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CAPÍTULO 2.1.5
SEPTICEMIA HEMORRÁGICA VÍRICA
1. DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD
A efectos del presente capítulo, la septicemia hemorrágica vírica (SHV) es una enfermedad de la trucha
arco iris de piscifactoría (51, 60), del rodaballo de piscifactoría (47), falso halibut del Japón de
piscifactoría (17), así como de varias especies marinas silvestres (14, 32, 33, 56), causada por el virus de
la septicemia hemorrágica vírica (VHSV, sinónimo del virus Egtved), un virus perteneciente al género
Novirhabdovirus de la familia Rhabdoviridae (57).
En la trucha arco iris la fase aguda de la enfermedad se presenta durante las primeras etapas de la
infección (hasta 30 días después de la infección), período en el cual los peces enfermos presentan
síntomas clínicos claros: un comienzo rápido de la mortalidad (que puede alcanzar el 100% en los
alevines), letargo, oscurecimiento de la piel, exoftalmos, anemia (branquias pálidas), hemorragias en la
base de las aletas, de las branquias, de los ojos y de la piel, forma anormal de nadar, intermitente o en
espiral, abdomen hinchado debido a un edema en la cavidad peritoneal. Además, después de la fase
aguda, la enfermedad puede cursar en una forma subclínica crónica, durante la cual el pez afectado no
muestra signos externos. Debido al tropismo del virus por el cerebro, la SHV puede presentarse en
forma nerviosa, caracterizada por una forma de nadar gravemente anormal, intermitente o en espiral.
Los criterios para la confirmación del diagnóstico aparecen resumidos en la sección 5 de este capítulo.
2. INFORMACIÓN PARA EL DISEÑO DE PROGRAMAS DE VIGILANCIA
a)
Factores del agente
El agente etiológico de la SHV es un rhabdovirus (VHSV; virus Egved), perteneciente al género
Novirhabdovirus, de la familia Rhabdoviridae, que también incluye el virus de la necrosis
hematopoyética infecciosa (IHNV). Los viriones presentan forma de bala (aproximadamente
70 nm de diámetro y 180 nm de largo), contienen un genoma de ARN monocatenario de sentido
negativo (ca. 11.000 nucleótidos) y poseen una envoltura que contiene la glicoproteína de la
membrana, que es el principal antígeno neutralizante de superficie. El genoma codifica seis
proteínas (una nucleoproteína, N; una fosfoproteína, P; una proteína de la matriz, M; la
glicoproteína de envoltura, G; una proteína no viriónica, NV, y una polimerasa asociada al virus,
L).
La neutralización mediante anticuerpos policlonales y monoclonales sugiere un serotipo único
compuesto por tres subtipos de VHSV (43):
Subtipo I – incluye cepas F1 (Dinamarca) y Hededam
Subtipo II – incluye cepas 23/75, DK-5131 y DK-5276
Subtipo III – incluye cepas DK-5151 y DK-5422
Aparte de la variación antes mencionada, el VHSV parece compartir un epítopo neutralizante del
grupo SHV y varios epítopos no neutralizantes localizados en la glicoproteína vírica (proteína G)
y no es posible distinguir los aislamientos marinos de los aislamientos de agua dulce utilizando
pruebas rutinarias basadas en el uso de anticuerpos.
Es más, no parece existir correlación entre el seroagrupamiento y los genotipos identificados
mediante el análisis de secuencias de ácido nucleico y, con el crecimiento cada vez mayor del
espectro de hospedadores, es probable que el serotipado posea un impacto menor en el
conocimiento de la epidemiología de la SHV. Se han identificado 4 genotipos principales
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basándose en los análisis de secuencias del ácido nucleico (52), tal como aparece en el cuadro 1
(que se comenta más adelante).
Las diferencias genéticas parecen estar más estrechamente relacionadas con la localización
geográfica que con el año del aislamiento de las especies hospedadoras (52). Aun no se han
definido las características genéticas de los aislamientos de VHSV muy patógenos para la trucha
arco iris. En las pruebas de infección por inmersión realizadas con la trucha arco iris se ha
observado que todos los aislamientos de peces marinos silvestres que se han examinado originan
una mortalidad baja o nula. (7, 12, 34, 36, 49, 53). Se ha descrito una mortalidad significativa en el
rodaballo de piscifactoría (47) y los asilamientos de especies de peces marinas europeas son
patógenos para el rodaballo. (21) y el bacalao del atlántico (53). Mientras que el falso halibut del
Japón es muy susceptible a los aislamientos de VHSV japoneses, se ha observado que la trucha
arco iris no es susceptible a la enfermedad cuando se inocula experimentalmente con uno de los
dos aislamientos japoneses de VHSV (18). Se ha observado mortalidad por infección natural en
las especies marinas silvestres a lo largo de la costa del Pacífico en Norteamérica (14, 32). Además
se ha observado que los aislamientos del arenque del pacífico son patógenos para esta especie en
condiciones experimentales (23).
La evidencia indica que la supervivencia del VHSV fuera del hospedador depende de la cepa vírica
y de las condiciones fisicoquímicas del medio acuoso (45). Las cepas marinas de Norteamérica
parecen ser más sensibles a los ciclos de congelación-descongelación que las cepas europeas de
agua dulce (24). La adición de una fuente de proteína (por ejemplo fluidos o suero ováricos)
proporciona un efecto protector que prolonga la supervivencia. Cuando un aislamiento marino
procedente de trucha arco iris, cultivado en su propio medio, se diluye en agua salada y se
mantiene a 4ºC con suero al 1%, permanece infeccioso durante más de 10 meses (16).
Independientemente de la cepa vírica, la supervivencia depende de la temperatura, mostrando una
correlación inversa; el virus sobrevive durante períodos mas largos a 4ºC que a 20ºC (45). Las
temperaturas por encima de los 20º son muy peligrosas.
Con respecto a la inactivación del agente, el VHSV es muy sensible a la radiación por UVC
(longitud de onda de 280–200 nm), mostrando una reducción de 3-log en la infectividad en agua
dulce a 7,9 ± 1,5Jm–2). El uso de UVC en la inactivación del VHSV puede ser útil para el
tratamiento del agua entrante en las piscifactorías, pero no sería efectivo por la interferencia del
tratamiento de la materia orgánica en suspensión que hay en el agua saliente (44).
