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SECCIÓN 2.1.
ENFERMEDADES DE PECES
CAPÍTULO I.1.
INFORMACIÓN GENERAL
A. BASES GENERALES DE LOS PROGRAMAS DE VIGILANCIA
Y CONTROL SANITARIO PARA PECES
1. PATÓGENOS Y ENFERMEDADES ESTUDIADAS
Los patógenos y las enfermedades de peces se incluyen en el Código Sanitario de Animales Acuáticos (el
Código Acuático) según las siguientes consideraciones básicas: las enfermedades resisten la terapia o
responden escasamente a ella, tienen una distribución geográfica restringida, son de gran importancia
socio-económica, y ocurren en especies implicadas en el mercado internacional. Para la lista actual de
enfermedades de peces de la OIE, consulte la última edición del Código Acuático. Este Manual de animales
acuáticos contiene capítulos sobre enfermedades enumeradas en el Código de animales acuáticos y otros
capítulos sobre enfermedades de importancia comercial.
2. ENFOQUE GENERAL DEL CONTROL SANITARIO ANIMAL EN CULTIVOS DE PECES
Un abordaje completo del control sanitario animal en cultivos de peces requiere:
• Una evaluación del estado sanitario de los animales empleando métodos basados en las
disposiciones del capítulo 1.1.4.
• La obligación de reabastecer las instalaciones de aguas libres o cerradas solamente con animales que
tengan un estado sanitario superior o igual al de los animales que ya viven en las áreas consideradas.
• La erradicación, cuando sea posible, de la enfermedad mediante el sacrificio de las existencias
infectadas, la desinfección de las instalaciones y la repoblación con peces libres de enfermedad y de
origen aprobado.
•
La notificación por parte de cada país miembro de sus necesidades particulares, además de
aquellas consideradas en el Código Acuático, para la importación de animales acuáticos y de
productos de animales acuáticos.
Si se siguen los procedimientos anteriores, es posible dar una seguridad adecuada del estado sanitario
de los productos de acuicultura en cuanto a las enfermedades especificadas y respecto a su país, zona o
lugar de origen.
La emisión de un certificado sanitario por el funcionario adecuado, basado en un informe sobre el
estado sanitario y en exámenes de los animales acuáticos, proporciona la seguridad de que los
productos de acuicultura de un envío definido se originan en un país, zona, granja o sitio de
recolección que está libre de una o más de las enfermedades especificadas que se relacionan en el Código
Acuático y posiblemente de otras enfermedades (ver modelo de certificado internacional en el Código
Acuático).
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo I.1. — Enfermedades de peces: Información general
La evaluación del estado sanitario de las existencias de peces se basa en la inspección de los sitios de
producción piscícola y en el examen posterior de muestras en el laboratorio, procedentes de ejemplares
de peces tomados de las existencias de una población definida de peces. Este objetivo requiere que las
muestras se recojan siguiendo tablas de tamaño de muestreo definidas y que se procesen con base en
métodos aceptados.
Para los patógenos de animales acuáticos se aplican varias técnicas. A efectos de análisis y diagnóstico,
el Manual de animales acuáticos ha establecido dos tipos de procedimientos de examen que son aceptables
para dicho fin: 1) Métodos de análisis, y 2) Métodos de diagnóstico. Los métodos aceptados se indican
en cada capítulo de la enfermedad.
B. PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO
1. RECOGIDA DE EJEMPLARES DE PECES
1.1. Diagnóstico en una situación de enfermedad
Debería recogerse un número mínimo de diez peces moribundos o de diez peces que manifiesten
signos de la enfermedad en cuestión: los peces deben estar vivos cuando se recogen y deben
enviarse vivos o muertos al laboratorio, envasados por separado en contenedores cerrados
asépticos y refrigerados, o en hielo. Debe evitarse de forma especial la congelación de los peces
recogidos. No obstante, es preferible y se recomienda la recolección de muestras de órganos de
los peces inmediatamente después de haber sido seleccionados en el sitio de producción, y
después guardar y procesar las muestras como se describe en las secciones 2 y 3. Debería unirse a
cada muestra una etiqueta de identificación que contenga información sobre el lugar, tiempo,
fecha, especie, número de muestras recogidas, estado muerto o moribundo del ejemplar al
recogerse, y nombre y datos de contacto del individuo que tomó la muestra.
1.2. Peces con apariencia clínica normal
La recolección de peces debe abarcar un número de ejemplares estadísticamente significativo,
pero resulta obvio que la falta de detección de algunos patógenos en la muestra no garantiza la
ausencia de dichos agentes en la muestra examinada o en las existencias piscícolas. Esto es
particularmente cierto en el caso de poblaciones libres o domesticadas de las que resulta difícil
tomar una muestra representativa y aleatoria. Sin embargo, el riesgo de que un patógeno escape al
sistema de vigilancia se reduce en las piscifactorías cuyas existencias se han inspeccionado y
comprobado para patógenos durante varios años (al menos 2), en la medida en que no se hayan
expuesto a una posible recontaminación por peces en vida libre.
