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DRUGS OF
TODAY
REPRINTED FROM DRUGS OF TODAY 2012, 48(SUPPLEMENT A)
FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO CON CEREBROLYSIN:
PROTECCIÓN Y REPARACIÓN CEREBRALES PARA CONTRARRESTAR LA
PATOLOGÍA DE LOS TRASTORNOS NEUROLÓGICOS AGUDOS Y CRÓNICOS
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DRUGS OF TODAY
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T. Strack (Takeda Global Research & Development, USA)
Z. Temesgen (Mayo Clinic, USA)
M.B.H. Youdim (Technion-Israel Institute of Technology, Israel)
Reprinted from Drugs of Today 2012, 48(Supplement A): 3-24
THOMSON REUTERS
Copyright © 2012 Prous Science, S.A.U. or its licensors. All rights reserved.
CCC: 1699-3993/2012
MONOGRAFÍA
FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO
NEUROTRÓFICO CON CEREBROLYSIN:
PROTECCIÓN Y REPARACIÓN CEREBRALES
PARA CONTRARRESTAR LA PATOLOGÍA
DE LOS TRASTORNOS NEUROLÓGICOS
AGUDOS Y CRÓNICOS
Eliezer Masliah 1 y Exuperio Díez-Tejedor 2
1Departmento
de Neurociencias, Universidad de California, La Jolla, California, EE UU; 2Departamento de
Neurología y Unidad de Ictus, Laboratorio de Investigación sobre Neurociencias, IdiPAZ (Instituto de Investigación
Sanitaria), Hospital Universitario La Paz, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, España
ÍNDICE
Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2
Actividades pleótropas generales de Cerebrolysin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3
Propiedades farmacodinámicas de Cerebrolysin en modelos animales de trastornos agudos y crónicos . . . . . . .11
Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
RESUMEN
Se considera que los factores neurotróficos forman parte
de la estrategia terapéutica en trastornos neurológicos
como la demencia, el ictus y el traumatismo craneoencefálico. Cerebrolysin es un preparado de neuropéptidos que
imita la acción de los factores neurotróficos endógenos en
lo que respecta a la protección y la reparación cerebrales.
Correspondencia: Eliezer Masliah, MD, Neurosciences and Pathology
Department, University of California, 9500 Gilman Drive, La Jolla CA
92093-0624, USA. E-mail: [email protected].
En modelos de demencia, Cerebrolysin reduce el depósito
de amiloide β y la fosforilación de la proteína tau asociada
a los microtúbulos mediante la regulación de la actividad
de la glucógeno sintasa cinasa-3β y la cinasa 5 dependiente de ciclina, aumenta la densidad sináptica y restablece la citoestructura neuronal. Estos efectos protegen la
integridad de los circuitos neuronales, lo que mejora el rendimiento cognitivo y conductual. Además, Cerebrolysin
mejora la neurogénesis en la circunvolución dentada, que
es la base del tratamiento de reposición neuronal en las
enfermedades neurodegenerativas. Estudios experimenta1
FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
E. Masliah y E. Díez-Tejedor
les con modelos animales de ictus han demostrado que
Cerebrolysin estabiliza la integridad estructural de las células mediante la inhibición de la calpaína y reduce el número de células apoptóticas después de una lesión isquémica. Cerebrolysin induce procesos reparadores, reduce el
volumen del infarto y la formación de edema y favorece la
recuperación funcional. Cerebrolysin también estimula la
neurogénesis inducida por el ictus en la zona subventricular, lo que confirma la autorreparación del encéfalo después del ictus. Los traumatismos encefálicos y de la médula espinal estimulan la expresión de factores neurotróficos
naturales para promover procesos de reparación y regeneración —regeneración axonal, plasticidad neuronal y neurogénesis— que se consideran fundamentales para la
recuperación futura. Los efectos neuroprotectores de
Cerebrolysin en traumatismos de la médula espinal inducidos experimentalmente demuestran que esta sustancia
evita la apoptosis de las motoneuronas lesionadas y favorece la recuperación funcional. En este apartado se resumen los datos más importantes sobre la farmacología de
Cerebrolysin obtenidos en análisis in vitro (bioquímica y
cultivos celulares) y en modelos animales in vivo de trastornos neurológicos agudos y crónicos.
INTRODUCCIÓN
Como consecuencia de la evolución demográfica, cabe
esperar que los trastornos neurológicos aumenten de
forma exponencial en un futuro próximo. El hallazgo de
un tratamiento eficaz para las enfermedades agudas o
crónicas sigue siendo un objetivo no conseguido y difícil
de lograr, debido a la intervención de múltiples variables
patógenas.
Durante mucho tiempo, la investigación de vanguardia
se centró en el diseño de compuestos con un único
mecanismo de acción farmacológico definido, pero estos
fármacos no conseguían curar enfermedades complejas
como lesiones o neurodegeneración del sistema nervioso central.
En patologías secundarias a trastornos neurológicos
agudos (p. ej., ictus o traumatismo encefálico) o a enfermedades neurodegenerativas crónicas (p. ej., demencia), el sistema nervioso muestra una escasa capacidad
de reparación, prevención de la muerte celular y regeneración. Por tanto, debido a los efectos pleótropos
(multifactoriales) de los factores neurotróficos, recientemente se ha prestado atención a su utilidad en la estrategia terapéutica dirigida a tales enfermedades. Estos
factores, también denominados neurotrofinas, como el
factor de crecimiento nervioso (NGF) y el factor neuro2
trófico derivado del cerebro (BDNF), son moléculas de
señalización en varias vías celulares que regulan el desarrollo, el funcionamiento correcto, la supervivencia y la
regeneración del tejido nervioso en condiciones fisiológicas y, lo que es más importante, después de una
lesión (1, 2). El tratamiento con factores neurotróficos
puede ser, por tanto, una opción para frenar la apoptosis neuronal y mejorar la reparación con el fin de reducir al mínimo la lesión isquémica producida por el ictus,
así como para interferir en la progresión de las demencias degenerativas y vasculares. El gran tamaño de los
factores neurotróficos (≈ 30 kDa) tiene una influencia
considerable en su potencial terapéutico, ya que se traduce en una penetración relativamente baja de la
barrera hematoencefálica.
Cerebrolysin actúa de forma similar a los factores neurotróficos endógenos pero, a diferencia de los factores
naturales, atraviesa la barrera hematoencefálica y ejerce
efectos pleótropos de neuroprotección y neurorregeneración después de su administración periférica.
Cerebrolysin es un preparado de neuropéptidos obtenido mediante una degradación enzimática normalizada
de proteínas cerebrales purificadas y contiene péptidos
de bajo peso molecular (< 10 kDa) y aminoácidos libres
(3).
Se han realizado estudios farmacológicos de Cerebrolysin en análisis in vitro (bioquímica y modelos de cultivos celulares) y en modelos animales in vivo de demencia, ictus o traumatismo encefálico. Es importante
señalar, no obstante, que ningún modelo animal de un
trastorno humano puede simular completamente las
condiciones observadas en el ser humano y que la neuropatología apreciada en los modelos puede ser más
sutil que la que se encuentra en el ser humano. En estos
modelos, Cerebrolysin ha mostrado de forma constante
efectos protectores y reparadores. Estos efectos pleótropos son exclusivos de Cerebrolysin, cuyo mecanismo de
acción no se reduce a un único mecanismo definido, sino
que implica varias vías diferentes. Cerebrolysin evita la
degeneración de las neuronas, restablece la estructura
neuronal, aumenta la densidad sináptica y estimula la
neurogénesis, lo que ha demostrado favorecer el rendimiento de la memoria y la recuperación funcional (4-7).
Los efectos protectores y reparadores de Cerebrolysin se
han evaluado en ensayos clínicos, que han demostrado
que este es un tratamiento bien tolerado para trastornos
neurológicos como el ictus isquémico, la demencia y el
traumatismo encefálico (1, 2, 8).
