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DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE PROCESOS QUE CURSAN CON SINTOMATOLOGÍA NERVIOSA EN CERDOS EN CRECIMIENTO Introducción Existen relativamente pocos agentes infecciosos capaces de causar síntomas nerviosos en el ganado porcino y la mayoría de ellos tienden a afectar casi en exclusiva a cerdos en transición y, más esporádicamente, a cerdos al comienzo del periodo de cebo. La excepción a esta regla es el virus de la enfermedad de Aujeszky que, dependiendo de la virulencia de la cepa, puede causar signos nerviosos en animales de distintas edades, aunque la incidencia y gravedad de la sintomatología suele ser muy superior en lechones lactantes. Aunque la infección por el virus de la enfermedad de Aujeszky también puede causar signos nerviosos en animales en transición pocas veces será éste el único signo observado ya que en granjas negativas los signos nerviosos se observarán también en animales más jóvenes y en las granjas donde la infección es endémica son más frecuentes los síntomas respiratorios en animales en cebo y, con menor frecuencia, el fallo reproductivo en las cerdas gestantes. Por el contrario, el resto de agentes capaces de causar signos nerviosos en animales en transición son específicos de esta fase, pudiendo aparecer su acción patógena desde poco después del destete hasta el comienzo del periodo de cebo. Entre estos agentes destacan Streptococcus suis, Haemophilus parasuis y determinadas cepas de Escherichia coli que son productoras de shigatoxina. Estas últimas son las causantes de la enfermedad de los edemas que se desencadena cuando colonizan el intestino delgado como consecuencia de disbiosis previas, normalmente causadas por problemas en la alimentación, y comienzan a producir la shigatoxina que destruye los endotelios vasculares causando la aparición de edemas que, cuando afectan al sistema nervioso producen síntomas nerviosos. Este cuadro se puede distinguir clínicamente del resto de cuadros nerviosos porque se suele acompañar de la aparición de edemas en distintas localizaciones, aunque no todos los animales muestran edemas evidentes, y no cursa con fiebre. Por el contrario, los cuadros clínicos causados por S. suis y H. parasuis pueden ser muy similares e incluso indistinguibles clínicamente, dependiendo de la forma considerada. Así, las infecciones causadas por cepas virulentas de S. suis se caracterizan por producir muertes súbitas en algunos animales, fiebre elevada, cuadros nerviosos que incluyen incoordinación, pedaleo, opistótonos y nistagmos, y artritis, mientras que la presentación aguda de la enfermedad producida por H. parasuis puede dar lugar a cuadros septicémicos que producen fiebre elevada y muertes súbitas y enfermedad de Glässer, que se caracteriza por la aparición de fiebre alta, poliserositis y síntomas nerviosos, incluyendo incoordinación, decúbito lateral y pedaleo. Ambos agentes son colonizadores tempranos y producen su acción patógena en la mayoría de los casos tras el destete, cuando desaparece la inmunidad maternal, por lo que el momento de presentación tampoco permite descartar el concurso de ninguno de ellos. Como consecuencia de su similitud clínica y la superposición en el momento de presentación, el diagnóstico definitivo debe incluir el envío de muestras al laboratorio y el aislamiento y/o identificación del agente patógeno. Las muestras más adecuadas para el diagnóstico de ambos procesos incluyen hisopos tomados de las meninges de animales con sintomatología nerviosa y 1 muestras de líquido pericárdico o articular. Por el contrario, las muestras de pulmón no se recomiendan ya que podrían conducir a un diagnóstico erróneo. Protocolo para el aislamiento e identificación de S. suis El diagnóstico de laboratorio de las estreptococias porcinas se basa en el aislamiento de la bacteria en medios convencionales a partir de las muestras clínicas disponibles y la posterior identificación de la bacteria en función de su morfología y características bioquímicas. Aunque se pueden usar pruebas bioquímicas tradicionales, en la mayoría de los laboratorios utilizan galerías miniaturizadas (tiras API) y se comparan los resultados con los disponibles en las bases de datos. Los pasos que habría que dar son los siguientes: 1. Siembra de las muestras e incubación de las placas Las muestras seleccionadas se siembran directamente en agar con un 5% de sangre de cordero y se incuban en aerobiosis durante 18‐24 horas. 