Download iracbiogen

Especialización en Reproducción bovina 2011
IRAC
CLASIFICACIÓN, MICROMANIPULACIÓN Y CONGELADO DE
EMBRIONES BOVINOS
Fecha: ___________
Nombre y Apellido: ___________________
Objetivo:
1. Transferir lo estudiado a lo largo del curso en la resolución de las actividades
presentadas.
Criterios de evaluación:
1. Manejo conceptual, nivel de profundización y capacidad para establecer
relaciones.
2. Capacidad crítica y posibilidad de realizar análisis personales.
3. Integración y transferencia de lo estudiado a situaciones concretas.
1. Observe las fotografías de embriones y en base al Sistema de Evaluación de
embriones de la Sociedad Internacional de Embriones (IETS) haga una
clasificación de los embriones según:
a. el estadio de desarrollo
b. la Calidad (grado 1,2,3,4).
c. Explique para cada fotografía la/s característica/s que tuvo en cuenta
para calificar los embrión.
Especialización en Reproducción bovina 2011
IRAC
2. Realice una comparación entre el método de congelado de embriones con
etilenglicol y la vitrificación teniendo en cuenta: medios de congelado, toxicidad,
curva de congelado, método de descongelado y practicidad (costos,
entrenamiento, etc.).
Respuestas:
FOTOS DE EMBRIONES.
El orden de las fotos para clasificarlos fueron de izquierda hacia derecha y de
arriba hacia abajo.
1) Estadio 4; Calidad 1 : Fundamentos, La masa celular es bien
redondeada, compacta y homogénea, la zona pelucida normal y no esta
adelgazada. No se encuentran células desprendidas ni degeneradas.
2) Estadio 3; Calidad 1 : Fundamentos, La masa celular e irregular y se
puede diferenciar el conjunto de células, la zona pelucida esta normal e
intacta. No se observan células degeneradas.
3) Estadio 4; Calidad 3 : Fundamentos, Se nota una mórula con un 50% o
mas de sus células degeneradas, una zona pelucida adelgazada, un
espacio perivitelino muy marcado.
4) Estadio 4, Calidad 3 : Fundamentos, Se observa una masa celular
irregular con mas del 50 % de las células degeneradas y que ocupan
casi todo el espacio perivitelino. Zona pelucida bien marcada y definida.
5) , 7) y 8) Estadio 4; Calidad 2 : Fundamentos, se nota una masa celular
redondeada con menos del 50 % de sus células degeneradas cuyos
blastomeras se notan de un color diferente, esta masa celular esta
ocupando casi todo el espacio perivitelino. La zona pelucida se
encuentra bien marcada y no esta adelgazada.
6) Estadio 5; Calidad 2 : Fundamentos , En este conjunto de células se
puede diferenciar en el contenido celular el blastocele, esta masa no es
muy homogénea y se pude diferenciar alguna degeneración celular. La
zona pelucida tiene un buen tamaño y forma. Esto en forma general para
toda la foto, hay 2 embriones que no alcanzo a ver el blastocele por lo
tanto podríamos estar en presencia de mórula compacta de calidad 2.
9) Infertilizado, Fundamento, en su masa celular se nota como un
puntillado, no viéndose división celular alguna, rodeado de una
membrana vitelina lisa.
RESPUESTA A LA PREGUNTA N° 2
El etilenglicol tiene la ventaja de transferirse en forma directa sin
sufrir daño en el útero por ser un medio isotónico.
El método de vitrificación necesita un proceso de descongelamiento
mas lento antes de ser transferido para no sufrir daño omótico.
Con el método de etilenglicol el embrión puede ser transferido en la
misma pajuela en la que fue congelada.
Especialización en Reproducción bovina 2011
IRAC
En la vitrificación se necesita sacar el embrión del envase en el que
fue congelado para cargarlo en una nueva pajuela y transferirlo.
En el método de etilenglicol se puede sincronizar las donantes y
receptoras al mismo tiempo y a su vez es un método simple.
En el método de EG se necesita un equipo para congelar los
embriones de un costo considerable.
En la vitrificación no se necesita un equipo para congelar los
embriones por lo tanto es un método menos costoso ideal para los
que se inician en la actividad.
Con respecto a las curvas de enfriamiento es más rápido con el
método de vitrificación si trabajamos con pocos embriones.
En cambio si necesitamos congelar muchos embriones es más útil el
proceso de EG ya que la congeladora posee muchos orificios para
congelarlos.
El método de vitrificación necesita concentraciones de
crioprotectores mayores que el de EG y esto resulta mas toxico para
los embriones para disminuir esa toxicidad se hace necesario utilizar
dos crioprotectores, por lo cual puede resultar mas engorrosa la
operación.
La vitrificación puede producir mayor daño de tipo omótico por el
cambio en el volumen intracelular.
Con respecto a los métodos de congelación en el caso de la vitrificación
hay varios métodos pero el más utilizado es el método OPS
1) Exponer los embriones por 1-3 min. a temperatura ambiente 20°C en
una solución de equilibrio por un 10% DMSO mas 10% EG en PBSm.
2) Pasar los embriones a una segunda solución, denominada solución
de vitrificación cuyo volumen no debe ser mayor de 5 uL.
3) Poner consecutivamente en una tercera gota no mayor a 1 uL los
embriones, para evitar así el aumento de volumen, sin que pase más
de 25 seg. Entre las 2 gotas. Por lo tanto esta dos gotas tendrán una
concentración de 20% de DMSO y 20% EG en PBSm.
4) Colocar posteriormente el extremo mas fino de las OPS (open pulled
straw) en la última gota, para que por medio de capilaridad suba el
embrión y quede en el extremo inferior del envase con el mínimo
volumen posible.
5) Sumergir inmediatamente la OPS en el nitrógeno líquido ( -196 °c).
6) Guardar las OPS en goblets para poder almacenarlos en los termos
de nitrógenos.
7) El proceso de descongelamiento se realiza a través de la exposición
de las pequeñas pajuelas expuestas a la llama las cuales tienen los
embriones en su interior con gotas de 0,25 M de sacarosa, lo que
permite el descongelamiento gradual de los embriones y a su vez
controla la entrada de agua en las células.
El método de congelación por EG el el sig.
1) Clasificar los embriones.
2) Lavarlos y volver a clasificarlos.
Especialización en Reproducción bovina 2011
IRAC
3) Colocarlos en EG 1,5 M y cargar la pajuela, el tiempo que debe
transcurrir para realizar estas tareas no debe sobrepasar los 10 min.
dependiendo te la temperatura ambiente.
4) Colocar las pajuelas en la congeladora (-5 a -7 °C) y dejar 1 a 2 min.
5) Realizar el seeding.
6) Congelar a 0,6 °C por minuto hasta -35°C.
7) Sumergirlas en N2 liquido (-196 °C)
Para su descongelación se saca la pajuela y se coloca a baño maria a 30°C
hasta que se descongele la pajuela, se saca la pajuela se seca bien y se
transfiere dentro de los 15 min. de descongelado.