THOMSON REUTERS – Reprinted from Drugs of Today 2012, 48(Supplement A)
E. Masliah y E. Díez-Tejedor
ACTIVIDADES PLEÓTROPAS GENERALES
DE CEREBROLYSIN
Protección cerebral: interrupción de la cascada
patológica en diferentes fases
La protección cerebral abarca un amplio espectro de
actividades celulares para proteger a las neuronas y las
estructuras tisulares cerebrales frente a diferentes tipos
de lesiones causadas por enfermedades agudas o crónicas. Se ha demostrado que la estrategia neuroprotectora con Cerebrolysin interfiere con la excitotoxicidad (5, 9,
10), la formación de radicales libres (11, 12) y las respuestas inflamatorias (13, 14), lo que tiene como consecuencia una disminución de la muerte celular apoptótica.
Estudios in vitro han demostrado que Cerebrolysin contrarresta los efectos destructivos del glutamato, lo que
se traduce en un aumento de la viabilidad neuronal (9,
10). En un modelo murino de neurodegeneración inducida por la inyección de ácido caínico, un análogo del glutamato, el tratamiento con Cerebrolysin mantuvo la
integridad de la morfología dendrítica en el hipocampo y
la neocorteza. Debido a la aparición de gliosis indicativa
de lesión en estos cerebros, se concluyó que, en lugar de
bloquear directamente los efectos del ácido caínico,
Cerebrolysin favorecía la regeneración (5).
Entre los efectos neuroprotectores de Cerebrolysin se
encuentra su capacidad de disminuir la formación de
radicales libres bajo agresión oxidativa (11). Los estudios
acerca de los efectos de Cerebrolysin sobre la actividad
enzimática de la catalasa y la superóxido dismutasa en
el suero de ratas después de la sección bilateral de fimbria-fórnix indicaron la existencia de un efecto más indirecto del fármaco sobre estas enzimas, mediante la
reducción de la formación de sus sustratos anión superóxido y peróxido de hidrógeno en lugar de su degradación (11). En jerbos sometidos a oclusión de la arteria
carótida, Sugita y cols. (12) demostraron que el tratamiento con Cerebrolysin disminuye la formación de radicales hidroxilo en el hipocampo y la corteza cerebral
después de la reperfusión isquémica. La reducción de la
muerte neuronal observada en la región CA1 del hipocampo, una zona particularmente sensible a la isquemia, se considera una consecuencia de este efecto.
La patología de los trastornos neurológicos agudos y
crónicos también se caracteriza por reacciones neuroinmunitarias-inflamatorias que implican activación de la
microglia, producción de citocinas y procesos inmunorreactivos. Una vez activadas, las células gliales producen citocinas proinflamatorias como la interleucina-1
FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
(IL-1), que actúan como mediadores inflamatorios. En
cultivos celulares primarios, Cerebrolysin redujo la activación de la microglia inducida por lipopolisacáridos y
reguló a la baja la expresión de la IL-1β (13). Se notificaron efectos similares en un modelo de neurodegeneración en ratas inducida por la inyección intrahipocámpica
del fragmento 1-40 de amiloide β (Aβ) seguida de la
administración de lipopolisacárido (14). Se ha demostrado que Cerebrolysin reduce la activación microglial al
disminuir las concentraciones cerebrales de IL-1β y la
expresión de ED1, una proteína marcadora que demuestra la presencia de respuesta inmunitaria (Fig. 1).
Además, los estudios morfológicos indicaron un efecto
de Cerebrolysin, dependiente del tiempo y de la dosis,
sobre la activación microglial al reducir el número de
células microgliales ameboides (activadas) y aumentar
el número de células planas (en reposo).
Supervivencia neuronal: soporte neurotrófico para
mejorar la viabilidad neuronal y reducir la apoptosis
Para evitar la atrofia, la hipofunción y la muerte celular,
los factores neurotróficos ejercen acciones favorecedoras
de la supervivencia y tróficas en diferentes tipos de neuronas, entre ellas las neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal y las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, así como las neuronas periféricas
sensitivas, corticales y del hipocampo. Por consiguiente,
los cultivos primarios de estas neuronas constituyen un
análisis habitual muy utilizado para determinar la actividad neurotrófica.
Los efectos de Cerebrolysin sobre la supervivencia neuronal se evaluaron en un modelo de estrés celular en
suero a baja concentración (2%) utilizando neuronas
corticales embrionarias de pollo. En comparación con
los controles, Cerebrolysin aumentó significativamente
la viabilidad neuronal (confirmada por un análisis MTT)
y redujo el número de células apoptóticas (tinción de
cromatina) después de 4 y 8 días in vitro (6). Una mezcla
artificial de aminoácidos que reproducía la fracción aminoácida de Cerebrolysin sólo tuvo un efecto transitorio
favorecedor de la viabilidad, muy probablemente por el
mejor aporte nutricional (Fig. 2A). Las extensiones de
estos estudios que investigan un espectro más amplio
de concentraciones de Cerebrolysin han demostrado
claramente un efecto dependiente de la dosis de
Cerebrolysin sobre la viabilidad neuronal (6, 15) (Fig. 2B).
Se realizaron estudios in vivo de Cerebrolysin sobre la
supervivencia de neuronas colinérgicas septales después de la sección axonal de fimbria-fórnix en el cerebro
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FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
E. Masliah y E. Díez-Tejedor
Figura 1. A) Reducción de las concentraciones corticales de interleucina-1 beta (IL-1β) por Cerebrolysin (0,5 o 2,0 ml/kg al día i.p.
durante 7 días) en ratas con implantes de amiloide β (Aβ4) en el hipocampo y que recibieron inyecciones de lipopolisacáridos (LPS).
Los valores representan las medias. Prueba de la U de Mann-Whitney: P < 0,01 frente a Aβ4LPS para Cerebrolysin 0,5 y 2,0 ml/kg
al día. (Reproducido con autorización de Álvarez, X.A. y cols. Cerebrolysin reduces microglial activation in vivo and in vitro: a potential
mechanism of neuroprotection. J Neural Transm Suppl 2000, 59: 281-92 [14]; Springer-Verlag Viena.) B) Reducción del porcentaje
del área ocupada por células microgliales activadas marcadas con ED1, medida en el área CA1 del hipocampo después del
tratamiento con Cerebrolysin (0,5 ó 2,0 ml/kg al día i.p. durante 7 días) en ratas con implantes de Aβ4 en el hipocampo y que recibieron inyecciones de LPS. Los valores representan las medias. Prueba de la U de Mann-Whitney: P < 0,05 frente a Aβ4LPS para
Cerebrolysin 0,5 ml/kg al día (14).
de rata (16). La sección transversal de esta vía septohipocampo provoca la degeneración de las neuronas
colinérgicas septales, especialmente en el núcleo basal
de Meynert, al bloquear el suministro de NGF por parte
4
del hipocampo. Los resultados han demostrado que el
grado de degeneración y atrofia neuronal fue notablemente menor en las ratas tratadas con Cerebrolysin (5
ml/kg i.p. durante 4 semanas) que en los controles. Este
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FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
Figura 2. Viabilidad de las neuronas corticales de embriones de pollo de 9 días de vida en suero de ternero fetal (FCS) al 2%, evaluado mediante un análisis de reducción de MTT. A) Viabilidad después de 4 y 8 días in vitro (DIV). Los cultivos se complementaron
con solución salina tamponada con fosfato (control), una mezcla artificial de aminoácidos (AAmix) o 0,4 mg/ml de Cerebrolysin.
Diferencias respecto a los controles *P < 0,001 (6). B) Viabilidad después de 4 DIV, complementado con FCS al 2% más una concentración variable de Cerebrolysin. *P < 0,05, **P < 0,01. (Adaptado con autorización de Hartbauer, M. y cols. Antiapoptotic effects
of the peptidergic drug Cerebrolysin on primary cultures of embryonic chick cortical neurons. J Neural Transm 2001, 108(4): 459-73[6];
Springer-Verlag Viena.)
efecto se reflejó en la prevención de la amnesia, tanto
anterógrada como retrógrada (17, 18).
efectos antiapoptóticos observados con Cerebrolysin son
En lo que respecta a otros mecanismos bioquímicos
implicados, los estudios farmacológicos indican que los
calpaína patológicamente sobreactivada ocasiona una
el resultado también de la inhibición de la calpaína. La
degradación de proteínas citoesqueléticas como la pro-
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FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
E. Masliah y E. Díez-Tejedor
Figura 3. Actividad inhibidora proporcional a la dosis de Cerebrolysin frente a m-calpaína y tripsina, medida utilizando caseína como
sustrato mediante análisis colorimétricos. *P < 0,005; **P < 0,07 frente a inhibición por tripsina. (Reproducido con autorización de
Wronski, R. y cols. Inhibitory effect of a brain derived peptide preparation on the Ca++-dependent protease, calpain. J Neural Transm
2000, 107(2): 145-57 [21]; Springer-Verlag Viena.)
teína 2 asociada a los microtúbulos (MAP-2), uno de los
elementos citoesqueléticos más vulnerables y, por tanto,
un indicador precoz y sensible de lesión neuronal. Las
consecuencias de la disminución de las concentraciones
de MAP-2 son degeneración neuronal y muerte celular.