Cuando un sitio determinado de producción de peces se dedica a la cría de salmónidos, para los
ensayos de Renibacterium salmoninarum y de algunos agentes de enfermedades víricas, es preferible
que una de las muestras que se hacen cada año se dedique al análisis de los productos sexuales
(esperma y fluido ovárico), que liberan los reproductores en el momento del desove (ver más
abajo). Si las poblaciones de peces adultos incluyen peces de diferentes edades, deben
seleccionarse para el muestreo los peces de mayor edad.
• Las muestras deben abarcar todas las especies del lugar que sean susceptibles (ver los capítulos
pertinentes de este Manual de animales acuáticos para la lista de especies susceptibles de cada
enfermedad), y en el grupo de muestras debe estar representado cada lote de una especie. Un
lote se define como un grupo de la misma especie que comparte un mismo suministro de agua
y que se origina de una misma descendencia o población reproductora.
El origen geográfico de las muestras debe definirse con el nombre del sitio de muestreo
asociado con sus coordenadas geográficas o con su localización respecto al curso de un río o
de un cuerpo de agua.
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo I.1. — Enfermedades de peces: Información general
•
Si en la población piscícola que se muestrea están presentes algunos peces moribundos, éstos
deben seleccionarse con preferencia para la colección de muestras, y el resto de la muestra
debe contener peces vivos seleccionados al azar de todas las unidades de cultivo que
representen el lote examinado.
• En el capítulo 1.1.4 de este Manual de animales acuáticos se presenta un enfoque general de la
inspección y el muestreo. El muestreo debe diseñarse de modo que haga posible la detección
de los animales infectados, con un nivel de confianza del 95%. La siguiente sección suministra
información pertinente sobre el muestreo de peces con aleta. El cuadro 1 puede emplearse
para calcular el tamaño de la muestra, hasta que se consideren los detalles específicos de cada
enfermedad en los capítulos dedicados a las enfermedades individuales en este Manual de
animales acuáticos.
• Como en el caso de los peces infectados clínicamente, deben tomarse muestras de órganos y
fluidos tan pronto como sea posible tras la recogida de las muestras de peces. Debe evitarse la
congelación de las muestras.
1.3. Especificaciones de muestreo según los objetivos de un programa determinado de
vigilancia para peces.
En el capítulo 1.1.4 de este Manual de animales acuáticos se presenta un enfoque general de la
vigilancia y muestreo. El muestreo debe diseñarse de modo que haga posible la detección de los
animales infectados, con un nivel de confianza del 95%. La siguiente sección suministra
información pertinente sobre el muestreo de peces con aletas. Para pruebas diagnósticas en que se
ha establecido la sensibilidad y la especificidad, se puede determinar el tamaño de la muestra
empleando métodos como el FreeCalc (www.ausvet.com.au) o programas similares, según se
indica en el capítulo 1.1.4 bajo el epígrafe “Requisitos de vigilancia para el reconocimiento
internacional de la ausencia de infección”. Sin embargo, para aquellas pruebas diagnósticas en las
que no se ha establecido la sensibilidad y la especificidad, el tamaño de la muestra debe
determinarse por defecto a partir del cuadro1 del presente capítulo.
Cuadro 1. Tamaño de muestra aleatoria en función de la supuesta prevalencia del patógeno en el lote, adjudicando a la
técnica un 100% de sensibilidad y especificidad.
Tamaño del lote
Tamaño de la muestra a
prevalencia del 2%
Tamaño de la muestra a
prevalencia del 5%
Tamaño de la muestra a
prevalencia del 10%
50
100
250
500
1000
1500
2000
4000
10.000
100.000 o más
50
75
110
130
140
140
145
145
145
150
35
45
50
55
55
55
60
60
60
60
20
23
25
26
27
27
27
27
27
30
Según Ossiander & Wedemeyer, 1973.
a) Determinación del estado sanitario de una reserva/población de peces en un sitio determinado de inspección
• Cada unidad de cultivo de peces debe inspeccionarse dos veces al año durante dos años en
la fase apropiada de la vida del pez, y a veces en la fase apropiada del año, cuando la
temperatura y la estación ofrecen la mayor oportunidad de observar signos clínicos y de
aislar los patógenos. En cada ocasión, se deben recoger los peces de las especies
susceptibles que aparecen en el Código Acuático para la enfermedad en cuestión, a fin de
detectar una prevalencia de infección igual o superior al 2% a un nivel de confianza del
95%. Con frecuencia, se toman 150 peces en cada ocasión. Si durante una de las dos
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo I.1. — Enfermedades de peces: Información general
inspecciones están presentes los reproductores, se tomarán hasta 150 muestras de fluidos
ováricos en dicha unidad de cultivo de peces.
