Download departamento de biotecnología

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA
Rafael Blasco Lozano
Ctra. de la Coruña Km. 7,5
28040 Madrid
Teléfono:
91 347 68 85
Fax:
91 357 31 07
Correo electrónico: [email protected]
Director:
Dirección:
1
PERSONAL DEL DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA
Personal en plantilla
Blasco Lozano, Rafael
Coll Morales, Julio
Ponz Ascaso, Fernando
Domínguez Juncal, Fco. Javier
Martínez Escribano, José Angel
Salinas Muñoz, Julio
Soler Llinares, Consuelo
Alonso Marti, Carmen C.
Alonso Moreno, Fernando
Ezquerra Martínez, Angel
Fresno Pérez, Jesús
Ley Vega de Seoane, Victoria
Sánchez Sánchez, Florentina
Torres Pascual, José Vicente
Jarillo Quiroga, José Antonio
Piñeiro Galvín, Manuel Angel
Saiz Calahorra, Juan Carlos
Pozo Benito, Juan Carlos
Monte Herraiz, Juan Vicente
Medina Alcázar, Joaquín
Casanova Pena, Carlos
Martínez de la Riva, Paloma
Miguel Casado, Eugenio José
Personal Contratado
Díaz Gil, Mª Gema
Muñoz Plaza, Alfonso
Rodríguez Méndez, Esperanza
Director
Investigador A1
Investigador A1
Investigador A2
Investigador A2
Investigador A2
Investigador A2
Investigador A2
Investigador A2
Investigador A3
Investigador A3
Investigador A3
Investigador A3
Investigador A3
Investigador A3
Investigador A3
Investigador A3
Investigador
Investigador N22
Téc. Superior Espec.
Técnico esp. Grad. Med
Técnico esp. Grd. Med
Especialista Tecn.
Invest.
Titulado Superior
Técnico Superior N3
Ayudante Técnico
Núñez del Castillo, Carolina P.
Redondo Moreno, Adela
Sánchez Navarrete, Pedro
González Gonzalez , Fermín
García Mullor, Tomás Javier
Calvo Gutiérrez, Margarita
Ayudante Técnico
Ayudante Laboratorio
Ayudante
Ayudante Serv. Generls
Auxiliar
Oficial
Alonso Blanco, Carlos
Arroyo García, Rosa Adela
Pelaz Herrero, Soraya
Revilla Calvo, Mª Concepción
Canto Nogues, Carmen
Catala Rodríguez, Rafael
Chamorro Pérez, Sonia
Escribano Romero, Estela
Feito Castellano, Mª José
Galindo Barreales, Inmaculada
García Cantalejo, Jesús Manuel
Gómez Hernández, Nuria
Jiménez Clavero, Miguel Angel
López Cobollo, Rosa María
López Fraga, Marta
Moreno Mozo, Juan Ignacio
Pérez Filgueira, Daniel M.
Resino Talavan, Paloma
Rocha Roso, Ana Isabel
Sánchez Puig, Juana Mª
Terrada Mayor, Estela
Titarenko Ivanova, Elena
Touriño Fernández, Mª Angeles
Ramón y Cajal
Ramón y Cajal
Ramón y Cajal
Ramón y Cajal
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Titulado Superior
Ruiz Montejano, Sandra
Alvarez Vega, Mª Belen
Zambrana
Quesada,
Encarnación
Escudero Pérez, Eloisa
San Martín González, David
Técnico Superior N3
Titulado Medio
Titulado Medio
Matesanz Rodríguez, Ruth
Montes Barberá, Mónica
Novillo Zaragoza, Fernando
Perdiguero de la Torre, Beatriz
Pérez Martín, Carlos
Rodríguez de la Rosa, Lourdes
Lázaro Somoza, Ana
Matesaz Rodríguez, Ruth
Moral Darde, Verónica
Quetglas Mas, José I.
Gómez de Nova, Pedro J.
Pérez Rivera, Gemma M.
Rubio González, Vicente
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
Predoctoral MEC
Predoctoral MEC
Predoctoral MEC
Predoctoral MEC
Tecnólogo INIA
Tecnólogo INIA
FINNOVA CM
Auxiliar
Auxiliar
Becarios
Ballesteros Jareño, Mª. Luisa
García Briones, Mercedes
García-Gallo Pinto, Mónica
Díaz García, Nardy del Valle
Lunello, Pablo
Oliverio Peppe, Karina
Córdoba García, Laura
Del Olmo Montoro, Iván
Gíl Dons, Félix
Hernáez de la Plaza, Bruno
Hernández Verdejo, Tomasa
Jiménez Gómez, José Mª.
López González, Leticia
Mansilla Mansilla, Carmen
Postdoctoral CM
Postdoctoral CM
Postdoctoral INIA
Postdoctoral INIA
Postdoct CONICET
Postdoct F. Carolina
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
Predoctoral INIA
2
OBJETIVOS GENERALES DEL DEPARTAMENTO
El departamento de Biotecnología incluye grupos de investigación que comparten la
característica común de la utilización de técnicas genéticas o moleculares para
conseguir objetivos innovadores aplicables a la producción agraria o industrial. El
Departamento tiene dos grandes ámbitos de actuación, que se agrupan en torno al tipo
de organismos usados: animales o vegetales. Así, dentro del ámbito “animal” tenemos
líneas de investigación enfocadas al estudio de peces como biofactorías, líneas de
trabajo centradas en virus animales, en vacunas, en la inmunología de especies
ganaderas, o en el uso de virus animales como marcadores medioambientales.
Dentro del ámbito “vegetal”, contamos con líneas de investigación centradas en la
genética del control de la floración y de la resistencia en el estrés ambiental, y líneas de
trabajo enfocadas al estudio de la función de la ruta de la ubiquitina en plantas; por su
parte, otros grupos están centrados en el estudio de virus vegetales y en su aplicación
para la producción de proteínas, en estudios de epidemiología y genética de poblaciones
o en el posible uso de plantas como biofactorías. De igual manera, contamos con
grupos implicados en la mejora genética especies vegetales como la vid, el trigo o de
gramíneas silvestres españolas, para poder ser utilizadas en temas de revegetación.
GRUPOS DE INVESTIGACIÓN
Peces transgénicos
Poxvirus
Inmunología
Apoptosis
Virus y contaminación ambiental
Vacunas
Evolución y epidemiología molecular
Virus vegetales
Tolerancia al estrés medioambiental
Unidad de mejora genética vegetal
Control genético del tiempo de floración
Biología reproductiva de plantas
Ciclo celular/ruta de la ubiquitina
Mejora genética de la vid
3
GRUPO PECES TRANSGENICOS
COMPONENTES
Coll Morales, Julio
Rocha Roso, Ana Isabel
Ruiz Montejano, Sandra
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
•
•
•
Mejora de vectores (promotores y transposones) para vacunación DNA en
peces
Métodos de transferencia en masa para transferencia de vectores a peces
Obtención de vectores para microalgas Dunaliellas
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
•
•
•
Vacunas DNA
Peces transgénicos
Transformación de microalgas Dunaliella
4
PROYECTOS
Código y título: RTA03-217. Biotecnología de peces: Mejora de la transfección y
transformación de sus líneas celulares
Entidad financiadora: INIA
Duración: 2003-2005
Investigador responsable: Coll Morales, Julio
Resumen objetivos:
Estudiar la transfección y transformación de células de pez con genes marcadores y
varios vectores para mejorar la vacunación DNA en peces
Principales resultados:
Se han obtenido por subclonajes en el plásmido pMCV1.4 y en el transposón "sleeping
beauty", vectores de expresión transitoria codificando para el antibiótico neomicina. Se
han subclonado en varios vectores SB (pT1, pT2 y pT3) los genes de Betagalactosidasa,
puromicina, defensinas humanas hNP1 y proteína G de VHSV. Resultados preliminares
apuntan a que en EPC existen transposasas activas, lo que sería de gran interes práctico
para aumentar la duración de las vacunas DNA. Se han mejorado los métodos de
subclonaje, producción, amplificación de plásmidos con una mayor pureza empleando
columnas de vidrio diseñadas en el laboratorio.
Se han completado 2 Patentes para su aplicación al campo de las vacunas DNA en
Acuicultura y presentado brillantemente una tesis doctoral (Dra.Ana Rocha Roso) que se
ha presentado a los premios SYVA del 2005.
Código y título: CPE03-016-C4. Tecnologías de peces como biofactorias: Metodos de
selección, transferencia genética en masa, métodos inducibles y expresión en mucus de
defensinas humanas en peces de importancia económica en España
Entidad financiadora: Plan estratégico INIA
Duración: 2003-2007
Investigador responsable: Coll Morales, Julio
Resumen objetivos:
Optimizar el uso de transposones como vectores de peces, transfectar células de trucha,
clonar defensinas humanas hNP1 y estudiar diferentes métodos de transferencia
genética a embriones del pez cebra en masa
Principales resultados:
Se está optimizado la electroporación de EPC como método alternativo al uso de los
liposomas. Aunque hasta ahora se han conseguido eficiencias de transfección menores que
con liposomas, se espera optimizar estos datos con el uso de la electroporación con ondas
de radiofrecuencia y extender estos métodos a la línea celular de trucha RTG2 mucho más
difícil de transfectar. A pesar de su interés práctico, no existe actualmente ninguna línea
celular de trucha que se pueda transfectar, muy probablemente debido a las bajas
temperaturas que requieren. Se han producido y clonado líneas celulares de EPC
expresando el gen de la resistencia a la neomicina y puromicina. Se espera producir clones
expresando proteína G de VHSV y defensinas humanas mediante co-transformación con
los plásmidos correspondientes y pMVC1.4-pac, pT1SVneo, pT2SVneo y pT3SVneo. Se
ha puesto a punto un método sencillo de obtención de embriones de pez cebra con un
mínimo de dedicación personal. Actualmente con 6 acuarios y unos 30-40 peces la
producción obtenida es de unos 1000 embriones por semana. Todavía se trabaja en mejorar
el rendimiento y la reproducibilidad así como la supervivencia de los embriones hasta la
eclosión evitando contaminaciones. Se siguen realizando algunos experimentos
preliminares de expresión temporal de ß-galactosidasa en embriones de 5 días utilizando
como método de transferencia de DNA (pMCV1.4- ßgalactosidasa) y la electroporación
con radiofrecuencia.
5
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
Rocha, A., Ruiz, S., Estepa, A. y Coll, J.M. Review on the application of inducible and
targeted gene-strategies to produce transgenic fish. Journal Marine Biotechnology.
6(2004)118-127
Mas, V., Rocha, A., Perez, L., Coll, J.M. y Estepa, A. Reversible unhibition of
spreading of infection and imbalance of viral protein accumulation at low pH in viral
haemorrhagic septicemia rhabdovirus, a salmonid rhabdovirus. Journal Virology. 78
(2004)1936-1944
Rocha, A., Ruiz, S., y Coll, J.M. Characterization of the syncytia formed by VHS
salmonid rhabdovirus G-gene transfected cells. Veterinay Immunolgy
Immunopathology 99 (2004) 143-152
Rocha, A., Ruiz, S., y Coll, J.M. Mutational analysis around the phospholipid-binding
domain of viral haemorrhagic septicemia fish rhabdovirus. Journal Virology.
78(2004)9115-9122
Patentes
•
•
Coll, J.M. (2004) Genes G mutantes del virus de la septicemia hemorrágica
de la trucha (VHSV) y aplicaciones. Patentes nº200402092.
Coll, J.M. (2004) Construcción génica, vector y vacuna ADN para la
vacunación de animales acuáticos Patentes nº200402093.
Tesis doctoral
"Caracterización y localización de la región de fusión del rabdovirus de la septicemia
hemorrágica de la trucha" Ana Rocha Roso. Universidad Complutense de Madrid 2004.
Sobresaliente cum laude.
6
GRUPO POXVIRUS
COMPONENTES
Blasco Lozano, Rafael
Galindo Barreales, Inmaculada
Matesanz Rodríguez, Ruth
Nuñez del Castillo, Carolina
Perdiguero de la Torre, Beatriz
Rodríguez de la Rosa, Lourdes
Sánchez-Puig, Juana María
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
El objetivo primordial del grupo es entender con detalle los mecanismos que operan en
la biogénesis y la función de la envuelta en el contexto de la infección, y aplicar ese
conocimiento al desarrollo de vectores vacunales más seguros e inmunogénicos.
Asímismo, trabajamos en el desarrollo y optimización de estrategias de expresión
genética y selección en poxvirus recombinantes.
Las funciones desempeñadas por la envuelta de los Poxvirus son muy importantes a
nivel del ciclo natural de infección, puesto que la envuelta determina en gran medida la
transmisibilidad e inmunogenicidad del virus. Aunque se conocen con detalle los
componentes de ésta membrana, se ha definido sólo parcialmente el papel que la
envuelta en conjunto y cada proteína en particular juega en diferentes procesos,
incluyendo 1) el envolvimiento del virus, 2) el transporte intracelular, 3) la inducción de
colas de actina 4) la liberación del virus al espacio extracelular y 5) la unión a la célula
y la modulación de la entrada del virus.
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
•
•
•
•
Caracterización del proceso de morfogénesis y transmisión de los Poxvirus
Modulación de la transmisibilidad de los Poxvirus mediante aproximaciones
genéticas
Mejora de vectores vacunales basados en Poxvirus
Desarrollo de vectores de expresión eucarióticos
7
PROYECTOS
Código y título: RTA02-029 Optimización de vectores vacunales basados en Poxvirus:
modulación genética de la transmisibilidad del virus.
Entidad financiadora: INIA
Duración: 2001-2004
Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael
Resumen objetivos:
• Identificación de nuevos genes involucrados en la transmisión del virus
célula a célula por mutagénesis al azar.
• Mutagénesis dirigida de la proteína mayoritaria de la envuelta viral,
codificada por el gen F13L
• Estudio de la contribución de diferentes proteínas de la envuelta en el
transporte y la transmisión de partículas virales célula a célula.
• Generación de proteínas de fusión con las proteínas B5R y F13L para el
anclaje de antígenos en la envuelta viral.
Principales resultados:
Se ha llevado a cabo un estudio de la transmisión célula a célula del virus vaccinia,
utilizando mutagénesis al azar. De esta manera se han aislado y caracterizado una serie
de virus mutantes que están afectados en su capacidad de producir placas de lisis
(mutantes de placa pequeña). Se han localizado mutaciones en los genes B5R, F13L,
A34R y A27L. Asímismo, se han generado mutantes que contienen mutaciones dentro
del gen F13L. Se ha estudiado la capacidad que tienen dichos mutantes para llevar a
cabo la adquisición de la envuelta, el transporte intracelular del virus y su transmisión a
las células adyacentes. Finalmente, se ha evaluado la posibilidad de anclar antígenos en
la partícula viral, mediante la generación de una serie de proteínas de fusión con
proteínas de la envuelta. Todos estos resultados pueden redundar en vectores vacunales
más atenuados, a la vez que más inmunogénicos.