Se ha demostrado que Cerebrolysin contrarresta el descenso de las cifras de MAP-2 en diferentes modelos de
lesión neuronal in vitro (9, 10, 19) e in vivo (20). Estos
datos están en consonancia con los resultados de un
análisis de actividad caseinolítica, que demostraron una
inhibición no competitiva, reversible y dependiente de la
dosis, de la calpaína μ y m por parte de Cerebrolysin.
También se observaron efectos inhibidores de
Cerebrolysin sobre la tripsina (Fig. 3), lo que indica que
en la inhibición de la proteasa están implicados diferentes componentes del fármaco (21).
Neurorregeneración: estimulación de la plasticidad
cerebral
Las neurotrofinas tienen un efecto decisivo sobre la plasticidad neuronal, la capacidad del cerebro para adaptarse a las cambiantes necesidades de su entorno externo e
interno. Los mensajeros celulares como el NGF son, por
6
tanto, estímulos importantes para las modificaciones
morfológicas de la estructura celular y las nuevas conexiones sinápticas (22, 23). Satou y cols. compararon el
efecto neurotrófico de Cerebrolysin y del NGF sobre el
crecimiento axonal en cultivos explantados de ganglios
de la raíz dorsal, ganglios ciliares y troncos simpáticos
de embriones de pollo de 10 a 11 días de vida (24). En
estos estudios, tanto Cerebrolysin como el NGF produjeron extensiones de fibras nerviosas. Además, Cerebrolysin tuvo una respuesta a la dosis con forma de U invertida sobre el crecimiento axonal de los ganglios dorsales
y troncos simpáticos, pero sin efecto sobre los ganglios
ciliares. Los resultados indican que Cerebrolysin tiene
efectos diferentes en función de la subpoblación de neuronas (24).
Una de las características más importantes de las neuronas es su capacidad de experimentar cambios dependientes de la actividad para ajustar su potencia sináptica, lo que da lugar a la potenciación o depresión de la
conectividad neuronal. Esta plasticidad sináptica está
relacionada con procesos fisiológicos como el aprendizaje y la memoria, y cuando está alterada podría contribuir al deterioro cognitivo (25, 26). Estudios in vivo han
THOMSON REUTERS – Reprinted from Drugs of Today 2012, 48(Supplement A)
E. Masliah y E. Díez-Tejedor
FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
Figure 4. Efectos de Cerebrolysin sobre la inmunorreactividad a la sinaptofisina. Cortes de ratones de 5 meses de vida se sometieron
a inmunomarcado con anticuerpos contra la sinaptofisina y se analizaron con microscopia confocal de barrido por láser (LSCM).
Todas las imágenes se obtuvieron de la corteza frontal. A) Control no transgénico (no tg) tratado con solución salina. B) Ratones tg
mThy1-hAPP751 (tg APP) tratados con solución salina. C) Control no tg tratado con Cerebrolysin. D) Ratones tg mThy1-hAPP751
tratados con Cerebrolysin. Barra = 10 μm. E) Análisis de imagen del porcentaje de área cubierta por terminaciones nerviosas
inmunorreactivas a la sinaptofisina en la corteza frontal y el hipocampo de ratones tg mThy1-hAPP751 y no tg de 5 meses de vida
tratados con solución salina o Cerebrolysin. *P < 0,05 en comparación con los animales no tg tratados con solución salina mediante
ANOVA unilateral con análisis de Dunnett post hoc. (Reproducido con autorización de Rockenstein, E. y cols. Effects of Cerebrolysin
on amyloid-beta deposition in a transgenic model of Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl 2002(62): 327-36 [30]; SpringerVerlag Viena.)
demostrado que Cerebrolysin mejora el aprendizaje
espacial y la memoria en ratas jóvenes hasta 3 meses
después del tratamiento (27) y restablece la capacidad
de aprendizaje en ratas con deterioro crónico de dicha
capacidad y de la memoria cuando se administra durante 4 meses después de lesiones cerebrales (28).
La regulación sináptica ejercida por Cerebrolysin para
favorecer la integridad de los circuitos neuronales en la
enfermedad de Alzheimer (EA) se ha estudiado en ratones transgénicos que expresan proteína humana (h)
mutante 751 precursora del amiloide (APP751) bajo el
promotor Thy-1 (mThy1-hAPP751) (29-31). Estos ratones
son especiales, ya que muestran deterioro histopatológico y cognitivo a una edad mucho más temprana (a partir
de los 3 meses) en comparación con otros modelos de EA
en ratones transgénicos (29). Después del tratamiento
con Cerebrolysin (mediante inyecciones intraperitoneales
de 5 ml/kg) durante 4 semanas, se procedió a inmunomarcado de cortes cerebrales con anticuerpos contra
sinaptofisina, una proteína marcadora sináptica, y se
cuantificaron mediante microscopia confocal de barrido
por láser. En ratones transgénicos, Cerebrolysin preservó
las terminales sinápticas de la corteza frontal y del hipocampo (30) (Fig. 4), un efecto que se correlacionó con un
mejor rendimiento conductual en el laberinto de agua de
Morris, un procedimiento sensible para evaluar la orientación espacial y el aprendizaje en roedores (31). Dado
que en el aprendizaje espacial está implicado el hipocampo, el rendimiento guarda relación con su integridad
estructural y sus conexiones con la corteza cerebral.
También se describió un aumento de la densidad de terminales presinápticas inmunoteñidas con sinaptofisina
después del tratamiento con Cerebrolysin en ratas naturales de 24 meses de vida en los subcampos del hipo-
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FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
E. Masliah y E. Díez-Tejedor
campo, la circunvolución dentada y la corteza entorrinal
(32). Estos datos estaban también en concordancia con
la mejoría observada en el rendimiento cognitivo medido en el laberinto de agua de Morris (33).
sináptica (41). Por tanto, los compuestos capaces de proteger las sinapsis y promover la neurogénesis suponen
una importante promesa en el desarrollo de nuevos tratamientos para los trastornos neurológicos.
Se han obtenido resultados similares en estudios con
ratas recién nacidas, un modelo para investigar la maduración del aprendizaje y la memoria. El tratamiento posnatal precoz con Cerebrolysin (2,5 ml/kg al día) durante
los 7 primeros días de vida produjo un aumento importante del número de terminales presinápticas en la corteza entorrinal y el hipocampo (4).
Los efectos de Cerebrolysin en la neurogénesis se estudiaron en ratones transgénicos mTHy1-hAPP751 a los
que se inyectaron 50 mg/kg de bromodesoxiuridina
(BrdU) (un marcador de las células en división) una vez
al día durante 5 días, seguidos por inyecciones diarias
intraperitoneales de Cerebrolysin (5 ml/kg de p.c.) o
solución salina durante 1 ó 3 meses (7). Se analizaron, en
la zona subgranulosa de la circunvolución dentada del
hipocampo, marcadores de células recién nacidas
(BrdU), proliferación (antígeno nuclear de células en
proliferación [PCNA]), neuroblastos en emigración
(doblecortina [DCX]) y apoptosis (método de marcado
del extremo libre por dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal [TUNEL]). En comparación con
los controles naturales, los ratones transgénicos tratados con solución salina experimentaron una disminución
del número de células progenitoras neurales (BrdU+ y
DCX+) en la zona subgranulosa de la circunvolución dentada (Fig. 5). Por el contrario, cuando se trató a los animales transgénicos con Cerebrolysin, experimentaron
un aumento significativo del número y la migración de
estas células nerviosas neonatales, y una reducción de la
actividad apoptótica TUNEL. Cerebrolysin no tuvo efecto
sobre la proliferación celular (PCNA) ni sobre la proporción de células progenitoras nerviosas que se convirtieron en neuronas y astroglia en la zona neurógena del
hipocampo.
