el
interactoma de las proteínas que se comportan de manera similar en Alzheimer y
tumores cerebrales y de manera inversa en cáncer de pulmón, además de realizar
estudios de reposicionamiento de fármacos para tratar las enfermedades estudiadas (tal
y como se mencionaba en el apartado de objetivos, una primera referencia en este
campo es el trabajo realizado por Jahchan et al., 2013). Además, resultaría interesante
también centrarse en aquellos genes que presentan comportamientos inversos entre
enfermedades en las que se ha descrito una comorbilidad directa, para tratar de localizar
los genes que pueden ser responsables del paso de un estado de muerte celular
(Alzheimer) a un estado de proliferación descontrolada (tumores cerebrales).
42
7. BIBLIOGRAFÍA
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ali, A.N., Ogunleye, T., Hardy, C.W., Shu, H., Curran, W.J. & Crocker, I.
(2014) “Improved hippocampal dose with reduced margin radiotherapy for glioblastoma multiforme”. Radiation Oncology. 9:20.
Atkinson, G.P., Nozell, S.E. & Benveniste, E.N. (2010) “NF- B and STAT3
signaling in glioma: targets for future therapies”. Expert Review of
Neurotherapeutics. 10:575-586.
Barretto, R.P.J., Ko, T.H., Jung, J.C., Wang, T.J., Capps, G., Waters, A.C., Ziv,
Y., Attardo, A., Recht, L. & Schnitzer, M.J. (2011) “Time-lapse Imaging of
disease progression in deep brain áreas Using fluorescence microendoscopy”. Nature Medicine. 17:223-228.
Blair, L.J., Nordhues, B.A., Hill, S.E., Scaglione, K.M., O’Leary, J.C. 3rd, Fontaine, S.N., Breydo, L., Zhang, B., Li, P., Wang, L., Cotman, C., Paulson,
HL., Muschol, M., Uversky, V.N., Klengel, T., Binder, E.B., Kayed, R., Golde,
T.E., Berchtold, N. & Dickey, C.A. (2013) “Accelerated neurodegeneration through chaperone-mediated oligomerization of tau”. The Journal of Clinical
Investigation. 123:4158-4169.
Berry, N., Jobanputra, V. & Pal, H. (2003) “Molecular genetics of schizophrenia: a critical review”. Journal of Psychiatry & Neuroscience.
28:415-429.
Borenstein, M., Hedges, L. & Rothstein, H. (2007) “Introduction to MetaAnalysis”. 1st Edition. John Wiley & Sons, New York. Pages: 86-115
Brynedal, B., Khademi, M., Wallström, E., Hillert, J., Olsson, T. & Duvefelt, K.
(2010) “Gene expression profiling in multiple sclerosis: a disease of the central nervous system, but with relapses triggered in the periphery?”. Neurobiology of
Disease. 37:613-621.
Carro, M.S., Lim, W.K., Alvarez, M.J., Bollo, R.J., Zhao, X., Snuder, E.Y.,
Sulman, E.P., Anne, S.L., Doetsch,F., Colman, H., Lasorella, A., Aldape, K.,
Califano, A. & Iavarone, A. (2010) “The transcriptional network for mesenchymal transformation of brain tumours”. Nature. 463:318-325.
Catalá-López, F., Suárez-Pinilla, M., Suárez-Pinilla, P., Valderas, J.M., GómezBeneyto, M., Martínez, S., Balanzá-Martínez, V., Climent, J., Valencia, A.,
McGrath, J., Crespo-Facorro, B., Sánchez-Moreno, J., Vieta, E. & TabarésSeisdedos, R. (2014) “Inverse and Direct Cancer Comorbidity in People with
Central Nervous System Disorders: A Meta-Analysis of Cancer Incidence in
577,013 Participants of 50 Observational Studies”. Psychotherapy and
Psychosomatics. 83:89-105
Chang, L., Lin, H., Sibille, E. & Tsheng, G.C. (2013) “Meta-analysis methods
for combining multiple expression profiles: comparisons, statistical
characterization and an Application guideline”. BMC Bioinformatics. 14:368
Chen, D., Zuo, D., Luan, C., Liu, M., Na, M., Ran, L., Sun, Y., Persson, A.,
Englund, E., Salford, L.G., Renström, E., Fan, X. & Zhang, E. (2014) “Glioma Cell Proliferation Controlled by ERK Activity-Dependent Surface Expression of
PDGFRA”. PLoS One. 9:e87281.