Código y título: BMC 2002-03047 Aproximaciones genéticas a la modificación de
vectores basados en el virus vaccinia.
Entidad financiadora: Programa Nacional I+D+I
Duración: 2002-2005
Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael
Resumen objetivos:
• Mutagénesis al azar del genoma de vaccinia por inserción de transposones y
estudio de virus mutantes de placa pequeña.
• Interacciones entre proteínas de la envuelta viral.
• Amplificación de la expresión de un gen exógeno.
Principales resultados:
Se ha evaluado la posibilidad de utilizar transposones para llevar a cabo una
mutagénesis al azar en el genoma del virus vaccinia. La transposasa se localizó en el
nucleo, por lo que, dado que la replicación del DNA viral es citoplasmática, no resulta
factible la utilización de la misma. Por otro lado, se ha estudiado la contribución de las
proteínas de la envuelta del virus extracelular en el transporte del virus envuelto. Es de
destacar que la presencia de las proteínas A33R y A34R es necesaria para la
incorporación de las proteínas F13L y B5R, respectivamente, en la envuelta. Se han
identificado y caracterizado las interacciones A33R:B5R y A34R:B5R, y su importancia
funcional para el correcto ensamblaje y función de la envuelta. Finalmente, se ha
conseguido la expresión de proteínas exógenas, mediada por replicones de alfavirus, a
partir de vaccinia recombinantes. Esta expresión permite producir una amplificación de
la expresión del gen exógeno.
8
Código y título: QLK2-CT-2002-01867 Increasing the potency of vaccinia MVA
vaccines.
Entidad financiadora: Unión Europeoa
Duración: 2002-2005.
Investigador responsable: Blasco Lozano, Rafael
Resumen objetivos:
Caracterización del rango de huésped y la morfogénesis en la cepa MVA de vaccinia
Anclaje de antígenos en la envuelta del virus y su inmunogenicidad
Principales resultados:
Hemos construido virus vaccinia recombinantes que expresan GFP, y comprobado que
se visualizan de forma muy sensible utilizando fluorescencia en cultivos celulares.
Hemos demostrado la utilidad de éstos virus en estudios de tropismo, puesto que la
fluorescencia en la célula infectada puede detectarse fácilmente en combinación con
marcadores celulares utilizando citometría de flujo. Así, hemos determinado que en la
infección de leucocitos de sangre periférica, las poblaciones más susceptibles son los
monocitos, seguidos por las células B y NK.
Hemos estudiado el efecto de anclar antígenos a la partícula viral, para lo que se han
evaluado proteínas de fusión con proteínas de la envuelta del EEV (B5R o F13L) o de la
envuelta del IMV (H3L). Nuestros resultados indican que la fusión a las proteína F13L
o H3L aumentan significativamente la respuesta de anticuerpos inducida en el modelo
de ratón. Por otro lado, la fusión con la proteína B5R aumenta la respuesta T en
comparación con la expresión de la proteína exógena soluble. Estos resultados
demuestran que la localización del antígeno modula de forma significativa la respuesta
inmune inducida.
9
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
Lorenzo, M.M., Galindo, I., and Blasco, R. (2004). Construction and Isolation of
recombinant vaccinia virus using genetic markers. Methods in Molecular Biology, 269,
15-30.
Sanchez-Puig, J.M. Sánchez, L. Roy, G. and Blasco, R. (2004) Susceptibility of different
leukocyte cell types to vaccinia virus infection. Virology J 2004, 1:10.
Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 6
Tesis doctorales
“Avances en la modulación de la expresión génica en virus vaccinia recombinantes”
Juana María Sanchez Puig. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense
de Madrid, 2003. Sobresaliente Cum Laude.
“Análisis de las interacciones entre proteínas de la envuelta del virus vaccinia”
Beatriz Perdiguero de la Torre. Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de
Madrid, 2004. Sobresaliente Cum Laude.
Patentes
“Virus ADN recombinante que comprenden un ADN complementario de un replicón de
un virus ARN y sus aplicaciones”
Número de solicitud P200301545
Fecha de presentación : 3 Julio 2003
Inventores: Juana María Sánchez Puig, María del Mar Lorenzo Gilsanz y Rafael Blasco
Solicitante : INIA
10
GRUPO INMUNOLOGÍA
COMPONENTES
Alonso Moreno, Fernando
Alvarez Vega, Belén
Cantó Nogués, Carmen
Chamorro Pérez, Sonia
Domínguez Juncal, Francisco Javier
Ezquerra Martínez, Angel
García Briones, Mercedes
López Fraga, Marta
Martínez de la Riva, Paloma
Pérez Martín, Carlos
Revilla Calvo, Concepción
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
•
•
•
•
•
Caracterización fenotípica y funcional de subpoblaciones de monocitos
porcinos y de células dendríticas derivadas de estos
Desarrollo de anticuerpos monoclonales frente receptores de membrana de
macrófagos y células dendríticas porcinos
Clonación de quimioquinas porcinas y evaluación de su potencial
inmunomodulador en vacunas DNA
Clonación y caracterización de receptores Toll-like porcinos
Caracterización fenotípica y funcional de subpoblaciones de linfocitos CD4,
definidas con el marcador 2E3
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
Inmunología porcina
• Caracterización de receptores de leucocitos porcinos
• Mecanismos inmunitarios implicados en protección frente infecciones
víricas. Mecanismos de evasión del patógeno. Inmunopatología
• Desarrollo de estrategias que incrementen la inmunogenicidad de las
vacunas. Uso de moléculas coestimuladoras, citocinas y quimioquinas.
Aplicación de receptores y ligandos de APCs para dirigir antígenos
11
PROYECTOS
Código y título: BIO2000-1636-C02-01 Análisis y caracterización de antígenos de
diferenciación porcinos (II).
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2000-2003
Investigador responsable: Domínguez Juncal, Francisco Javier
Resumen objetivos:
Caracterización de receptores de macrófagos y células dendríticas porcinas
Principales resultados:
Se han clonado y caracterizado a nivel molecular los ortólogos porcinos de CD172a
(correspondiente al marcador de referencia mielomonocitico SWC3) y CD107a
(LAMP-1), reconocidos por los Acmo BL1H7 y 4E9/11 respectivamente.
Se han identificado cuatro subpoblaciones de monocitos porcinos mediante el análisis
simultáneo de los marcadores SWC3, CD163, SLA-II y CD14. Estas poblaciones
difieren en la expresión de moléculas de adhesión, moléculas coestimuladoras,
capacidad de producción de TNF-α y en su susceptibilidad a la infección por el virus de
la Peste porcina africana. Se han caracterizado fenotípica y funcionalmente las células
dendríticas porcinas derivadas de esta poblaciones de monocitos. Las DC derivadas de
los monocitos CD163+ son mas eficientes que las derivadas de las células CD163presentando antígenos de recuerdo y aloantígenos a los linfocitos T. Esta mayor
eficiencia se correlaciona con una expresión mayor de moléculas SLA II y
coestimuladoras.
Código y título: AGL2000-1488 Caracterización de las células porcinas infectadas por
el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP) efecto sobre su
función.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2000-2003
Investigador responsable: Alonso Moreno, Fernando
Resumen objetivos:
• Estudio de la susceptibilidad de distintas poblaciones macrofágicas porcinas
a la infección por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino.
• Estudio del efecto de la infección sobre la función del macrófago porcino.
• Estudio de la modulación de marcadores porcinos por el virus del síndrome
reproductivo y respiratorio porcino.
Principales resultados:
El macrófago alveolar porcino es la célula diana principal del virus del SRRP, aunque
otras células del sistema mononuclear-fagocítico pueden también infectarse de forma
minoritaria. La presencia de sialoadhesina en la superficie celular parece ser un factor
determinante.
El virus del SRRP interfiere con la capacidad del macrófago alveolar porcino para
producir las citoquinas inflamatorias TNF-α, IL-1β y MIP-1β en respuesta a un estímulo
como el PMA. El TNF-α ejerce un efecto antivírico in vitro, reduciendo la progenie
viral en casi 2 logaritmos. El virus del SRRP induce un efecto inhibidor sobre la
capacidad fagocítica y sobre la actividad oxidativa (producción de radicales de oxígeno)
del macrófago alveolar porcino. También reduce la expresión de los antígenos de
histocompatibilidad de clase I en los macrófagos alveolares porcinos infectados. El
anticuerpo monoclonal 3B11/11, que reconoce al homólogo porcino de la sialoadhesina,
inhibe la infección de los macrófagos alveolares porcinos por el virus del SRRP. La
distribución tisular de la sialoadhesina coincide con la de las células susceptibles a ser
infectadas por este virus.
12
Código y título: BIO2000-0054-P4-03 Clonaje y expresión de quimioquinas porcinas:
su utilización como inmunomoduladores en vacunas de DNA en el cerdo.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2001-2004
Investigador responsable: Domínguez Juncal, Francisco Javier
Resumen objetivos:
Clonaje y expresión de quimioquinas porcinas y evaluación de su potencial
inmunomodulador en vacunas DNA.
Principales resultados:
Se han clonado en el plásmido pcDNA3.1 los ortólogos de las quimioquinas MIP-1β
(CCL4), SDF-1(CXCL12), MIP-3α(CCL20) y SLC (CCL21), y se ha confirmado su
expresión (como moléculas de fusión con GFP) por Western blot y citometria de flujo.
También se ha analizado su actividad biológica en ensayos de migración de PBMC y
DCs. Las secuencias de estas quimioquinas presentan una homología mayor, tanto en
nucleótidos como en aminoácidos, con las secuencias humanas que con las de rata o
ratón.
La capacidad adyuvante de estas quimioquinas se evaluó en un modelo de inmunización
con DNA utilizando como inmunógeno, plásmidos que codifican las proteínas GP4 y N
del virus PRRS. La adición de las construcciones de MIP-3α (CCL20) y SDF-1
(CXCL12) incrementaba de forma significativa los niveles de anticuerpos específicos
frente al virus, mientras que con pSLC se obtuvo una mejor respuesta proliferativa.
Código y título: AGL2000-1441 Análisis estructural y funcional del antigeno de
diferenciacion porcino CD163: identificacion de ligandos.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2001-2004
Investigador responsable: Ezquerra Martínez, Angel
Resumen objetivos:
• Obtención de formas solubles de la molécula reconocida por el anticuerpo
2A10.
• Obtención de anticuerpos monoclonales frente a las moléculas aisladas.
• Búsqueda de ligandos celulares y las moléculas de VPPA
• Caracterización molecular de los ligandos del CD163
• Análisis de la expresión de las variantes de CD163 en tejidos porcinos.
Principales resultados:
• Establecimiento de líneas celulares transfectadas con los genes de los
antígenos CD163 y CD107a porcinos.
• Clonaje, secuenciación y caracterización molecular del gen del antígeno
CD107a porcino.
• Obtención de anticuerpos monoclonales frente a dos epítopos diferentes de
CD163 porcino y puesta a punto de un ELISA para detección y
cuantificación de esta molécula.
• Caracterización de una variante molecular del antígeno CD163 porcino.
• Obtención de clones de baculovirus con el segmento que codifica la porción
extracelular del antígeno CD163 porcino y su proteína de fusión con GFP,
para la obtención de cantidades suficientes de estos polipéptidos para su uso
como reactivos para la identificación y caracterización de ligandos.
13
Código y título: PTR-1995-0573-OP Desarrollo de anticuerpos monoclonales frente a
antígenos de diferenciación de leucocitos porcinos.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I PETRI
Duración: 2002-2004
Investigador responsable: Dominguez Juncal, Francisco Javier
Resumen objetivos:
Desarrollar Acmo frente antígenos de activación de leucocitos porcinos y finalizar la
caracterización de Acmo frente antígenos de diferenciación obtenidos en proyectos
previos, con vistas a su comercialización.
Principales resultados:
Se ha transferido a BIOVET-UCO para su comercialización una colección de
hibridomas productores de Acmo frente SLA I, SLA-DR, SLA-DQ, CD5, CD11a,
CD11R3, CD18, CD25, CD45, CD45RA, CD46, CD107a, CD163, SWC3, SWC7, y
otros antígenos con expresión restringida a monocitos/macrófagos o de activación cuyo
ortólogo humano o murino no ha podido ser identificado. Se ha caracterizado un Acmo
(2E3) que reconoce una molécula restringida a una subpoblación de linfocitos CD4+ en
sangre periférica. Los análisis fenotípicos y funcionales indican que la población
CD4+2E3+, aunque incluye una proporción importante de células CD4+CD8α+, está
integrada por células “naive”, mientras que dentro de la población CD4+2E3- se
localizan las células efectoras o de memoria. Esta población CD4+2E3- presenta, a su
vez, cierto grado de heterogeneidad cuando se analiza la expresión de marcadores como
CD8α, CD45RA o SLA-II. Esta heterogeneidad parece reflejar la existencia de
diferentes estadios en el desarrollo de las células de memoria, aunque también puede
corresponderse con una diversidad funcional.
Código y título: RTA03-215 Clonaje y caracterización de los receptores “Toll like”
porcinos.
Entidad financiadora: INIA
Duración: 2003-2005
Investigador responsable: Dominguez Juncal, Francisco Javier
Resumen objetivos:
• Clonación, expresión y caracterización de los genes que codifican el TLR2,
TLR4, TLR6 y TLR9 porcinos
• Producción y caracterización de Acmo frente estos receptores
• Estudio de la expresión y función de estos receptores en poblaciones
leucocitarias.
Principales resultados:
• Clonación en diferentes plámidos de las secuencias completas de TLR2,
TLR4, TLR6, TLR9 y MD2 porcinos.
• Obtención de baculovirus recombinantes que expresan la región
correspondiente al ectodominio del TLR4 fusionado al epítopo V5 y a una
cola de histidinas.
• Caracterización de la expresión de estos TLRs en diferentes tejidos
porcinos y poblaciones leucocitarias por RT-PCR.
• Obtención de transfectantes estables de TLR2 en la línea CHO
• Inmunización de ratones con TLR2 y TLR4 y puesta a punto de un sistema
de “screening” para la obtención de Acmo.
