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Comparison of three diagnostic tests for abortions caused by infectious bovine
rhinotracheitis.
Comparación de tres pruebas diagnósticas para el aborto por rinotraqueitis infecciosa
bovina en hatos lecheros.
Alfa Bracho Cárdenas 1, Carlos J. Jaramillo Arango1, José Juan Martínez Maya 1*,
Juan Montaño Hiroshe1, Arturo Olguín y Bernal1. 1. Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia. Universidad Nacional Autónoma de México, 04510,
México, D.F.
Resumen
The present study compares characteristics of immunoperoxidase and
immunofluorescence tests for abortions caused by IBR, as well as their concordance
with serum neutralization in the mothers of said calves, compared against a standard
test of viral isolation. Forty-nine aborted fetuses, obtained over a one-year period,
were evaluated. Liver, spleen, kidney and lung samples were collected from each
fetus. Serum from the mothers was collected on three occasions, one month apart,
commencing one month after the abortion. Diagnostic technique followed that
prescribed by the World Health Organization (WHO). A total of 29 viral isolations
were obtained. The immunoperoxidase (IP) and immunofluorescence (IF) techniques
had a sensitivity of 96.7% and 24.1%, respectively, and a specificity of 20% and
70%, respectively. The positive predictive value for these was 64.4% and 53.8%,
respectively, while the negative predictive value was 80% and 38.9%, respectively.
Of the organs sampled, the liver and kidney samples were best for IF and IP
diagnosis, respectively. Concordance for serum neutralization, immunofluorescence
and immunoperoxidase with respect to viral isolation was not significant (P >0.05).
Introducción
El Herpes bovis 1 (BHV-1) de la familia Herpesviridae ocasiona la rinotraqueitis
infecciosa bovina (IBR). La infección puede ocurrir en forma subclínica,1 y se
caracteriza por la interrupción de la gestación, que afecta del 25 al 50% de las vacas
gestantes. Generalmente el aborto ocurre en el tercer tercio de la gestación, en un
tiempo no mayor a tres semanas en el que el feto está autolisado 1,2.
Se menciona que el diagnóstico en abortos solamente puede ser confirmado por
examen de tejido fetal 1. Aunque los aislamientos vírales obtenidos de distintas
formas clínicas de la enfermedad difieren en su afinidad por los distintos órganos,
resultan serológicamente idénticas 3.
La prueba de SN con incubación de 24 h tiene una sensibilidad del 94.4% y una
especificidad del 93.2% y con incubación de 1 h una sensibilidad del 89.2% y una
especificidad cercana al 100% 4. Una limitante es que sólo es certera en hatos donde
no se vacuna 1.
La prueba de IF se utiliza para identificar antígenos y anticuerpos en material fresco
(riñón y glándulas adrenales) o procesado (hígado, riñón, placenta, bazo), 5, 6 se ha
visto que la prueba indirecta es más sensible 3, 6. En examen directo de secciones
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congeladas de riñón fetal tiene una especificidad de más del 90%; y una sensibilidad
del 67% 7.
La técnica de IP tiene una sensibilidad del 94% 7.
El AV tiene el inconveniente de ser lento ya que tarda al menos una semana; las
muestras deben congelarse a -70°C, los cultivos se incuban a 37°C y se observa
diariamente para comprobar la aparición de efecto citopático, este efecto debe
valorarse en comparación con cultivos no inoculados llamados testigos negativos,
especialmente en casos de virus que precisan periodos de incubación superiores a una
semana 8.
En México, se recomienda como prueba de rutina la SN, aceptada internacionalmente
como prueba de referencia 8. Sin embargo, las dificultades de su implementación, así
como la celeridad en la obtención de los resultados, determinan la necesidad de una
prueba alternativa de equivalente valor o mejor especificidad y sensibilidad. Además,
la SN no hace diferencia entre individuos vacunados o infectados con cepas de campo
9
.
Material y métodos
Mediante un muestreo no probabilístico por conveniencia, se evaluaron los fetos
abortados, y los sueros de las vacas y vaquillas progenitoras de los fetos a lo largo del
año de estudio (1997). Se realizó necropsia de los fetos y se disecó hígado, bazo,
riñón y pulmón 3, 8, de cada uno se obtuvieron aproximadamente 2 cm³, y se
conservaron estériles y en congelación a -4ºC durante 1- 2 días.
El día del aborto, se le tomaron 10 ml de sangre a la vaca mediante punción en la
vena coccígea. El suero se obtuvo por centrifugación (2500 rpm, 15 min.), en viales
estériles. Este proceso se repitió a los 30 y 60 días después del aborto; las muestras se
conservaron en congelación a -4ْC hasta su análisis. A cada muestra de órgano se le
realizaron las pruebas de AV, IP IF.
La técnica de AV se realizó según la OIE 10. Se utilizaron las líneas celulares MDBK
y PK15; si durante 5 días no hubo efecto citopático se realizaron de tres a cinco
pases por muestra de feto. Simultáneamente se realizó IP en placa de 96 pozos para
evidenciar que el aislamiento viral fuera de IBR.
Para las técnicas de IP e IF se realizaron tres cortes por congelación de 3-5µM por
órgano / muestra para cada prueba. La muestra fue positiva cuando al menos en una
de las cuatro muestras de órgano de un solo feto dio una reacción positiva a IP y a IF.