Por lo que respecta a la desinfección, el VHSV es sensible a muchos de los desinfectantes
comúnmente utilizados (50, 60). La actividad virucida de algunos de estos agentes se reduce si se
diluyen en agua marina en comparación con la solución salina tamponada con fosfato (25).
b)
Factores relacionados con el hospedador
El número de especies de hospedadores susceptibles al VHSH es cada vez mayor e incluye a la
trucha arco iris y a otras especies de trucha, el salmón del Atlántico, varias especies de peces que
habitan en las corrientes de agua dulce, ríos y lagos, así como varias especies de peces marinos
silvestres y de piscifactoría. Cada vez es mayor el número de especies marinas silvestres de las que
se ha aislado el VSHV, lo que ha llevado a algunos a concluir que el VHSV es endémico en
especies de peces marinos o anádromos. Recientemente se ha revisado la gama de peces de los
que se han obtenido aislamientos de VHSV y de peces de los que se ha demostrado
experimentalmente que son susceptibles de hospedar el VHSV (48), pero aquí no ofreceremos un
listado de los mismos.
Los reservorios de VHSV son peces infectados clínicamente así como portadores asintomáticos
entre los peces de cultivo o silvestres. El virus virulento se elimina en primer término en la orina,
siendo los riñones, el bazo, el encéfalo y el corazón, los lugares en los que más abunda el virus.
Los supervivientes de epizootias se transforman en portadores del virus durante toda la vida. El
descubrimiento de que una amplia gama de especies de peces silvestres, tanto de agua dulce como
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marina, pueden portar el virus, proporciona una evidencia clara de que las poblaciones víricas
pueden mantenerse en el medio silvestre y actuar como fuente de infección para los peces de
piscifactoría. A la inversa, los peces silvestres no infectados son susceptibles a la infección por el
virus procedente de los peces de piscifactoría (9, 20). De este modo la transferencia bidireccional
del virus entre las poblaciones de peces de piscifactoría y las de peces silvestres, desempeña un
papel importante en el mantenimiento de las poblaciones víricas (30).
Son varios los factores que influyen en la susceptibilidad a la SHV. Existe una variación individual
en lo relativo a la susceptibilidad de cada una de las especie de peces, y la edad del pez parece
tener cierta importancia – cuanto más joven sea el pez mayor es la susceptibilidad -, lo que
probablemente es debido al envejecimiento del sistema inmune innato y/o al desarrollo de al
menos cierta inmunidad en los peces mayores después de una exposición previa. Sin embargo en
el caso de peces muy susceptibles, la infección es patente en animales de todos los tamaños.
c)
Patrón de la enfermedad
El conocimiento del mecanismo de la transmisión del virus se debe principalmente a los estudios
europeos sobre aislamientos de VHSV de agua dulce en los que se ha observado que la
transmisión es horizontal a través del contacto con otros peces infectados, agua contaminada,
fomites, etc. El virus se elimina sobre todo por la orina (39) y los fluidos reproductores, y también
puede transmitirse mediante la intervención de los pájaros piscívoros (46). La transmisión se
produce a una temperatura de entre 1 y 12ºC, y el tiempo de incubación es de 1 a 2 semanas a
12ºC y de 3 a 4 semanas a 1ºC.
Durante e inmediatamente después de la declaración de la epizootia (que puede provocar una
mortalidad masiva), el virus puede aislarse de inmediato en cultivo celular en poblaciones
silvestres o de piscifactoría en entornos de agua dulce (31) o agua marina (14, 17). El riñón y el
bazo proporcionan los títulos víricos más elevados. La detección del VHSV es más problemática
en peces portadores clínicamente sanos (30). Mientras que el VHSV es capaz de crecer en una
amplia gama de líneas celulares de pez, la línea celular BF2 parece ser muy susceptible a la
infección por cepas europeas de agua dulce (42). Sin embargo, la susceptibilidad de una línea
celular a la infección depende de una serie de parámetros que incluyen el linaje de la línea y las
diferencias entre cepas víricas (14, 17).
Se ha establecido el estatus de portadores de VHSV para las especies de peces de agua dulce (9,
20). El estatus virológico de tales portadores depende de varios parámetros, como el intervalo de
tiempo transcurrido desde la exposición inicial y la proximidad geográfica a las salidas de las
piscifactorías. Se ha establecido que la prevalencia de los portadores, basada en la detección de
anticuerpos contra VHSV, se sitúa en un rango del 6-67% (10, 32). Más recientemente y a partir
del descubrimiento de las cepas de VHSV en especies marinas, se han realizado varios estudios
con un amplio muestreo que abarca especies de peces de las aguas costeras de la Europa
continental (3), el Reino Unido (22), Norteamérica (14, 36) y Japón (55). En estos estudios se
analizaron muestras para detectar la presencia del virus mediante inoculación en líneas celulares de
peces. En algunos estudios, se mezclaron distintas muestras de peces, con lo que la determinación
de la prevalencia precisa se hace difícil. Sin embargo, basándose en el aislamiento vírico en cultivo
celular e independientemente de la especie de pez examinada, la prevalencia del VHSV en las
especies de peces marinos incluidas en el muestreo de esos estudios se situó en un rango del 0,02–
4,7%.
Hasta finales de los años ochenta, se creía que el VHSV se restringía a la trucha arco iris de
producción intensiva en Europa continental, dándose algún aislamiento ocasional a partir de un
número restringido de otras especies de agua dulce (e. g. la trucha común, el lucio [19, 29]),
mientras que Gran Bretaña, Irlanda del Norte e Irlanda estarían libres de SHV. A finales de los
años ochenta, con la detección y aislamiento de VHSV a partir del salmón del Pacífico cerca de la
costa norteamericana del Pacífico (4, 15, 58) se demostró, en estudios realizados con
posterioridad, que el VHSV se encuentra en numerosas especies de peces silvestres y de
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piscifactoría a lo largo de las costas norteamericanas del Atlántico y del Pacífico (8, 14, 32, 33, 56),
en los mares que bordean el Reino Unido (7, 22, 51), el mar Báltico, en Skagerrak y Kattegat (36)
y en las aguas que rodean Japón (55).
En un estudio reciente (52) se ha demostrado que existen cuatro genotipos principales de VHSV
que correlacionan con su distribución geográfica (cuadro 1). La certeza en la diferenciación de
estos cuatro genotipos será importante para la lucha contra la enfermedad en el futuro.
