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Newsletter Microbial http://www.microbial‐systems.com Núm. 6 Enero‐Marzo de 2012 Informaciones sobre Análisis Microbiológicos por PCR ¿Es Legiofast ENVIRON® el mejor kit del mercado para detectar Legionella pneumophila por PCR? que proviene ese material genético. Reciente“...la detección por Introducción Legionella es un bacilo aeróbico, gramnegativo, mente, no obstante, se han publicado trabajos PCR a tiempo real con flagelación polar, cuyo hábitat primario son que demuestran que la persistencia temporal es un excelente las aguas dulces. Soporta un rango de tempera- de este material una vez muerta la bacteria es indicador no sola- turas amplio y su crecimiento se ve favorecido realmente muy baja. Por tanto, la detección por por la presencia de materia orgánica. Se repro- PCR a tiempo real es un excelente indicador no mente de la preduce en unas vacuolas especiales llamadas solamente de la presencia de Legionella, sino sencia de Legione- fagosomas, presentes en amebas. Una vez en el también -gracias a su uso cuantitativo-- de su pulmón es capaz de invadir, y por tanto evadir, nivel de carga. lla, sino también macrófagos y reproducirse en su interior de su nivel de car- los también en vacuolas modificadas por genes de ¿Cuál es el fundamento científico de los ga.” patogenicidad presentes en Legionella. kits de Microbial? En la actualidad se conocen 48 especies del género Legionella la más importante de las cuales es, por sus implicaciones clínicas, Legionella pneumophila, que produce la llamada “Enfermedad del legionario” o legionelosis. La infección por Legionella puede presentarse como neumonía típica o como una enfermedad febril sin focalización pulmonar denominada Fiebre de Pontiac. ”Legiofast, meControl de la legionelosis diante el uso de La mayor fuente de contagio es la red de distridianas genéticas bución de aguas de grandes edificios, hoteles y estables, asegura la hospitales, la humidificadoras, las maquinas de los SPA's y las fuentes de agua termal. detección de cual- rocío, Los sistemas de aire acondicionado no son una quier cepa y cuafuente relevante de Legionella, aunque sí parequier serogrupo de cen serlo las torres de refrigeración de las grandes instalaciones. Las normas higiénicoLegionella pneusanitarias para la prevención y control de la mophila, principal legionelosis están recogidas en la legislación causante de la ma- mediante sendos Reales Decretos: el 865/2003, yoría de las infec- de 4 de julio, y el 352/2004, de 27 de julio. ciones ” Detección de Legionella ”El límite de detección está por debajo de las 100 genomas o unidades bacterianas por litro” Por su parte, la detección de Legionella está regulada por la norma ISO11731 se ha basado tradicionalmente en el cultivo en placa de un medio selectivo con carbón activo llamado BCYE. La detección rápida de Legionella, no está recogida en ningún documento de normalización todavía y su aplicación como método alternativo choca con la necesidad de dar el resultado en número de viables. Como es sabido, la PCR detecta ADN, de manera que no es posible aseverar la viabilidad del organismo del ‐ 1 ‐ Diseñar y producir un buen kit para detectar un patógeno por PCR es una tarea difícil cuya mayor complejidad radica en la definición del gen diana, es decir contra qué secuencias de ADN presentes en el genoma de la bacteria a identificar, vamos a dirigir nuestras sondas. El genoma de Legionella pneumophila consta de 3,5 millones de pares de bases englobadas en unos 3200 genes, cuyas secuencias presentan distintos grados de conservación entre los diferentes aislados. En Microbial, nos hemos caracterizado por aplicar una idea distinta al desarrollo de kits para la detección de patógenos por PCR. Las compañías competidoras, tanto las del campo de la analítica convencional como las de la producción de hardware para PCR ofrecen soluciones basadas en la utilización de genes diana y de primers y sondas de primera generación: invA para Salmonella, hlyA para Listeria y mip o dotA para Legionella. El análisis de la idoneidad de estos dos últimos genes diana para la detección de Legionella revela serios problemas que los usuarios presentes y futuros de esta técnica deberían conocer. El más grave sea quizás la falta de conservación del gen entre las diferentes cepas de Legionella justo en las zonas de hibridación con los oligonucleótidos. Recordemos que éstos últimos (primers i sondas) son de secuencia fija, por lo que el buen funcionamiento de los mismos requiere la misma invariabilidad en el gen diana y no es siempre es así. El ejemplo más claro lo ofrece la diana dotA. Los sistemas de PCR existentes en el mercado que se basan en la detección de este gen utilizan primers y sondas contra regiones altamente variables de este gen (figura 1). La Newsletter Microbial Figura 1.‐ Secuencias del gen dotA de diferentes serogrupos de Legionella pneumophila. Las zonas más claras indican posiciones donde el nucleótido (A,T, G o C) varía según la cepa falta de regulación sobre estos productos permite que se pue- dan ofrecer en el mercado kits supuestamente específicos, pero con una inclusividad que dista mucho de ser la deseable. Ventajas del uso de Legiofast environ® En cambio, Legiofast, mediante el uso de dianas genéticas estables, asegura la detección de cualquier cepa y cualquier El kit de rt-PCR Legiofast environ® ofrece múltiples ventajas serogrupo de Legionella pneumophila, sino también que el frente los kits para la detección de Legionella pneumophila nivel de detección sea de los mejores del mercado, un aspecto disponibles actualmente en el mercado muy tenido en cuenta para la acreditación de cualquier laboratorio. ¿Qué usos tiene Legiofast environ®? Algunos laboratorios han empezado a usar Legiofast environ® para realizar screening de sus muestras. Las muestras que dan positivo por rt-PCR para L. pneumophila suelen contener Legionella en concentraciones detectables por el método ISO, mientras que las que no contienen esta bacteria dan negativo. Considerando que el límite de amplificación de Legiofast está entre 1 y 10 genomas por reacción y que cada reacción puede llegar a admitir hasta 5 ul de extracto, el límite de detección está por debajo de las 100 genomas o unidades bacterianas por litro. Esto ha permitido a algunos laboratorios utilizar Legiofast environ® como método alternativo para el despistaje de muestras, en sustitución del polémico “pooling” (combinación de varias muestras en una sola hasta conseguir un volumen de 1L). Tabla 1. Principales ventajas del nuevo kit Legiofast environ® Parametro Característica diferencial Diana génética Diana genética estable, invariable. . Patente: PCT/EP2006/068592 Primers Uso de un juego de 3 “primers” para una reacción de “nested” PCR Limite de detección 1‐10 unidades genómicas/reacción < 100 unidades genómicas/litro Volumen extracto 1‐5 µl/reacción Resultados ‐Negativos : Ausencia de L. pneumophila ‐Positivos : Presencia y carga de L. pneumophila* © Microbial SL Parque Científico de la UdG Edificio J. Casademont, E C/ Pic de Peguera 15 E-17003 Girona (España) Tel.: 972 183 226 Fax: 972 183 256 http://www.microbial-systems.com ‐ 2 ‐