2. Identificación de la bacteria 2.1. Morfología de las colonias: S. suis produce colonias pequeñas, grisáceas, α‐hemolíticas tras 18‐24 horas de incubación en agar con un 5% de sangre de cordero. 2.2. Morfología de la bacteria: S. suis es un coco Gram +. Para comprobar su morfología es necesario realizar una tinción de Gram. Para ello se toma una colonia y se pone sobre una gota de agua en un portaobjetos y se fija por calor a la llama. Una vez fijada la muestra se realiza la tinción para lo cual se cubre la muestra con Violeta de Genciana durante 1 minuto tras lo cual se lava con agua para retirar el exceso de colorante y se añade Lugol como mordiente para facilitar la fijación del color. Tras incubar 1 minuto se retira el Lugol y se lava el cubreobjetos con agua nuevamente. A continuación se lava el portaobjetos con alcohol acetona hasta que no se arrastre más colorante. Finalmente se añade safranina como tinción de contraste para las bacterias Gram‐ y tras 1 minuto de incubación se lava y se observa al microscopio a 100x aumentos. 2.3. Pruebas bioquímicas 2.3.1. Prueba de la catalasa. Los cocos Gram+ pueden ser estreptococos, micrococos, enterococos o estafilococos. La presencia o ausencia de catalasa ayuda a diferenciarlos. Los estafilococos y micrococos son catalasa + y los estreptococos y enterococos son catalasa ‐, diferenciándose estos últimos, además de por su origen clínico, por su capacidad para crecer en presencia de un 6% de cloruro sódico. Para realizar la prueba de la catalasa se pone una gota del reactivo (peróxido de hidrógeno) en un portaobjetos y sobre ella se pone una colonia de la bacteria y se observa la liberación de oxígeno que promueve la catalasa en el caso de bacterias positivas. 2.3.2. Tira API Strep 20. La identificación definitiva de los estreptococos se realiza utilizando baterías de pruebas bioquímicas. Para ello se pueden utilizar galerías miniaturizadas que permiten realizar diversas pruebas bioquímicas de forma cómoda y sencilla, aunque en 2 ocasiones la diversidad fenotíípica de las bbacterias pue
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Pruebas bioquímicas H. parasuis debe diferenciarse de bacterias similares, como Actinobacillus minor, Actinobacillus indolicus y Actinobacillus porcinus. Esta diferenciación es importante porque estos Actinobacillus pueden estar presentes en muestras de cerdos, aunque se consideran apatógenos. Esta diferenciación es posible en función de su perfil bioquímico. En concreto la capacidad para producir indol y la actividad catalasa permiten diferenciar estas especies entre sí. Los perfiles de cada especie se resumen en la Tabla 1. Tabla 1: Perfil bioquímico de H. parasuis y distintos Actinobacillus del ganado porcino Prueba bioquímica Catalasa Indol H. parasuis + ‐ A. minor ‐ ‐ A. indolicus + + A. porcinus ‐ ‐ La prueba de la catalasa se realiza igual que se ha descrito en el caso de S. suis. Para realizar la prueba del indol se debe crecer la bacteria en medio BHI suplementado con un 10% de suero de caballo durante 24 horas y transcurrido este tiempo se añaden unas gotas de reactivo de Kovac. Si la bacteria produce indol el reactivo adquirirá un color rojizo mientras que si es negativa permanecerá con su color original. 