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CLASIFICACIÓN, MICROMANIPULACIÓN Y CONGELADO DE
EMBRIONES BOVINOS
Fecha: ___________
Nombre y Apellido: ___________________
Objetivo:
1. Transferir lo estudiado a lo largo del curso en la resolución de las actividades
presentadas.
Criterios de evaluación:
1. Manejo conceptual, nivel de profundización y capacidad para establecer
relaciones.
2. Capacidad crítica y posibilidad de realizar análisis personales.
3. Integración y transferencia de lo estudiado a situaciones concretas.
1. Observe las fotografías de embriones y en base al Sistema de Evaluación de
embriones de la Sociedad Internacional de Embriones (IETS) haga una
clasificación de los embriones según:
a. el estadio de desarrollo
b. la Calidad (grado 1,2,3,4).
c. Explique para cada fotografía la/s característica/s que tuvo en cuenta
para calificar los embrión.
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Foto N°1: Estadio: 4, 7 días. Calidad: 1 excelente, embrión ideal, esférico,
simetrico, con células de tamaño, color y textura uniformes
Foto N°2: Estadío: 7. 7,5 días. Calidad: bueno, pequeñas imperfecciones como
algunas blastomeras sueltas, tamaño irregular o algunas vesículas.
Foto N°3: Estadío: 7. 7,5 días. Clara diferencia entre el trofoblasto y el macizo
celular interno. El embrión se identifica claramente y ocupa casi todo el espacio
perivitelino. Calidad: Excelente, embrión esférico, simétrico, con células de
tamaño, color y textura uniformes
Foto N°4: Estadio 5 ó Blastocito temprano, cavidad con fluído ó blastocele,
apariencia sello como anillo, se puede diferenciar el trofoblasto del macizo
celular interno. Día 7-7,5.Calidad: bueno pequeñas imperfecciones como
blastómeras sueltas, tamaño irregular o algunas vesículas
Foto N°5: Estadio: 5. 7 días. Calidad: 2 Bueno: pequeñas imperfecciones,
blastómeras sueltas, tamaño irregular y vesículas.
Foto N°6: Estadio 4 Mórula. Dia 6 Calidad: 2 bueno, hay blastómeras sueltas,
tamaño irregular, vesículas.
Foto N°7: Estadio 6 o Blastocito. Calidad: degenerado, células de apariencia
vesicular, granular y blastómeras sueltas y desorganizadas
Foto N°8:
Calidad: Infertilizado, puede ser confundido con una mórula compacta o con un
blastocito expandido. Apariencia granular (puntillado) rodeado por una
membrana vitelina lisa.
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2. Realice una comparación entre el método de congelado de embriones con
etilenglicol y la vitrificación teniendo en cuenta: medios de congelado, toxicidad,
curva de congelado, método de descongelado y practicidad (costos,
entrenamiento, etc.).
Etilenglicol (EG) -crioprotector intracelular
-previene formación de cristales de hielo
-evitan daños tóxicos u osmóticos a nivel celular
Congelado de Embriones con Etilenglicol
- Reemplaza el agua intracelular en las células de los embriones antes de la
congelación.
- Combinado con tasas lentas de congelamiento reduce los cambios de
volumen celular y minimizan la formación de cristales de hielo dentro de
las células.
- Descongelación: debe realizarse rápidamente para evitar la
recristalización ( aprox. a 250 ° C/min)
Vitrificación
- Involucra el uso de mezclas de crioprotectores como glicerol y etilenglicol,
glicerol y propanediol o etilenglicol y propanediol con sacarosa, tetralosa o
galactosa
- Proceso de enfriamiento que permite la formación del estado vítreo de una
solución, por medio de la extrema elevación de la viscosidad sin la
presencia de cristalización.
- El estado vítreo promueve la distribución iónica del líquido , impidiendo la
formación de cristales de hielo en espacios intra y extracelulares
- Reduce la ocurrencia de daños químicos y mecánicos que ocurren
durante el enfriamiento y que si existen con el congelamiento
- Las curvas de enfriamiento son más rápidas en comparación con el
congelamiento, asociadas a mayores concentraciones de crioprotectores.