14
CONVENIOS
Código y título: CC01-0035. Convenio para la transferencia de hibridomas productores
de anticuerpos monoclonales frente antígenos de diferenciación de leucocitos porcinos,
inmunoglobulinas de trucha y virus de la IPN
Entidad financiadora: INIA, BIOVET-UCO
Duración: 1996-2003
Investigador responsable: Domínguez Juncal, Francisco Javier
Resumen objetivos:
Transferencia de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales frente antígenos
de diferenciación de leucocitos porcinos, inmunoglobulinas de trucha y virus de la IPN.
CONTRATOS
Código y título: CON03-010. Investigación y desarrollo de agentes terapeúticos y de
diagnóstico en dos patologías porcinas de gran importancia técnica y económica: 1)
Síndrome Respiratorio y Reproductor Porcino (PRRS) y 2) Disentería Porcina.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I PROFIT
Duración: 2003- 2006
Investigador responsable: Alonso Moreno, Fernando
Resumen objetivos:
Construcción de VLPs quiméricas de parvovirus con epítopos de la proteína GP5 del
virus del SRRP implicados en una respuesta inmune protectora frente al virus.
Código y título: CON04-020 Agreement between INIA and SEROTEC to regulate the
production and commercial exploitation of monoclonal antibodies against porcine
leukocyte differentiation antigens.
Entidad financiadora: INIA, SEROTEC
Duración: 2004-2007
Investigador responsable: Dominguez Juncal, Francisco Javier
Resumen objetivos:
Regular la elaboración y explotación comercial de anticuerpos monoclonales frente
antigenos de diferenciación de leucocitos porcinos.
PARTICIPACIÓN
INSTITUCIONES
EN
PROYECTOS
LIDERADOS
POR
OTRAS
Código y título: QLK2-CT-2002-01304 Optimizing DNA based vaccination against
FMDV in sheep and pigs
Entidad financiadora: UE
Duración: 2002-2005
Investigador responsable: Bernard Charley, Francisco Sobrino
Resumen objetivos:
Desarrollo de una vacuna DNA para fiebre aftosa basada en la utilización de minigenes
que codifican epitopos T y B del VFA asociados a señales que los dirigen a diferentes
compartimentos celulares.
15
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
N. Domenech, M.P. Rodríguez-Carreño, M. P. Filgueira, B. Alvarez, S. Chamorro, J.
Domínguez. 2003.Identification of porcine macrophages with monoclonal antibodies in
formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Vet. Immunol. Immunopathol. 94, 77-81.
N. Domenech, B. Alvarez, R. Bullido, F. Alonso, A. Ezquerra, J. Domínguez. 2003.A
new epitope on swine CD5 molecule detected by monoclonal antibody 5F12/9.
Hybridoma and Hybridomics. 22, 179-182.
F. Chianini, N. Majó, J. Segalés, J. Domínguez, M. Domingo. 2003.Immunohistological
characterisation of PCV2 associate lesions in lymphoid and non-lymphoid tissues of
pigs with natural postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Vet.
Immunol. Immunopathol. 94, 63-75.
C. Sánchez-Torres, P. Gómez-Puertas, M. Gómez del Moral, F. Alonso, J.M. Escribano,
A. Ezquerra, J. Domínguez. 2003. Expression of porcine CD163 on
monocytes/macrophages correlates with permissiveness to African swine fever
infection. Arch. Virol. 148, 2307-2323.
C. Revilla, M.P. Rodríguez-Carreño, B. Alvarez, S. Chamorro, L.M. Alonso, A.
Ezquerra, F. Alonso, J. Domínguez. 2004. 2E3, a new marker that selectively identifies
porcine CD4+ naive T cells. Dev. Comp. Immunol. 28, 229-237.
J. Segalés, M. Domingo, F. Chianini, N. Majó, J. Domínguez, L. Darwich, E. Mateu.
2004. Immunosuppression in postweaning multisystemic wasting syndrome affected
pigs. Vet. Microbiol. 98, 151-158.
N. Domenech, R. Bullido, B. Alvarez, E. Campos, MP. Rodríguez-Carreño, M. Gómez
del Moral, F. Alonso, , A. Ezquerra, J. Domínguez. 2004. Characterization of a novel
activation antigen on porcine lymphocytes recognized by monoclonal antibody 5A6/8.
Res. Vet. 35, 339-348.
E. Campos, C. Revilla, S. Chamorro, B. Alvarez, , A. Ezquerra, J. Domínguez, F.
Alonso. 2004. In vitro effect of classical swine fever virus on a porcine aortic
endothelial cell line. Res. Vet. 35, 625-633.
S. Chamorro, C. Revilla, N. Gomez, B. Alvarez, , F. Alonso, A. Ezquerra, J.
Domínguez. 2004. In vitro differentiation of porcine blood CD163- and CD163+
monocytes into functional dendritic cells. Immunobiology, 209, 57-65.
16
Tesis doctorales
Título: Interacciones del virus de la peste porcina clásica con las células del sistema
inmune porcino
Doctorando: Emilia Campos Ramos
Director: Fernando Alonso Moreno
Universidad: Complutense de Madrid
Facultad/Escuela: Veterinaria
Calificación: Sobresaliente “cum laude” Fecha: 2003-02-01
Secuencias de genes depositadas en bases de datos
1. AJ577084 Sus scrofa mRNA for putative CCL20 chemokine (CCL20 gene) gi—
57283132— emb—AJ577084.1— SSC577084 [57283132]
2. AJ577083 Sus scrofa mRNA for putative CXCL12 chemokine (CXCL12 gene)
gi—57283130— emb—AJ577083.1— SSC577083 [57283130]
3. AJ544724 Sus scrofa mRNA for swine workshop cluster 3 antigen precursor (swc3
gene) gi—57283100— emb—AJ544724.1— SSC544724 [57283100]
4. AJ620414 Sus scrofa mRNA for lysosome-associated membrane glycoprotein 1
(LAMP=1 gene) gi—57282793— emb—AJ620414.1— [57282793]
5. AJ585194 Sus scrofa mRNA for putative CCL21 chemokine (CCL21 gene) gi—
57282610— emb—AJ585194.1— [57282610]
6. AJ851240 Sus scrofa partial mRNA for C-X-C chemokine receptor type 3 (CXCR3
gene) gi—54606510— emb—AJ851240.1— [54606510]
7. AJ628065 Sus scrofa mRNA for Toll-like receptor 4 (TLR4 gene).
OTRAS ACTIVIDADES
Cursos
Inmunología porcina. XII Curso Internacional sobre Enfermedades exóticas animales.
Centro de Investigación en Sanidad Animal (INIA). Valdeolmos (Madrid), Noviembre
2003 (Javier Domínguez)
Enzimoinmunoensayos: Fundamentos y aplicaciones en la cuantificación de citoquinas,
metaloproteasas y prostaglandinas Curso de Biología Molecular para MédicosResidentes. Hospital Juan Canalejo. A Coruña Noviembre 2003. (Javier Domínguez)
Inmunología porcina. XIII Curso Internacional sobre Enfermedades exóticas animales.
Centro de Investigación en Sanidad Animal (INIA). Valdeolmos (Madrid), Noviembre
2004 (Javier Domínguez)
Curso de Doctorado (UCM): TEMAS DE INVESTIGACIÓN EN INMUNOLOGÍA.
Inmunología Porcina. Marzo 2003 (Angel Ezquerra)
17
GRUPO APOPTOSIS
COMPONENTES
Alonso Martí, Carmen Covadonga
Díaz Gil, Gema
García–Gallo Pinto, Mónica
Hernáez de la Plaza, Bruno
Quetglas Mas, Jose Ignacio
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
•
•
•
Conocer los mecanismos de entrada y salida en la célula de diversos virus
animales, entre ellos el virus de la Peste porcina africana (VPPA)
Establecer los mecanismos de interacción virus-célula responsables de la
patogénesis inducida por los virus
Definición de dianas terapéuticas y diseño de inhibidores de transporte para
el bloqueo de la infección viral
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
•
•
•
•
Estudio de los mecanismos moleculares de patogenicidad de virus animales
Estudios proteómicos de la interacción virus-célula
Mecanismos de regulación de la apoptosis por virus
Aplicaciones biotecnológicas de los genes víricos. Vías de la apoptosis como
dianas terapeúticas.
18
PROYECTOS
Código y título: BIO2004-00690. Estudio de las interacciones patógeno- hospedador
del virus de la Peste porcina africana mediante técnicas de proteómica y microscopía
confocal.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2004-2005
Investigador responsable: Alonso Martí, Carmen Covadonga
Resumen objetivos:
El análisis de las interacciones entre las proteínas del virus y determinados sistemas
celulares, permiten una caracterización de la regulación específica del virus de dichos
sistemas como son el equilibrio celular redox, las proteínas de choque térmico y la
regulación de la apoptosis. Partimos de la hipótesis de que estas proteínas pueden
permitirnos conocer los mecanismos moleculares de la patogénesis del virus y constituir
dianas para silenciamiento génico mediante siRNA con efectos esperables sobre la
replicación vírica, sobre la inducción de la apoptosis por el virus y sobre la patogénesis
que este agente produce.
Principales resultados:
Se ha caracterizado la p54 como la primera proteína del VPPA inductora de apoptosis,
aunque se sabe que la muerte celular por apoptosis es uno de los eventos patogénicos
principales de la infección y solo se han podido caracterizar proteínas con actividad
inhibidora de la apoptosis (homólogos a bcl2, IAPs, etc.) Se ha continuado la
realización de un catálogo de proteínas celulares cuya expresión se regula
negativamente en las primeras fases de la infección mediante electroforesis
bidimensional y espectrometría de masas.. Se ha caracterizado por proteómica la
modificación posttraduccional de una proteína vírica (pE120R) que se acetila. Esta
proteína es esencial para el transporte de salida del virus a la superficie de la célula
durante la exocitosis. Para estudiar este proceso se ha construido un virus verde
fluorescente que se visualiza con gran sensibilidad en infecciones en cultivo.
Código y título: AGL2002-00668. Estudio de la interacción virus-célula mediante
análisis proteómico de la infección por el virus de la Peste porcina africana.
Entidad financiadora: Programa Nacional de Ganadería Duración: 2003-2005
Investigador responsable: Alonso Martí, Carmen Covadonga
Resumen objetivos:
Se trata de abordar el estudio de las interacciones moleculares del VPPA con la célula
infectada, y la caracterización funcional de la regulación de la supervivencia celular por
el virus mediante: Catalogación e identificación mediante análisis proteómico
(electroforesis 2-D y MALDI-TOF) de los cambios en el perfil protéico de la célula
infectada por el VPPA.
Principales resultados:
Se realizó el primer análisis de las interacciones virus- huésped para el VPPA mediante
proteómica con el objetivo de identificar dianas para estudios de patogenia. Estudiamos
los cambios en el perfil de expresión protéica de las células tras la infección viral
mediante electroforesis bidimensional. Posteriormente, las proteínas que presentaban
cambios significativos fueron identificadas por MALDI- TOFF. Los cambios mas
significativos se encontraron en 12 proteínas sobreexpresadas relacionadas con el
equilibrio Redox, proteínas de choque térmico, miembros del complejo Ran- GppnhpRanbd1 y apolipoproteínas. Estas modificaciones de las proteínas celulares parecen
jugar un papel determinante en la infección, en los mecanismos de apoptosis y en los
mecanismos de modulación transcripcional.
19
Código y título: QLK3-2000-00362. The potential and application of virus host evasion
genes that modify apoptosis and cytokine responses.
Entidad financiadora: Unión Europea
Duración: 2000-2003
Investigador responsable: Alonso Martí, Carmen Covadonga
Resumen objetivos:
1. Identificación de dianas celulares víricas para el homologo bcl2 A179L, DP71 L
and E183L
2. Definir las cascadas intracelulares modificadas por los genes reguladores de la
apoptosis y las respuestas de TNF del VPPA
Principales resultados:
El homólogos vírico a Bcl2 del VPPA A179L interacciona las proteínas celulares
proapoptóticas Bcl2, llamadas “BH3 only proteins”: Bad, Blk, Bik, Bim, Bmf, PUMA,
DP5, etc por lo que A179L es capaz de bloquear la apoptosis celular inducida por muy
diversos estímulos. No interacciona con la proteína Bid en su forma completa o inactiva
y si con su forma activa o truncada (tBid). Confirmamos la especificidad de la
interacción mediante coimmunoprecipitación y colocalización de ambas proteínas en
microscopía confocal. Demostramos que A179L bloquea la apoptosis inducida por Bid
durante su expresión transitoria en células Vero, señalando que la acción de este gen es
capaz de bloquear la via de apoptosis inducida por receptores de muerte (TNF, Fas) en
un paso posterior a la activación de la caspasa 8.
Caracterización del mecanismo de acción del gen de VPPA homólogo al supresor de la
apoptosis ICP34,5 de herpes simplex. Interacción con la fosfatasa celular PP1.
Caracterización de la interacción de la proteína P30 del VPPA con la ribonucleoproteína
K, encargada del transporte nucleocitoplásmico de mRNAs, que media el “shut- off”
celular.
Código y título: BMC2000-1003. Caracterización de los ligandos celulares de los
genes reguladores de la apoptosis del virus de la Peste porcina africana.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2000-2003
Investigador responsable: Alonso Martí, Carmen Covadonga
Resumen objetivos:
• Identificar las proteinas diana celulares que interaccionan con los genes del
virus de la Peste porcina africana
• Caracterizar las consecuencias funcionales de estas interacciones en la
regulación de la supervivencia de la célula huésped
Principales resultados:
Utilizando proteómica funcional, mediante ensayos de doble híbrido en levaduras
hemos caracterizado la interacción de la proteína p54 del VPPA a la proteína celular
dineína. La proteína p54 del VPPA, producto del gen E183L, es una proteína
mayoritaria del virión externamente expuesta en la partícula vírica. Hemos encontrado
que la p54 interacciona con una proteína motora microtubular, la dineína en su cadena
ligera de 8kd (DLC8), facilitando el transporte de entrada del virus hacia el interior de
la célula. Se ha caracterizado la secuencia mínima necesaria para la interacción de la
proteína vírica con DLC8 y esta secuencia de unión es compartida por otros virus tanto
DNA como RNA según nuestros estudios y los de otros autores. La inhibición funcional
de la dineína por expresión transitoria de mutantes dominantes negativos o inhibidores
específicos que actúan sobre el complejo motor microtubular es capaz de bloquear la
infección inhibiendo la producción de proteínas víricas tanto tempranas como tardías.
Por lo tanto, la dineína es una proteína candidata para las tecnologías de silenciamiento
génico siRNA constituyendo una posible diana para drogas antivirales.