43
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Choi, J.K., Yu, U., Kim, S. & Yoo, O.J. (2003) “Combining multiple microarray studies and modeling interstudy variation” Bioinformatics. 19 Suppl 1: i84-90
Cohen, J. (1988) “Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences”. Chapte: The Analysis of Variance. Lawrence Erlbaum Associates. Pages: 273406.
Davie, C.A. (2008) “A review of Parkinson´s disease”. British Medical Bulletin.
86: 109-127.
Devine, M.J., Plun-Favreau, H. & Wood, N.W. (2011) “Parkinson’s disease and cancer two wars, one front”. Nature Reviews. 11:812-823.
Dunckley, T., Beach, T.G., Ramsey, K.E., Grover, A., Mastroeni, D., Walker,
D.G., LaFleur, B.J., Coon, K.D., Brown, K.M., Caselli, R., Kukull, W., Higdon,
R., McKeel, D., Morris, J.C., Hulette, C., Schmechel, D., Reiman, E.M., Rogers,
J. & Stephan, D.A. (2006) “Gene expression correlates of neufibrillary tangles in Alzheimer’s disease”. Neurobioogy of Aging. 27:1359-1371.
Garner, J.M., Fan, M., Yang, C.H., Du, Z., Sims, M., Davidoff, A.M. & Pfeffer,
L.M. (2013) “Constitutive Activation of Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT3) and Nuclear Factor B Signaling in Glioblastoma
Cancer Stem Cells Regulates the Notch Pathway”. The Journal of Biological
Chemistry. 288:26167-26176.
Gautier, L., Cope, L., Bolstad, B.M. & Irizarry, R.A. (2004) “affy-analysis of
Affymetrix GeneChip data at the probe level”. Bioinformatics. 20:307-315.
Goldenberg, M.M. (2012) “Multiple Sclerosis Review”. 37:175-184.
Gourraud, P., Harbo, H.F., Hauser, S.L. & Baranzini, S.E. (2012) “The genetics of multiple sclerosis: an up-to-date review”. Immunological Reviews. 248:87103.
Grzmil, M., Morin, P.Jr., Lino, M.M., Merlo, A., Frank, S., Wang, Y., Moncayo,
G. & Hemmings B.A. (2011) “MAP kinase-interacting kinase 1 regulates
SMAD2-dependent TGF-ß signaling pathway in human glioblastoma”. Cancer
Research. 71:2392-2402.
Guorffy, B., Molnar, B., Hermann, L., Szallasi, Z. & Eklund, A.C. (2009)
“Evaluation of Microarray Preprocessing Algorithms Based on Concordance with RT-PCR in Clinical Samples”. PLoS One. 4:e5645.
Hagemann, C., Gloger, J., Anacker, J., Said, H.M., Gerngras, S., Kühnel, S.,
Meyer, C., Rapp, U.R., Kämmerer, U., Vordermark, D., Flentje, M., Roosen, K.
& Vince, G.H. (2009) “RAF expression in human astrocytic tumors”. International Journal of Molecular Medicine. 23:17-31.
Hou, J., Aerts, J., den Hamer, B., van Ljcken,W., den Bakker, M., Riegman, P.,
van der Leest, C., van der Spek, P., Foekens, J.A., Hoogsteden, H.C., Grosveld,
F. & Philipsen, S. (2010) “Gene expression-based classification of non-small
cell lung carcinomas and survival prediction”. PLoS One. 5:e10312.
Ibáñez, K., Boullosa, C., Tabarés-Seisdedos, R., Baudot, A. & Valencia, A.
(2014) “Molecular Evidence for the Inverse Comorbidity between Central Nervous System Disorders and Cancers Detected by Transcriptomic Metaanalyses”. PLoS Genetics. 10: e1004173.