• Si la vigilancia sanitaria de los peces se realiza en poblaciones de peces libres en un sitio
determinado de inspección, o en estanques de crianza sin instalaciones de retención, en las
que pueden juntarse diferentes cultivos de peces, se deben recoger 150 ejemplares de peces
una vez al año durante dos años. En la medida que sea posible, se deben recoger con
preferencia los peces de más edad y/o el fluido ovárico de los salmónidos.
• Durante este período de dos años, la unidad de producción pesquera solo puede recibir
peces de una unidad cuyo estado sanitario ya haya sido aprobado y sea igual o superior al
estado sanitario que se desea para la instalación que está siendo inspeccionada.
b) Mantenimiento del estado sanitario
• Las inspecciones deben continuar dos veces por año después de que una unidad de
producción pesquera, incluyendo unidades de producción en estanques equipados con
instalaciones de retención, haya sido reconocida como libre de todas o de alguna de las
enfermedades listadas en el Código Acuático tras 2 años de vigilancia, con pruebas de
laboratorio y con ausencia de cualquier síntoma clínico sospechoso. Un establecimiento de
acuicultura que se haya reconocido como libre de infección puede mantener su
reconocimiento oficial como libre de infección siempre que se mantengan continuamente
las condiciones básicas de bioseguridad.
Un establecimiento de acuicultura que se haya reconocido libre de infección puede
interrumpir la vigilancia dirigida y mantener su reconocimiento oficial como libre de
infección siempre que se mantengan continuamente las condiciones básicas de bioseguridad.
• La unidad de producción pesquera solo puede recibir peces cuyo estado sanitario sea igual
o superior al de los ya presentes.
Las especificaciones anteriores de muestreo para la determinación y mantenimiento
del estado sanitario de los peces en sitios concretos de producción pesquera presuponen
que están en vigor todas las precauciones detalladas en la sección A.2 (enfoque global
para el control sanitario animal en cultivos de peces).
2. MATERIAL DE MUESTRAS USADO EN PRUEBAS VÍRICAS Y BACTERIOLÓGICAS
El material de muestra depende del tamaño de los animales y del objeto de la prueba, es decir, varía
según se trate del diagnóstico de una enfermedad abierta o de la detección de peces que son portadores
subclínicos del patógeno.
2.1. Especificaciones según el tamaño del pez
Alevines y crías con saco vitelino: la muestra es el pez entero pero se elimina el saco vitelino si
está presente.
Peces de 4 a 6 cm: se toman todas las vísceras incluyendo el riñón. Se puede obtener un trozo
del encéfalo tras cortar la cabeza al nivel del borde posterior del opérculo y apretar lateralmente.
Peces de más de 6 cm: se toma el riñón, bazo y corazón o encéfalo.
Reproductores: se toma el fluido ovárico y/o tejidos.
2.2. Especificaciones según el estado clínico
En el caso de infección clínica, además de alevines enteros o vísceras completas, los órganos para
muestreo en pruebas de virus son el riñón anterior, el bazo y el corazón o el encéfalo; para
pruebas bacteriológicas, el riñón o el bazo; y cuando se muestrea para pruebas del síndrome
epizoótico ulcerativo, la piel o el músculo. Se toman muestras de diez peces muertos y se
combinan para formar grupos con un máximo de cinco peces cada uno.
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo I.1. — Enfermedades de peces: Información general
Para detectar portadores subclínicos, las muestras pueden combinarse en grupos de hasta cinco
peces por grupo. Los grupos de fluido ovárico de cinco peces reproductores no deben superar un
volumen total de 5 ml, es decir, 1 ml por reproductor. Estas muestras de fluido ovárico se toman
individualmente de cada hembra muestreada y no se recogen después de la puesta de huevos.
Una vez que se han extraído los órganos y/o el fluido ovárico de los peces muestreados
asépticamente, se dividen en dos partes si se va a realizar un examen bacteriológico y vírico.
3. TRATAMIENTO GENERAL DE MUESTRAS DE ÓRGANOS O FLUÍDOS PARA EXAMEN VÍRICO
3.1. Transporte y tratamiento de las muestras con antibióticos
Los grupos de órganos o de fluidos ováricos se colocan en viales estériles y se guardan a 4ºC hasta
que se realiza la extracción del virus en el laboratorio. La extracción de virus debe llevarse a cabo
preferentemente dentro de las 24 horas siguientes al muestreo de los peces, pero es aceptable
hasta las 48 horas.
Las muestras de órganos también pueden transportarse al laboratorio colocándolas en viales que
contengan un medio de cultivo para células o solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), con
antibióticos que se añaden para evitar el crecimiento de contaminantes bacterianos (un volumen
de órgano en al menos cinco volúmenes de líquido de transporte). Las concentraciones adecuadas
de antibióticos son: gentamicina (100 μg/ml) o penicilina (800 Unidades Internacionales [UI]/ml)
y estreptomicina (800 μg/ml). También pueden incorporarse al medio de transporte los
compuestos antifúngicos Mycostatin® o Fungizona® a una concentración final de 400 UI/ml.