20
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
B. Hernáez, G. Díaz- Gil, M. García-Gallo, J.I. Quetglas, I. Rodríguez-Crespo, L.
Dixon, J.M. Escribano and C. Alonso. The African swine fever virus dynein-binding
protein p54 induces infected cell apoptosis. FEBS Letters 569: 224-228, 2004
Alfonso P., J. Rivera, B. Hernaez, C. Alonso and J. M. Escribano. Identification of
cellular proteins modified in response to African swine fever virus infection by
proteomics. Proteomics 7 (4), 2037- 2046, 2004.
Tejera N, D Gómez-Garre , A. Lázaro, J. Gallego-Delgado, C Alonso, J Blanco, A
Ortiz, J Egido. Persistent proteinuria upregulates angiotensin II type 2 receptor and
induces apoptosis in proximal tubular cells. American Journal of Pathology 164: 18171826, 2004
Soto K., D. Gómez- Garre, R. Largo, J. Gallego- Delgado, N. Tejera, M.P. Catalán, A.
Ortiz, J.J. Plaza, C. Alonso and J. Egido. Tight blood pressure control decreases
apoptosis during renal damage. Kidney International 65(3): 811-822, 2004
Alfonso P., J. Rivera, B. Hernaez, C. Alonso and J. M. Escribano. Identification of
cellular proteins modified in response to African swine fever virus infection by
proteomics. Proteomics 7 (4), 2037- 2046, 2004.
M. Martínez Moreno, I Navarro- Lérida, F. Roncal, J.P. Albar, C. Alonso, F. Gavilanes
and I. Rodríguez- Crespo. Recognition of novel viral sequences that associate to the
dynein light chain LC8 identified through a Pepscan technique. FEBS Letters 544: 262267, 2003
Libros y capítulos de libros
Covadonga Alonso.Viruses and Apoptosis.Serie Progress in Molecular and Subcellular
Biology Series Vol 36. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York.ISSN 0079-6484
ISBN 3-540-20228-5
B. Hernáez, J. M. Escribano and C. Alonso. Switching on and off the cell death cascade:
African swine fever virus apoptosis regulation. Viruses and Apoptosis. (Ed) 2004
Progress in Molecular and Subcellular Biology Series. Springer- Verlag Berlin,
Heidelberg, New York
Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 15
Tesis doctorales dirigidas
Estudio de los mecanismos de regulación de la apoptosis relacionados con proteínas
proapoptóticas de la familia Bcl-2, en la infección por el virus de la Peste porcina
africana (4/06/2003). Patricia Fernández- Zapatero. Universidad Autónoma de Madrid
(Facultad de Ciencias)
21
Caracterización de ligandos celulares de proteínas del virus de la Peste porcina africana
involucradas en etapas tempranas de la infección. (31/10/2004). Bruno Hernáez de la
Plaza. Universidad Complutense de Madrid (Facultad: Ciencias Biológicas)
OTRAS ACTIVIDADES
Participación en comités y representaciones internacionales
•
•
•
Título del Comité: CSF and ASF Laboratories Annual Meeting. GrangeDublin, Irlanda
Entidad de la que depende: European Comission Food and Veterinary
Laboratories Office (FVO) Tema: Peste porcina clásica y africana Fecha:
Mayo 2004
Examinador Externo para el grado de doctor, PhD degree, School of
Biomedical and Molecular Sciences, University of Surrey, U.K. 2005
Cursos
•
•
•
•
•
•
•
•
Profesora del PhD programme in Biomedicine, Virology Course Gulbenkian
Foundation. Oeiras, Lisboa 2000- 2004
Profesora del curso de doctorado de la Universidad Pública de Navarra:
Técnicas inmunológicas y de biología molecular para estudios vacunales y
de patogenicidad 2003
Profesora del curso de doctorado UAM "Sistema inmune y agentes
infecciosos" Centro Nacional de Biotecnología, 2002-2005
Evaluador para Revistas científicas y Proyectos de Investigación de
Agencias Nacionales e Internacionales
Evaluador del British Research Council (bbsrc)
Agencia Nacional Argentina de Promoción Científica y Tecnológica
ANEP, Agencia Nacional Española de Promoción Científica y Tecnológica
Agencia Nacional de Evaluación del Fondo de Investigaciones Sanitarias del
Instituto Carlos III (ISCIII)
22
GRUPO VIRUS Y CONTAMINACION AMBIENTAL
COMPONENTES
Córdoba García, Laura
Escribano Romero, Estela
Gómez Hernández, Nuria
Jiménez Clavero, Miguel Angel
Ley Vega de Seoane, Victoría
Saiz Calahorra, Juan Carlos
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
•
•
•
•
•
•
•
Puesta a punto de sistemas moleculares de detección de virus entéricos
animales en muestras animales (sueros, heces, .....) y medioambientales
(aguas, lodos, ....).
Determinación de la prevalencia de virus entéricos animales en muestras de
ganado y en aguas superficiales.
Estudio de la utilidad de la detección de virus entéricos animales como
marcadores de contaminación medioambiental.
Comparación de las técnicas moleculares desarrolladas para la detección de
virus entéricos animales con las metodologías habitualmente utilizadas en la
determinación de contaminación medioambiental (detección de materia
orgánica y compuestos químicos: nitritos, nitratos, potasio, cobre,.... ).
Estudio de los mecanismos de entrada del virus de la enfermedad vesicular
del cerdo en la célula.
Estudios de la estructura tridimensional del virus de la enfermedad vesicular
del cerdo.
Estudios estructurales de los cambios evolutivos originados en el virus de la
enfermedad vesicular del cerdo durante su adaptación al cerdo.
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
•
•
•
•
Estudio, análisis y caracterización de virus entéricos animales.
Utilización de virus entéricos animales como marcadores de contaminación
medioambiental.
Estudio del virus de la enfermedad vesicular del cerdo.
Estudio y caracterización de virus zoonóticos emergentes y re-emergentes
(virus de la hepatitis E, virus del Nilo Occidental, ....)
23
PROYECTOS
Código y título: RTA02-35. Detección de Enterovirus animales en muestras
ambientales.
Entidad financiadora: INIA
Duración: 2000-2004
Investigador responsable: Ley Vega de Seoane, Victoria; Saiz Calahorra, Juan Carlos
Resumen objetivos:
Puesta a punto de sistemas de detección molecular de virus entéricos animales
(Enterovirus, Teschovirus, Rotavirus, Astrovirus,....) en muestras animales y
medioambientales de distintas regiones de España.
Principales resultados:
Dada la baja concentración de virus en aguas, se han puesto a punto sistemas de
concentración de dichos patógenos en aguas superficiales. Mediante filtración a través
de filtros electropositivos y posterior ultracentrifugación se ha conseguido un factor de
concentración de entre 25 y 50 veces la concentración inicial.
Se han desarrollado metodologías para la detección molecular de virus entéricos. Para
ello se han desarrollado sistemas de detección mediante RT-PCR convencionales y
anidadas, así como mediante sistemas a tiempo real.
Se ha determinado la prevalencia de Teschovirus porcinos en muestras de origen animal
y medioambiental.
Se han obtenido datos preliminares sobre la prevalencia de otros virus entéricos
(enterovirus, rotavirus, astrovirus, ....) en muestras animales y de aguas.
Se ha confirmado la utilidad de la detección de virus entéricos animales como
marcadores de contaminación medioambiental.
Código y título: 07M/0023/02. Contaminación medioambiental por virus entéricos
animales derivada de residuos de explotaciones ganaderas de la Comunidad de Madrid.
Entidad financiadora: Comunidad de Madrid
Duración: 2003-2004
Investigador responsable: Ley Vega de Seoane, Victoria; Saiz Calahorra, Juan Carlos
Resumen objetivos:
Puesta a punto de sistemas de detección molecular de Enterovirus bovinos y
Teschovirus porcinos en muestras de origen animal y medioambiental de la Comunidad
de Madrid.
Principales resultados:
Se han aplicado las metodologías desarrolladas en el laboratorio para la detección
molecular de virus entéricos al estudio de la prevalencia de dichos virus en muestras de
origen animal y medioambiental de la Comunidad de Madrid.
Se ha demostrado la utilidad de la detección de virus entéricos animales (Enterovirus
bovinos y Teschovirus porcinos) como marcadores de contaminación medioambiental.
Mediante análisis comparativos, se ha demostrado que la detección de Teschovirus
porcinos es una técnica mas sensible y específica que las metodologías habitualmente
utilizadas en la determinación de contaminación medioambiental (detección de materia
orgánica y compuestos químicos: nitritos, nitratos, potasio, cobre,.... )
24
PARTICIPACIÓN
INSTITUCIONES
EN
PROYECTOS
LIDERADOS
POR
OTRAS
Código y título: Providing tools to prevent emergence of enteric viruses (EVENT).
Entidad financiadora: Unión Europea
Duración: 2004-2008
Investigador responsable: Marion Koopmans (Holanda); Saiz Calahorra, Juan Carlos
(INIA)
Resumen objetivos:
Proporcionar las herramientas de laboratorio necesarias para la creación de una red de
vigilancia (epidemiológica) de brotes de enfermedades víricas relacionados con el agua
y los alimentos, hepatitis A y otras enfermedades raras y emergentes (atribuibles a virus
entéricos, como el de la hepatitis E, etc...)
25
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
Escribano-Romero, E., Jiménez-Clavero, M.A., Gomes, P., García-Ranea, J.A., and
Ley, V. Heparan sulfate mediates swine vesicular disease virus attachment to the host
cell. (2004). Journal of general Virology. 85: 653-663.
Jiménez-Clavero, M.A., Fernández, C., Ortiz, J.A., Pro, J., Carbonell, G., Tarazona,
J.V., Roblas, N.,and Ley, V., (2003). Teschoviruses as indicators of fecal contamination
of water. Appl Environ Microbiol. 69: 6311-5.
Jiménez-Clavero, M.A., Ley, V.. Fita, I. and Verdaguer, N. Crystallization and
preliminary X-ray analysis of swine vesicular disease virus. (2003). Acta
Crystallographica 359 :541-543.
Verdaguer, N., Jiménez-Clavero, M.A., Fita, I. and Ley, V. (2003). Structure of swine
vesicular disease virus : mapping of changes occurring during adaptation of human
coxsackie B5 virus to infect swine. (2003). Journal of Virology 77 : 9780-9789.
OTRAS ACTIVIDADES
Patentes Método para determinar la contaminación medioambiental mediante la
detección de enterovirus bovino (EVB) o porcino (EVP). Inventores: Ley, V.; Jiménez
Clavero, M.A. Europa, nº EP336 663 A3. USA application 2004/0058312 A1.
26
GRUPO VACUNAS
COMPONENTES
Gil Dones, Félix
Gómez Casado, Eduardo
Martínez Escribano, Jose Angel
Moreno Echanove, Ignacio
Pérez Filgueira, Mariano
Resino Talaván, Paloma
Titarenko Ivanova, Elena
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
•
•
Desarrollo de sistemas no fermentativos para la producción de vacunas y
reactivos de diagnóstico (plantas transgénicas y larvas de insecto)
Virus de la Peste porcina africana: desarrollo de una vacuna, nuevos métodos
diagnósticos e interacción virus-célula
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
•
•
•
•
Diseño de alternativas moleculares que mejoren la producción de proteínas
recombinantes en diferentes sistemas y su funcionalidad
Desarrollo de moléculas que mejoren la inmunogenicidad de las vacunas
recombinantes
Definición de las proteínas relevantes en la protección frente al virus de la
Peste porcina africana y de sistemas que permitan su correcta presentación al
sistema inmune
Desarrollo de vacunas recombinantes frente a diversos patógenos animales
cuyas proteínas relevantes están bien definidas
27
PROYECTOS
Código y título: RTA01-057. Desarrollo de vacunas recombinantes mejoradas
Entidad financiadora: INIA
Duración: 2002-2004
Investigador responsable: Martínez Escribano, Jose Angel
Resumen objetivos:
Desarrollo de estrategias genéricas para incrementar la inmunogenicidad de vacunas
recombinantes mediante direccionamiento de las proteínas vacunales a células
presentadoras de antígeno (APCs). Para ello proponemos fusionar tres diferentes
antígenos vacunales, pertenecientes a tres modelos víricos, a estructuras diméricas
conteniendo la molécula CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte antigen 4) que se une al
CD80 y CD86 de las APCs, o a un anticuerpo recombinante de cadena única (scFv),
generado a partir del anticuerpo monoclonal 1F12, el cual reconoce la cadena β del
antígeno de clase II tipo DR de las APCs. Se espera que el direccionamiento de estos
antígenos vacunales a las APCs incremente su poder inmunogénico en diferentes
especies animales, pudiendo definir así dos estrategias genéricas para la obtención de
vacunas recombinantes de alta eficacia inmunizante.
Principales resultados:
Obtención de un anticuerpo recombinante que fusionado a proteínas vacunales
incrementa el potencial inmunogénico de estas en diferentes especies animales a través
de su direccionamiento a células presentadoras de antígeno.
Código y título: BIO2001-0370. Utilización de plantas como biofactorías. Desarrollo
de sistemas de sobreproducción de xenoproteínas de interés vacunal.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2001-2003
Investigador responsable: Martínez Escribano, Jose Angel
Resumen objetivos:
1. Expresión de proteínas vacunales en semillas utilizando un promotor específico
2. Utilización de ubiquitina y formas mutadas de la misma como proteínas de
fusión
3. Obtención de proteínas de fusión con polipéptidos vegetales abundantes o de
probada eficacia de expresión y acumulación
4. Multimerización de antígenos para prevenir la acción de las proteasas celulares
5. Transformación con múltiples copias del transgén en el mismo o diferentes loci
Principales resultados:
• Desarrollo de un sistema eficiente de expresión de proteínas recombinantes
en semillas de tabaco
• Producción de la proteína VP60 del RHDV en plantas transgénicas con alto
rendimiento y formación de VLPs
• Desarrollo de un sistema de tetramerización de antígenos vacunales
recombinantes en plantas transgénicas que favorece su acumulación y
aumenta su capacidad inmunogénica
• Desarrollo de un sistema de direccionamiento de proteínas vacunales a
células presentadoras de antígeno mediante un anticuerpo monoclonal
recombinante de cadena sencilla (APCH1)
• Expresión de un péptido de rotavirus en plantas transgénicas y su utilización
con éxito como vacuna oral
• Expresión de alto rendimiento de un péptido vacunal del virus de la fiebre
aftosa fusionado a la proteína beta-glucuronidasa
28
Código y título: PETRI 95-0624-OP. Producción de reactivos para el control y
profilaxis del síndrome respiratorio y reproductivo del ganado porcino (PRRS) en un
sistema libre de cultivos celulares.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2003-2005
Investigador responsable: Martínez Escribano, Jose Angel
Resumen objetivos:
El proyecto consiste en mejorar los resultados de inmunogenicidad alcanzados con esta
proteína expresada en baculovirus por otros autores mediante fusión traduccional con
una molécula denominada CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte antigen 4). El CTLA4
direccionará la proteína vacunal hacia células presentadoras que expresen las moléculas
CD80/CD86 en sus superficie (macrófagos y células dendríticas), potenciando su
inmunogenicidad. Adicionalmente se expresará la ORF7 del virus, la cual codifica para
una proteína de 15 kDa (p15) empleada para el diagnóstico serológico por su estabilidad
antigénica entre diferentes aislados. Tanto la GP5 como la p15 se producirán mediante
baculovirus en larvas de Trichoplusia ni, un sistema de alta eficiencia y bajo coste, que
elimina la necesidad de utilizar sistemas fermentativos basados en cultivos celulares.