Cuadro 1. Genotipos del virus de la septicemia hemorrágica vírica
Genotipo
Ia
Ib
II
III
IV
Distribución
Principalmente aislamientos de trucha arco iris en Europa continental
Principalmente aislamientos de hospedadores marinos en el Mar Báltico, Skagerrak y
Kattegat, relacionados con los de Ia
Aislamientos de hospedadores marinos en el Mar Báltico, distintos a los de Ib, sin una
relación sólida con los de Ia
Principalmente aislamientos procedentes de los alrededores de las Islas Británicas
Aislamientos del Pacífico Noroeste (Norteamérica) y Japón
La temperatura del agua es un factor ecológico importante. Generalmente, la enfermedad se
presenta a temperaturas que van de los 4ºC a los 14ºC. Las temperaturas superiores a 15ºC
inhiben el crecimiento del virus (6). A temperaturas más altas, rara vez se produce la enfermedad
(60). Las temperaturas bajas (1-15ºC) propician, por lo general, una expansión del curso de la
enfermedad, con mortalidad diaria baja pero con mortalidad acumulada elevada. La SHV aparece
en todas las estaciones, aunque es más frecuente en primavera cuando las temperaturas de las
aguas suben o fluctúan. En las revisiones de Wolf (60) y Smail (50) se ofrecen descripciones
detalladas de esas condiciones.
Al igual que ocurre con otras enfermedades víricas de los peces, existen otros factores que
predisponen a la enfermedad, como son el estrés y la edad de los peces. El VHSV puede
permanecer encubierto y la enfermedad puede precipitarse después de un caso de estrés (16). La
gravedad de la enfermedad es inversamente proporcional a la edad del pez; los peces jóvenes (por
ejemplo, alevines de trucha arco iris) son más susceptibles a la enfermedad y a la mortalidad a ella
asociada que los peces mayores (por ejemplo, los salmoncillos y los peces cultivados).
d)
Control y prevención
En ausencia de agentes antivíricos, los métodos de control de la SHV normalmente dependen de
los programas oficiales de seguimiento sanitario y de las medidas políticas que se adopten.
Previamente se han revisado ejemplos de prácticas que han tenido éxito en la reducción del
número de piscifactorías infectadas en un área endémica y han prevenido la re-infección, tales
como los procedimientos de vaciado sanitario y descanso de la explotación (40). Los métodos
para reducir el impacto de la enfermedad se basan en la prevención del contacto entre los virus y
las especies hospedadoras (desinfección de la estufa, utilización de existencias libres del patógeno
específico –SPF-, utilización de agua de manantial o agua de pozo), así como de la reducción de
los estresantes fisiológicos.
Aunque los mecanismos de inmunidad en los peces no se comprenden plenamente (28), se ha
demostrado fehacientemente la resistencia inmune al VHSV debida a una exposición previa del
pez al virus (60). Sin embargo, aunque la investigación sobre el desarrollo de vacunas contra la
SHV se ha venido realizando a lo largo de tres décadas o más, aún no está disponible
comercialmente una vacuna.
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3.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
a)
Métodos de diagnóstico de campo
•
Síntomas clínicos
Aunque no hay síntomas clínicos específicos de la SHV los peces enfermos muestran los signos
típicos de la infección sistémica, que variarán dependiendo de la gravedad y el estado de la
infección.
Fase aguda: rápida aparición de mortalidad, letargo, oscurecimiento de la piel, exoftalmos, anemia
(palidez de las branquias) hemorragias en la base de las aletas, branquias, ojos y piel, natación
anormal, intermitente o en espiral, o hinchazón del abdomen debido a un edema en la cavidad
peritoneal.
Fase crónica: no hay signos externos claros.
Forma nerviosa: debido al tropismo de los virus para el cerebro, la forma nerviosa se caracteriza
por una natación muy anormal, intermitente o en espiral.
Infecciones latentes: no hay signos externos.
b)
c)
Métodos clínicos
•
Lesiones macroscópicas: el riñón y el hígado se ven notablemente afectados. En la fase aguda el
riñón se torna de color rojo oscuro pero puede mostrar signos de necrosis grave en los peces
moribundos. El hígado está pálido y moteado. Puede haber petequias generalizadas en la piel,
el tejido muscular y los órganos internos. El tracto gastrointestinal está totalmente vacío de
comida.
•
Lesiones microscópicas: el riñón, el hígado y el bazo muestran necrosis focal extensiva y
degeneración - vacuolas citoplásmicas, picnosis, cariólisis e invasión linfocitaria. Mientras los
músculos esqueléticos no parecen estar infectados, los eritrocitos se pueden acumular en el
manojo de músculos y fibras del esqueleto sin causar daño al músculo propiamente dicho (50).
•
Microscopía/citopatología electrónica: el VHSV es un rabdovirus con forma de bala de 69–75 nm,
de diámetro y entre 180-240 nm de longitud. Los aspectos ultraestructurales del desarrollo de
la infección viral en el cultivo celular han sido descritos previamente (2).
Métodos de detección e identificación del agente
Los métodos estándar de vigilancia (detección del pez portador) de la SHV se basan en métodos
directos, i.e. el aislamiento del VHSV en cultivo celular seguido de la identificación mediante el
uso de los métodos basados en los anticuerpos (prueba de inmunofluorescencia indirecta (FAT),
enzimoinmunoensayo (ELISA) o los métodos basados en el ácido nucleico (ej. reacción en cadena
de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)). Debido a la baja sensibilidad, la
demostración inmunológica directa del antígeno de VHSV por la prueba de unión a anticuerpo en
tejidos de peces infectados sólo puede utilizarse cuando se sospecha la existencia de infección por
SHV (basándose en los síntomas clínicos, los datos epidemiológicos y la histopatología). Se está
desarrollando una tecnología basada en la PCR utilizando la detección directa de las secuencias
nucleotídicas del VHSV específico en el tejido de los peces (5, 13). La técnica puede utilizarse
como confirmación de una infección patente en los peces, pero no ha sido aún validada para
usarla en los programas de vigilancia directa para obtener la confirmación de un estado libre de
SHV.