Para estabilizar los virus, si el tiempo de transporte supera las 12 horas, se puede añadir suero o
albúmina (5-10%).
3.2. Extracción de virus
• Este procedimiento se realiza por debajo de 15ºC, y preferiblemente entre 0 y 5ºC.
• Se decanta el medio suplementado con antibióticos del órgano de la muestra.
• Se homogeneiza los grupos de órganos en medio de transporte a una dilución final de 1/10
utilizando un mortero con mano o un homogeneizador eléctrico hasta obtener una pasta.
• Se centrifuga el homogeneizado en una centrífuga refrigerada a 2-5ºC y 2.000-4.000 g durante
15 minutos, recoger el sobrenadante y tratarlo cuatro horas a 15ºC, o durante toda la noche a
4ºC, con antibióticos, por ejemplo, con gentamicina 1mg/ml. Si el envío de la muestra se ha
realizado en un medio de transporte (es decir, con exposición a antibióticos), puede omitirse el
tratamiento del sobrenadante con antibióticos. El tratamiento con antibiótico hace innecesario
el filtrar a través de filtros de membrana.
• De modo análogo, las muestras de fluido ovárico pueden tratarse con antibióticos para
controlar la contaminación microbiana. En ningún caso las muestras de homogeneizados o de
fluidos ováricos pueden diluirse más de dos veces.
• Las muestras de fluido ovárico deben centrifugarse del mismo modo que los homogeneizados
de órganos, y los sobrenadantes se emplean directamente para los pasos siguientes.
3.3. Tratamiento para neutralizar virus enzoóticos
En algunos países, con frecuencia los peces son portadores subclínicos de virus enzoóticos, como
el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), que puede inducir en cultivos celulares
susceptibles un efecto citopático (CPE) y, por tanto, complicar el aislamiento y la identificación de
patógenos concretos. En tales situaciones, la capacidad infecciosa de los virus enzoóticos debería
neutralizarse antes de realizar ensayos para los virus listados en el Código Acuático. Sin embargo,
cuando es importante determinar si está presente uno de los virus enzoóticos, las muestras deben
ensayarse con y sin la presencia de anticuerpos neutralizantes (NAbs).
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo I.1. — Enfermedades de peces: Información general
Para neutralizar los birnavirus acuáticos, se mezclan volúmenes iguales (200 μl) de una solución de
NAbs contra los serotipos del birnavirus endógeno y del sobrenadante de prueba. Se deja
reaccionar la mezcla durante 1 hora a 15ºC, o durante toda la noche a 4ºC, antes de la inoculación
a monocapas de células susceptibles. El título de la solución de NAb empleada (puede ser un
suero multivalente) debería ser de al menos 2000 en un ensayo de reducción de placas al 50%
contra los serotipos víricos presentes en el área geográfica dada.
Cuando se considera que las muestras de un país, de una región, de una población de peces o de
una unidad de producción están libres de infecciones víricas enzoóticas, puede omitirse este
tratamiento del homogeneizado de los órganos.
Este esquema también puede utilizarse para neutralizar otros virus enzoóticos del área que se está
analizando.
4. PROCESAMIENTO GENERAL DE MUESTRAS PARA EXAMEN BACTERIOLÓGICO
Como en el caso de las infecciones víricas, se pueden usar los órganos internos como fuente para el
aislamiento cuando se sospeche cualquier infección sistémica. Sin embargo, la proliferación activa de
microorganismos saprofitos supone una desventaja tan importante que para los exámenes
bacteriológicos se emplean tejidos frescos recién tomados. El hecho de que no se puedan añadir
sustancias antibióticas al medio de transporte en el que se recogen las muestras refuerza esta
preferencia.
C. MATERIALES Y PRODUCTOS BIOLÓGICOS NECESARIOS PARA EL
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE PATÓGENOS DE PECES
1. VIRUS DE PECES
1.1. Líneas celulares de peces
Las siguientes líneas celulares de peces son necesarias para ensayos de los patógenos de peces
mencionados en el Código Acuático:
Mojarra oreja azul (BF-2)
Salmón real (CHSE-214)
Epithelioma papulosum cyprini (EPC)
Trucha arco iris (RTG-2)
Carpita cabezona (FHM)
Ronco catire (GF)
Riñón cefálico de salmón (SHK1)
Riñón de salmón atlántico (ASK)
1.2. Medios de cultivo
El medio usado más ampliamente para el cultivo de células de peces es el tradicional medio
mínimo esencial de Eagle (MEM) con sales de Earle y suplementado con suero fetal bovino (FBS)
al 10%, antibióticos y 2mM de L-glutamina.
No obstante, el medio de Stocker, que es una forma modificada del medio anterior con doble
concentración de algunos aminoácidos y vitaminas, se recomienda particularmente para aumentar
el crecimiento celular, empleando los mismos suplementos que los arriba indicados más un 10%
de triptosa fosfato.