Principales resultados:
Obtencion de un kit diagnóstico para el estudio de la serología del virus PRRS basado
en la proteína p15 (ORF 7) basado en la expresión de esta proteína en larvas de
Trichoplusia ni.
Código y título: CPE03-022-C5. Desarrollos biotecnológicos para la utilización
rentable de plantas como biofactorías
Entidad financiadora: INIA
Duración: 2004-2007
Investigador responsable: Martínez Escribano, Jose Angel
Resumen objetivos:
El presente proyecto tiene como principal objetivo el desarrollo de diferentes estrategias
para mejorar la utilización biotecnológica de plantas como biofactorías. Los diferentes
grupos integrantes de la propuesta plantean propuestas basadas tanto en vectores víricos
de plantas como en la transformación genética nuclear o cloroplástica. En el caso de los
vectores virales, el proyecto contempla la utilización del tobamovirus del mosaico del
tabaco (tobacco mosaic virus, TMV), del potyvirus del mosaico del nabo (turnip mosaic
virus, TuMV) y del potyvirus de la sharka (plum pox virus, PPV).
Principales resultados:
• Utilización de secuencias de dimerización o tetramerización que permitirían
obtener estructuras complejas de cada proteína recombinante aumentando su
estabilidad en la célula vegetal.
• Empleo de secuencias SEKDEL de retención en retículo endoplásmico.
• Utilización de secuencias que permitan el transporte de las proteínas
recombinantes a cloroplastos.
• Obtención de fusiones a un gen de ubiquitina mutado que permite su
procesamiento proteolítico y favorece la acumulación de las xenoproteínas.
• Utilización del promotor de la fitohemaglutinina de judia para dirigir la
acumulación de proteína en semillas (compartimento que almacena de forma
muy estable las proteínas recombinantes).
29
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
Hernaez B, Fernandez-Zapatero P, Garcia-Gallo M, Rodriguez-Crespo I, Alvarez A,
Dixon LK, Escribano JM, and Alonso C. Proapoptotic BH3- only protein Bim
translocation triggers apoptosis by a bcl-2 dependent pathway in African swine fever
virus infection. FEBS Letters 569, 224-228. 2004
Wigdorovitz A, Mozgovoj M, Dus Santos MJ, Parreño V, Gómez C, Pérez-Filgueira
DM, Trono KG, Ríos RD, Franzone PM, Fernández F, Carrillo C, Escribano JM, and
Borca MV. Protective lactogenic immunity conferred by a peptide bovine rotavirus
edible vaccine produced in transgenic plants. J. Gen. Virol 85, 1825-1832. 2004
Hernaez B, Escribano JM, Alonso C. Switching on and off the cell death cascade:
African swine fever virus apoptosis regulation. Prog Mol Subcell Biol36:57-69. 2004
Alfonso P, Rivera J, Hernaez B, Alonso C, and Escribano JM. Identification of cellular
proteins modified in response to ASFV infection determined by proteomics. Proteomics
4 2037-2046. 2004
Alfonso P, Catalá-Rodríguez M, Rico-Morales ML, Durante-Rodríguez G, MoroRodríguez E, Fernández-García H, Escribano JM, Alvarez-Fernandez E, García-Poblete
E. Proteomic análisis of lung biopses: differential protein expresión profile from
peritumoral to tumoral tissue. Proteomics 4:442-447. 2004
Hernáez B, Escribano JM, and Alonso C. Switching on and off the cell death cascade:
African swine fever virus apoptosis. Viruses and apoptosis. Series “Progress in
molecular and subcellular biology. Springer-Verlag. Ed. Covadonga Alonso. 2004.
Sanchez-Torres C, Gomez-Puertas P, Gomez del Moral M, Alonso F, Escribano JM,
Ezquerra A, and Domínguez J, Expresión of porcine CD163 on
monocytes/macrophages correlates with permissiveness to African swine fever virus
infection. Arch. Virol. 148: 2307-2323. 2003
Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 13
Tesis doctorales
•
•
Desarrollo de estrategias de sobreexpresión de antígenos vacunales en
plantas
transgécicas. Doctorando: Félix Gil Dones. Universidad
Complutense de Madrid. 2003. Apto Cum Laude
Caracterización de ligandos celulares de proteínas del virus de la Peste
porcina africana involucradas en etapas tempranas de la infección.
Doctorando: Bruno Hernáez de la Plaza. Universidad Complutense de
Madrid 2004. Apto Cum Laude.
30
Patentes
Inventores (p.o. de firma): José A. M. Escribano y Félix Gil Dones
Título: Sistema para producir péptidos y proteínas multiméricos y sus aplicaciones
N. de solicitud: 200302845 País de prioridad: España
Fecha de prioridad: Diciembre 2003
Entidad titular: INIA
Inventores (p.o. de firma): José A. M. Escribano, Félix Gil y Javier Dominguez
Título: Proteína de fusión con direccionamiento de antígenos vacunales a células
presentadoras de antígeno y sus aplicaciones
N. de solicitud: 200302958 País de prioridad: España
Fecha de prioridad: Diciembre 2003
Entidad titular: INIA
OTRAS ACTIVIDADES
•
•
•
•
•
•
Participación como experto en las ponencias CICYT de seguimiento de
proyectos y concesión de proyectos en el área de Biotecnología
Pertenecer al editorial board de la revista Journal of General Virology (desde
Enero de 2002)
Evaluador de proyectos científicos para el ANEP, Agencia Nacional de
Evaluación Argentina, USDA Americano, proyectos BBSRC Inglaterra y
para la Comisión Europea
Evaluador habitual de trabajos científicos para las revistas científicas
internacionales Journal of Virology, Journal of General Virology, Journal of
Virological Methods, Veterinary Immunology and Immunopathology,
Archives of Virology, etc..
Profesor de diferentes cursos de doctorado de la Universidad Autónoma de
Madrid.
Participación como miembro de tribunal de tesis doctorales en la
Universidad Complutense y Autónoma de Madrid y Universidad Pública de
Navarra
31
GRUPO EVOLUCION Y EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
COMPONENTES
Malpica Romero, Jose Mª
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
•
Encontrar modelos predictivos en epidemiología.
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
•
Epidemiología y genética de poblaciones: hacia una síntesis.
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
Moreno, I. M., J. M. Malpica, J. A. Diaz-Pendon, E. Moriones, A. Fraile et al., 2004
Variability and genetic structure of the population of watermelon mosaic virus infecting
melon in Spain. Virology 318: 451-460.
Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 2
32
GRUPO VIRUS VEGETALES
COMPONENTES
Calvo Gutierrez, Margarita
Fresno Pérez, Jesús
Lunello, Pablo
Mansilla Mansilla, Carmen
Montes Barberá, Mónica
Ponz Ascaso, Fernando
Sánchez Sánchez, Florentina
Touriño Fernández, Mª Ángeles
Zambrana Quesada, Encarnación
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
Las actividades de I+D del grupo se insertan en el ámbito de la Biotecnología de los
Virus Vegetales. En este contexto biotecnológico, los objetivos son variados, enlazados
por nexos tecnológicos comunes.
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
Los objetivos biotecnológicos aludidos comportan varias actividades que van desde el
desarrollo de nuevas aplicaciones biotecnológicas para el diagnóstico y la tipificación
virales, en su vertiente más aplicada, hasta la investigación de los mecanismos
moleculares y celulares subyacentes a los procesos de infección de las plantas por los
virus y fenómenos asociados de expresión de enfermedad o resistencia, en la más
fundamental. En situaciones intermedias se sitúan los trabajos de desarrollo de vectores
virales para la utilización de plantas como biofactorías y la producción de biomoléculas
de interés industrial. También se mantiene un tipo de actividad tradicional en el grupo
como el de la prospección viral en determinados cultivos y caracterización molecular de
nuevos virus y aislados virales, lo que además de proporcionar un tipo de información
que resulta útil en sí misma, proporciona un buen banco de pruebas de los métodos de
diagnóstico y tipificación desarrollados.
Además, en los últimos años una pequeña parte del grupo ha estado desarrollando
aplicaciones automatizadas de los marcadores moleculares en el terreno
agroalimentario, tanto en los proyectos de I+D propios del grupo como ofreciendo un
servicio a otros grupos de investigación.
33
PROYECTOS
Código y título: BIO2002-02191. Biomoléculas vegetales implicadas en la mediación
del movimiento viral y macromolecular en plantas.
Entidad financiadora: Plan Nacional de I+D+I
Duración: 2002-2005
Investigador responsable: Ponz Ascaso, Fernando
Resumen objetivos:
El objetivo principal del proyecto es la identificación de genes de Arabidopsis thaliana
implicados en la mediación del movimiento viral. Los objetivos concretos son los
siguientes:
• Caracterización molecular detallada de las líneas transgénicas para el gen
29k de ORMV capaces de complementar el movimiento viral
• Escrutinio de mutantes EMS de la línea transgénica que expresa la proteína
29k de ORMV alterados en su capacidad de complementación del
movimiento viral
• Caracterización genética y mapeo de los mutantes
• Clonaje posicional de los genes afectados en los mutantes seleccionados
• Interacción entre mutantes que limitan el movimiento viral y silenciamiento.
Principales resultados:
Se ha realizado una caracterización genética de las líneas transgénicas, estableciéndose
que la línea trangénica funcional para la complementación del movimiento viral es
portadora de un único locus de inserción, que se encuentra en homocigosis. Se ha
localizado el transgen en el cromosoma 1 de Arabidopsis, ligado a los marcadores
NGA111 (115,55cM) y ATPASE (117,86cM). Se ha realizado una caracterización
fisiológica de dicha línea transgénica: se observa una alteración del tiempo de floración,
y la expresión de la proteína 29k de ORMV no implica alteraciones en el reparto de
biomasa o de azúcares. La caracterización genética inicial de los mutantes EMS de
dicha línea transgénica afectados en su capacidad de complementar el movimiento viral
indica que el fenotipo de la mutación es recesivo.
Código y título: QLK1 CT2001-02373. Development of quantitative and qualitative
methods to identify plant and animal species in foods.
Entidad financiadora: Unión Europea
Duración: 2001-2004
Investigador responsable: Ponz Ascaso, Fernando
Resumen objetivos:
El objetivo principal del proyecto es el desarrollo de sistemas basados en PCR para la
detección específica de frutos secos (almendra, avellana y nuez) en alimentos
procesados. Las diferentes fases de dicho objetivo son: desarrollo de la detección
cualitativa, desarrollo de la detección cuantitativa y la validación de dichos desarrollos.
Principales resultados:
Se han desarrollado cebadores específicos para las tres especies de frutos secos a partir
de amplificaciones con cebadores de marcadores tipo SCAR (specific sequence
characterized amplified region). Se ha demostrado que la amplificación con estos
cebadores es específica de especie, no presentando reactividad cruzada. Asimismo los
cebadores son universales para la especie, al ser capaces de amplificar todas las
variedades ensayadas de cada especie. Se ha demostrado su aplicabilidad a alimentos
procesados: se detecta la presencia específica de almendra o avellana en los diferentes
alimentos ensayados (turrón, cereales de desayuno, muesli y galletas). Se ha
desarrollado un método de detección cuantitativa, en base a los cebadores específicos
anteriores, mediante PCR cuantitativa en tiempo real con una sonda TaqMan. La
34
validación de los análisis se ha realizado en colaboración con el Dr. Kuchta (Bratislava),
experto en análisis de alimentos, confirmándose los resultados de los desarrollos.
Código y título: RTA01-037-C2-1. Influencia del grado de adaptación de aislados de
PVY, de su propensión vectorial y de la actividad vectorial de los pulgones sobre la
virosis asociada en cultivos al aire libre de plantas solanáceas.
Entidad financiadora: INIA
Duración: 2001-2003
Investigador responsable: Ponz Ascaso, Fernando
Resumen objetivos:
Determinación de la competencia y la dispersión entre aislados de PVY transmisibles
genéticamente distintos y, determinación del grado de adaptación de aislados de PVY
no transmisibles (NAT) en prevalencia y dispersión en presencia de aislados
transmisibles.
Principales resultados:
Los análisis de competencia entre aislados de PVY transmisibles han establecido que
los aislados con distancias genéticas relativamente altas no compiten entre sí y se
mantienen en infecciones mixtas indefinidamente, produciéndose competencia entre
aislados a partir de una distancia genética umbral; en general, se puede apreciar una
jerarquía clara de aislados en cuanto a su capacidad de desplazar a otros ya que existen
aislados con un alto grado de adaptación que tienen un fuerte potencial de convertirse en
prevalentes de una población. Los estudios realizados con aislados NAT indican que
dichos aislados se transmiten eficientemente en presencia de otro aislado transmisible
en la misma planta (infección mixta) y poco eficientemente si los virus están en plantas
distintas. Los análisis para determinar el grado de adaptación de aislados NAT para
prevalencia y dispersión en estos ensayos se han visto limitados por el bajo número de
aislados de PVY NAT caracterizados.
Código y título: BIO2003-04516. Caracterización de factores determinantes de la
enfermedad causada por potyvirus en el patosistema Arabidopsis thaliana-virus del
mosaico del nabo.