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• Métodos directos de detección
i) Métodos microscópicos
El riñón y el hígado son las principales dianas, y el examen de cortes histológicos de los
peces enfermos revelan la degeneración y necrosis de los tejidos hematopoyéticos del riñón
(y del bazo), degeneración focal y necrosis del hígado. En cortes de los músculos
esqueléticos se pueden observar muchos focos de células sanguíneas rojas, mientras que las
fibras de los músculos permanecen sin daño.
ii) Aislamiento e identificación del agente
•
Cultivo celular
Está muy documentado el aislamiento del virus de SHV en los cultivos de un número
de líneas celulares de peces establecidas (27, 42). Mientras la inoculación de las líneas
celulares de peces con tejidos de peces procesados para el aislamiento del virus está
considerada como método de referencia de los programas de vigilancia (para detectar el
pez portador) con respecto a la sensibilidad, se desconoce la sensibilidad exacta del
procedimiento. El material del pez infectado, apropiado para el examen virológico,
depende del tamaño del pez. Se pueden utilizar como muestras un alevín completo
(longitud del cuerpo <4 cm), las vísceras, incluyendo el riñón (4 cm < longitud del
cuerpo < 6 cm), o, con un pez de mayor tamaño, el riñón, el bazo, el corazón, el
encéfalo y el fluido ovárico de los reproductores en el momento del desove.
Se recomiendan las líneas celulares de los peces BF-2 (obtenida de alevín del pez sol o
mojarra) y RTG-2 (obtenida de gónadas de la trucha arco iris). Como alternativa,
pueden utilizarse las células EPC (obtenidas de células de carpa) o FHM (obtenida de
pez forrajero de cabeza grande), pero, en general, son menos susceptibles que la BF-2 y
la RTG-2 (27, 42).
Tras la detección del virus por la aparición de efecto citopático vírico (ECP) en cultivos
celulares, se le identifica mediante pruebas basadas en anticuerpos o pruebas basadas en
el ácido nucleico. Cualquier prueba basada en anticuerpos requerirá el uso de
anticuerpos validados en cuanto a su sensibilidad y especificidad (1). Debido a la
proliferación de aislamientos víricos de SHV obtenidos de especies de peces marinos,
existe el riesgo potencial de que con algunos preparados de anticuerpos no se detecten
todos los aislamientos.
a) Aislamiento de virus
Se utilizan los procedimientos descritos en el capítulo I.1 (sección B.3.2).
b) Aislamiento de monocapas celulares
i)
Antes de inocular las células, se mezcla el sobrenadante con un volumen igual
de un conjunto bien diluido de antisueros contra serotipos originales del virus
de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), y se incuba durante por lo menos
una hora a 15ºC o durante 12-18 horas a 4ºC. El título del antisuero debe ser de
al menos 1/2.000 en una prueba de neutralización por reducción en placa al
50%.
ii)
El tratamiento de los inóculos con antisuero contra IPNV (un virus que en
algunas partes del mundo aparece en el 50% de las muestras de peces) tiene por
objeto evitar que se desarrolle el efecto citopático (ECP) causado por el IPNV
en cultivos celulares inoculados. Eso reducirá la duración del examen virológico
así como el número de casos en los que la aparición de CPE debe considerarse
como indicio potencial de SHV.
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iii) Cuando las muestras provengan de unidades de producción a las que se
considera libres de IPNV, se puede omitir el tratamiento de los inóculos con
antisuero frente a IPNV.
iv) Se transfiere el sobrenadante del homogeneizado de órganos a monocapas
producidas 24 horas antes y cubiertas con medio de cultivo celular que
contenga suero de ternera fetal (FCS) al 2-10% y un tampón adecuado (v.g. Tris
o HEPES [ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfónico) en dilución
doble, es decir, la dilución primaria y, adicionalmente, otra dilución 1/10 a
partir de la primera, que dé como resultado una dilución final de material tisular
en un medio de cultivo celular de 1/100 y 1/1000, respectivamente (a fin de
prevenir la interferencia homóloga). La proporción entre el tamaño del inóculo
y el volumen del medio de cultivo celular debe ser de 1:10.
v)
Se deberá usar un mínimo de 2 cm2 de zona celular, correspondiente a un
pocillo de los 24 que hay en una bandeja de cultivo celular. Se recomienda la
utilización de bandejas de cultivo celular, pero en su lugar también se pueden
utilizar unidades de zona de crecimiento similares o mayores.
c) Observación de la incubación
i)
Se ha de seguir el curso de la infección mediante controles positivos y otros
cultivos celulares inoculados, haciendo exámenes microscópicos diarios a
40−100 aumentos durante 7 días. Se recomienda la utilización del microscopio
de contraste de fases. Si no se incluyen controles positivos o si se sospecha que
ha disminuido la susceptibilidad celular, se llevará a cabo la titulación de
existencias de VHSV al menos una vez cada 6 meses para verificar la
susceptibilidad de los cultivos celulares a la infección.
ii)
Los cultivos celulares inoculados se incubarán a 15ºC durante 7-10 días y se
someterán a una inspección regular (al menos tres veces por semana) para
observar la aparición de ECP a 40-100 aumentos.
iii) Es importante mantener el pH del medio de cultivo celular entre 7,3 y 7,6
durante la incubación. Eso se consigue añadiendo tampón bicarbonato estéril
(para frascos con cultivo celular que están herméticamente cerrados o placas en
una atmósfera de 5% CO2/95% de aire) o una solución tamponada con 2 M de
Tris (para placas de cultivo de células) al medio de cultivo celular o,
preferiblemente, usando un medio HEPES tamponado
iv) Si aparece ECP en los cultivos celulares inoculados con diluciones del
homogeneizado, se debe proceder de inmediato a la aplicación de
procedimientos de identificación (véase más adelante la identificación del virus).
v)
Si no se desarrolla ECP tras 7-10 días de la incubación primaria, se realizará un
subcultivo de cultivos de células frescas utilizando una zona de células similar a
la del cultivo primario.
d) Procedimientos de subcultivo
i)
A los 7–10 días de la inoculación se agrupan, según su línea celular, alícuotas del
medio (sobrenadante) procedente de todos los cultivos/pocillos que conforman
el cultivo primario.
ii)
Luego se inoculan las mezclas en cultivos celulares homólogos no diluidos y
diluidos al 1/10 (obteniendo como resultado diluciones finales del
sobrenadante de 1/10 y 1/100, respectivamente), tal como se ha descrito
anteriormente.
iii) La inoculación puede ir precedida de una pre-incubación de las diluciones con
antisueros IPN en dilución apropiada, tal como se describió en el capítulo I.1,
sección B.1.