A los sueros de las madres se les realizó la prueba de SN conforme a lo establecido en
el CENASA 8, 10, 11, con punto de corte de negativo arriba de 1:128. El suero
hiperinmune se trabajó a una dilución de 1:520 12.
Análisis Estadístico:
El AV se utilizó como estándar diagnóstico (prueba con sensibilidad cercana al
100%) 13.
Al comparar IP e IF directa con el AV se obtuvieron las proporciones de verdaderos
positivos (VP), verdaderos negativos (VN), falsos positivos (FP), falsos negativos
(FN), la Se, la Es, el VP(+) y el VP(-) en cada prueba. Con estos resultados se
compararon las pruebas de IP e IF y se calculó el Indice de Concordancia Bruta
(ICB) y la concordancia por Indice de Kappa (IK) con SN 13, 14. Para el análisis se
utilizó el programa EPI-Info 6.
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Resultados
Se obtuvieron un total de 86 muestras de fetos abortados, de las cuales sólo fue
posible analizar 49 debido a la auto lisis.
En 29 (59%) de 49 muestras de fetos se aisló el virus de la IBR. El 26.5% de las
muestras fueron positivas a IF y el 89.7% a IP. La positividad por órgano de IF varió
del 13% al 18% para riñón e hígado respectivamente, sin diferencia significativa (p =
0.9205).
Para IP por órgano la variación de positividad fue del 42% al 74% en hígado y riñón
respectivamente, la cual fue significativa (p = 0.012). La prueba de IF tuvo una Se de
24.1% y una Es de 70%, un VP(+) de 53.8% y un VP(-) de 38.9%; el IK con AV fue
de -0.052 , no significativo (p = 0.64). Por órgano, IF tuvo una Se de 10 y 20% y una
Es de 79 y 88%, para bazo y pulmón, respectivamente, en todos los órganos la
concordancia por IK con el AV no fue significativa. La prueba de IP presentó Se del
96.6% y Es del 20%, un VP(+) de 64.6% y un VP( -) de 80%; La concordancia por
IK con AV fue de 0.187, no significativa (p = 0.02) Por órgano, IP tuvo la mejor
respuesta en hígado con Es de 88.4%, VP(+) de 84.2%, y una concordancia
significativa (IK= 0.3827; p = 0.0033).
De los 49 fetos se pudo obtener suero sólo de 38 madres en el primer muestreo, 34 en
el segundo y 26 en el tercero, para la prueba de SN.
El valor promedio de anticuerpos contra IBR de los animales que abortaron en
general fue de 1:32. Sólo hubo concordancia significativa al considerar como
positivos los sueros del primer muestreo con valores de 1:32 o mayor (IK = 0.27, p =
0.04), destaca señalar que la sensibilidad fue de 68% y la especificidad de 61.5%.
Discusión
La Se de la prueba de IP (96.7%) fue mayor a la encontrada por Smith et al., y
Delgado et al. 4, 6, del 96% por avidina-biotina y del 83.3% por la técnica directa
respectivamente. La Es (20%) fue menor a la notificada por Delgado et al.6, cercana al
100% .
La Se y Es obtenidas por IF (24.1%, 70%) fueron menores a las encontradas por
Smith et al. y Delgado et al. 4, 6 (Se del 67% y 83.3% respectivamente), no así la Es ya
que Delgado et al., 19 encontraron 100% bajo condiciones de laboratorio.
La concordancia entre la prueba de IF y AV (ICB = 42.8%) fue menor a la
encontrada por Reed et al., (50%) 15 y por Bratanich et al., (83%) 5.
Los órganos de elección para envío de muestras al laboratorio fueron el hígado, riñón
y pulmón, lo que concuerda con lo señalado por Smith et al. 4
La variación en los valores de SN (1:2 hasta mayores de 1:128) en las vacas al
momento del aborto, coinciden con lo señalado por S. Van Drunen et al 16. En el
CAIT hubo dos animales con valores mayores a 1:128 en el momento del aborto y
que presentaban signos respiratorios sugestivos de IBR, y no estaban vacunados, lo
cual evidencia la circulación del virus en el área estudiada 16, 17, 18, 19.
No fue posible evaluar la concordancia de SN con las pruebas de IP e IF, ya que los
resultados obtenidos pudieron deberse a la presencia del antígeno en el feto de madres
inmunizadas con vacuna inactivada en un tiempo no mayor a seis meses entre
vacunación y el aborto.
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Podemos concluir que la IP e IF directa no fueron métodos rápidos y confiables para
la detección del herpes virus bovino en tejidos fetales. Ambas pruebas tuvieron una
especificidad limitada para detectar al virus; cabe señalar que tanto la IP como la IF
resultaron ser métodos menos laboriosos y costosos que el AV para la detección del
herpes virus bovis I.
No se encontró relación entre los resultados de IP e IF respecto a los de SN; la prueba
de SN ha sido aceptada internacionalmente como la tècnica de referencia, por lo tanto
es necesario definir el estado endèmico del àrea donde se utilize.
Agradecimientos
Al Centro Nacional de Servicios de Diagnóstico en Salud Animal (CENASA) y al
Complejo Agropecuario e Industrial de Tizayuca, Hidalgo (CAIT), por el apoyo
brindado para la realización de este estudio.
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