Estos medios se tamponan con bicarbonato sódico, con 0,16 M de tris-hidroximetil aminometano
(Tris) HCl o los cortes preferiblemente los cortes con 0,02 M de ácido N-2-hidroxietil-piperazinaN-2-etanosulfónico (HEPES). El uso de bicarbonato sódico se restringe solo a cultivos celulares
mantenidos en recipientes de cultivo celular muy bien cerrados.
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo I.1. — Enfermedades de peces: Información general
Alternativamente, para algunas líneas celulares como la SHK1, se puede usar el medio de
Leibovitz (L15) suplementado con FBS (al 5 o 10%), L-glutamina (4 mM) y gentamicina
(50 µg/ml).
Para el crecimiento celular, el contenido normal de FBS en el medio es del 10%, mientras que
para el aislamiento de virus o para la producción de virus el FBS puede reducirse hasta el 2%. De
modo similar, el pH del medio de cultivo para el crecimiento de las células es de 7,3-7,4 y se ajusta
a 7,6 para la producción de virus o para el ensayo de virus.
La composición de la mezcla de antibióticos utilizada con más frecuencia es penicilina
(100 IU/ml) y dihidroestreptomicina (100 µg/ml). Si se espera una contaminación por hongos
puede usarse Mycostatin (50 IU/ml). Se pueden emplear otros antibióticos y otras
concentraciones de antibióticos según la conveniencia del operador dependiendo de la
sensibilidad antibiótica de las cepas bacterianas encontradas.
1.3. Controles positivos para virus y preparación de antígeno
a) Nomenclatura de los virus
•
•
•
•
•
•
•
Virus de la necrosis hematopoyética epizoótica (EHNV)
Virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV)
Virus de la viremia primaveral de la carpa (SVCV)
Virus de la septicemia hemorrágica vírica (sinónimo, virus Egtved)
Virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV)
Iridovirus de la dorada japonesa del Mar Rojo (RSIV)
Virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV)
b) Poducción de virus
Para la producción de la mayoría de estos virus deben inocularse los cultivos celulares
susceptibles (ver las secciones correspondientes en este Manual de animales acuáticos) con
multiplicidades de infección (m.o.i.) más bien bajas, es decir, de 10-2 a 10-3 unidades
formadoras de placas (PFU) por célula.
Para la propagación de los virus, las temperaturas óptimas son:
•
•
•
•
15ºC para IHNV, VHSV, ISAV y IPNV
20ºC para SVCV
22ºC para EHNV
25ºC para RSIV
c) Conservación y depósito de los virus
• Centrifugar los cultivos celulares infectados a 2-5ºC y 2.000-4.000 g durante 15 minutos,
después diluir los sobrenadantes que contienen los virus hasta obtener títulos víricos de
alrededor de 1-2 × 106 PFU/ml.
• Distribuir las suspensiones víricas resultantes en viales estériles conteniendo 0,3-0,5 ml cada
uno.
• Congelar y almacenar cada serie de stock de virus estándar a –80ºC o en nitrógeno líquido,
y comprobar su título vírico a intervalos regulares si no se han empleado durante mucho
tiempo.
Liofilización: el almacenamiento de las muestras de siembra de las cepas de virus estándar a
largo plazo (décadas) se realiza por liofilización. Con este fin, antes del proceso, las
suspensiones víricas en el medio de cultivo celular suplementado con FCS al 10% se mezclan
(v/v) con un volumen igual de medio de crioconservación (como, por ejemplo, hidrolizado de
lactoalbúmina al 20% en agua destilada). Los liófilos se sellan o se taponan al vacío y se
guardan a 4ºC en la oscuridad.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo I.1. — Enfermedades de peces: Información general
2. BACTERIAS DE PECES
2.1. Medios de cultivo
Pocas especies de bacterias patógenas de peces requieren medios especiales de cultivo, y la
mayoría de las peptonas que se utilizan normalmente para aislamiento (tripsina-soja, cerebrocorazón, etc.) pueden emplearse adecuadamente. Sin embargo, las bajas temperaturas óptimas de
algunas especies causan un crecimiento lento, y durante el aislamiento se obtienen con frecuencia
colonias pequeñas. En estos casos, para mejorar el cultivo se suelen añadir factores de
enriquecimiento, como suero o sangre al 5-10%. Contrariamente, Renibacterium salmoninarum es un
organismo muy difícil de crecer y requiere medios especiales enriquecidos con cisteína (No.
A11B).
En el caso de los peces, la bacteriología se lleva a cabo a temperaturas entre 20 y 26ºC. Resulta a
veces útil o necesario tener acceso a diversas estufas. Renibacterium salmoninarum, Flavobacterium
psychrophilus y otras bacterias necesitan 15ºC para un crecimiento óptimo, y muchas de las bacterias
aisladas de peces de agua caliente pueden incubarse a 30ºC para acelerar las etapas del diagnóstico.