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Capítulo 2.1.5. — Septicemia hemorrágica vírica
iv) Como alternativa a lo anterior, se inoculan alícuotas del 10% del medio
procedente del cultivo primario directamente en un pocillo que contenga
cultivo celular fresco (subcultivo pocillo a pocillo).
v)
Se incuban y observan durante 7 días los cultivos inoculados, tal como se ha
indicado para la inoculación de cultivos primarios.
vi) Si no se produce ECP, la prueba se considerará negativa.
•
Identificación del virus
a) Prueba de neutralización
i)
Se recoge el medio de cultivo de las monocapas celulares que muestren ECP y
se centrifugan a 2.000 g durante 15 minutos a 4°C, o se filtran con una
membrana que tenga poros de 45-µm para separar los restos celulares.
ii)
Se diluye el medio que contiene el virus en cantidades que van de 10–2 a 10–4.
iii) Se mezclan alícuotas (de, por ejemplo, 200 µl) de cada dilución con volúmenes
iguales de una solución de anticuerpos anti-VHSV, y, de forma similar, se tratan
las alícuotas de cada dilución de virus con medio de cultivo celular (la solución
de anticuerpos neutralizantes [NAb] deberá tener un título de reducción del
50% de las placas de al menos 2.000).
iv) Paralelamente, se pueden utilizar otras pruebas de neutralización contra:
• una cepa de virus homólogo (prueba de neutralización positiva)
• una cepa de virus heterólogo (prueba de neutralización negativa).
v)
Si es preciso, se puede realizar una prueba de neutralización similar utilizando
anticuerpos contra IPNV.
vi) Se incuban todas las mezclas a 15°C durante 1 hora.
vii) Se transfieren las alícuotas de cada una de esas mezclas a monocapas de
24 horas cubiertas con medio de cultivo celular que contenga 10% de FCS (se
inoculan dos pocillos por dilución) y se incuban a 15ºC; para ello son
suficientes placas de cultivo celular de 24 o de 12 pocillos junto con 50 µl de
inóculo.
viii) Se observan los cultivos celulares para observar la aparición de ECP y se leen
los resultados tan pronto como aquél ocurra en controles no neutralizados
(protegiendo las monocapas celulares en controles de neutralización positiva).
Se registran los resultados ya sea después de un simple examen microscópico
(preferiblemente, de contraste de fases) o después de desechar el medio de
cultivo celular y teñir las monocapas de células con una solución de cristal
violeta al 1% en etanol al 20%.
ix) El virus ensayado se podrá identificar como VHSV cuando se evite o se retrase
notablemente la aparición de ECP en los cultivos celulares que han recibido la
suspensión de virus tratada con anticuerpos específicos anti-VHSV, mientras
que el ECP será evidente en todos los demás cultivos celulares.
x)
En ausencia de cualquier neutralización por Nab contra VHSV, es obligatoria la
realización de una prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI), una prueba
de inmunoperoxidasa, un enzimoinmunoensayo (ELISA) o RT-PCR, utilizando
la muestra sospechosa. Se han observado casos de deriva antigénica en el
antígeno de superficie, que hace que resulte fallida la prueba de neutralización
con NAb anti-VHSV.
Como alternativa, se pueden realizar otras pruebas de eficacia probada.
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b) Prueba de inmunofluorescencia indirecta
i)
Se preparan monocapas de células en pocillos de 2 cm2 en placas de plástico
para cultivo celular o en cubres, con el fin de conseguir un 80% de confluencia,
lo que se logra normalmente dentro de las 24 horas siguientes a la incubación a
22ºC (se siembran seis monocapas celulares por cada aislamiento del virus que
se quiere identificar, más dos monocapas para un control positivo y otras dos
para un control negativo). Se puede reducir al 2-4% el contenido de FCS en el
medio de cultivo celular. Se recomienda encarecidamente la utilización de
placas de Terasaki cuando se trata de identificar muchos aislamientos de virus.
ii)
Cuando las monocapas celulares estén preparadas para la infección, es decir, el
mismo día o al día siguiente de la siembra, se inoculan las suspensiones del
virus objeto de identificación realizando la dilución decimal por partes,
directamente en los pocillos o en los frascos con cultivo celular.
iii) Se diluye de forma similar la suspensión de VHSV control, para obtener un
título de virus de aproximadamente 5000–10.000 unidades formadoras de
placas (PFU) en el medio de cultivo celular.
iv) Se incuba a 15°C durante 24 horas.
v)
Se separa el medio de cultivo celular se aclara una vez con solución salina
tamponada con fosfato (PBS) 0,01 M, pH 7,2, luego se aclara brevemente otras
tres veces con una mezcla fría de 30% de acetona/70% de etanol (v/v)
(conservada a –20ºC).
vi) Dejar que se realice la fijación durante 15 minutos. Bastará con 0,5 ml para
2 cm2 de monocapa celular.
vii) Se deja que las monocapas celulares se sequen al aire durante por lo menos
30 minutos y se procesa de inmediato o se congela a –20°C.
viii) Se prepara una solución purificada de anticuerpos o suero anti-VHSV en
0,01 M de PBS, pH 7,2, que contenga 0,05% de Tween-80 (PBST) a la dilución
adecuada (que se habrá determinado previamente o que habrá comunicado el
suministrador del reactivo).
ix) Se rehidratan las monocapas celulares secas mediante cuatro lavados con
solución PBST, y se retira ese tampón tras el ultimo lavado.
x)
Se tratan las monocapas celulares con una solución de anticuerpos durante
1 hora a 37ºC en una cámara oscura, procurando que no se produzca
evaporación, v.g., colocando un trozo de algodón empapado en la cámara
húmeda. El volumen de la solución a utilizar es de 0,25 ml por cada 2 cm2 de
pocillo.
xi) Se aclara cuatro veces con PBST, como se hizo anteriormente.
xii) Durante una hora, se tratan las monocapas celulares a 37ºC con una solución de
isotiocianato de fluoresceína (FITC), o anticuerpo conjugado con tetrametilrodamina-5-(y -6-) isotiocianato (TRITC) contra la inmunoglobulina usada en la
primera monocapa y preparada según las instrucciones del suministrador. Con
frecuencia, estos anticuerpos conjugados son de cabra o conejo.
xiii) Aclarar cuatro veces con PBST.
xiv) Se examinan de inmediato en placas de plástico las monocapas celulares
tratadas, o se montan los cubres utilizando, por ejemplo, solución salina de
glicerol, pH 8,5 antes de observarlas al microscopio.
xv) Se examinan con luz ultravioleta utilizando un microscopio con lente ocular de
×10, y lente objetivo de 20–40 aumentos y abertura numérica de >0,65 y >1,3
162
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.5. — Septicemia hemorrágica vírica
respectivamente. Antes de cualquier otra observación, los controles positivos y
negativos deberán ofrecer los resultados esperados.