44
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Jahchan, N.S., Dudley, J.T., Mazur, P.K., Flores, N., Yang, D., Palmerton, A.,
Zmoos, A., Vaka, D., Tran, K.Q.T., Zhou, M., Krasinska, K., Riess, J.W., Neal,
J.W., Khatri, P., Park, K.S., Butte, A.J. & Sage, J. (2013) “A Drug Repositioning Approach Identifies Tricyclic Antidepressants as Inhibitors of
Small Cell Lung Cancer and Other Neuroendocrine Tumors”. Cancer Discovery.
3:1-14.
Kim, E.K. & Choi, E. (2010) “Pathological roles of MAPK signaling pathways in human diseases”. Biochimica et Biophysica Acta. 1802:396-405.
Lee, H., Herrmann, A., Deng, J.H., Kujawski, M., Niu, G., Li, Z., Forman, S.,
Jove, R., Pardoll, D.M. & Yu, H. (2009) “Persistently activated Stat3 maintains constitutive NF-kappaB activity in tumors”. Cancer Cell. 15:283-293.
Lehrer, S. (2010) “Glioblastoma and dementia may share a common cause”. Medical Hypotheses. 75:67-68.
Lesnick, T.G., Papapetropoulos, S., Mash, D.C., Ffrench-Mullen, J., Shehadeh,
L., de Andrade, M., Henley, J.R., Rocca, W.A., Ahlskog, J.E. & Maraganore,
D.M. (2007) “A genomic pathway approach to a complex disease: axón
guidance and Parkinson disease”. PLoS Genetics. 3:e98.
Li, J. & Tseng, G.C. (2011) “An adaptively wieghted statistic for detecting differential gene expression when combining multiple Transcriptomic studies”. The Annals of Applied Statistics. 5: 994-1019
Liang, W.S., Dunckley, T., Beach, T.G., Grover, A., Mastroeni,D., Walker,
D.G., Caselli, R.J., Kukull, W.A., McKeel, D., Morris, J.C., Hulette, C.,
Schmechel, D., Alexander, G.E., Reiman, E.M., Rogers, J. & Stephan, D.A.
(2007) “Gene expression profiles in anatomically and functionally distinct regions of the normal aged human brain”. Physiological Genomics. 12:311-322.
Lu, T.P., Tsai, M.H., Lee, J.M., Hsu, C.P., Chen, P.C., Lin, C.W., Shih, J.Y.,
Yang, P.C., Hsiao, C.K., Lai, L.C. & Chuang, E.Y. (2010) “Identification of a novel biomarker, SEMA5A, for non-small cell lung carcinoma in nonsmoking
women”. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19:2590-2597.
Lyustikman, Y., Momota, H., Pao, W. & Holland, E.C. (2008) “Constitutive
Activation of Raf-1 Induces Glioma Formation in Mice”. Neoplasia. 10:501510.
Macbeth, G., Cortada de Kohan, N. & Razumiejczyk, E. (2007) “El MetaAnálisis: La Integración de los Resultados Científicos”. Evaluar. 7:34-46.
Matallanas, D., Birtwistle, M., Romano, D., Zebisch, A., Rauch, J., von
Kriegsheim, A. & Kolch, W. (2011) “Raf Family Kinases: Old Dogs Have Learned New Tricks”. Genes & Cancer. 2:232-260.
McCall, M.N., Jaffee, H.A. & Irizarry, R.A. (2012) “fRMA ST: frozen robust Multiarray analysis for Affymetrix Exon and Gene ST arrays”. Bioinformatics.
28:3153-3154.
Mei, M., Su, Bo, Harrison, K., Chao, M., Siedlak, S.L., Previll, L.A., Jackson,
L., Cai, D.X. & Zhu, X. (2006) “Distribution, levels and phosphorylation of Raf1 in Alzheimer’s disease”. Journal of Neurochemistry. 99: 1377-1388.
45
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Merenlender-Wagner, A., Malishkevich, A., Shemer, Z., Udawela, M., Gibbons,
A., Scarr, E., Dean, B., Levine, J., Agam, G. & Gozes, I. (2013) “Autophagy has a key role in the pathophysiology of schizophrenia”. Molecular Psychiatry. 1-7.
