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Especialización en Reproducción bovina 2011
IRAC
CLASIFICACIÓN, MICROMANIPULACIÓN Y CONGELADO DE
EMBRIONES BOVINOS
Fecha: ___________ Nombre y Apellido: Alfie DIego________________
Objetivo:
1. Transferir lo estudiado a lo largo del curso en la resolución de las actividades
presentadas.
Criterios de evaluación:
1. Manejo conceptual, nivel de profundización y capacidad para establecer
relaciones.
2. Capacidad crítica y posibilidad de realizar análisis personales.
3. Integración y transferencia de lo estudiado a situaciones concretas.
1. Observe las fotografías de embriones y en base al Sistema de Evaluación de
embriones de la Sociedad Internacional de Embriones (IETS) haga una
clasificación de los embriones según:
a. el estadio de desarrollo
b. la Calidad (grado 1,2,3,4).
c. Explique para cada fotografía la/s característica/s que tuvo en cuenta
para calificar los embrión.
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1) 4.1 La masa celular es compacta, su color es uniforme, la zona pelucida
esta intacta y es de tamaño normal, no está adelgazada. No tiene
células muertas, desprendidas ni degeneradas. La masa celular es bien
redondeada.
2) (3.1) Es una mórula temprana, sus células son de gran tamaño porque
todavía no ha sufrido una gran mitosis y no se ha compactado. A pesar
de ser una mórula de 5 o 6 días sus células ya no se pueden
contabilizar. Su color es uniforme y su forma es simétrica. Aunque da la
sensación de que las células de la periferia son de mayor tamaño, la
textura indica lo contrario
3) 4.3 Es una mórula con mas del 50 % de sus células degeneradas. La
zona pelucida es muy delgada. Hay detritus celular la diferencia de color
entre las células del embrión es muy marcada, el espacio peri vitelino es
muy marcado.
4) (4.3) Es una mórula con mas del 50 % de las células degeneradas,
Hacia la derecha se puede ver las células “sanas” formando la mórula de
un tamaño mas pequeño que el que formaría si todas las células fueran
normales, es un embrión apto para ser transferido en fresco pero no
para congelar y no sirven para el comercio internacional. La zona
pelucida no presenta lesiones.
5)
6) 5.1 Son blástulas de excelente y buena calidad. La masa celular es
compacta, puede llegar a haber algunas imperfecciones como
blastomeras sueltas y tamaño irregular pero en general el color y el
tamaño de las células es uniforme, su forma es esférica y simétrica
7) (4.2) Es una mórula de aproximadamente 6 días. Tiene entre el 50 y el
84 % de su masa celular intacta aunque hay algunas células
degeneradas y de distinto tamaño. La zona Pelucida esta intacta. El
cumulo de celula sanas matienen la simetría y el grado de
compactación.
8)4.2. Es una mórula que tiene menos de 50 % de la masa celular degenerada
pero no tiene mas del 84 % de la masa celular intacta. La zona pelucida está
intacta y no esta muy adelgazada. El color de las blastomeras es diferente en la
zona degenerada y su textura también
9) Infertilizado. No tiene células divididas, es un huevo infertilizado. Lo que se
ve e el citoplasma del ovocito con sus zona pelucida
2. Realice una comparación entre el método de congelado de embriones con
etilenglicol y la vitrificación teniendo en cuenta: medios de congelado, toxicidad,
curva de congelado, método de descongelado y practicidad (costos,
entrenamiento, etc).
Existen muchas diferencias entre ambos métodos aunque su finalidad es la
misma (la crio preservación de embriones para poder utilizarlos en el futuro,
para poder transportarlos, venderlos, exportar/importar, etc.)
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En cuanto a la forma y método de transferencia, el Etilenglicol (EG) tiene la
ventaja de poder transferirse en forma directa, de una solución 1,6M a un
medio isotónico como es el útero sin sufrir daño. En cambio, el método de
vitrificación necesita realizar un proceso de descongelamiento mas prolongado
antes de ser transferido para no sufrir daño osmótico.