Como alternativa, se pueden utilizar otras IFI o técnicas immunocitoquímicas
(fosfatasa alcalina o peroxidasa) de eficacia probada.
c) Enzimoinmunoensayo
i)
Se recubren los pocillos de las placas de microtitulación a utilizar en el ELISA
con diluciones adecuadas de inmunoglobulina (Ig) purificada o de suero
especifico anti-VHSV en 0,01 M de PBS, pH 7,2, (200 µl/pocillo).
ii)
Se incuba toda la noche a 4ºC.
iii) Se aclara cuatro veces con 0,01 M de PBS que contenga 0,05% de Tween-20
(PBST).
iv) Se bloquea con leche desnatada (un 5% en PBST) u otra solución bloqueadora
durante 1 hora a 37°C (200 µl/pocillo).
v)
Se aclara cuatro veces con PBST.
vi) Se añade un 2% de Tritón X-100 a la suspensión del virus que hay que
identificar.
vii) Se distribuyen en pocillos (100 µl/pocillo) diluciones en dos o tres fases del
virus que se va a identificar, el virus VHSV control y el control negativo (e. g. el
virus de la necrosis hematopoyética); se deja que reaccione con el anticuerpo
anti-VHSV durante 1 hora a 20ºC.
viii) Se aclara cuatro veces con BST.
ix) Se añade a los pocillos bien un antisuero anti-VHSV policlonado y marcado
con biotina o un MAb contra proteína N específico para un dominio diferente
al del Mab de recubrimiento y conjugado previamente con biotina.
x)
Se incuba durante 1 hora a 37°C.
xi) Se aclara cuatro veces con PBST.
xii) Se añade peroxidasa de rábano conjugada con estreptavidina a los pocillos que
contienen el anticuerpo conjugado con biotina y se incuba 1 hora a 20°C.
xiii) Se aclara cuatro veces con PBST. Se añade el substrato y el cromógeno. Se
detiene la prueba en cuanto reaccionen los controles positivos y se leen los
resultados.
xiv) La interpretación de los resultados debe ser acorde con las absorbancias ópticas
obtenidas mediante los controles positivo y negativo, y se debe ajustar a las
directrices de cada prueba; por ejemplo, la absorbancia a 450 nm del control
positivo debe ser como mínimo de 5–10 × A450 del control negativo. Las
absorbancias superiores a 3 × A450 de los controles negativos se consideran
positivas. Como alternativa se pueden utilizar dos desviaciones estándar por
encima de la media de los tejidos control usados.
Se ofrece como ejemplo la forma del ELISA basado en biotina-avidina, referido más
arriba.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
163
Capítulo 2.1.5. — Septicemia hemorrágica vírica
d) Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
A fin de evitar contaminación cruzada y exposición a ARNasas, se debería realizar el
trabajo con ARN utilizando una cabina apropiada y guantes.
i)
Aislamiento de ARN: se extrae el ARN total de las células infectadas en
suspensión (en medio de cultivo celular) utilizando el método del fenolcloroformo, o una columna de centrifugación para extracción de ARN por
afinidad, por ejemplo, RNeasy Total RNA kit (Qiagen, Alemania), de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. Se debe re-suspender el ARN en agua
destilada libre de ARNasa (ej., agua tratada con dietil-pirocarbanato al 0,1%).
ii)
RT-PCR: la amplificación por la RT-PCR puede llevarse a cabo en uno o dos
pasos usando un conjunto de cebadores que se une a una zona preservada
dentro de la nucleocápsida (N): 5’-GGG-GAC-CCC-AGA-CTG-T-3’ (cebador
directo) y 5’-TCT-CTG-TCA-CCT-TGA-TCC-3’ (cebador inverso). El
resultado de la amplificación es un segmento de 811 pares de bases (pb).
iii) RT-PCR de un solo paso: se puede realizar una RT-PCR con un solo tubo de
50 µl utilizando el Titan One Tube RT-PCR System (de Roche, Alemania) y
siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente explicado, la mezcla para
la reacción por la PCR consta de: 5 µl de ARN vírico extraído
(aproximadamente 0,5–2 µg), 50 pmoles de cada uno de los cebadores, 1 µl de
dNTP 10 mM, 10 µl de 5 × tampón de reacción RT-PCR (con MgCl2 7,.5 mM
y dimetil sulfoxida), 2,5 µl de DTT 100 mM, y 1 µl de mezcla de enzimas. Se
recomiendan los ciclos siguientes: 50°C durante 30 minutos, 94°C durante
2 minutos, 35 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 52°C durante 30 segundos,
68°C durante 60 segundos; finalmente, la reacción de ARN se mantiene a 68°C
durante 7 minutos.
iv) RT-PCR de dos pasos: la mezcla de ADNc consta de 5 µl del ARN vírico
extraído (aproximadamente 0,5–2 µg), 50 pmoles de cada cebador, 1 × tampón
de transcripción inversa (con Tris/HCl 50 mM, pH 8,3, MgCl2 3 mM, KCl
75 mM, 10 mM), 1 mM de mezcla de dNTP, 5 U de transcriptasa inversa
(StrataScript RNase transcriptase H-inversa, Stratagene, EE.UU.) ajustada con H2O
a un volumen final de 20 µl. La transcripción inversa se debe realizar a 42°C
durante 30 minutos, 94°C durante 5 minutos, y enfriarse 4–10°C durante
3 minutos.
v)
Para amplificaciones posteriores por PCR, se prepara la muestra base
compuesta por 5 µl de la reacción de ADNc, 50 pmoles de cada cebador, 1 ×
tampón de polimerasa Taq (con Tris/HCl 10 mM, pH 9, MgCl2 1,5 mM, KCl
50 mM, 0.01% de gelatina, 0,1% Tritón X-100), 1 mM de mezcla de dNTP,
1,5 U de polimerasa Taq, y se ajusta con H2O hasta un volumen final de 50 µl.
