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Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO ÁREA ESPECÍFICA DE: MICROBIOLOGÍA NOMBRE DE LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE VIROLOGÍA CÓDIGO: FAR 315L FECHA DE ELABORACIÓN: MARZO 2002 NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: FORMATIVO TIPO DE ASIGNATURA: DISCIPLINARIA PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN: M. C. Nidia Gary Pazos Salazar M. C. Maria Susana Pérez Fernández M. C. Oscar Pérez Toríz M. C. Alejandro Ruíz Tagle M. C. Carlos Téllez Osorio M. C. Claudy Lorena Villagran Padilla HORAS DE TEORÍA: 3 HORAS PRÁCTICA: 2 1 CRÉDITOS: 8 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B INDICE NÚMERO DE LA PRÁCTICA PRÁCTICA No. 1 PRÁCTICA No. 2 PRÁCTICA No. 3 PRACTICA NO 4 PRÁCTICA No. 5 PRÁCTICA No. 6 PRÁCTICA No. 7 PRÁCTICA No. 8 PRÁCTICA No. 9 PRACTICA No 10 PRÁCTICA No. 11 PRÁCTICA No. 12 PRÁCTICA No. 13 PRÁCTICA No. 14 PRACTICA No 15 PRACTICA No 16 TÍTULO DE LA PRÁCTICA PÁGINA NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE VIROLOGÍA. PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA). PRINCIPIOS Y APLICACIONES. PRUEBA DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) PARA EL DIAGNÓSTICO PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE. PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) PARA EL DIAGNÓSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE. HUEVO FÉRTIL DE AVE COMO MODELO BIOLÓGICO PARA EL CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE VIRUS. ENSAYO DE LAS VÍAS DE INOCULACIÓN EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO. REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO. TITULACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR (DI50) EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO. CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS PARA LA REPLICACIÓN DE VIRUS ANIMALES: OBTENCIÓN, PROLIFERACIÓN Y MANTENIMIENTO. SEMINARIO: OBTENCIÓN DE UN CULTIVO PRIMARIO DE FIBROBLASTOS DE EMBRIÓN DE POLLO. PROLIFERACIÓN DE CULTIVOS CELULARES MEDIANTE SUBCULTIVO O PASE 1:2 REPLICACIÓN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES: OBSERVACIÓN DE MONOESTRATOS CELULARES NORMALES Y CON EFECTOS CITOPÁTICOS. REPLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS EN ESCHERICHIA COLI. ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) EN EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE VIRUS: FUNDAMENTO, APLICACIONES Y LIMITACIONES. ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE CITOMEGALOVIRUS, RUBÉOLA, HEPATITIS B Y HIV. EVALUACIÓN FINAL 3 2 7 12 16 20 24 28 28 32 37 40 43 47 52 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICA NO. 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE VIROLOGÍA INTRODUCCIÓN El conocimiento de las propiedades fisicoquímicas y de la infectocontagiosidad de los viriones, permite definir las normas que en materia de seguridad, son necesarias para no correr ningún riesgo de adquirir aún en forma accidental, una infección por este tipo de partículas. Con base en lo anterior, se enlistan a continuación los reglamentos y normas que habrán de seguirse en el Laboratorio de Virología, con la finalidad de asegurar la integridad física de los alumnos, así como para mantener una organización adecuada para el desarrollo de las prácticas correspondientes. La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no se permitirá el acceso al laboratorio. Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. Colocar todo los artículos personales en la zona lateral o en los cajones de las mesa de trabajo. Al iniciar y finalizar las prácticas, lavarse las manos con agua y jabón desinfectante. Queda estrictamente prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio, así como introducir algún objeto en la boca. La puerta del laboratorio debe mantenerse cerrada. Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de utilizarla. Permanecer en la zona de trabajo asignada para cada equipo. Comunicarse con sus compañeros solo en la medida indispensable. Antes de iniciar la práctica, leer y recordar la metodología a seguir de acuerdo con las indicaciones del profesor. Si se tienen dudas, es el momento para aclararlas. 3 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra (rotura de material, derramamiento de suspensiones virales, etc.). Todo el material que se va a incubar o desechar, deberá colocarse en el sitio indicado por el profesor. Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporciona; el material de desecho no contaminado deberá depositarse en los contenedores correspondientes. En forma previa a su lavado, siempre se deberá desinfectar el material que se le proporcione en el laboratorio. Rotule todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos: grupo, sección, equipo, nombre del alumno, así como fecha de entrada y salida. En general, las disposiciones anteriores tienden al cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, en la cual se establecen los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los Residuos Peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos e instituciones relacionadas con el sector salud. En la NOM referida, se establecen además definiciones de interés para los laboratorios y áreas de microbiología, tales como: Desinfección: Destrucción de microorganismos patógenos en todos los ambientes, materias o partes que pueden ser nocivos, por los distintos medios mecánicos, físicos o químicos contrarios a su vida o desarrollo, con el fin de reducir el riesgo de transmisión de enfermedades. Residuo peligroso biológico-infeccioso: El que contiene bacterias, virus u otros microorganismos con capacidad de causar infección o que contiene o puede contener toxinas producidas por microorganismos que causan efectos nocivos a seres vivos y al ambiente, que se generan en hospitales y establecimientos de atención médica. En adición, se consideran residuos siguientes: 4 peligrosos biológico-infecciosos los Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B La sangre Los cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así como los generados en la producción de biológicos Los instrumentos y aparatos para transferir, inocular y mezclar cultivos Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico Los residuos anatómicos derivados de la atención a pacientes de los laboratorios Los equipos y dispositivos desechables utilizados para la exploración y toma de muestras Los objetos punzo cortantes usados o sin usar Los que han estado en contacto con pacientes o sus muestras clínicas durante el diagnóstico y tratamiento, incluyendo navajas, lancetas, jeringas, pipetas Pasteur, agujas hipodérmicas, de acupuntura y para tatuaje, bisturíes, cajas de Petri, cristalería entera o rota, porta y cubreobjetos, tubos de ensayo y similares. Con base en lo anterior, los residuos peligrosos infecto-contagiosos, deberán ser tratados por métodos físicos o químicos, los cuales: Deberán garantizar la eliminación de microorganismos patógenos Deberán volver irreconocibles a los residuos peligrosos biológico-infecciosos Deberán ser cremados, si se trata de residuos patológicos. El cumplimiento de las consideraciones señaladas con anterioridad, garantiza la seguridad que deberá observarse tanto para alcanzar los objetivos de las prácticas, como para su desarrollo en condiciones asépticas. Finalmente y dada la especificidad de especie que presentan los virus, en esta primera sesión de laboratorio se hará énfasis en que a través de las diferentes prácticas, se utilizarán únicamente suspensiones virales de tipo vacunal destinadas para uso veterinario, con la finalidad de evitar el más mínimo riesgo de infección hacia los estudiantes. 5 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B CUESTIONARIO 1. Con ayuda de un esquema especifique, cuál sería el manejo que se la daría a materiales como jeringas, portaobjetos, pipetas, tubos y material con residuos de tejidos, desde que han sido utilizados para el análisis de virus hasta su destino final. 6 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICA No. 2 PRUEBAS DE HEMAGLUTINACIÓN (HA) E INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA). PRINCIPIOS Y APLICACIONES Desde el descubrimiento de los virus, se identifico que de acuerdo a sus características moleculares, estos agentes requieren del empelo de modelos vivos para su análisis; esta condición hace particularmente difícil implementar el uso de sistemas adecuados como son el uso de animales de laboratorio o los modelos de Células en Cultivo. De esta manera se hizo necesaria la búsqueda de alternativas para el análisis de virus que omitieran la necesidad de modelos vivos. PRUEBA DE HEMAGLUTINACIÓN (HA). Inicialmente, la HA se aplicó para el análisis del virus Influenza, sin embargo como explicaremos más adelante, se puede aplicar para realizar ensayos sobre cualquier virus con proteínas estructurales con propiedades hemaglutinantes. El nombre de Hemaglutinación se debe al hallazgo de que los virus Influenza podían aglutinar