También se observó una acción sinaptotrófica de
Cerebrolysin en neuronas diferenciadas terminalmente
de la línea celular NTera de teratocarcinoma humano
(NT2N) (34).
Estos datos indican que Cerebrolysin regula la conectividad neuronal en el cerebro al facilitar el nuevo crecimiento de las prolongaciones neuronales dañadas y aumentar
la densidad sináptica, lo que apoya la capacidad del cerebro de adaptarse a los cambios en el entorno.
Reparación y regeneración cerebral: estimulación
de la neurogénesis
Los efectos regenerativos de Cerebrolysin también están
respaldados por su capacidad de promover la neurogénesis. Las neuronas neonatales proceden de células precursoras, que son células progenitoras multipotentes
con capacidad de autorrenovación y que persisten en la
edad adulta (35). Son muchos los factores que influyen
en el grado de neurogénesis en el cerebro adulto, como
un entorno enriquecido, que se debe principalmente a la
inhibición de la apoptosis espontánea y a la prolongada
supervivencia de los progenitores (36), o la muerte celular inducida por una lesión, probablemente a través de la
liberación de neurotrofinas por las células supervivientes
circundantes (37). La estimulación de las células progenitoras neuronales in vivo para proliferar, diferenciarse y
emigrar al foco de lesión se considera un instrumento
terapéutico prometedor en el tratamiento de trastornos
destructivos y degenerativos, aunque el mecanismo
exacto de estimulación aún no está claro. Estudios de
modelos animales transgénicos de diferentes trastornos
neurológicos han demostrado alteraciones significativas
del proceso de neurogénesis adulta en el hipocampo en
condiciones patológicas (38-40). Además, estudios previos revelaron que la neurogénesis que se produce en el
cerebro adulto es importante para la función de la
memoria en el hipocampo, junto con la plasticidad
8
Estos resultados concuerdan con los de estudios precedentes de cultivos de células progenitoras neurales y de
ratas adultas normales en los que se investigaron los
efectos de Cerebrolysin sobre la neurogénesis de la circunvolución dentada (42). En especial, los modelos animales de EA mostraron un aumento de las concentraciones del factor 2 de crecimiento de unión a la
heparina (HBGF-2) en la zona límbica (43), aunque las
concentraciones elevadas de HBGF-2 inhiben la neurogénesis y estimulan la proliferación de células progenitoras en lugar de su diferenciación en neuronas. En
células progenitoras cultivadas del hipocampo adulto,
el HBGF-2 redujo, de forma proporcional a la dosis, la
concentración de MAP-2 (marcador de diferenciación
/neurogénesis) y aumentó la expresión de proteína tau
asociada a los microtúbulos (marcador de proliferación), lo que indica un desplazamiento de la polaridad
dendrita a axón inducida por el HBGF-2. Estos efectos
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E. Masliah y E. Díez-Tejedor
FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
Figura 5. Análisis inmunocitoquímico cuantitativo de células positivas para bromodesoxiuridina (BrdU) y doblecortina (DCX) en
ratones no transgénicos (no tg) y transgénicos con la proteína precursora del amiloide (tg APP) tratados con (+) o sin (–) Cerebrolysin
durante 1 ó 3 meses. CM, capa molecular; CCG, capa de células granulosas; ZSG, zona subgranulosa. #, P < 0,05 en comparación con
los controles no tg tratados con excipiente; *, P < 0,05 en comparación con los ratones tg APP tratados con excipiente. (Reproducido
con autorización de Springer Science+Business Media: Acta Neuropathologica, Effects of Cerebrolysin on neurogenesis in an APP transgenic model of Alzheimer’s disease. Vol. 113, 2007, 265-75, Rockenstein, E., Mante, M., Adame, A., Crews, L., Moessler, H., Masliah, E.,
Figuras 1, 2 y 6, © Springer-Verlag 2006 [7].)
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FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
E. Masliah y E. Díez-Tejedor
Figura 6. Cortes inmunohistoquímicos marcados con bromodesoxiuridina (BrdU) de la circunvolución dentada de ratas de control
(A) y tratadas con Cerebrolysin (B) y análisis de los recuentos de células BrdU+ y NeuN/BrdU+ (C y D, respectivamente) en la capa
granulosa/subgranulosa total por cerebro. También se muestran las vías de navegación representativas de las ratas de mejor aprendizaje no tratadas y tratadas con Cerebrolysin (E), con los círculos verdes en el cuadrante superior derecho que indican la posición
de la plataforma durante la última sesión de entrenamiento. CL, Cerebrolysin; Cont., control. (Adaptado con autorización de
Springer Science+Business Media: Acta Neuropathologica, The dentate gyrus neurogenesis: a therapeutic target for Alzheimer’s disease, Vol. 105, 2003, pp. 225-32, Tatebayashi, Y., Lee, M.H., Li, L., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I., Figures 4A, 4B, 4E, 4F and 5B, ©
Springer-Verlag 2002 [42].)
Figura 7. Detección de péptidos inmunorreactivos con el factor neurotrófico ciliar (CNTF), el factor neurotrófico derivado de la estirpe
de gliocitos (GDNF) y los factores de crecimiento insulinoide I y II (IGF-I e IGF-II) en Cerebrolysin mediante análisis espectrofotométricos ELISA. En Cerebrolysin no se detectaron péptidos inmunorreactivos con neurotrofina 3 y 4 (NT-3 y NT-4) y con el factor inhibidor
de la leucemia (LIF). (Reproducido de Neurobiology of Aging, Vol. 28(8), Chen, H., Tung, Y.C., Li, B., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I.,
Trophic factors counteract elevated FGF-2-induced inhibition of adult neurogenesis, pp. 1148-62, Copyright 2007, con autorización de
Elsevier [44].)
10
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E. Masliah y E. Díez-Tejedor
fueron contrarrestados por Cerebrolysin (42). Se observó que la administración intraperitoneal in vivo de
Cerebrolysin aumentaba los progenitores del hipocampo de ratas adultas diferenciados de forma similar a las
neuronas, tanto al contrarrestar el cambio de polaridad
inducido por el HBGF-2 como al reducir la apoptosis de
células recién nacidas. Además, la potenciación de la
neurogénesis en la circunvolución dentada guardó relación con un mejor rendimiento cognitivo evaluado en la
tarea de orientación espacial del laberinto de agua de
Morris (Fig. 6) (42).
Otros estudios sobre neurogénesis realizados con cultivos de células progenitoras de ratas han identificado en
Cerebrolysin actividades de factor neurotrófico ciliar, factor neurotrófico derivado de una línea celular glial y factores de crecimiento insulinoides I y II (IGF-I e IGF-II).
Todos estos factores pueden contrarrestar los efectos
negativos del aumento del HBGF-2 sobre la neurogenésis y la maduración neuronal (Fig. 7) (44).
También se realizaron estudios sobre el potencial neurógeno de Cerebrolysin en modelos animales de isquemia
cerebral. En un estudio de ratas sometidas a oclusión
embólica de la arteria cerebral media (OACM) se demostraron aumentos significativos de las células progenitoras neurales BrdU+ e inmunorreactividad DCX (un marcador de emigración de neuroblastos) en la zona
subventricular después de 28 días de tratamiento con
2,5 y 5 ml/kg de Cerebrolysin iniciado 24 ó 48 horas después de un ictus. Cerebrolysin también redujo las células
TUNEL+ dentro del límite isquémico y mejoró el resultado funcional según las pruebas conductuales. Los datos
mecánicos revelaron un bloqueo de la vía de la inositol3-fosfato cinasa/Akt como mediador de los efectos de
Cerebrolysin sobre la migración y proliferación de células
progenitoras neurales (45).