La PCR posterior se realiza en los siguientes ciclos: 94°C durante 2 minutos,
35 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 52°C durante 30 segundos, 68°C durante
60 segundos, y finalmente se mantiene a 68°C durante 7 minutos.
vi) La cantidad y especificidad de las reacciones por RT-PCR se pueden evaluar
mediante la electroforesis, en gel de agarosa al 1%, de 1/10 de la reacción en gel
de agarosa al 1,5% que contenga bromuro de etidio, y se pueden observar
mediante transiluminación con UV.
NOTA: Es posible que haya que optimizar los protocolos térmicos, dependiendo
del termociclador que se utilice.
Existen varios métodos PCR efectivos que están disponibles (52, 59), de los que el
presente es uno más. Se están elaborando métodos de diagnóstico por PCR más
recientes, algunos con mejoras específicas, pero pocos son sometidos a una
validación sistemática como la recomendada en el capítulo 1.1.3 de este Manual de
164
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.5. — Septicemia hemorrágica vírica
animales acuáticos antes de quedarse obsoletos. En su lugar también se pueden utilizar
otros métodos PCR de eficacia probada.
• Métodos de detección de antígeno basados en el uso de anticuerpos
A lo largo de los años se han desarrollado métodos de detección de antígeno basados en
la utilización de anticuerpos, como IFI, ELISA y varios procedimientos
inmunohistoquímicos para la detección del VHSV (38). Por lo general se admite que los
principales órganos diana son el riñón y el hígado, y que el empleo de frotis tisulares o
cortes de tejidos pueden desempeñar un papel importante en el diagnóstico durante la
fase aguda de la enfermedad (11). La utilización de estas técnicas puede contribuir a una
rápida detección e identificación en comparación con las del cultivo celular de
aislamientos de virus. Sin embargo, los resultados pueden verse afectados por
parámetros tales como la sensibilidad y especificidad o la preparación de las muestras;
los resultados negativos deben tomarse con precaución. No se deben utilizar estas
técnicas para detectar peces portadores.
•
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
i)
Se sangra completamente el pez.
ii)
Se realizan frotis de riñón sobre portas de vidrio limpios o en el fondo de los
pocillos de una placa de plástico para cultivo celular.
iii) Se conservan los trozos de riñón (como se indica en el capítulo I.1, sección
B.3.1) junto con los otros órganos requeridos para el aislamiento del virus en
caso de que dicho aislamiento se necesite más tarde.
iv) Se deja secar al aire el frotis durante 20 minutos.
v)
Se fija con acetona etanol/acetona y se seca, tal como se indicó en la sección
3.c.ii, Identificación del virus, b, pasos (v–vii)).
vi) Se rehidratan las preparaciones anteriores (véase la sección 3.c.ii Identificación del
virus, b, paso [ix]) y se bloquea con 5% de leche desnatada y 1% de
seroalbúmina bovina en PBST durante 30 minutos a 37º.
vii) Se lava cuatro veces con PBST.
viii) Se tratan los frotis con solución de anticuerpo contra VHSV y se aclara, tal
como se indicó en la sección 3.c.ii Identificación del virus, b.
ix) Se bloquea y se aclara tal como se indicó en los pasos (vi) y (vii).
x)
Se detecta la reacción con anticuerpo específico conjugado con FITC, se aclara
y se observa tal como se indicó en la sección 3.c.ii Identificación del virus, b, pasos
(xii–xv).
xi) Si la prueba es negativa, se procesarán las muestras de órganos guardadas a 4ºC
para el aislamiento del virus en cultivo celular, tal como se ha descrito más
arriba.
• Enzimoinmunoensayo (38)
a) Procedimientos de muestreo
Véanse las siguientes secciones del capítulo I.1:
B.1. para la selección de los especimenes de peces
B.2. para la selección de los materiales que forman parte de la muestra.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
165
Capítulo 2.1.5. — Septicemia hemorrágica vírica
b) Procesamiento de las muestras de órganos
Véanse las siguientes secciones del capítulo I.1:
B.3.1. para el transporte
B.3.2. para la extracción del virus y para la obtención de homogeneizados de
órganos.
c) Procedimiento del enzimoinmunoensayo
i)
El procesamiento de las placas de microtitulación se describe en la sección 3.c.ii
Identificación del virus, c, de este capítulo hasta el paso (iv) (inclusive).
ii)
Se separa una alícuota de 1/4 de la dilución de cada homogeneizado por si se
requiere una mayor cantidad de aislamiento de virus en cultivo celular.
iii) Se trata el resto del homogeneizado con 2% de Tritón X-100, como en la
sección 3.c.ii, Identificación del virus, c, paso (vi), y 2 mM de cloruro de fenil metil
sulfónico; se mezcla suavemente.
iv) Se completan los demás pasos (vii–xiv) del procedimiento descritos en la
sección 3.c.ii Identificación del virus, c.
v)
Si la prueba es negativa, se procesarán las muestras de órganos guardadas a 4ºC
para el aislamiento del virus en cultivo celular, tal como se ha descrito
anteriormente.
Se ofrece como ejemplo la forma del ELISA basado en biotina-avidina, referido más
arriba. (41).
• Técnicas moleculares
Cada vez se utilizan más las pruebas moleculares (como la RT-PCR y la PCR en tiempo
real) por su rapidez y sensibilidad (35). Además, tras el descubrimiento de la cepa
marina norteamericana del Pacífico, y de las cepas europeas y del Atlántico, la
secuenciación de los productos de la PCR puede proporcionar datos epidemiológicos
importantes (52, 54). Aunque se puede justificar la utilización de estas pruebas para la
detección e identificación del virus durante la fase aguda de la enfermedad, está por
probar cuál es el grado de su sensibilidad en comparación con las pruebas de cultivo
con aislamientos del virus. Se necesita más investigación en ese sentido para determinar
si las pruebas moleculares se pueden utilizar en programas de vigilancia.