Moskvina, V., Harlod, D., Russo, G., Vedernikov, A., Sharma, M., Saad, M.,
Holmans, P., Bras, J.M., Bettella, F., Keller, M.F., Nicolaou, N., SimónSánchez, J., Gibbs, J.R., Schulte, C., Durr, A., Guerreiro, R., Hernandez, D.,
Brice, A., Stafánsson, H., Majamaa, K., Gasser, T., Heutink, P., Wood, N.,
Martinez, M., Singleton, A., Nalls, M.A., Hardy, J., Owen, M., O’Donovan, M.C., Williams, J., Morris, H.R. & Williams, N.M. (2013) “Analysis of Genome-Wide Association Studies of Alzheimer Disease and of Parkinson
Disease to Determine If These 2 Diseases Share a Common Genetic Risk”. JAMA Neurology. 70:1268-1276.
Nussbaum, R.L. & Christopher, E.E. (2003) “Alzheimer’s Disease and Parkinson’s Disease”. The NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE”. 348:1356-1364.
Puputti, M., Tynninen, O., Sihto, H., Blom, T., Mäenpää, H., Isola, J., Paetau,
A., Joensuu, H. & Nupponen, N.N. (2006) “Amplification of KIT, PDGFRA, VEGFR2, and EGFR in Gliomas”. Molecular Cancer Research. 12:927-934.
Querfurth, H.W. & LaFerla, F.M. (2010) “Alzheimer’s Disease”. The NEW
ENGLAND JOURNAL of MEDICINE. 362: 329-44.
Ramasamy, A., Mondry, A., Holmes, C.C. & Altman, D.G. (2008) “Key Issues in Conducting a Meta-Analysis of Gene Expression Microarray Datasets”. PLoS
Medicine. 5: 1320-1332.
Ravi, R.K., Weber, E., McMahon, M., Williams, J.R., Baylin, S., Mal, A.,
Harter, M.L., Dillehay, L.E., Claudio, P.P., Giordano, A., Nelkin, B.D. &
Mabry, M. (1998) “Activated Raf-1 Causes Growth Arrest in Human Small Cell
Lung Cancer Cells”. The Journal of Clinical Investigation. 101:153-159.
Riley, B. & Kendler, K.S. (2006) “Molecular genetic studies of schizophrenia”. European Journal of Human Genetics. 14:669-680.
Rinkenbaugh, A.L. & Baldwin, A.S. (2011) “Monoallelic Deletion of NFKBIA
in Glioblastoma: When Less Is More”. Cancer Cell. 163-165.
Sabates-Bellver, J., Van der Flier, LG., de Palo, M., Cattaneo, E., Maake, C.,
Rehrauer, H., Laczko, E., Kurowski, M.A., Bujnicki, J.M., Menigatti, M., Luz,
J., Ranalli, T.V., Gomes, V., Pastorelli, A., Faggiani, R., Anti, M., Jiricny, J.,
Clevers, H. & Marra, G. (2007) “Transcriptome profile of human colorrectal adenomas”. Molecular Cancer Research. 5:1263-1275.
Sanchez-Meca, J., Martínez, F.M. & Medina, T.B. (2006) “Revisiones Sistemáticas en las Ciencias de la Vida. El concepto de Salud a través de la
síntesis de la Evidencia Científica”. Capítulo: Modelo de efectos fijos y modelo
de efectos aleatorios. FISCAM, páginas: 189-204.
Shi, F., Abraham, G., Leckie, C., Haviv, I. & Kowalczyk, A. (2011) “Metaanalysis of gene expression microarrays with missing replicates”. Bioinformatics. 12:84
46
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Sun, L., Hui, A.M., Su, Q., Vortmeyer, A., Kotliarov, Y., Pastorino, S.,
Passaniti, A., Menon, J., Walling, J., Bailey, R., Rosenblum, M., Mikkelsen, T.