Con el método de Transferencia directa, el embrión puede ser transferido en la
misma pajuela en el que fue congelado (similar a una IA), en cambio el proceso
de vitrificación necesita sacar al embrión del envase en el que fue congelado,
para cargarlo en una nueva pajuela y transferirlo.
Con el Método de EG se puede lograr una sincronía completa entre donantes y
receptoras, es un método simple y muy eficiente.
La ventaja económica que tiene el método de vitrificación es que no
necesitamos de un equipo para congelar embriones que pueden llegar a ser
muy costos, entonces, se convierte en una técnica muy apropiada para quienes
se están iniciando en la actividad.
En cuanto a las curvas de enfriamiento, estas son mucho más rápidas que las
necesarias para congelar con EG y el proceso de congelado (individual) es más
rápido, pero si tenemos un gran número de embriones, resulta mucho más
práctico el congelado con EG ya que la congeladora cuenta con muchos
orificios para introducir gran cantidad de embriones y congelarlos al mismo
tiempo.
El método de vitrificación utiliza concentraciones de crioprotector mucho
mayores que el método de EG (1,6M)
Debido a la alta concentración de crioprotectores, la técnica de vitrificación
resulta mas toxica para los embriones, esta toxicidad puede verse reducida
utilizando 2 crioprotectores diferentes (en general DMSO y EG) con lo cual se
baja la concentración individual de cada uno disminuyendo la toxicidad general.
El método de vitrificación también puede producir un mayor daño de tipo
osmótico por el cambio en el volumen intracelular.
Metodo de Congelación con EG
1El primer paso es clasificar los embriones, luego hay que lavarlos y volvarlos a
clasificar. Una vez hecho esto debemos Colocarlos en EG 1,5 M y cargar la
pajuela para lo cual contamos con un tiempo de entre 5 y 10 minutos,
dependiendo de la temperatura ambiente
Una vez cargadas las pajuelas debemos colocarlas en la congeladora (-5 a -7
ºC) y dejar 1 a 2 minutos y realizar el “seeding”. Luego del seeding debemos
congelar a 0,6 ºC por minuto hasta - 35 ºC. Cuando los embriones se
encuentren a esta temp. Ya están listos para ser sumergidos en el Nitrogeno
liquido.
En cuanto a la vitrificación, existen varios métodos pero aquí voy a explicar el
mas utilizado que es el método de OPS (Open –Pulled Straw)
En primer lugar hay que exponer los embriones durante 1-3 min a temperatura
ambiente en una solución de equilibrio compuesta por: 10% DMSO + 10% EG
en PBSm. Esta es la primer solución a la que se exponen, luego deben ser
pasados a la segunda solución (de vitrificación),cuyo volumen no debe ser
mayor de 5 uL. Pondermos a los embriones en una tercer gota
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Estas dos gotas (las 2 primeras) de la solución de vitrificación
tendrán, por tanto, una mayor concentración, compuestas por: 20% de DMSO
+ 20% EG en PBSm. Luego tomamos una pajuela de 0,25 ( la cual fue
expuesta a la llama directa para lograr disminuir su diámetro para que los
embriones puedan ascender por capilaridad una vez que con el extremo mas
fino toquemos la gota de 1 Ul en la cual se encuentran los embriones., con el
mínimo volumen posible. Una vez hecho esto sumergimos la pajuela en el
nitrógeno liquido y la introducimos dentro de una pajuela mas grande para
poder manipular y clasificar mejor los embriones.
En cuanto a la descongelación, En lo que respecta a la transferencia directa
debemos sacar la pajuela del nitrógeno y exponerla a baño maria a 30 °C,
secar la pajuela y transferir el embrión. En cambio, con el método de
vitrificación, el proceso de descongelamiento se realiza a través de la
exposición de las pajuelas pequeñas expuestas a la llama (ops) las cuales
tienen los embriones en su interior en gotas de 0,25 M de sacarosa, lo que
permite el descongelamiento gradual de los embriones y a su vez controla la
entrada de agua en las células de los mismos.