PROPIEDADES FARMACODINÁMICAS
DE CEREBROLYSIN EN MODELOS ANIMALES
DE TRASTORNOS AGUDOS Y CRÓNICOS
Cerebrolysin es un fármaco dirigido a múltiples dianas
terapéuticas, que afecta a varias vías moleculares en la
patogenia de enfermedades complejas como la demencia, el ictus y el traumatismo craneoencefálico. Al imitar
los efectos de factores neurotróficos endógenos,
Cerebrolysin ayuda al sistema nervioso a mantener,
proteger y restablecer la función neuronal. Se han desarrollado diferentes modelos animales y, a pesar de que
estos modelos son solo una aproximación de la patología completa observada en el ser humano, representan
FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
un instrumento útil para investigar procesos patológicos subyacentes y validar la seguridad y la eficacia de
nuevos fármacos.
Demencia
Se han desarrollado diversos modelos animales para
investigar los acontecimientos moleculares asociados a
la aparición de la EA, estudiar la progresión del proceso
neurodegenerativo de la EA y determinar la importancia
anatomopatológica de moléculas o mutaciones específicas (29). Las ratas viejas, por ejemplo, son modelos
animales adecuados para estudiar las alteraciones conductuales y morfológicas cerebrales durante el envejecimiento, porque las ratas senescentes muestran alteraciones de la memoria y del aprendizaje similares a las
observadas en el ser humano (46). En ratas Long Evans
viejas, de 24 meses de vida, Cerebrolysin (2,5 ml/kg
p.c./día durante 19 días) aumentó el número de terminales presinápticas, como demuestra el incremento de la
inmunotinción de sinaptofisina, una proteína marcadora
de las vesículas sinápticas (32). Estos efectos se observaron en áreas cerebrales relacionadas con el rendimiento
cognitivo: los subcampos del hipocampo, la circunvolución dentada y la corteza entorrinal. El efecto del
aumento de la densidad sináptica sobre el rendimiento
cognitivo se investigó en el laberinto de agua de Morris,
un sistema de análisis válido para comprobar el procesamiento de la información espacial en roedores, que en
ratas senescentes es equivalente al trastorno de orientación de los seres humanos con demencia. Los resultados
demuestran que las latencias de escape y, por tanto, el
rendimiento cognitivo, mejoraron significativamente tras
el tratamiento con Cerebrolysin (Fig. 8). Además, la
observación de una diferencia significativa ya en el primer día de la prueba indicó un dominio acelerado de la
tarea (33).
También se reseñó un mejor rendimiento cognitivo con
Cerebrolysin en estudios de evitación pasiva en ratas viejas. En este modelo de ensayo conductual, se entrena a
las ratas para suprimir su comportamiento natural de
entrar en el compartimento oscuro de una caja de transporte mediante la aplicación única de un estímulo punitivo (47). El tiempo que necesitan los animales para volver
a su comportamiento natural (latencia) sirve como parámetro del rendimiento del aprendizaje. Ratas SpragueDawley de 24 meses tratadas una vez al día durante 7
días con Cerebrolysin (25 ml/kg de p.c./día) o con un
derivado de Cerebrolysin enriquecido con péptidos tuvieron un mejor rendimiento que los animales tratados con
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Figura 8. Rendimiento cognitivo medido por las latencias de escape en ratas de 24 meses de vida después del tratamiento con
Cerebrolysin o solución salina al 0,9% como control en los días de prueba 1-4 en el laberinto de agua de Morris. Diferencia significativa entre el grupo experimental y el grupo de control por día: *P < 0,05. (Adaptado con autorización de Gschanes, A., Windisch, M.
The influence of Cerebrolysin and E021 on spatial navigation of 24month-old rats. J Neural Transm Suppl 1998, 53: 313-21 [33];
Springer-Verlag Viena.)
solución salina o con una solución de aminoácidos sintéticos que reproducía la fracción de aminoácidos de
Cerebrolysin. Es interesante señalar que los análisis han
demostrado una diferencia específica de sexo en la latencia, ya que solo en las hembras se ha observado un rendimiento significativamente mejor (latencia más prolongada). El motivo de los efectos divergentes en las ratas
macho y hembra podría explicarse en diferentes principios de aprendizaje o en el umbral de respuesta al shock,
que es menor en las hembras que en los machos (9).
amnesia retrógrada, el NGF administrado por vía intracerebroventricular solo tuvo un efecto débil y el HBGF-2 no
protegió al cerebro frente a los déficit de memoria y de
aprendizaje (17). La comparación de las pruebas a corto
plazo 14 días después de la lesión de fimbria-fórnix con
las pruebas a largo plazo después de 6 meses demostró
que los efectos protectores de Cerebrolysin sólo son persistentes si el tratamiento con el fármaco se mantiene
durante 28 días; 14 días de tratamiento crónico inmediatamente después de la lesión de fimbria-fórnix sólo tienen efectos en la prueba a corto plazo (18).
Los déficits cognitivos observados en las ratas viejas también están presentes en el modelo de sección de fimbriafórnix. La separación de las vías fimbria-fórnix produce
degeneración de neuronas colinérgicas en el septo
medial debido al bloqueo del suministro de factores de
crecimiento a las neuronas colinérgicas y ocasiona déficit
en la memoria remota (amnesia retrógrada) y en la capacidad de aprender nuevas tareas (amnesia anterógrada).
La lesión experimental de las vías septo-hipocampo
seguida de tratamiento diario con Cerebrolysin (5 ml/kg
p.c. i.p.) durante 4 semanas demostró que el grado de
degeneración y atrofia neuronal en el cerebro de rata era
mucho menor que en los controles tratados con solución
salina (16). En el laberinto de agua de Morris,
Cerebrolysin administrada por vía periférica (2,5 ml/kg
p.c./día durante 14 días) antagoniza por completo la
Las investigaciones sobre los acontecimientos moleculares asociados a la aparición de la EA, la progresión de los
procesos neurodegenerativos y la función anatomopatológica de moléculas o mutaciones específicas también
se han visto facilitadas por el desarrollo de modelos de
animales transgénicos. El modelo de ratón unitransgénico mThy1-hAPP751 sobreexpresa la proteína precursora del amiloide humana mutada (hAPP751) bajo el control del promotor Thy-1 murino (29). Este modelo de
ratón transgénico es único en el sentido de que el depósito de placas de amiloide en el cerebro comienza a los 3
meses de vida, mucho antes que en otros modelos de
ratones transgénicos. En este modelo, la formación de
placas se acompaña de astrogliosis, pérdida importante
de inmunorreactividad de la sinaptofisina, apoptosis y
déficit cognitivos.
12
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El tratamiento con Cerebrolysin (5 ml/kg p.c./día durante 4 semanas) en comparación con solución salina produjo una reducción significativa de las concentraciones
de Aβ1-42 y del tamaño y la cantidad de placas Aβ-inmunorreactivas tanto en la corteza frontal como en el hipocampo de animales transgénicos de 5 meses de vida. El
examen neuropatológico reveló que Cerebrolysin promovía la regeneración sináptica en un grado semejante
al observado en los ratones de control no transgénicos
(Fig. 4) (30). Se constató una regeneración sináptica
similar en las cohortes de ratones de 6 y 9 meses de vida.
Además, Cerebrolysin redujo la proporción de neuronas
que presentaron fragmentación del ADN, detectada
mediante el método TUNEL. La carga de Aβ en la corteza frontal se redujo en un 43% en el grupo joven y en el
27% en el grupo de más edad. Los déficits de rendimiento en el laberinto de agua de Morris mejoraron significativamente en la cohorte más joven; en la cohorte de más
edad se observó una tendencia (31).
Estudios a largo plazo de estos ratones transgénicos
demostraron que los efectos neuroprotectores y antiamiloidógenos de Cerebrolysin persistían después de suspender el tratamiento (5 ml/kg p.c./día i.p. durante 3
meses). Se observaron efectos beneficiosos en el aprendizaje espacial en el laberinto de agua de Morris y en los
FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
marcadores de neurodegeneración 3 meses después de
la interrupción del tratamiento, pero desaparecieron al
cabo de 6 meses. Asimismo, las reducciones del depósito de amiloide desaparecieron al cabo de 6 meses. En
resumen, estos datos indican la persistencia de la actividad neuroprotectora de Cerebrolysin durante al menos 3
meses después de la interrupción del tratamiento, una
observación que concuerda con los resultados clínicos
de los estudios sobre EA (48).