2.2. Almacenamiento de los cultivos
Las cepas bacterianas se pueden guardar a corto plazo en medios ordinarios, manteniendo los
tubos con agar inclinado o los cultivos líquidos a 4ºC. Para muchas cepas, el uso de medios
comerciales o de cultivo en agar inclinado, recubiertos con una capa de aceite mineral, extiende la
viabilidad a 1-2 años manteniendo las mismas condiciones sin especiales requisitos adicionales.
La congelación es probablemente el mejor modo de conservar las suspensiones bacterianas de
títulos elevados. Sin embargo, no siempre evita que cambien algunas características fenotípicas.
Cuando es importante la estabilidad de alguna característica, como la virulencia, puede ser mejor
emplear la liofilización, aunque el número de bacterias viables puede descender notablemente.
Se han propuesto diversas clases de aditivos para mejorar la eficacia de la congelación y de la
liofilización, en el primer caso principalmente glicerol (5-15%), y en el segundo leche desnatada,
lactosa o dextrano (5-10%). No hay una regla general, y las condiciones más convenientes tienen
que determinarse para todas las especies en ensayos previos. La adición a cultivos frescos de un
volumen de aditivo que contenga Bactopeptona al 11% + Dextrano al 4% ha proporcionado
excelentes resultados en la liofilización de algunas bacterias de peces, pero en muchos casos
merecen ensayarse otras fórmulas.
3. SEROLOGÍA
3.1. Producción de antisueros de conejo y de anticuerpos policlonales contra virus de peces
Hay varios modos de obtener anticuerpos de conejo contra virus de peces. No obstante, el título y
la especificidad están influenciados por el programa de inoculación utilizado. Los siguientes
protocolos de inmunización se pueden emplear para producir antisueros para uso en el
aislamiento de virus y/o en procedimientos de identificación que se describen más tarde.
a) Antisueros contra el virus de la necrosis pancreática infecciosa
Inyección intravenosa el día 0 con 50-100 μg de virus purificado, seguida de una inoculación
idéntica de recuerdo el día 21, y sangría 5-7 días más tarde. Los conejos pueden reutilizarse si
la sangría no es completa.
b) Antisueros contra otros virus
Los protocolos de inmunización alternan una inyección intramuscular o intradérmica con
posteriores dosis intravenosas de recuerdo:
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo I.1. — Enfermedades de peces: Información general
Día 0: inyección primaria, se mezcla (v/v) 500-1.000 μg de virus purificado con adyuvante
(adyuvante incompleto de Freund u otros1) hasta un volumen total de 1,2 ml. Este antígeno se
inocula en el conejo mediante inyecciones intradérmicas multipuntuales (20 puntos en cada
lado) después de que el animal haya sido afeitado.
Día 21: se recogen aproximadamente 20 ml de sangre y se prueba su reactividad
(neutralización, fluorescencia); se reinocula intravenosamente con la misma cantidad de virus
purificado que en la inyección primaria, pero sin adyuvante.
Antes de la inyección intravenosa de recuerdo, se debe tratar el conejo con promotazina
(12 mg, intramuscularmente) para evitar una posible respuesta anafiláctica.
Día 28: se toma una muestra de sangre, se comprueba la reactividad del suero y se sangra o se
vuelve a inocular según los resultados.
Este procedimiento de inmunización es muy adecuado, en el caso de los rabdovirus, para
producir antisueros que se utilicen en pruebas de inmunofluorescencia y en
enzimoinmunoensayos (ELISA). Sin embargo, un método más eficaz para la producción de
antisueros neutralizantes es la inyección regular intravenosa sin adyuvante (0,2 ml) cada 3–
4 días (dos veces a la semana). Pueden ser necesarias hasta 15 inyecciones; 1 semana después
de la última inyección, se debe recoger una muestra de suero y probarla.
3.2. Antisueros contra bacterias de peces
Todavía resulta difícil obtener de fuentes comerciales sueros antimicrobianos en grandes
cantidades, y a menudo será necesario preparar dichos antisueros. Los métodos generales son los
mismos que para los virus. Con frecuencia los antígenos bacterianos se usan como preparaciones
crudas de bacterias muertas por calor o por formalina (0,35% de formalina). La inoculación al
conejo en dosis crecientes puede ser intramuscular, cada semana, con adyuvante la primera vez, o
intravenosa en intervalos de 3–4 días y sin adyuvante. A menudo se requiere una inyección de
recuerdo después de 15 días.
Para producción de sueros anti-Renibacterium resulta muy eficaz un programa especial de
inoculaciones intradérmicas multipuntuales, y es también útil para otras bacterias de baja
antigenicidad en conejos.
El antígeno son bacterias muertas por calor (60ºC, 45 minutos) y se ajusta a 2 mg/ml. Los
costados de los animales se afeitan cuidadosamente, y se realizan inyecciones intradérmicas
multipuntuales utilizando cantidades totales de 1mg de bacteria por animal, de acuerdo con el
siguiente programa:
Día 1:
1 mg + adyuvante completo de Freund (CFA) (v/v)
Día 21:
1 mg + adyuvante incompleto de Freund (IFA) (v/v)
Día 42:
1 mg + IFA
Día 63:
1 mg de antígeno
Día 68:
Recolección de muestras de sangre (unos 30 ml)
Las inyecciones de recuerdo y las sangrías para recoger suero pueden repetirse a intervalos de
1 mes.
