Download Electroforesis de Hemoglobina

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ELECTROFORESIS
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Es
un
método
que
permite
el
desplazamiento de una molécula (con carga
eléctrica neta) dentro de un campo
eléctrico. La molécula con carga se mueve
en dirección al electrodo con signo opuesto,
separándose a medida que pasa el tiempo.
La velocidad (v) de migración de las
moléculas dentro de un campo eléctrico
depende de aspectos tales como:
a) la fuerza del campo eléctrico (E),
b) la carga eléctrica neta de la molécula
(z),
c) el coeficiente de fricción de la molécula
(éste depende de su tamaño y su forma).
FUNDAMENTO
* Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga
neta son colocadas en un campo eléctrico, estas
experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que
posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo
las moléculas cargadas positivamente se desplazaran
hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas
positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo
positivo).
El movimiento de las moléculas esta gobernado también
por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con
el solvente dificultará este movimiento originando una
fuerza que se opone , por otro lado las moléculas
tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento
browniano debido a que poseen energía cinética propia
denominado difusión. La energía cinética de las
moléculas aumenta con la temperatura, por ello a
mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las
moléculas no migren de una manera
homogénea, de tal manera que, si las moléculas
son colocadas en un cierto lugar de solución, los
iones comenzaran a moverse formando un
frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos
reducir el movimiento de las moléculas
empleando un medio que oponga mas
resistencia a dicho movimiento. Una forma
común de hacer esto es formar un gel. El gel
consiste de un polímero soluble de muy alto
peso molecular que atrapa moléculas de agua y
forma un tamiz que dificulta el movimiento de
los solutos, consecuentemente, la migración
electroforética de las moléculas será mas lenta,
pero el ensanchamiento del frente se vera
reducido también.
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Es un examen que mide los diferentes
tipos de Hb y permite identificar varios
tipos de ella, los cuales implicar una
enfermedad hemolítica.
Es el método de laboratorio de más
ayuda para separar y medir
hemoglobinas normales y ciertas
anormales.
Se realiza este examen cuando existe
un problema asociado con formas
anormales de hemoglobina
(hemoglobinopatía).
La hemoglobina, la proteína presente
en los glóbulos rojos que transporta
oxígeno, tiene varias formas
moleculares, algunas normales y otras
anormales.
PREPARACIÓN DE LA
SANGRE
* Centrifugar 5 mL de sangre por 5
minutos a 3000 r.p.m. (para remover el
plasma).
* Lavar los eritrocitos con solución salina
fisiológica, tres veces. Para esto se
centrifuga cada vez por tres minutos a
3000 r.p.m. (remover el sobrenadante
después de cada centrifugación.
* Agregar 0.4 mL de cloroformo y agitar
vigorosamente por 5 minutos.
* Centrifugar por 15 minutos a 3000
r.p.m.
* Separar el hemolizado del sobrenadante.
PREPARACIÓN DE LA
ELECTROFORESIS:
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Colocar una tira de acetato de celulosa dentro de una
cubeta conteniendo solución buffer (pH 8.6 - 9.2); dejar
allí por 5 minutos.
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Sacar la tira de la solución y eliminar el exceso de
buffer.
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Colocar la tira en la cámara de electroforesis , arreglar
de forma que quede bien extendida.
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Usar un capilar para aplicar las muestras en la tira de
acetato de celulosa.
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Añada suficiente buffer dentro de la cámara hasta que
haga contacto con los extremos de la tira.
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Corra la muestras por unos 30 minutos a 250
- 300 V.
Saque la tira, una vez que se cumpla el
tiempo de corrida.
Tiña la tira con el Ponceau's durante 10
minutos (no agite).
Decolore la tira agitándola suavemente en un
baño de ácido acético al 5% hasta que el
fondo rojizo sea removido (se realizan tres
baños sucesivos).
Secar la tira en un incubador por 10 minutos
a una temperatura entre 60 - 100º C.
Observe la tira y aprecie las diferencias de
movilizaciones de las hemoglobinas
empleadas.
EQUIPOS
RESULTADOS
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Los resultados obtenidos con la estandarización de las 3
técnicas electroforéticas fueron satisfactorios.
Se realizó la electroforesis de Hb en medio alcalino a 1 446
pacientes: 931 (64,4 %) atendidos en el IHI; 423 (29,3 %)
remitidos de otros hospitales, policlínicos y consultorios de
La Habana y 92 (6,3 %) de otras provincias del país. Se
cuantificó el porcentaje de Hb A en 93 enfermos con
hemoglobinopatías que requirieron de
exanguinotransfusión. A 193 enfermos se les cuantificó la
Hb F; de ellos, el 75,2 % (n=140) mostraron valores
elevados. Se determinaron los niveles de Hb A2 en 132
casos; en 20 (15,2 %) estaba aumentada y en 24 (18,2 %)
disminuida.
En la figura 1 se muestra el resultado de una electroforesis
de Hb. Se observan casos con el patrón normal (Hb AA) y
otros con diferentes hemoglobinopatías estructurales.
Se diagnosticaron 149 portadores (heterocigóticos) de
hemoglobinas anormales cualitativas; 60 enfermos, 24
pacientes con a talasemia o deficiencia de hierro y 20 con b
talasemia heterocigótica.
Resultados
normales (*):
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Se requiere una muestra de sangre venosa de 5 a 7 mL en un
tubo lavanda con EDTA.
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En los adultos estas moléculas de hemoglobina a continuación
hacen el total de hemoglobina:
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Hb A1: 95% a 98%
Hb A2: 2% a 3%
Hb F: 0,8% a 2%
Hb S: 0%
Hb C: 0%
* Aunque se han descrito muchas moléculas diferentes de
hemoglobina, las más comunes son HbA1, HbA2, HbF,
HbS, HbC, Hgb H y Hgb M. En adultos normales, sólo la
HbA1 y la HbA2 están presentes en niveles significativos.
Se pueden presentar pequeñas cantidades de HbF (que
es la mayor Hb presente en el feto), pero no ocasionan
consecuencias, a menos que sus niveles sean superiores
al 2% del total.
* En los niños estas moléculas de hemoglobina a
continuación hacen el total de hemoglobina:
* Hb F (recién nacido): 50% a 80%
* Hb F (6 meses): 8%
* Hb F (después de 6 meses): 1% a 2%
Significado de los
resultados
anormales
* La
presencia de niveles significativos
hemoglobinas anormales puede indicar:
* Anemia células falciformes o drepanocitosis
* Enfermedad por hemoglobina C
* Hemoglobinopatías raras.
* Una de las condiciones adicionales bajo
de
las
cuales se puede realizar el examen es la
Talasemia.