Entidad financiadora: Plan Nacional de I+D+I
Duración: 2003-2006
Investigador responsable: Sánchez Sánchez, Florentina
Resumen objetivos:
Los objetivos generales de este proyecto son, por una parte, el análisis de los factores
virales y, por otra, el análisis de los factores del huésped, determinantes de los síntomas
causados por la infección de TuMV en Arabidopsis thaliana. En el análisis de los
factores virales el objetivo concreto es la identificación del gen/determinante de
síntomas y el estudio de la influencia del título viral en la aparición de dichos síntomas,
en base a los síntomas diferenciales producidos en la infección por dos aislados (UK1 y
JPN1). Entre los factores del huésped se estudiarán la influencia de las hormonas y del
fotoperiodo en los síntomas y se analizarán diferentes mutantes del huésped para
evaluar la incidencia de determinadas mutaciones en los síntomas.
Principales resultados:
En cuanto a los factores virales determinantes de síntomas, los análisis de los síntomas
inducidos por los diferentes recombinantes entre el clon infectivo de UK1 y regiones
equivalentes del genoma de JPN1 indican que el determinante de síntomas reside en la
proteína P3. Los datos de título viral indican que los títulos de JPN1 se mantienen a la
mitad de los títulos de UK1 y existe una variación temporal de los títulos de ambos
aislados en parte aérea y en raíz con cinéticas diferentes. Respecto a los factores del
huésped determinantes de síntomas, no se han encontrado efectos del fotoperiodo ni por
35
el tratamiento externo con auxinas o giberelinas en los síntomas típicos inducidos por
cada uno de los aislados, manteniéndose el enanismo grave en plantas infectadas con
UK1 y el enanismo ligero en plantas infectadas con JPN1.
CONVENIOS
Código y título: CC01-0008. Realización de un proyecto de obtención de variedades de
fresa.
Entidad financiadora: INIA
Duración: 2001-2005
Investigador responsable: Ponz Ascaso, Fernando
Resumen objetivos:
Desarrollo de marcadores moleculares para la identificación de variedades de fresa.
Principales resultados:
Se han desarrollado marcadores moleculares de tipo ISSR (regiones intermicrosatélites) para fresa. Estos marcadores permiten distinguir las diferentes
variedades de fresa ensayadas, entre ellas la variedad "Aguedilla" de gran importancia
en este proyecto.
36
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
Jenner, C.E., Wang, X., Tomimura, K., Ohshima, K., Ponz, F., Walsh, J. 2003. The dual
role of the potyvirus P3 protein of turnip mosaic virus as a symptom and avirulence
determinant in brassicas. Molecular Plant-Microbe Interactions 16:777-784.
García-González, F., Núñez, Y., Ponz, F., Roldán, E.R.S., Gomendio, M. 2003. Sperm
competition mechanisms, confidence of paternity, and the evolution of paternal care in
the golden egg bug (Phyllomorpha laciniata). Evolution 57:1078-1088.
Mansilla, C., Sánchez, F., Ponz, F. 2003. The diagnosis of the tomato variant of pepino
mosaic virus: an IC-RT-PCR approach. European Journal of Plant Pathology 109:139146.
Sánchez, F., Wang, X., Jenner, C.E., Walsh, J., Ponz, F. 2003. Strains of turnip mosaic
virus as defined by the molecular analysis of the coat protein gene of the virus. Virus
Research 94:33-43.
Núñez, Y., Ponz, F., Gallego, F.J. 2004. Microsatellite-based genotyping of the Swine
Lymphocyte Alloantigens (SLA) in miniature pigs. Research in Veterinary Science 77:
59-62.
Lunello, P., Mansilla, C., Conci, V., Ponz, F. 2004. Ultra-sensitive detection of two
garlic potyviruses using a real-time fluorescent (TaqMan) RT-PCR assay. Journal of
Virological Methods 118: 15-21.
Núñez, Y., Fresno, J., Torres, V., Ponz, F., Gallego, F:J. 2004. Practical use of
microsatellite markers to manage Vitis vinifera germplasm: Molecular identification of
grapevine samples collected blindly in D.O. “El Bierzo” (Spain). Journal of Horticulture
Science & Biotechnology 79: 437-440.
Otros artículos
Lunello, P., Ponz, F. 2004. Production of virus-free vegetativelly propagated crops:
The garlic case as a reference system. Recent Research Developments in Plant
Pathology 3:67-83.
Libros y capítulos de libros
Luis-Arteaga, M., Ponz, F. 2003. Potato virus Y. Compendium of Pepper Diseases, pp.
35-36. APS Press, St. Paul, Minnesota. Estados Unidos. ISBN 0-89054-300-3.
Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 10
Patentes
Barbosa, G., de Blas, C., Borja, MJ., Ponz, F., Torres, V. Orden alfabético de firma.
Procedure for the detection and identification of viral and subviral pathogens
Canadian Intellectual Property Office. Patente Nº 2098270. Concesión: 23/9/2003
37
OTRAS ACTIVIDADES
Cursos y Conferencias Invitadas
Varios miembros del grupo han participado como profesores en los Cursos
Internacionales de Diagnóstico de Virus Vegetales que se celebraron en el INIA en
2003 y 2004, organizados conjuntamente por INIA y AECI.
A lo largo de los años 2003 y 2004, Fernando Ponz fue invitado a pronunciar
conferencias o impartir seminarios por las siguientes organizaciones externas al INIA:
Amgen/Ciemat. Madrid. Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la
Terapéutica Humana.
Sociedad Española de Patologías Respiratorias. Cáceres. Aplicaciones de la
Biotecnología Vegetal: alternativas al uso de las plantaciones de tabaco.
Foro Nueva Economía. The Wall Street Journal Europe. Madrid. Un escenario para la
Agrobiotecnología en el futuro de la Agricultura Española.
Reunión Nacional de Virología Vegetal. Javea, Alicante. Resistencias naturales a virus:
genes de resistencia.
Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas. UPV-CSIC. Valencia.
Interacciones potyvirus/agentes biológicos.
Academia China de Ciencias Agrarias. Diversas ciudades de China. Plant Virus
Biotechnology.
38
GRUPO TOLERANCIA AL ESTRÉS MEDIOAMBIENTAL
COMPONENTES
Ballesteros Jareño, Mª Luisa
Catalá Rodriguez, Rafael
Hernández Verdeja, Tamara
López Cobollo, Rosa
Medina Alcázar, Joaquín
Moreno Mozo, J. Ignacio
Novillo Zaragoza, Fernando
Redondo Moreno, Adela
Salinas Muñoz, Julio
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
•
•
Caracterización funcional de RCI2A, un gen de Arabidopsis cuya expresión
se induce en respuesta a temperaturas bajas, deshidratación, NaCl y ABA, y
no pertenece al regulón de los CBFs.
Identificación de intermediarios en las vias de señalización que median la
expresión de RCI2A.
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
•
Mecanismos moleculares que controlan la respuesta de las plantas a
situaciones ambientales (abióticas) extremas.
39
PROYECTOS
Código y título: BIO2001-0344. Disección genética y molecular de los mecanismos de
señalización qe median el proceso de aclimatación a las temperaturas bajas y la
respuesta a diferentes tipos de estrés abiótico en Arabidopsis.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2001-2004
Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio
Resumen de objetivos:
Caracterización molecular y funcional de genes implicados en la respuesta de las plantas
a estreses abióticos.
Principales resultados:
Identificamos una serie de mutantes de Arabidopsis afectados en la regulación de la
expresión de RCI2A que definen la existencia de una nueva red de señalización que
regula la respuesta de Arabidopsis a distintas situaciones de estrés ambiental. Las
mutaciones correspondientes definen intermediarios en las diferentes vias de
señalización que componen esa red. Confirmamos que la proteína RCI2A está
localizada en la membrana plasmática y juega un papel fundamental en la respuesta de
Arabidopsis a distintas situaciones de estrés ambiental. El análisis del genoma de
Arabidopsis reveló que en Arabidopsis hay 8 genes RCI2 (RCI2A-H) que, a pesar de su
alto nivel de homología, no tienen la misma función. Los genes RCI2 se encuentran
ampliamente distribuidos entre numerosos organismos, incluyendo bacterias, hongos,
plantas y animales inferiores. Todos los genes RCI2 y las correspondientes proteínas
están muy conservados y parecen tener un origen evolutivo común.
Código y título: BIO2004-00628. Caracterización molecular y funcional de nuevos
intermediarios en la señalización del proceso de aclimatación a las temperaturas bajas
implicados en el metabolismo de RNA mensajeros.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2004-2007
Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio
Resumen de objetivos:
Caracterización molecular y funcional de las proteinas LSMs de Arabidopsis
Principales resultados:
Caracterización molecular y funcional de las proteinas LSMs de Arabidopsis
Código y título: CPE03-006-C6-1. Cultivos halotolerantes para una agricultura
sostenible.
Entidad financiadora: INIA
Duración: 2004-2008
Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio
Resumen de objetivos:
Caracterización funcional de RCI2A
40
CONTRATOS
Código y título: CON03-043. Explotación de la tecnología CBF2.
Entidad financiadora: FuturaGene Inc.
Duración: 2003-2008
Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio
Resumen de objetivos:
Caracterización funcional de CBF2
Código y título: CON04-019. Aislamiento y caracterización de proteínas sintetizadas
en respuesta a heladas en especies frutales.
Entidad financiadora: Agroseguro
Duración: 2004-2007
Investigador responsable: Salinas Muñoz, Julio
Resumen de objetivos:
Identificación de proteínas específicas de helada en frutales.
41
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
R. Catalá, E. Santos, J. M. Alonso, J. R. Ecker, J. M. Martínez-Zapater and J. Salinas
(2003). Mutations in the Ca2+/H+ transporter CAX1 increase CBF/DREB1 expression
and the cold acclimation response in Arabidopsis. Plant Cell 15: 2940-2951.
S. Sugano, H. Kaminaka, Z. Rybka, R. Catalá, J. Salinas, K. Matsuy, M. Ohme-Takagi
and H. Takatsuji (2003). Stress-responsive zinc finger gene ZPT2-3 plays a role in
drought tolerance in petunia. Plant J. 36: 830-841.
F. Novillo, J. M. Alonso, J. R. Ecker and J. Salinas (2004). CBF2/DREB1C is a
negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A expression, and plays a
central role in stress tolerance in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 39853990.
M. González-Guzmán, D. Abía, J. Salinas, R. Serrano and P. L. Rodríguez (2004). Two
new alleles of the abscisic aldehyde oxidase 3 gene reveal its role in abscisic acid
biosynthesis in seeds. Plant Physiol. 135: 325-333.
Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 3
Tesis doctorales
Título: Identificación de nuevas rutas de señalización en la respuesta de aclimatación a
las temperaturas bajas en Arabidopsis thaliana L. Rafael Catalá Rodríguez (2003).
Universidad Complutense de Madrid. (Facultad/Escuela: CC. Biológicas) Sobresaliente
“Cum Laude”
42
GRUPO UNIDAD DE MEJORA GENÉTICA VEGETAL
COMPONENETES
Casanova Pena, Carlos
Gómez de Nova, Pedro José
Monte Herráiz, Juan Vicente
Soler Llinares, Mª Consuelo
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
El grupo posee una amplia trayectoria de trabajo en el campo de la mejora genética
vegetal, preferentemente de cereales de invierno.
Asimismo, tiene amplia experiencia en la utilización de gramíneas silvestres tanto para
su utilización en la mejora de formas cultivadas afines, como en la obtención de nuevos
cultivos a partir de ellas mediante selección y domesticación.
PRINICPALES LÍNEAS DE I+D+I
•
•
•
•
Obtención de trigos panaderos selectos, mediante métodos convencionales y
citogenéticos, utilización de la variación genética extraespecífica y de la
androgénesis y más recientemente de la transformación. Selección asistida
por marcadores moleculares. Análisis de la regulación y expresión genética
de los caracteres relacionados con la calidad.
Obtención de triticales hexaploides secundarios mediante métodos
convencionales y, especialmente mediante utilización de la androgénesis.
Obtención de variedades de gramíneas a partir de poblaciones heterogéneas
de gramíneas anuales autóctonas, para su utilización como cubiertas
vegetales en suelos de cultivos leñosos, preferentemente de olivar.
Selección de gramíneas anuales y perennes para su utilización en temas de
revegetación y en la recuperación de zonas degradadas y deterioradas.
43
PROYECTOS
Código y título: AGL2000-0762-C02. Búsqueda y caracterización de genes de calidad
y su utilización para la mejora convencional y por transformación, utilizando
androgénesis y cultivo de embriones inmaduros en cereales de ciclo normal y
staygreen.
Entidad financiadora: Plan Nacional de I+D+I
Duración: 2001-2003
Investigador responsable: Nicolas Jouve; Soler Llinares, Mª Consuelo
Resumen objetivos:
Con su realización se pretendía contribuir a la mejora del trigo panadero en España
mediante la obtención de nuevas formas selectas productivas y de calidad, adaptadas
principalmente a las tradicionales zonas cerealistas de secano. Para el cumplimiento de
este objetivo, las técnicas convencionales de mejora se apoyaron en técnicas tales como
introducción de variación genética extraespecífica, cultivos "in vitro" y androgénesis y
la selección del material segregante se llevó a cabo mediante la utilización de
marcadores bioquímicos, moleculares y de FISH. Asimismo se pretendía desarrollar un
protocolo para la utilización posterior de la transformación en trigos
Principales resultados:
Obtención de varios trigos panaderos de calidad y alta producción; obtención de varios
triticales androgenéticos competitivos; caracterización alélica de los principales genes
que codifican las proteínas del endospermo; cuantificación de las diferentes fracciones
proteicas dependientes de dichos genes; determinación de los parámetros que
intervienen en las propiedades de amasado de la harina y en la formación del gluten y
análisis de su relación con la composición alélica y la cantidad de proteínas; estudio de
la influencia de la introducción de genes de centeno en la calidad y producción final de
los trigos; desarrollo de un protocolo para la aplicación de la transformación (biolística,
Agrobacterium) en trigos; análisis de transformación y su detección en plantas
transformadas mediante la aplicación de FISH y técnicas moleculares
Código y título: CAO-00-019-C5-3. Manejo de cubiertas vegetales en olivar y su
incidencia medioambiental
Entidad financiadora: FAGA-FEOGA garantía
Duración: 2000-2005
Investigador responsable: Soler Llinares, Mª Consuelo
Resumen objetivos:
Se pretendía luchar contra la pérdida de suelo en los cultivos del olivo mediante la
utilización de cubiertas vegetales de gramíneas anuales que se siembran en el olivar
y que se obtienen mediante selección y domesticación a partir de poblaciones
autóctonas genéticamente heterogéneas.