• Métodos indirectos de detección
• Métodos serológicos
Debido al escaso conocimiento que se tiene de la serología de las infecciones víricas de los
peces, hasta ahora no se ha aceptado la detección de anticuerpos contra virus en los peces
como método rutinario de diagnóstico para evaluar el estado vírico de las poblaciones de
peces. (26, 28).
4. CLASIFICACIÓN DE LAS PRUEBAS SEGÚN SU FINALIDAD
En el cuadro 2 aparecen los métodos disponibles en la actualidad para la vigilancia, detección y
diagnóstico del VHSV. Las letras que aparecen en el cuadro simbolizan lo siguiente: A = se trata de un
método recomendado por su disponibilidad, utilidad, especificidad y sensibilidad diagnósticas; B = se
trata de un método estándar con buena sensibilidad y especificidad de diagnóstico: C = el método es
aplicable en algunas situaciones, pero su aplicación se ve seriamente limitada por razones de coste,
precisión y otros factores; D = el método no se recomienda para el presente propósito. Esta
caracterización es un tanto subjetiva ya que la adecuación de tales métodos depende de factores como
la sensibilidad, la especificidad y la utilidad. Aunque no todos los métodos agrupados bajo las
166
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.5. — Septicemia hemorrágica vírica
categorías A o B han sido estandarizados o validados formalmente (véase el capítulo 1.1.2), su carácter
rutinario y el hecho de haberse utilizado ampliamente sin resultados dudosos, los convierte en
aceptables.
Cuadro 2. Vigilancia, detección y diagnóstico de la septicemia hemorrágica vírica
Método
1. Síntomas generales
2. Histopatología
3. MET
4. Aislamiento en cultivo celular,
seguido de la identificación por los
métodos 5, ó, 6 indicados más abajo.
5. Ensayo de anticuerpos
6. PCR seguida de secuenciación
Alevines
D
D
D
Vigilancia
Cultivados
D
D
D
Reproductores
D
D
D
Presuntivo
Confirmativo
B
B
C
D
D
D
A
A
A
A
A
D
C
D
C
D
C
B
C
A
A
MET = microscopía electrónica de transmisión; PCR = reacción en cadena de la polimerasa.
5.
CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO CONFIRMATIVO
a)
Definición de un caso sospechoso
Se sospechará de la presencia de VHSV si:
i)
El pez enfermo pertenece a una especie hospedadora susceptible (teniendo en cuenta que
posiblemente no se conozcan todas las especies susceptibles. La gama de hospedadores
marinos conocidos está ampliándose con rapidez).
La temperatura del agua se sitúa en 1-18ºC (se desconoce la existencia de brotes de la
enfermedad a temperaturas superiores a 18ºC). Parece que en el caso de la trucha arco iris de
piscifactoría los brotes de SHV son más frecuentes en primavera cuando las temperaturas son
bajas, pero comenzando a subir o a fluctuar.
Aumenta la ratio de mortalidad: las ratios de mortalidad pueden ser altas para todos los grupos
de edad. La gravedad de la enfermedad es inversamente proporcional a la edad del pez y la ratio
de mortalidad de los alevines puede ser cercana al 100% (siendo más baja para los peces
adultos).
Los peces muestran uno o varios de los siguientes síntomas clínicos de infección sistémica:
letargo, oscurecimiento de la piel, exoftalmos, anemia (branquias de color pálido), hemorragias
en la base de las aletas, las branquias, los ojos y la piel, nadar anormal, de tipo intermitente o en
espiral, abdomen distendido por edema en la cavidad peritoneal.
Signos patológicos evidentes: el riñón está rojo oscuro durante la fase aguda pero muestra una
necrosis aguda en los peces moribundos. El hígado está pálido y moteado. Puede producirse
una hemorragia petequial en la piel, el tejido muscular y los órganos internos. El tracto
gastrointestinal se vacía de contenido alimenticio.
Histopatología: El riñón, el hígado y el bazo muestran necrosis focal extendida y degeneración
–vacuolas citoplásmicas, picnocitosis, cariolisis e invasión linfocitaria. Mientras el músculo
esquelético no parece afectado por la infección, los eritrocitos pueden acumularse entre los
manojos y fibras del músculo esquelético, sin dañar al músculo propiamente dicho.
ó
ii)
El aislamiento e identificación del VHSV en cultivo celular procede de una única muestra de
tejidos de pez (tal como se describió en la sección 3.c).
ó
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.5. — Septicemia hemorrágica vírica
iii) La presencia del VHSV se pone de manifiesto por los resultados de dos pruebas de laboratorio
realizadas de forma independiente, como las pruebas RT-PCR e IFI, tal como se describió en la
sección 3.c).
b)
Definición de caso confirmado
Se considerará confirmada la presencia de VHSV si, además de los criterios expuestos en la
sección 5.a.i, se cumplen estos otros criterios:
i)
El aislamiento del virus de la SHV en cultivos celulares puesto de manifiesto por el efecto
citopático típico de la infección por VHSV, seguido de la identificación del virus por una
prueba de anticuerpos (IFI, ELISA, inmunocitoquímica) y/o PCR, seguidos de la
secuenciación del segmento amplificado.
ii)
El VHSV se detecta en preparados de tejido o tejidos por inmunoensayo, en el que se utilizan
anticuerpos específicos anti-VHSV
iii) Detección del VHSV mediante RT-PCR seguida de la secuenciación del amplicón.
De forma alternativa, en ausencia de síntomas clínicos y hallazgos post-mortem consistentes con
la SHV, se considerará confirmada la presencia del VHSV si se da uno de los siguientes criterios:
i)
Se aísla e identifica el VHSV, tal como se describe en la sección 3.c, en dos muestras
procedentes de uno o más peces ensayadas en diferentes ocasiones;
ii)
Se aísla e identifica el VHSV en un pez, tal como se describe en la sección 3.c, y se detecta la
SHV en tejidos procedentes de cualquier pez mediante inmunoensayo o RT-PCR seguido de la
secuenciación del producto amplificado.
6. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO/DETECCIÓN PARA ESTABLECER LA AUSENCIA DE INFECCIÓN
La utilización de los procedimientos adecuados descritos en el capítulo 1.1.4.
Ausencia de virus en el cultivo celular.
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NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE especializado en septicemia hemorrágica vírica (véase el
cuadro al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web de la
OIE : www.oie.int).
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