2.4. Identificación mediante PCR. Aunque las pruebas bioquímicas pueden indicarnos que estamos en presencia de H. parasuis, la identificación definitiva debe hacerse mediante técnicas moleculares y particularmente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) realizada sobre la bacteria aislada. Esta técnica permite realizar numerosas copias de un fragmento seleccionado del ácido nucleico del agente patógeno utilizando el material genético de ese agente como molde hasta el punto en que pueda ser 4 visualizado fácilmente. Para que se puedan realizar las copias es necesario en primer lugar purificar el ácido nucleico que servirá de molde y posteriormente añadirlo a una mezcla que contiene, además de un tampón que asegura la especificidad de la reacción, unos oligonucleótidos que actúan como cebadores uniéndose específicamente al molde e iniciando así la copia, deoxinucleotidos trifosfato (dNTPs) que serán añadidos secuencialmente según corresponda a los cebadores para hacer la copia del molde y una polimerasa que se encargará de seleccionar los dNTPs adecuados y añadirlos a la cadena de ADN naciente para que la copia sea fiel al molde original. 2.4.1. Extracción del ácido nucleico: Aunque existen muchas formas de extraer los ácidos nucleicos, incluyendo diversos sistemas comerciales, cuando la muestra de partida son bacterias procedentes de un cultivo una forma fácil y barata de hacerlo es hervir las bacterias. Este proceso lisa las bacterias y libera el ácido nucleico que se encuentra en su interior. Para ello se ponen 500 µL de agua para biología molecular en un tubo tipo eppendorf. Con un asa de platino se recoge el crecimiento de una placa diluyendo el contenido de 2 asas en el agua. Mientras tanto se pone agua a hervir en un recipiente y cuando ésta hierve se meten los tubos cerrados y colocados sobre un flotador en el agua. Tras hervir 10 minutos, los tubos se centrifugan a 14000 xg durante 3 minutos y el sobrenadante se utiliza como molde para la PCR. 2.4.2. PCR: Para llevar a cabo la PCR se utilizará un kit comercial (HotStarTaq DNA Polymerase, Qiagen) y la mezcla se realizará siguiendo las instrucciones del fabricante de la siguiente forma: 1. Tampón de PCR 10x ............... 10 µL 2. dNTPs ..................................... 2 µL 3. Cebador Directo .................... 2 µL 4. Cebador Reverso ................... 2 µL 5. Polimerasa ............................. 0,5 µL 6. Agua ....................................... 63,5 µL 7. Muestra ................................. 20 µL Para que se produzca la reacción es necesario que se sucedan una serie de ciclos de térmicos que permitan la activación de la polimerasa, la desnaturalización de la doble hebra de ADN, la unión específica del cebador a su molde y la actividad de la polimerasa añadiendo nucleótidos y generando la copia del ADN molde. Finalmente la reacción termina con un último ciclo que tiene como objetivo permitir que se complete la generación de las copias que han quedado incompletas. La composición exacta del programa de amplificación dependerá de las características de la polimerasa que se utilice, de las características de los cebadores y del tamaño del fragmento de ADN que se quiere amplificar. En este caso, las condiciones de reacción serán las siguientes:  1 ciclo de 95 °C durante 15 minutos (para activar la polimerasa)  35 ciclos para aumentar de forma exponencial el número de copias del fragmento de ADN seleccionado que constarán de tres pasos: 5 94 °C durante 30 segundos (para separar la doble cadena de ADN y permitir el acceso del cebador a su secuencia complementaria) o 59 °C durante 30 segundos (para permitir la unión específica del cebador a su molde) o 72 °C durante 1 minuto (para que actúe la polimerasa y se genere la nueva copia del fragmento seleccionado) 1 ciclo de 72 °C durante 10 minutos (para completar las copias de ADN que puedan haber quedado incompletas en los ciclos anteriores) o
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2.4.3. Visualización del producto de PCR: El amplicón generado se puede visualizar mediante electroforesis en geles de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio u otras sustancias que se unan al ADN y emitan fluorescencia al exponerse a la luz ultravioleta. La especificidad de la reacción se establece por el tamaño del amplicón que se determina por comparación con un patrón de peso molecular. 6