1
El uso de adyuvante completo de Freund puede estar restringido en base a consideraciones de protección animal. Los
adyuvantes alternativos sintéticos son trehalosa dimicolato y monofosfato del lípido A.
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Capítulo I.1. — Enfermedades de peces: Información general
3.3. Procesamiento y depósito de sueros inmunes
Después de la coagulación de la sangre, se recoge y centrifuga el suero a 20ºC y se calienta durante
30 minutos a 56ºC. El suero resultante tratado por calor se filtra a través de un filtro de
membrana (tamaño de poro 450 nm) y se guarda temporalmente a 4ºC durante el tiempo
necesario para el análisis de su reactividad y especificidad, y para probar que estas propiedades no
se afectan por las condiciones de conservación (por ejemplo, congelación o liofilización). Los
sueros estériles de conejo se pueden mantener al menos 2 meses a 4ºC sin ningún cambio en sus
propiedades. Se distribuye (normalmente en pequeños volúmenes) y se congela a –20ºC o se
liofiliza.
Las inmunoglobulinas (Ig) se pueden extraer de los antisueros por métodos convencionales
apropiados para la purificación de Ig. La unión selectiva a la proteína A constituye un método
fiable y eficaz. La concentración de las soluciones de Ig se ajusta a los valores requeridos para la
posterior preparación de conjugados o para el almacenamiento.
Conservación de Ig: Mezclar una solución de Ig de una concentración de 2 mg/litro con glicerol puro
estéril (v/v) y mantener a –20ºC. También se pueden preparar soluciones de Ig en glicerol con
una concentración más elevada.
3.4. Anticuerpos monoclonales de ratón contra virus y bacterias de peces
En los últimos años se han obtenido anticuerpos monoclonales (MAbs) contra la mayoría de los
virus de peces. Algunos de ellos, como MAbs solos o asociados en dos o tres, han originado
reactivos biológicos adecuados para la identificación de grupos víricos (IPN, VHS, IHN). Otros
MAbs, tomados individualmente o como componentes de combinaciones de Ab, permiten la
tipificación exacta de VHSV e IHNV. Estos MAbs se pueden obtener de los laboratorios de
referencia citados al final de este Manual de animales acuáticos.
También se ha descrito la producción de MAbs contra bacterias. Ello ha permitido el desarrollo
de kits comerciales de diagnóstico para Renibacterium salmoninarum, pero en la mayoría de los casos
la producción permanece limitada a laboratorios especializados.
Teóricamente, las IgGs monoclonales de ratón se pueden procesar y guardar como las IgGs
policlonales. Sin embargo, la reactividad de algunos MAbs puede alterarse por procesos
enzimáticos, de radiomarcaje o de liofilización. Por tanto, es necesario probar los distintos MAbs
en las condiciones en que van a ser empleados.
3.5. Uso de técnicas moleculares para pruebas y diagnósticos confirmativos
Se han desarrollado técnicas moleculares que incluyen sondas de ácido nucleico y la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para la identificación de muchos patógenos de animales acuáticos.
Sin embargo, como en el caso de otras técnicas de diagnóstico, las ventajas de sensibilidad se
contrarrestan frecuentemente por problemas técnicos de interpretación o susceptibilidad.
Mientras que los métodos basados en el cultivo directo o en la serología son relativamente fiables,
la PCR puede ser muy dependiente de las condiciones bajo las cuales se lleva a cabo y muy
susceptible a contaminaciones en el laboratorio por productos de PCR previas, originando falsos
resultados positivos. Por tanto, aunque en esta versión de este Manual de animales acuáticos se
incluyen como métodos de diagnóstico y confirmativos varios protocolos con sondas de ácido
nucleico y PCR, siempre que sea posible se especifican, como métodos estándar de análisis,
técnicas bien establecidas (por ejemplo, el aislamiento del virus). Cuando se empleen estas nuevas
técnicas moleculares, deben realizarse con cuidado y con especial atención a la inclusión de
controles positivos y negativos adecuados.
3.5.1. Preparación de muestras
En estas técnicas, las muestras deben prepararse para conservar el ADN del patógeno. De
modo similar, las muestras preparadas para pruebas basadas en métodos con anticuerpos
deben conservarse para que retengan los sitios antigénicos reactivos frente a los anticuerpos
usados.
82
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo I.1. — Enfermedades de peces: Información general
Las muestras seleccionadas para pruebas de diagnóstico basadas en ADN o en anticuerpos
deben manejarse y envasarse con el máximo cuidado para minimizar la potencial
contaminación cruzada entre las muestras o la degradación de las mismas antes de poder
realizar el ensayo. Para evitar la contaminación, deberían usarse recipientes nuevos (bolsas
de muestra o botellas de plástico). En cada envase o contenedor debe colocarse una
etiqueta resistente al agua rellenada con los datos apropiados para cada serie de muestras.