La reducción del depósito de amiloide con Cerebrolysin
puede deberse a la regulación de la degradación del Aβ
y a la modulación de la expresión, maduración o procesamiento de la APP. Para investigar el mecanismo implicado se trató durante 6 meses con Cerebrolysin (5 ml/kg
p.c./día i.p.) a ratones mThy1-hAPP751 de 3 meses de
vida; sirvieron de controles ratones naturales tratados
con solución salina o Cerebrolysin y ratones transgénicos
tratados con solución salina. Los análisis neuropatológicos demostraron que el efecto de Cerebrolysin no está
relacionado con la expresión de APP, con la modulación
de enzimas de procesamiento de APP ni con la degradación de Aβ, sino con la regulación de la maduración de
APP y, por tanto, con su distribución intracelular. Los
análisis de inmunotransferencia han demostrado que
Cerebrolysin regula la actividad de las cinasas que inter-
Figura 9. Concentraciones de cinasa 5 dependiente de ciclina fosforilada (CDK5-p), activadores p35 y p25 de CDK5 (p35/p25) y de
glucógeno sintasa cinasa-3 beta (GSK-3β–p) en los cerebros de ratones transgénicos con proteína precursora del amiloide tratados
con Cerebrolysin o solución salina. *P < 0,05 frente a solución salina. (Adaptado con autorización de Rockenstein, E. y cols.
Cerebrolysin decreases amyloid-beta production by regulating amyloid protein precursor maturation in a transgenic model of Alzheimer’s
disease. J Neurosci Res 2006, 83(7): 1252-61 [49].)
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E. Masliah y E. Díez-Tejedor
vienen en la fosforilación de APP al reducir las concentraciones de la forma activa de la cinasa 5 dependiente
de la ciclina (CDK5) y de sus activadores p35 y p25 y
aumentar la concentración de la glucógeno sintasa cinasa-3 beta (GSK-3β) inactiva (Fig. 9).
Al reducir la fosforilazión de la APP, disminuye la cantidad de APP en el compartimento trans-Golgi antes de
su transporte axonal al área sináptica donde, una vez
degradada por las secreatasas β y γ, se libera Aβ tóxico
(7). Además, como se sabe que GSK-3β y CDK5 intervienen en la fosforilación de la proteína tau (TAU) asociada
a los microtúbulos y en el transporte axonal rápido
impulsado por cinesina, Cerebrolysin regularía también
la producción del Aβ al controlar el flujo axoplásmico
(49). GSK-3β y CDK5 fosforilan TAU en residuos esenciales para la formación de ovillos neurofibrilares, lo que
plantea la cuestión de si Cerebrolysin podría disminuir
también la patología neurofibrilar observada en la EA.
La transferencia de genes somáticos con TAU mutante
(mut) con virus adenoasociado (AAV2) (P301L) muestra
patología TAU y mayor neurodegeneración, además de
las características anatomopatológicas distintivas de los
ratones transgénicos Thy1-hAPP751 comunicadas previamente (50). A los 3 meses, los ratones recibieron una
inyección bilateral de AAV2-mutTAU en el hipocampo.
Un mes después, se inició el tratamiento con Cerebrolysin o solución salina (2,5 ml/kg p.c. i.p.) durante 3
meses. Se sacrificó a los animales para realizar análisis
de fosforilación de TAU y neurodegeneración. Los resultados han confirmado el efecto modulador de Cerebrolysin sobre la actividad de CDK5 y de GSK-3β ya publicado (49), que da lugar a una menor fosforilación anormal
de TAU y una mejoría de la enfermedad neurodegenerativa en el hipocampo (Fig. 10). Es interesante señalar que
este efecto se limitó a la región cerebral inyectada con
AAV2-mutTAU, mientras que no se observó un efecto
significativo sobre la fosforilación de TAU endógena. Por
tanto, y de acuerdo con la hipótesis de que el Aβ potencia la patología TAU (51), estos datos respaldan la participación de vías alternativas distintas a la reducción de
la fosforilación de TAU mediante la reducción de la producción de Aβ.
En la EA, los agregados de Aβ potencialmente tóxicos se
acumulan no solo alrededor de las neuronas y en los
puntos sinápticos (52), sino también en los vasos sanguíneos, originando angiopatía amiloide cerebral (53),
un rasgo anatomopatológico distintivo, que comienza a
desarrollarse en ratones mThy-1-hAPP751 ya a los 6
meses de vida. Los análisis de la microvascularización de
animales de 7 y 12 meses de vida tratados con
14
Figura 10. Efectos de Cerebrolysin sobre el número de neuronas en ratones transgénicos con proteína precursora del
amiloide (tg APP) inyectados con TAU mutante con virus adenoasociado (AAV2-mutTAU) y tratados con Cerebrolysin o
excipiente (solución salina). Las imágenes corresponden a la
inmunorreactividad NeuN en la zona del hipocampo de los animales. En comparación con los ratones tratados solo con excipiente (A, C), los ratones tg APP tratados con Cerebrolysin que
recibieron AAV2-mutTAU experimentaron una recuperación
significativa de la densidad neuronal (B, D). (Adaptado con
autorización de Springer Science+Business Media: Acta
Neuropathologica, Neurofibrillary and neurodegenerative pathology in APP-transgenic mice injected with AAV2-mutant TAU: neuroprotective effects of Cerebrolysin, Vol. 117, 2009, pp. 699-712,
Ubhi, K., Rockenstein, E., Doppler, E. et al., Figuras 7A, 7B, 7E y
7F, © Springer-Verlag 2009 [50].)
Cerebrolysin durante 3 meses han demostrado un descenso, proporcional al tiempo, del depósito de Aβ alrededor de los vasos sanguíneos. Esto se acompañó de
una microgliosis y astrogliosis perivascular reducida y de
una mejor función vascular, como demuestra la mayor
expresión de los marcadores de linfocitos B como la
molécula de adherencia de las células endoteliales a las
plaquetas (CD31) y la proteína de unión hermética ZO-1 y
una menor concentración de Aβ perivascular e intersticial y de proteína gliofibrilar ácida (54). Estos efectos de
Cerebrolysin sobre la vascularización cerebral son especialmente importantes porque no solo mejoran las alteraciones neurodegenerativas en la EA sino también la
frecuencia de microinfartos y hemorragias cerebrales
que suelen asociarse a esta enfermedad (53).
Isquemia cerebral
Se ha demostrado que los factores neurotróficos mantienen la supervivencia neuronal en respuesta a diversas
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formas de lesión en sistemas de cultivos celulares y en
modelos animales de ictus (55). Los efectos pleótropos
de Cerebrolysin se han estudiado in vitro, en cultivos de
órganos, en modelos animales de isquemia global y
focal y en modelos de rehabilitación del ictus. Se ha
demostrado que el suplemento de cultivos tisulares con
Cerebrolysin evita la degeneración neuronal y la muerte
celular en modelos diferentes de lesión in vitro relacionados con la enfermedad. Estos efectos, dependientes
de la dosis y del tiempo, se observaron después de una
intoxicación por glutamato en neuronas cultivadas de
telencéfalo de embrión de pollo (9), después de la agresión oxidativa provocada por hierro o por hierro y glutamato (10) o después de la hipoxia histotóxica inducida
por yodoacetato (19). Los estudios en los que se investigó la muerte celular tras lesiones por glutamato, yodoacetato e ionomicina demostraron una disminución de la
muerte neuronal (Fig. 11), con un desplazamiento de
necrosis a apoptosis (56).
FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
También se realizaron estudios de muerte celular en cultivos de cortes cerebrales organotípicos de crías de ratón
de 7 días de vida (57). Los cortes cerebrales se lesionaron con glutamato durante 24 horas y se cultivaron
durante otros 8 días. Se tiñeron con los compuestos
intercalantes de ADN yoduro de propidio o YO-PRO-1
para detectar necrosis y apoptosis. Las mediciones fluorescentes mostraron un descenso pronunciado tanto de
la necrosis como de la apoptosis en la región del hipocampo cuando se añadió Cerebrolysin a los cultivos de
cortes cerebrales (Fig. 12). Los efectos fueron incluso
más pronunciados cuando Cerebrolysin se añadió antes
y después de la lesión que cuando sólo se añadió después de esta.
Los datos experimentales preliminares de cultivos de
neuronas y de ratas con isquemia cerebral focal indican
que Cerebrolysin interfiere en la apoptosis al modular la
señalización del factor 1 derivado de las células del
Figura 11. Efecto de distintas concentraciones de Cerebrolysin sobre la viabilidad (%) de las neuronas corticales de pollo 24 horas
después de lesiones isquémicas agudas con glutamato (1 mM durante 1 h) o yodoacetato (0,01 μM durante 5 min) y después de la
exposición crónica a ionomicina (0,25 μM durante 24 h). Las células se cultivaron con Cerebrolysin 8 días in vitro antes de la lesión.
Los valores se refieren al porcentaje de viabilidad en comparación con controles no lesionados y no tratados (viabilidad del 100%).
*P < 0,001 frente a los controles lesionados y no lesionados. (Adaptado con autorización de Springer Science+Business Media:
Neurotoxicity Research, In vitro models of brain ischemia: the peptidergic drug Cerebrolysin protects cultured chick cortical neurons from
cell death, Vol. 4, 2002, pp. 59-65, Gutmann, B., Hutter-Paier, B., Skofitsch, G., Windisch, M., Gmeinbauer, R., Figura 2, © 2002
Taylor & Francis Ltd. [56].)
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FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
E. Masliah y E. Díez-Tejedor
Figura 12. Aparición de células necróticas teñidas con yoduro de propidio (YP) (A) y de células apoptóticas teñidas con YO-PRO-1 (B) en
cortes cerebrales organotípicos de crías de ratones tratadas (++), no tratadas (–/–) o tratadas sólo después de la lesión (–/+) con
Cerebrolysin antes, inmediatamente después y 8 días después de la lesión inducida por glutamato, medida según las lecturas de fluorescencia. Se muestran fluoromicrofotografías representativas tanto de la tinción con YP como con YO-PRO-1 en el día 13 (C). (Adaptado
con autorización de Riley, C. y cols. A peptide preparation protects cells in organotypic brain slices against cell death after glutamate intoxication. J Neural Transm 2006, 113(1): 103-10 [57]; Springer-Verlag Viena.)
16
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estroma y de PSA-NCAM (forma de ácido polisiálico de
la molécula de adherencia de las células nerviosas) (58).
La capacidad de Cerebrolysin para inducir procesos restauradores en neuronas ya en proceso de degeneración
se estudió en un análisis con glutamato y en el modelo
de privación de oxígeno/glucosa en cultivos primarios de
células corticales de pollo (59). En ambos modelos,
Cerebrolysin tuvo un potencial curativo claramente
dependiente del tiempo y de la dosis, con un efecto cuya
magnitud se debilitaba al aumentar el margen entre la
lesión y el comienzo del tratamiento, y un perfil de respuesta a la dosis característico en forma de U de
Cerebrolysin y de otros factores de crecimiento y neuropéptidos (60, 61).
Experimentos detallados acerca del posible mecanismo
de acción indicaron que Cerebrolysin estabiliza el citoesqueleto al regular la actividad de la calpaína, una proteasa dependiente de Ca2+. La integridad estructural del
citoesqueleto es un requisito para mantener una función
neuronal normal, pero se pone en peligro en condiciones
isquémicas debido a la sobreactividad de la calpaína. Un
análisis de la actividad caseinolítica de la calpaína ha
demostrado que Cerebrolysin inhibió, de forma dependiente de la dosis, tanto la calpaína μ como la m, de
manera reversible y no competitiva. Experimentos de
dilución seriada indicaron con claridad una estrecha
unión de los componentes de Cerebrolysin a calpaína, lo
que indica la existencia de fragmentos de calpastatina
en Cerebrolysin. Aunque en menor medida, Cerebrolysin
también inhibió la tripsina y la papaína, lo que denota un
mecanismo diferente de interacciones de inhibición enzimática (véase la Fig. 3) (21).
La isquemia global inducida por la ligadura bilateral de
la arteria carótida es un modelo que crea isquemia prosencefálica prolongada pero moderada en ratas. A fin de
investigar los efectos protectores de Cerebrolysin solo y
en combinación con hipotermia (35 °C), se sometió a
ratas Wistar a 6 horas de ligadura. Antes de la intervención quirúrgica, se trató a los animales una vez con
Cerebrolysin (2,5 ml/kg p.c. s.c.). En condiciones de normotermia e hipotermia, Cerebrolysin evitó la aparición
de edema y tuvo una influencia positiva en la recuperación del flujo sanguíneo cerebral local. Los efectos fueron aún más pronunciados en condiciones de hipotermia
(62).
En otro estudio se sometió a ratas Wistar a ligadura bilateral permanente de la arteria carótida y a una hipoxia
hipóxica adicional durante 15 minutos. La mortalidad en
FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
las 24 horas siguientes a la ligadura disminuyó a la
mitad en los animales tratados con Cerebrolysin (2,5
ml/kg p.c. s.c.) en comparación con los animales de control no tratados (63).
El volumen del infarto y los trastornos funcionales se
investigaron en modelos animales de isquemia focal. Se
sometió a ratas Sprague-Dawley a OACM transitoria con
reperfusión 2 horas después. Los animales recibieron
Cerebrolysin (1,0, 2,5 ó 5,0 ml/kg p.c. i.v.) o solución salina inmediatamente después de la intervención y 2, 24 y
48 horas después. Para evaluar el tamaño del infarto, se
tiñeron cortes coronales cerebrales con 2,3,5-cloruro de
trifeniltetrazolio y se analizaron mediante un sistema de
imagen interconectada por ordenador. Los resultados
revelaron una curva de dosis-respuesta con forma de U
invertida; la dosis de 2,5 ml de Cerebrolysin/kg de p.c.
fue la que logró el mejor efecto terapéutico. En comparación con los controles tratados con solución salina,
esta dosis de Cerebrolysin redujo el volumen del infarto
en un 64% y fue más eficaz para mejorar los déficits neurológicos. La mortalidad disminuyó en todos los animales tratados con Cerebrolysin (Fig. 13) (64).
En un estudio similar se sometió a ratas Thomae a
OACM durante 2 horas, seguido de reperfusión durante
90 minutos. Se trató a los animales una vez con
Cerebrolysin (2,5 mg/kg p.c. s.c) 30 minutos antes de la
intervención. Los cortes cerebrales se tiñeron con hematoxilina y eosina (H y E) para el análisis de volumen del
infarto y se sometieron a inmunotinción de MAP-2 como
un parámetro de trastornos funcionales. El edema cerebral se calculó morfométricamente. Cerebrolysin redujo
en un 50-80% la pérdida de neuronas alteradas funcionalmente en zonas relevantes del cerebro y tuvo un efecto beneficioso en el volumen del infarto y la aparición de
edema (65).