- Lesiones tóxicas por el uso de altas concentraciones de crioprotectores
- Lesiones osmóticas por alteraciones en el volumen celular durante la
adición y dilución de las soluciones de crioprotectores dentro de las
células embrionarias
- Para disminuir la toxicidad y sus efectos existen estrategias, entre las
cuales están : - uso de crioprotectores de baja toxicidad usando
crioprotectores de bajo peso molecular y así reducir la concentración y
tiempo de exposición dentro de las soluciones crioprotectoras, previniendo
de igual forma los daños de tipo osmóticos causados en las células
-asociación de uno ó más crioprotectores aminoran la
toxicidad de las soluciones de vitrificación, al aumentar la permeabilidad
de sus agentes y reducir la toxicidad específica de cada uno de los
componentes por medio de la combinación de estructuras químicamente
compatibles. La asociación más común es DMSO con EG. También
soluciones hipertónicas compuestas por crioprotectores extracelulares
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como proteínas , sacáridos o polímeros. Estas soluciones permiten
disminuir los daños osmóticos al disminuir la velocidad de entrada de agua
a las células, el más usado es la sacarosa.
-la manipulación en la exposición de embriones a las
soluciones crioprotectoras, puede determinar una mayor o una menos
taza de sobrevivencia durante la vitrificación
- al controlar por medio del tiempo y la temperatura de
exposición son las principales variables porque son las que determinan los
efectos osmóticos y tóxicos sobre las células embrionarias. La exposición
de los embriones por etapas de la concentración final de la crioprotectora,
disminuye el estrés osmótico , permitiendo que las células embrionarias
tengan un mejor intercambio de líquidos a través de las membranas. Este
principio es válido también durante el descongelamiento, al prevenir la
velocidad de retirada del crioprotector de las células durante la dilución.
- Las curvas de enfriamiento son fundamentales en el proporcionamiento
del estado amorfo, al moento de la vitrificación. La vitrificación se logra
con una concentración de de 1,5 M de cualquier crioproector, mientras
que la tasa de enfriamiento que se emplee sea de 15000°C/min.
Método de Congelado de Embriones
1° Exposición de los embriones a temperatura ambiente (22°C) a
concentraciones molares de un crioprotector permeable de bajo peso
molecular como EG, hasta que se alcanza el equilibrio entre la solución
crioprotectora y el embrión
2° Inducción de la formación de cristales de hielo ( seeding) entre -5 y 7°C.
3° Descenso lento y controlado de la temperatura (0,33 a 11,0 °C/min)
hasta los -30°C ó -35°C.
4° Colocación en nitrógeno líquido (N2; -196°C) donde puede permanecer
almacenado indefinidamente
5° Descongelación controlad-2
6° Remoción del crioprotector a temperatura ambiente.
7° Transferencia del embrión a una receptora.
La congelación de embriones se aplica en programas de transferencia de
embriones, facilita el comercio internacional de genética. La
criopreservación con etilenglicol tiene una gran ventaja porque permite la
transferencia directa de embriones bovinos sin retirar el crioprotector luego
del descongelado. La pajuela con el embrión se descongela en agua y
una vez en útero, el crioprotector sale del embrión y este se hidrata con
los fluidos del tracto reproductivo obteniendo una tasa de preñez del 58%
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Curva de Congelado
Método de Vitrificación
- Exponer los embriones durante 1-3 min. A temperatura ambiente (20 °C)
en una solución de equilibrio compuesta por: 10% DMSO + 10% EG en
PBSm.
- Pasar los embriones a una segunda solución, llamada solución de
vitrificación, cuyo volumen no debe ser mayor a 5 ul.
- Depositar los embriones en una tercera gota no mayor a 1 ul, para evitar
el aumento de volumen, sin sobrepasar los 25 segundos, entre las dos
gotas. Estas dos gotas de la solución de vitrificación tendrán una mayor
concentración, compuestas por: 20% DMSO + 20% EG en PBSm.
- Colocar posteriormente el extremo más fino de la OPS en la última gota,
para que por medio de capilaridad, los embriones sean almacenados en el
extremo inferior del envase, con el mínimo de volumen posible.
- Sumergir inmediatamente la OPS en el nitrógeno líquido (-196°C)
- Guardar las OPS dentro de gobelets, para poder ser almacenados dentro
de los termos de nitrógeno
Proceso de descongelamiento:
Se realiza a través de la exposición de las OPS en gotas de 0,25 M de
sacarosa, lo que permitirá el descongelamiento gradual y el control de la
entrada de agua a las células.