Principales resultados:
Se ha puesto de manifiesto que un modo muy eficaz para luchar contra la erosión del
suelo en el olivar es el de la utilización de cubiertas vegetales compuestas por gramíneas
seleccionadas a partir de poblaciones naturales heterogéneas y que se implantan en los
olivares. Se han determinado las especies de gramíneas más favorables para la
obtención de estas cubiertas, tras un proceso de selección genética y domesticación. Se
han obtenido algunas variedades que han mostrado sus buenas características para ser
utilizadas puesto que protegen eficazmente el suelo y no entran en competencia con el
olivo.
44
Código y título: RTA02-038. Obtención de variedades de Gramíneas para su
utilización en temas de revegetación y de lucha contra la erosión en suelos alterados y
deteriorados.
Entidad financiadora: INIA
Duración: 2002-2005
Investigador responsable: Soler Llinares, Mª Consuelo
Resumen objetivos:
Se pretendía la recuperación de suelos deteriorados y alterados mediante la siembra en
ellos de variedades de gramíneas españolas, obtenidas a partir de poblaciones
heterogéneas de gramíneas autóctonas, principalmente perennes.
Principales resultados:
Se ha formado una amplia colección de gramíneas españolas, perennes y anuales, que
encierran un gran potencial para su utilización en temas de revegetación y de lucha
contra la erosión; se ha estudiado la variabilidad genética de las poblaciones
recolectadas y el modo de su utilización; se han determinado y se ha trabajado con
varias especies con el fin de obtener variedades que se puedan explotar comercialmente;
cabe destacar en este sentido los estudios y obtenciones llevados a cabo con poblaciones
pertenecientes a varias especies de festucas, Elymus y Stipa
Código y título: AGL2003-08128-C02. Mejora de la calidad de trigo y triticale por
métodos convencionales y transformación
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2003-2006
Investigador responsable: Nicolás Jouve; Soler Llinares, Mª Consuelo
Resumen objetivos:
Supone una continuación y ampliación de los objetivos del proyecto AGL2000-00762C02.
CONVENIOS
Código y título: CC02-0024. Desarrollo de cubiertas vegetales a partir de gramíneas
seleccionadas
Entidad financiadora: INIA, CIFA de Córdoba y AGROSA.
Duración:2002-2005
Investigador responsable: Soler Llinares, Mª Consuelo
Resumen objetivos:
Llevar a cabo una serie de ensayos, en diferentes ubicaciones de olivar, de variedades de
gramíneas obtenidas por el grupo de investigación, con el fin de seleccionar las mas
adecuadas para su explotación comercial en la lucha contra la erosión del suelo de
olivar.
Principales resultados:
Se encuentra en trámites en el Registro Europeo de Variedades vegetales la inscripción
de dos variedades de gramíneas para su explotación comercial
45
PUBLICACIONES
Otros artículos
Bernardo A, Peña E, De Bustos A, Soler C, Jouve N. Using AS-PCR and HPLC in
characterizing glutenin genes of a collection of Spanish common wheats. Ewac
Newsletter. Volumen 12, 40-43. (2003) UK
Jouve N, Peña E, bernardo A, Cuadrado A, Soler C. Obtención de línea de trigo,
Triticum aestivum L., con sustituciones cromosómicas 1RS/1AL (1A), 1RS/1BL (1B) y
1R (1D). Caracterización agronómica y utilización para la mejora de la calidad Actas de
Horticultura. Volumen 41, 53-56. (2004) España.
Soler C, Casanova C, Rojo A. Desarrollo de cubiertas vegetales a partir de gramíneas
seleccionadas, para su explotación en tierras de olivar. Actas de Horticultura.
Volumen:41, 97-100 (2004) España
Libros y capítulos de libros
Soler C, Casanova C, Monte JV, Saavedra M, García P. Obtención de variedades de
gramíneas para ser utilizadas como cubiertas vivas en el olivar. Investigación y
Transferencia de Resultados de Investigación al sector oleícola. 257 -261 (2003).Junta
de Andalucía. ISBN 84-95083-80-9. Sevilla
Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 5
Tesis doctorales
Título: “El género Festuca en España : estudios de variabilidad y de relaciones entre las
especies” Pedro José Gómez de Nova (Julio 2003). Directores tesis: Consuelo Soler y
Juan Vicente Monte. Universidad de Alcalá de Henares. (Facultad/Escuela: Facultad de
C. Biológicas). Calificación: Sobresaliente cum laude
46
GRUPO CONTROL GENÉTICO DEL TIEMPO DE FLORACIÓN
COMPONENTES
Jarillo Quiroga, Jose Antonio
Lázaro Somoza, Ana
Miguel Casado, Eugenio José
Oliverio Peppe, Karina Andrea
Olmo Montoro, Iván del
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
•
•
•
•
Estudio del control genético del tiempo de floración en Arabidopsis
Estudio del papel de la remodelación de la cromatina en la regulación de
transiciones de desarrollo en plantas
Estudio del papel de proteínas ligadoras de ubiquitina tipo E3 en el control
del tiempo de floración
Disección genética y genómica de las rutas de la represión floral
PRINCIPALES LÍNEAS DE I + D + I
•
•
•
•
Control del tiempo de floración en Arabidopsis
Análisis genético y genómico de la rutas represoras de la floración
Función de proteínas ligadoras de ubiquitina tipo E3 en el control del tiempo
de floración
Remodelación de cromatina y desarrollo
47
PROYECTOS
Código y título: BIO2002-00753 Análisis genético y molecular de la interacción de la
luz con las rutas de la floración en Arabidopsis. Caracterización del locus regulador
negativo ESD1.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2002-2005
Investigador responsable: Jarillo Quiroga, Jose Antonio
Resumen objetivos:
El objetivo general del presente proyecto es la caracterización genética y molecular del
locus ESD1, un posible represor del tiempo de floración en Arabidopsis, que parece
participar en la vía de la transmisión de la señal de luz roja.
Principales resultados:
Además del fenotipo de floración temprana, las mutaciones esd1 provocan efectos
pleiotrópicos que afectan a la morfología general de la planta, así como al desarrollo de
flores y frutos. En paralelo, observamos que la mutación esd1 provocaba una pérdida
parcial de sensibilidad a la luz roja y hemos demostrado la existencia de una relación
epistática de phyB sobre esd1 en la respuesta de elongación del hipocotilo en tales
condiciones. Con el fin de establecer la relación entre el locus ESD1 y las rutas de
regulación del tiempo de floración establecidas en los modelos genéticos propuestos,
hemos construido y analizado plantas dobles mutantes portadoras de mutaciones en el
locus ESD1 y en otros loci representativos de la ruta. Únicamente el análisis del tiempo
de floración de los dobles mutantes esd1fve y esd1fca reveló la existencia de una
relación de epistasia. Nosotros hemos demostrado que las mutaciones esd1 afectan al
nivel de expresión de FLC, y que por lo tanto el locus ESD1 es necesario para la
correcta expresión del gen. Sin embargo, las mutaciones esd1 también afectan al tiempo
de floración de forma independiente de FLC. El locus ESD1 ha sido clonado y codifica
una proteína relacionada con actina (ARP6), que probablemente participa en complejos
remodeladores de la cromatina.
Código y título: QLK3-CT2002-01973. Developing Single Nucleotide Polymorphic
(SNP) markers for adaptive variation in forest trees (TREESNIPs).
Entidad financiadora: Unión Europea
Duración: 2002-2006
Investigador responsable: Cervera Goy, Mª Teresa
Resumen objetivos:
El objetivo del proyecto es el estudio de la variación adaptativa en diversas especies
forestales europeas, empleando SNP (polimorfismos de nucleótidos sencillos). En
concreto, en el caso del pino rodeno (P. pinaster), este proyecto permitirá estudiar la
función de genes candidatos seleccionados en la tolerancia al estrés hídrico.
Principales resultados:
Para su ejecución se han diseñado ensayos procedencias – progenies que cuentan con 12
individuos de 20-30 familias de unas 20 poblaciones que representan la clina
pluviométrica de la especie. Se ha empleado un panel de descubrimiento de 50
individuos (5 megagametofitos de 10 poblaciones de la clina) para detectar
polimorfismos (SNPs e INDELs) en la secuencia de 6 genes candidatos y 2 genes
control, con los que se han definido haplotipos. En base a dichos haplotipos se está
procediendo a la caracterización molecular de las madres del ensayo de procedenciasprogenies, que se completa con su genotipado con microsatélites nucleares, marcadores
neutros que proporcionan información sobre los procesos históricos, así como con su
evaluación fenotípica, para estimar los efectos fenotípicos de alelos individuales y
genotipos.
48
PARTICIPACIÓN
INSTITUCIONES
EN
PROYECTOS
LIDERADOS
POR
OTRAS
Código y título: A genomic approach to the identification of the genetic and
environmental components underlying berry quality in grapevine.
Entidad financiadora: Fundación Genoma España GRAPEGEN Duración: 2004-2007
Investigador responsable: Martinez Zapater, José Miguel
Resumen objetivos:
El objetivo general de este proyecto es desarrollar herramientas derivadas de la
genética, genómica y proteómica para investigación básica y aplicada en viticultura.
49
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
Ausin, I, Alonso-Blanco, C, Jarillo, J.A., Ruiz, L y Martinez-Zapater, J. M (2004).
Regulation of flowering time by FVE, a retinoblastoma-associated protein. Nature
Genetics 36,162-166
Otras publicaciones
Capel J, Lozano, R, Martinez-Zapater, J.M., Jarillo, J.A.(2003). Ritmos y relojes
circadianos de las plantas. Ecosistemas 12, 1-9
Libros y capítulos libros
Jarillo J.A, Capel J, y Cashmore A.R (2004). Physiological and molecular
characteristics of plant circadian clocks En Molecular Biology of Circadian Rhythms,
John Wiley and Sons Inc, USA. pp. 185-209.
Nº de ponencias, comunicaciones y poster publicados: 4
Tesis Doctorales
Caracterización fisiológica y molecular de ESD1 (early in short days 1), un locus
regulador del tiempo de floración en Arabidopsis. Doctorando: Maria del Mar Martin
Trillo. Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid, 2004. Sobresaliente
Cum Laude
OTRAS ACTIVIDADES
•
•
•
Organizador del curso de Doctorado: "Respuesta de las plantas a factores
mediombientales y a estreses abioticos" Universidad de Almería Curso
2002-2003
Profesor participante en el curso correspondiente al Programa de Doctorado
del Departamento de Biología de la Universidad Autónoma de Madrid
“Biología Vegetal: Aspectos moleculares, fisiológicos y biotecnológicos”.
Clases impartidas sobre el tema “Respuestas de las plantas a la luz:
fotomorfogénesis”
Miembro experto en la comisión evaluadora del programa BIO-2003
(CICYT)
50
GRUPO BIOLOGIA REPRODUCTIVA DE PLANTAS
COMPONENTES
López González, Leticia
Miguel Casado, Eugenio
Piñeiro Galvín, Manuel
Teresa Matamoros, Libertad
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
•
•
Profundizar en el conocimiento de los circuitos génicos reguladores que
controlan el inicio de la floración con especial énfasis en aquellos factores
que reprimen la floración hasta que la planta se encuentra en condiciones
medioambientales óptimas o alcanza un nivel de desarrollo adecuado.
Analizar el papel de la remodelación de la cromatina en el control de
transiciones de desarrollo en plantas. Estamos particularmente interesados en
procesos de desarrollo con potencial biotecnológico tales como el inicio de
la floración y la dormición/germinación de semillas.
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
•
•
•
•
Control genético del tiempo de floración.
Identificación de nuevos represores de la transición floral.
Papel de la cromatina en el establecimiento de patrones de expresión génica
implicados en el control del desarrollo de plantas.
Identificación y análisis de la regulación de genes maestros de procesos de
desarrollo con potenciales implicaciones biotecnológicas.
51
PROYECTOS
Código y título: 07B/0004/2002. Análisis genético y molecular de la represión del
inicio de la floración.
Entidad financiadora: Comunidad de Madrid
Duración: 2003-2004
Investigador responsable: Piñeiro Galvín, Manuel
Resumen objetivos:
El momento de inicio de la floración es crucial para determinar el éxito reproductivo de
especies vegetales y la productividad de especies agrícolas. Para comprender mejor como
se regula este proceso hemos abordado el estudio de rutas genéticas que reprimen la
floración en Arabidopsis; en concreto, empleando aproximaciones genéticas y
bioquímicas, hemos analizado la ruta en la que participa el represor floral EBS. Además,
hemos investigado la existencia en otras especies vegetales de circuitos reguladores
homólogos al mediado por EBS en Arabidopsis, lo que podría facilitar la manipulación del
tiempo de floración en especies de interés agrícola.
Principales resultados:
Hemos identificado diversas mutaciones que suprimen el fenotipo de floración temprana
de mutantes ebs, y que por tanto podrían participar en la ruta de represión floral mediada
por EBS. Asimismo hemos iniciado la caracterización molecular del complejo proteico
represor del que forma parte EBS; finalmente disponemos de resultados que sugieren la
existencia de sistemas de represión mediados por proteínas EBS-like en otras especies
vegetales tales como tabaco, donde estarían implicadas en el control de diversos aspectos
del desarrollo.
Código y título: BIO2004-00494. Regulación del desarrollo y cromatina en plantas.
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2004-2007
Investigador responsable: Piñeiro Galvín, Manuel
Resumen objetivos:
La remodelación de la cromatina tiene un papel fundamental en la regulación de procesos
de desarrollo en plantas. Nosotros estamos analizando los mecanismos epigenéticos que
controlan algunos de estos procesos, en particular aquellos que inciden sobre la
productividad de especies agrícolas como el inicio de la floración y la germinación de
semillas. Nos proponemos caracterizar el papel de la remodelación de la cromatina en la
represión de genes centrales en el control del tiempo de floración y de la germinación de la
semilla en Arabidopsis. Abordaremos también la caracterización funcional de familias de
proteínas reguladoras de la expresión génica a través de remodelación de la cromatina y
cuyo papel en el control del desarrollo de la planta es desconocido. El conocimiento de la
regulación de estos procesos facilitará el desarrollo de programas que permitan su
manipulación en especies cultivadas.
Principales resultados:
Hemos llevado a cabo una búsqueda de mutantes que nos permitan identificar genes
implicados en la represión del gen integrador floral FT. Hemos aislado diversos mutantes
que producen una aceleración de la floración en condiciones de fotoperíodos no
inductivos. Asimismo estamos desarrollando herramientas moleculares que nos permitan
identificar factores implicados en la remodelación de la cromatina y que regulen la
germinación de la semilla. Finalmente, hemos analizado la función de la proteína SHL,
relacionada con factores remodeladores de cromatina y hemos demostrado que participa en
la represión de la floración y en la regulación de otros procesos de desarrollo. Estos
estudios ilustran el papel de la cromatina en el control del tiempo de floración y otros
aspectos del desarrollo de la planta.