Los efectos promotores de recuperación de Cerebrolysin
se investigaron en un modelo de OACM permanente
mediante electrocoagulación. En el primer paso se estudiaron diferentes concentraciones de Cerebrolysin y se
observó que una dosis de 2,5 ml/kg p.c. i.p. durante 21
días iniciada 24 horas después de la lesión era más eficaz en lo que respecta a la recuperación funcional que la
dosis de 1,0 ó 5,0 ml/kg p.c. En el siguiente estudio de
intervalos de tiempo utilizando una dosis de 2,5 ml/kg
p.c. de Cerebrolysin (i.p.) en comparación con los controles tratados con solución salina se comunicó una recuperación importante de la función sensitivomotora cuando el tratamiento se inició 24 ó 48 horas después de la
lesión; sin embargo, un intervalo de 72 horas resultó
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E. Masliah y E. Díez-Tejedor
Figura 13. Fotografías representativas de cortes cerebrales teñidos con 2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) que muestran un
infarto 72 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media y de 2 horas de reperfusión en ratas tratadas por vía intravenosa
con Cerebrolysin o excipiente. El volumen relativo del infarto después del tratamiento se representa en el gráfico. (Reproducido con
autorización de Hanson, L.R. y cols. Cerebrolysin reduces infarct volume in a rat model of focal cerebral ischemic damage. Am J
Neuroprotec Neuroregen 2009, 1(1): 60-6 [64].)
ineficaz. Es interesante señalar que, a pesar de la mayor
recuperación neurológica observada cuando el tratamiento se inició en 48 horas, no se observó ningún efecto sobre el volumen del infarto determinado 21 días des18
pués del ictus mediante tinción con H y E y análisis de
imágenes interconectadas por ordenador. Estos resultados coinciden con los obtenidos con los factores de crecimiento HBGF-2 o proteína morfogenética ósea 7 y
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señalan que la estimulación de la germinación axonal es
un posible mecanismo de reparación funcional o de
mayor proliferación y diferenciación de las células progenitoras neuronales (66). Estos resultados también estarían relacionados con observaciones independientes de
mejor neurogénesis y resultados funcionales después de
una oclusión embólica experimental de la arteria cerebral media en roedores. En dosis de 2,5 y 5 mg/kg,
Cerebrolysin produjo un aumento significativo de los
recuentos de células progenitoras neurales BrdU+ en la
zona subventricular y de inmunorreactividad DCX en la
zona homolateral subventricular y del límite isquémico
estriatal tras 28 días de tratamiento iniciado en las 24
horas siguientes al ictus experimental. Cerebrolysin
también redujo las células TUNEL+ en el límite isquémico y, aunque el volumen del infarto no disminuyó con el
tratamiento, pruebas conductuales indicaron mejores
resultados neurológicos. Al igual que en otros estudios
mencionados, Cerebrolysin también favoreció la migración de células progenitoras neurales, todo lo cual indi-
FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
ca que la potenciación de la neurogénesis secundaria a
la isquemia y los mejores resultados funcionales pueden
estar relacionados con el aumento de la proliferación,
diferenciación y migración de células progenitoras neurales (45).
En resumen, un gran número de estudios experimentales demuestran que Cerebrolysin contrarresta los procesos fisiopatológicos que se producen en la cascada
isquémica y favorece la recuperación y neuroplasticidad
después de una lesión isquémica.
Lesión traumática encefálica y de la médula espinal
Se ha identificado un número muy elevado de factores
neurotróficos cuya expresión está aumentada en respuesta a la lesión encefálica traumática. Se ha demostrado que interfieren en las cascadas causadas por dicha
lesión y favorecen procesos reparadores y regenerativos
como regeneración axonal, plasticidad neuronal y neurogénesis, que podrían ser fundamentales para la recu-
Figura 14. Cortes microscópicos de los segmentos medulares C5 de controles intactos (A) y lesionados tratados con excipiente (B),
así como de ratas lesionadas tratadas con factor neurotrófico derivado del cerebro (C) o Cerebrolysin (D). Se incubaron segmentos
de médula espinal marcados con fluoro-rubí para tinción de inmunofluorescencia de acetiltransferasa de colina a fin de detectar la
regeneración axonal en el muñón nervioso musculocutáneo. Escala de las barras = 135 ?m. (Adaptado con autorización de Springer
Science+Business Media: Experimental Brain Research, Reinnervation of the rat musculocutaneous nerve stump after its direct reconnection with the C5 spinal cord segment by the nerve graft following avulsion of the ventral spinal roots: a comparison of intrathecal
administration of brain-derived neurotrophic factor and Cerebrolysin, Vol. 159, 2004, pp. 425-32, Haninec, P., Dubovy, P., Samal, F.,
Houstava, L., Stejskal, L., Figura 2, © Springer-Verlag 2004 [70].)
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FARMACOLOGÍA DEL TRATAMIENTO NEUROTRÓFICO
E. Masliah y E. Díez-Tejedor
peración después de un traumatismo encefálico (67).
Se investigaron los efectos neuroprotectores de
Cerebrolysin en lesiones medulares agudas inducidas
experimentalmente en perros sobre bases clínicas e histológicas. La lesión de la médula espinal se indujo por
compresión utilizando un balón inflado de una sonda de
Foley sobre los segmentos medulares mediotorácicos
(68). Los resultados demuestran que Cerebrolysin (3
ml/día i.m. durante 6 días comenzando 3 horas después
de la intervención quirúrgica) evitó las alteraciones
degenerativas en la mayor parte de las neuronas del
asta anterior de los segmentos medulares lesionados y
posteriormente su propagación a las fibras nerviosas
axonales de la sustancia blanca. El tratamiento con
Cerebrolysin también produjo una mejoría clínica gradualmente progresiva de la función neurológica.
La avulsión de la raíz ventral ocasiona pérdida de motoneuronas debido a apoptosis en el segmento medular
correspondiente. La supervivencia de las motoneuronas
en el asta ventral fue significativamente mayor después
de 4 semanas de administración intratecal de IGF-I o
Cerebrolysin, sin diferencias significativas entre los dos
tratamientos (69).
También se utilizó el modelo de reconexión de las raíces
anteriores para evaluar y comparar la mejoría del rescate de motoneuronas y de la reinervación funcional del
músculo bíceps en ratas tras la administración intratecal
de Cerebrolysin (12 μl/día) y BDNF (5 μg/d) mediante
minibombas osmóticas (velocidad 0,5 μl/h) durante 4
semanas. Cuatro meses después de la intervención, el
tratamiento con BDNF o Cerebrolysin produjo un
aumento significativo del número de neuronas motoras
marcadas de forma retrógrada (un indicador de la regeneración axonal en el muñón nervioso musculocutáneo),
las áreas somáticas del corte y la densidad de los axones
regenerados en comparación con el tratamiento con
excipiente. Cerebrolysin protegió a las motoneuronas
contra la muerte celular y fue más eficaz que BDNF para
la recuperación funcional del nervio motor dañado (Fig.
14) (70).
CONCLUSIONES
Los estudios farmacológicos realizados con cultivos
celulares y modelos animales demuestran sistemáticamente los efectos protectores y regenerativos de
Cerebrolysin en trastornos neurológicos agudos y crónicos como la demencia, el ictus y los traumatismos del
encéfalo y la médula espinal. Cerebrolysin interfiere en
20
diferentes pasos de la cascada patológica, lo que da
lugar a efectos pleótropos del tratamiento similares a los
producidos por factores neurotróficos. A diferencia de
estos, los péptidos de Cerebrolysin tienen un bajo peso
molecular, lo que les permite atravesar la barrera hematoencefálica y, por tanto, aumentar la escasa capacidad
de autorreparación del cerebro en condiciones adversas
mediante su administración periférica.
La influencia positiva de Cerebrolysin en la protección y
reparación estructural y funcional es la base de su eficacia
clínica en enfermedades neurológicas complejas. El positivo perfil de seguridad de Cerebrolysin subraya su importancia clínica en una estrategia de tratamiento eficaz.
DECLARACIÓN DE INTERESES
La elaboración de este suplemento de Drugs of Today fue
financiada por EVER Neuro Pharma, el fabricante de
Cerebrolysin. Los autores no han recibido remuneración
alguna por la redacción de este artículo.
E. Díez-Tejedor es coautor de toda la información contenida en este artículo, excepto la relativa a demencia.
E. Masliah ha contribuido como conferenciante en congresos para EVER Neuro Pharma (previamente EBEWE
Neuro Pharma) y parte de su investigación ha sido financiada parcialmente por EVER Neuro Pharma. E. DíezTejedor ha colaborado como asesor clínico, investigador
en ensayos clínicos o como conferenciante para las
empresas siguientes: AstraZeneca, Bayer, Bristol-Myers
Squibb, Boehringer Ingelheim, Ferrer, Pfizer, sanofiaventis, Servier, UCB Pharma, Uriach, EVER Neuro
Pharma y Lundbeck.
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Brain-derived peptides reduce the size of cerebral infarction
C
THOMSON REUTERS – Reprinted from Drugs of Today 2012, 48(Supplement A)
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