Algunos métodos adecuados para la conservación y el transporte de muestras tomadas para
pruebas moleculares, o basadas en anticuerpos, son los siguientes:
• Ejemplares vivos helados o refrigerados: en el caso de ejemplares que pueden ser
transportados rápidamente al laboratorio para ensayos a realizar en 24 horas, las
muestras se envasan en bolsas que se rodean de una adecuada cantidad de hielo húmedo
en una caja aislada y se envían al laboratorio.
• Ejemplares completos congelados: se seleccionan ejemplares vivos según el propósito del
muestreo, se congelan rápidamente en el campo usando hielo seco machacado, o se
congelan en el laboratorio de campo mediante un congelador mecánico a –20ºC o a
temperatura más baja. Se prepara e inserta la etiqueta en el contenedor con las muestras,
se empaquetan éstas con una cantidad adecuada de hielo seco en una caja aislada y se
envían al laboratorio.
• Muestras conservadas en alcohol: en regiones donde es problemático el almacenamiento y
envío de muestras congeladas, se puede usar etanol de 90-95% para conservar, guardar y
transportar algunos tipos de muestras. Se envasan para el transporte de acuerdo con los
métodos que se describen arriba.
• Tejidos fijados para la hibridación in-situ e inmuno-histoquímica: para esta finalidad son
adecuados los métodos clásicos de conservación de tejidos. Una buena elección para el
posterior uso de sondas moleculares es la solución de Davidson. Específicamente para
ADN, se debe evitar una sobre-fijación (más de 24-48 horas).
3.5.2. Conservación de ARN y ADN en tejidos usando RNAlater
El tejido se corta hasta que sea menor de 0,5 cm en una dimensión y se sumerge en
10 volúmenes de solución RNAlater (por ejemplo, una muestra de 0.5 gramos requiere
unos 5 ml de RNAlater). Los órganos pequeños, como el riñón, el hígado y el bazo se
pueden mantener enteros en RNAlater. Estas muestras se pueden guardar a 4ºC durante un
mes, a 25ºC durante una semana o a –20ºC indefinidamente. Los tejidos tratados con
RNAlater se mantienen a –20ºC.
3.5.3. Extracción de ADN
Para extraer el ADN, se homogeneizan a polvo los tejidos conservados. Se añaden
alrededor de 10 volúmenes de tampón de extracción (NaCl [100 mM], ácido
etilendiaminotetracético [EDTA, 25 mM], pH 8, dodecil sulfato sódico [SDS, 0,5%]) junto
con proteinasa K (100 µg/ml). Después de incubar durante toda la noche a 50ºC, se extrae
el ADN con fenol/cloroformo usando un protocolo estándar, y se precipita con etanol.
Teniendo en cuenta las limitaciones de tiempo y los riesgos para el personal de laboratorio,
los kits comerciales disponibles constituyen una alternativa técnica satisfactoria. El uso de
kits comerciales debería validarse mediante comparación con un protocolo estándar a base
de fenol/cloroformo antes de emplearlos de método rutinario en los laboratorios de
diagnóstico.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
83
Capítulo I.1. — Enfermedades de peces: Información general
3.5.4. Extracción de ARN
Para aislar ARN de tejidos conservados en RNAlater, se extrae simplemente el tejido de la
solución de RNAlater y se trata como si fuera un tejido fresco. La mayoría de los tejidos
puede homogeneizarse directamente en tampón de lisis o de extracción.
3.5.5. Preparación de cortes finos para hibridación in-situ
Para hibridación in-situ (ISH), los tejidos se fijan en solución fijadora de Davidson durante
aproximadamente 24 horas y después se incluyen en parafina según métodos estándar en
histología. Se realizan cortes de 5 µm de grosor y se colocan en portas tratados con
aminoalquilsilano, que se incuban después durante toda la noche en una estufa a 40ºC. Se
elimina la parafina de los cortes mediante inmersión en xileno durante 10 minutos. Este
paso se repite otra vez y luego se elimina el solvente por inmersión sucesiva en dos baños
de alcohol absoluto, durante 10 minutos cada vez. Después, los cortes se rehidratan por
inmersión en una serie de etanol. El protocolo puede exigir un paso de permeabilización de
membrana para facilitar el acceso al ADN diana. Con este fin, los cortes se tratan a 37ºC
durante 30 minutos con proteinasa K (100 µg/ml) en tampón TE (Tris [50 mM], EDTA
[10 mM]). En pruebas de ISH resulta esencial teñir tanto un corte conocido positivo como
un corte conocido negativo para eliminar resultados positivos falsos debidos a una tinción
inespecífica, y resultados negativos falsos por errores en el protocolo de tinción.
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