52
PARTICIPACIÓN
INSTITUCIONES
EN
PROYECTOS
LIDERADOS
POR
OTRAS
Código y título: A genomic approach to the identification of the genetic and
environmental components underlying berry quality in grapevine.
Entidad financiadora: Fundación Genoma España GRAPEGEN Duración: 2004-2007
Investigador responsable: Martinez Zapater, José Miguel
Resumen objetivos:
El objetivo general de este proyecto es desarrollar herramientas derivadas de la
genética, genómica y proteómica para investigación básica y aplicada en viticultura.
53
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
Piñeiro, M., Gómez-Mena, C., Schaffer, R., Martínez-Zapater, J.M. and Coupland, G.
(2003) EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling
factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell 15, 15521562.
An, H., Roussot, C., Corbesier, L. Vincent, C., Suárez-López, P., Piñeiro, M.,
Hepworth, S., Mouradov, A., Justin, S., Turnbull, C. and Coupland, G. (2004)
CONSTANS regulates a systemic signal that induces photoperiodic flowering of
Arabidopsis. Development, 131, 3615-3626.
Piñeiro, M. and Martínez-Zapater, J.M. (2003). Vernalization. En Encyclopedia of
Applied Plant Sciences. Eds.: Thomas, B., Murphy, D., and Murray, B., pp 1056-1063.
Academic Press.
OTRAS ACTIVIDADES
Cursos impartidos
Participante (cuatro horas) en el curso “Biología Molecular de Plantas” correspondiente
al Programa de Doctorado del Departamento de Biología de la Universidad Autónoma
de Madrid “Biología Vegetal: Aspectos moleculares, fisiológicos y biotecnológicos”.
Clases impartidas sobre el tema “Fase reproductiva del desarrollo en plantas. Floración”
54
GRUPO CICLO CELULAR/RUTA DE LA UBIQUITINA
COMPONENTES
Pozo Benito, Juan Carlos del
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
Nuestro grupo está interesado en el estudio de la función de la ruta de la ubiquitina en
plantas. Esta ruta juega un papel muy importante en estos organismos, regulando una
gran variedad de procesos durante el desarrollo de la plantas. Nosotros estamos
interesados en la regulación de la división y diferenciación celular a través de la ruta de
la ubiquitina. Hemos identificado dos enzimas E3 ligasas de ubiquitina (SCFAtSKP2) que
están regulando la división celular mediante la degradación de factores transcripcionales
e inhibidores de ciclinas entre otros. En estos momentos estamos intentando identificar
más dianas de estas enzimas E3 y su relación con la respuesta a ambientes externos
adversos, ya que ambos genes se regulan diferencialmente frente a diversas condiciones
de crecimiento adversas, tales como la salinidad o la deficiencia nutricional.
Por otro lado, nuestro grupo está desarrollando una protocolo de purificación de
proteínas poli-ubiquitinadas para su posterior identificación mediante espectrometría de
masas.
Por último, también estamos muy interesados en el desarrollo radicular de las plantas.
Las raíces laterales (RL) se generan a partir de divisiones de las células del periciclo que
están paradas en G1. Hasta la fecha se conoce que la señal que dispara la formación de
las RL es la acumulación puntual de la fitohormona auxina. Asimismo, se conocen
muchos genes implicados en la formación y desarrollo de las LRs. Sin embargo, hasta la
fecha se desconoce el control genético que determina que grupo de células del periciclo
desarrollan una LR y por que otras no lo hacen. Nosotros estamos intentando responder
esta pregunta, y para ello estamos llevando acabo diversos experimentos genéticos y
moleculares.
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
•
•
•
Desarrollo: División y diferenciación celular en plantas. Papel de la ruta de
la ubiquitina en el control de la proliferación celular.
Biotecnología de plantas: mejora del sistema radicular para una mejor
adaptación de la s plantas a los diferentes medioambientes.
Proteómica: identificación de proteínas degradadas a través de la ruta de la
ubiquitina en plantas
55
PROYECTOS
Código y título: BMC-2001-2292. Control del Ciclo Celular en Plantas a través de la
Ruta de al Ubiquitina. Utilización de la Proteómica para el Estudio de la Función del
Complejo SCFAtSKP2
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2001-2004
Investigador responsable: Pozo Benito, Juan Carlos del
Resumen objetivos:
• Estudio de los factores de ciclo celular E2Fc y DPb. Analisis de su función
dentro de la proliferación y diferenciación celular en plantas.
• Identificación y estudio de complejos SCF que regulan la división celular.
Principales resultados:
En este proyecto hemos estudiado la regulación de los factores transcripcionales E2Fc y
DPc que están implicados en el control del ciclo celular. Asimismo, hemos identificado
dos proteínas con motivo F-box que tienen una alta homología a la SKP2 de humanos.
Estas dos proteínas con motivo F-box de Arabidopsis, AtSKP2A y AtSKP2B, forman
parte de los complejos SCF que funcionan como enzimas ligasas de ubiquitina. En este
proyecto hemos encontrado que la estabilidad de ambas proteínas, E2Fc y DPb se
regulan a través de la ruta de la ubiquitina-SCF(SKP2). Asimismo, mediante doshíbridos hemos identificado otras proteínas que interaccionan con AtSKP2A y en estos
momento nos hayamos en el proceso de estudiar las implicaciones de dicha interacción
(analizar si son sustratos de los complejos SCF(AtSKP2).
Código y título: BIO2004-01749. La Ruta de la Ubiquitina en Plantas. Análisis
proteómico y funcional de los complejos SCF(AtSKP2)
Entidad financiadora: Plan Nacional I+D+I
Duración: 2004-2007
Investigador responsable: Pozo Benito, Juan Carlos del
Resumen objetivos:
Estudio de la función de los complejos SCF(SKP2) en la división celular y en respuesta a
estímulos externos, tales como salinidad o deficiencia nutricionales. Estudio de la
relevancia de la ruta de la ubiquitina-SCF en el desarrollo radicular y en la formación de
primordios laterales radiculares.
Principales resultados:
La ruta de la ubiquitina juega un papel crucial en el control de la estabilidad de diversas
proteínas, muchas de las cuales desempeñan funciones importantes en diferentes
circuitos reguladores, tanto durante desarrollo programado de los organismos como
durante las respuestas a estímulos externos del medio ambiente. Datos preliminares nos
han indicado que la expresión de los genes AtSKP2 se modula en respuesta a diferentes
estímulos externos que afectan a división celular. Esto, junto al echo que los complejos
SCF(SKP2) regulan proteínas que controlan el ciclo celular, nos ha sugerido que la
degradación de ciertas proteínas dianas a través de la actividad de los complejos
SCF(SKP2) puede ser una de las vías de conexión entre el ambiente externo y la
capacidad y/o decisión de crecimiento de las plantas.
En este proyecto proponemos, utilizando como sistema modelo Arabidopsis, estudiar la
regulación y función específica de los complejos SCFSKP2, identificar las proteínas
dianas reguladas por estos complejos y determinar la función biológica de estas dianas.
Por otro lado, utilizando una aproximación proteómica, pretendemos llevar a acabo un
análisis global de las proteínas dianas que se regulan a través de la ruta de la ubiquitina
en determinados procesos. Para ello, se llevará a cabo diferentes tipos de abordajes
experimentales, utilizando técnicas bioquímicas, genéticas y proteómicas funcionales.
56
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
J.C. del Pozo, A. Lopez-matas, E. Ramírez-Parra, and C. Gutierrez. (2004) Hormonal
control of the plant cell cycle Physiologia Plantarum 123: 173-183.
57
GRUPO MEJORA GENETICA DE VID
COMPONENTES
Arroyo García, Rosa
Perez Rivera, Gemma Mª
Correo electrónico: [email protected]
OBJETIVOS
El objetivo general del grupo es la Mejora Genética de la Vid (Vitis vinifera L)
PRINCIPALES LÍNEAS DE I+D+I
•
•
•
•
Identificación varietal y clonal.
Diversidad genética en poblaciones naturales.
Aplicación de la selección asistida por marcadores moleculares para la
mejora genética de uva de mesa.
Desarrollo de herramientas genómicas y estudios de genómica funcional en
poblaciones naturales y variedades cultivadas.
58
PROYECTOS
Código y título: RF02-010-C3. Caracterización Agronómica y Molecular de vides
silvestres españolas.
Entidad financiadora: INIA
Duración: 2002-2005
Investigador responsable: Arroyo García, Rosa
Resumen objetivos:
Los objetivos generales de este proyecto son: La recolección, conservación, evaluación
agronómica y molecular de vides silvestres españolas Vitis vinifera subsp sylvestris
(C.C. Gmelin) Hegi.
Principales resultados:
En el presente proyecto se han analizado 47 de las 51 poblaciones recogidas que
corresponden a 300 individuos de la P. Ibérica. En el análisis de los 9 microsatélites
cloroplásticos polimórficos se obtuvo un haplotipo mayoritario que se le denomino A.
Estos resultados refuerzan los estudios realizados previamente (Arroyo et al., 2002) en
los que coinciden el haplotipo A como mayoritario en las poblaciones cultivadas de la
Península Ibérica. Es posible que, al contrario de lo establecido por la teoría dominante
sobre el origen de la domesticación de la vid, en la cual indica que la domesticación de
la vid tuvo lugar en la región trascaucásica y se extendió a la cuenca Mediterránea pudo
ocurrir eventos independientes de domesticación en toda el área de distribución. En el
análisis con 17 microsatélites nucleares se observo una mayor diferenciación genética
entre poblaciones que dentro de poblaciones. Por otro lado, establecimos las relaciones
genéticas entre poblaciones silvestres y variedades de vinificación de manera individual.
Los resultados obtenidos se puede observar tres grupos uno correspondiente a
accesiones silvestres, otro a cultivadas españolas y un tercer grupo correspondiente a
accesiones silvestres y cultivadas. Dentro de las variedades cultivadas de este tercer
grupo se encuentran variedades autóctonas españolas.
La evaluación agronómica de estas poblaciones silvestres se realizará durante este año.
Código y título: COREGRAPEGENE, Convenio Trilateral Europeo
Entidad financiadora: Ministerio de Educación y Ciencia Duración: 2004-2007
Investigador responsable: Martinez Zapater, José Miguel; Arroyo García, Rosa
Resumen objetivos:
El principal objetivo del proyecto es el desarrollo de una colección nuclear de genotipos
de vid (cultivados y silvestres) que representen la máxima diversidad alélica y
fenotípica que se encuentra en los bancos de germoplasma Europeos. Esta colección
nuclear se explotará en la identificación de genes responsables de caracteres de calidad
y resistencia en vid utilizando una estrategia de genética inversa.
Principales resultados:
Hasta el momento se ha desarrollado una colección nuclear de variedades cultivadas
mediante el análisis de 20 microsatelites nucleares. Se ha partido de 2300 accesiones de
variedades de vinificación y uva de mesa reduciéndose a 100 variedades que
representan la máxima diversidad alélica. Con respecto a las accesiones silvestres se ha
partido de 400 accesiones y estamos en el proceso de completar el análisis de los
microsatélites nucleares. En el futuro se va a realizar el análisis fenotípico de las
variedades cultivadas y accesiones silvestres con el fin de desarrollar la colección
nuclear con caracteres morfológicos. Por otro lado, estamos realizando la selección de
genes candidatos para el análisis funcional en estas colecciones.
59
Código y título: P2004 MA01. Estudios de la diversidad genética en vides silvestres y
cultivadas de Marruecos.
Entidad financiadora: AECI
Duración: 2004-2005
Investigador responsable: Martinez Zapater, José Miguel; Arroyo García, Rosa
Resumen objetivos:
Dentro del objetivo general, el proyecto se enfocará en los siguientes objetivos
específicos:
1. Evaluación de la diversidad genética disponible en los genotipos de vides
cultivadas y silvestres usando microsatelites nucleares y cloroplásticos.
2. Caracterización de la diversidad fenotípica para caracteres de calidad y
resistencia.
3. Establecimiento de las relaciones genéticas entre genotipos de variedades
cultivadas, entre genotipos de cultivados y silvestres, también entre genotipos
procedentes de Marruecos y cultivares del resto de la cuenca Mediterránea.
Principales resultados:
Durante este tiempo se han analizado 40 variedades autóctonas de Marruecos y 20
accesiones silvestres con 7 microsatelites nucleares. Los resultados mostraron que las
relaciones filogenéticas de las accesiones silvestres como un grupo entremezclado con
las variedades autóctonas. Esto podría indicar que las accesiones silvestres son escapes
de variedades cultivadas ó ha existido una alta contribución del germoplasma local en el
desarrollo de las variedades autoctonas. En el análisis de las variedades autóctonas de
Marruecos nos encontramos un numero elevado de sinonimias (variedades
genotipicamente idénticas con nombres distintos). La comparación de las variedades de
Marruecos con variedades de uva de mesa comercial y variedades de Túnez mostraron
una alta similitud genética con las variedades de Túnez. En la actualidad se están
realizando los análisis con microsatélites cloroplasticos y se han recolectado 7
poblaciones silvestres.
PARTICIPACIÓN
INSTITUCIONES
EN
PROYECTOS
LIDERADOS
POR
OTRAS
Código y título: A genomic approach to the identification of the genetic and
environmental components underlying berry quality in grapevine.
Entidad financiadora: Fundación Genoma España
Duración: 2004-2007
Investigador responsable: Martinez Zapater, Jose Miguel
Resumen objetivos:
El objetivo general de este proyecto es desarrollar herramientas derivadas de la
genética, genómica y proteómica para investigación básica y aplicada en viticultura.
60
PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
J.A. Cabezas, M.T. Cervera, R. Arroyo-García, J. Ibáñez, I. Rodríguez, J. Borrego, F.
Cabello and J. M. Martínez-Zapater. Garnacha and Garnacha Tintorera: Genetic
relationships and origin of teintourier varieties cultivated in Spain. American Journal
Enology Viticulture Vol. 54,237-245. (2003)
Snoussi, H., Harbi Ben Slimane, M., Ruiz-García, L. Martínez-Zapater, JM and ArroyoGarcía, R. Genetic relationships between Tunisian cultivated and wild grapevine
accessions show two group genetically separated suggesting and independent origin.
Genome. Vol47, 1211-1219. (2004)
R. Arroyo- García and JM Martínez-Zapater. Characterization of new polymorphic
simple repeat loci in grape (Vitis vinifera L). Vitis. Vol 43 (4), 175-178 (2004)
61