& Fine, H.A. (2006) “Neuronal and glioma-derive stem cell factor induces
angiogénesis within the brain”. Cancer Cell. 9:287-300
Tabarés-Seisdedos, R., Dumont, N., Baudot, A., Valdera, J.M., Climent, J.,
Valencia, A., Crespo-Facorro, B., Vieta, E., Gómez-Beneyto, M., Martínez, S. &
Rubenstein, J.L. (2011) “No paradox, no progress: inverse cancer comorbidity in people with other complex disease”. The Lancet Oncology. 12:604-608.
Tabarés-Seisdedos, R. & Rubenstein, J.L. (2013) “Inverse cancer comorbidity: a serendipitous Opportunity to gain insight into CNS disorders”. Nature Reviews.
14:293-304.
Takahashi, S. (2012) “Heterogeneity of Schizophrenia: Genetic and Symptomatic Factors”. American Journal of medical genetics. 162B:648-652.
Taminau, J., Lazar, C., Meganck, S. & Nowé, A. (2014) “Comparison of Merging and Meta-Analysis as Alternative Approaches for Integrative Gene
Expression Analysis”. ISRN Bioinformatics.
Tilstra, J.S., Clauson, C.L., Niedernhofer, L.J. & Robbins, P.D. (2011) “NF- B
in Aging and Disease”. Aging and Disease. 2:449-465.
Tseng, G.C., Ghosh, D. & Feingold, E. (2012) “Comprehensive literatura review and statistical considerations for microarray meta-analysis”. Nucleic Acids
Research. 40: 3785-3799.
Valderas, J.M., Starfield, B., Sibbald, B., Salisbury, C. & Roland, M. (2009)
“Defining Comorbidity: Implications for Understanding Health and Health Services”. Annals of Family Medicine. 7:357-363.
Wan, J., Fu, A.K.Y., Ip, F.C.F., Ng, H., Hugon, J., Page, G., Wang, J.H., Lai, K.,
Wu, Z. & Ip, N.Y. (2010) “Tyk2/STAT3 Signaling Mediates ß-AmyloidInduced Neuronoal cell Death: Implications in Alzheimer’s Disease”. Neurobiology of Disease. 30:6873-6881.
Wang, J., Duncan, D., Shi,Z. & Zhang, B. (2013) WEB-based Gene SeT
AnaLysis Toolkit (WebGestalt): update 2013”. Nucleic Acids Research.
41:W77-83.
Wang, X. (2011) “Genomic meta-nalysis combining microarray studies with
confounding clinical variables: Application to depression analysis”. University
of Pittsburgh.
Wang, X., Kang, D.D., Shen, K., Song, C., Lu, S., Chang, L., Liao, S.G., Huo,
Z., Tang, S., Ding, Y., Kaminski, N., Sibille, E., Lin, Y., Li, J. & Tseng, G.C.
(2012) “An R package suite for microarray meta-analysis in quality control,
differentially expressed genes analysis and pathway enrichment detection”. Bioinformatics. 28: 2534-2536.
Wang, Y., Xia, X.Q., Jia, Z., Sawyers, A., Yao, H., Wang-Rodriguez, J.,
Mercola, D. & McClelland, M. (2010) “In silico estimates of tissue components in surgical samples based on expression profiling data”. Cancer Research.
70:6448-6455.
47
-
-
Zhang, B., Kirov, S. & Snoddy, J. (2005) “WebGestalt: an integrated system for exploring gene sets in various biological contexts”. Nucleic Acids Research.
33:W741-748.
Zheng, B., Liao, Z., Locascio, J.J., Lesniak, K.A., Roderick, S.S., Watt, M.L.,
Eklund, A.C., Zhang-James, Y., Kim, P.D., Hauser, M.A., Grünblatt, E., Moran,
L.B., Mandel, S.A., Riederer, P., Miller, R.M., Federoff, H.J., Wüllner, U.,
Papapetropoulos, S., Youdim, M.B., Cantuti-Castelvetri, I., Young, A.B.,
Vance, J.M., Davis, R.L., Hedreen, J.C., Adler, C.H., Beach, T.G., Graeber,
M.B., Middleton, F.A., Rochet, J.C., Scherzer, C.R. & Global PD Gene
Expression (GPEX) Consortium. (2010) “PGC-1 , a potential therapeutic target
for early intervention in Parkinson’s disease”. Science Translational Medicine.
6:52ra73.
48