eritrocitos, posteriormente se determinó que el origen de esta propiedad se debía a la existencia de una glicoproteína presente en la envoltura viral a la cual se le denominó como hemaglutinina. Actualmente se sabe que una gran cantidad de virus poseen proteínas externas con estas características por lo que el método tiene una amplia aplicabilidad en el análisis de diferentes entidades virales. También se descubrió que la hemaglutinina tiene el papel de funcionar precisamente como el ligando viral encargado de reconocer al receptor en las células blanco. De manera general, el receptor corresponde a las moléculas de ácido siálico presente sobre la superficie de diversos tipos celulares, aun que dependiendo del virus esta molécula puede estar enlazada en diferentes tipos de enlaces químicos. A este respecto cabe resaltar que la función de la hemaglutinina no es entonces aglutinar eritrocitos, más bien es participar en el primer paso de la replicación viral que es la adsorción, pero sus propiedades sirven para desarrollar la prueba de HA que se utiliza como un ensayo in vitro. 7 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Para empezar a conocer la prueba de HA, se hace necesario describir las ventajas y desventajas que ofrece. Ventajas: Prueba sencilla de desarrollar. No requiere de una infraestructura complicada. Es económica. Ideal cuando se manejan muestras con alta carga viral. Se aplica en los ensayos para la determinación de la naturaleza química de los receptores celulares. Desventajas: Se emplea sólo como diagnóstico presuntivo. Existen agentes no virales que pueden causar HA. Es poco sensible. Genera falsos negativos. El fundamento de esta prueba consiste en poner de manifiesto la existencia de virus con proteínas con capacidad hemaglutinante que reconocen receptores celulares. De esta manera los virus se unirán a los eritrocitos de la especie que sea siempre que contenga en su superficie moléculas de ácido siálico. La prueba se representa en el siguiente esquema: | ERITROCITO ERITROCITO Virus con proteínas Hemaglutinantes HEMAGLUTINACIÓN Para la realización de esta prueba se requiere tomar una muestra que contenga virus, como ejemplo tenemos: stocks virales provenientes de lotes vacunales o de cosechas obtenidas de células en cultivo; muestras de origen clínico tomadas de acuerdo a la zona anatómica que afecta el virus, tal es el caso del virus influenza donde la muestra a tomar corresponde a un lavado faríngeo. 8 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Para procesar la muestra se preparan diluciones seriadas al doble empezando desde la dilución 1:10 hasta la dilución 1:1280 empleando como diluyente una solución amortiguadora de fosfatos. Posteriormente a cada dilución se le adiciona la misma cantidad de una suspensión de eritrocitos preparada al 1%. Todo esto se realiza en tubos de fondo en U o en microplacas de fondo en U. Los eritrocitos aglutinados sedimentarán en el fondo del pozo formando una red, mientras los no aglutinados sedimentan por gravedad. De acuerdo a la forma del pozo se forma una dona o un anillo en el centro. Los sedimentos se aprecian de la siguiente manera: PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA Una prueba de HA positiva implica la sospecha de un virus presente en la muestra, sin embargo la determinación exacta del virus involucrado en una patología es aún incierta. Por esta razón como siguiente paso se debe aplicar una prueba que permita la plena identificación del tipo de virus, a este respecto se cuenta con una prueba serológica. PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que demuestre una respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta está representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se conoce como Inhibición de la Hemaglutinación (IHA). Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la hemaglutinina del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce como neutralización vírica. La prueba de IHA, puede representarse esquemáticamente de la siguiente manera: 9 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Primera fase: Reconocimiento Ag-Ac. Virus con proteínas hemaglutinantes Anti-HA Neutralización viral Segunda fase: Interacción con eritrocitos: demostración de la IHA. ERITROCITO NO EXISTE RECONOCI MIENTO La existencia de anticuerpos que puedan reconocer a cepas virales específicas permite diagnosticar plenamente que un virus en particular es el responsable de alguna patología. Esto basándose en un principio fundamental de inmunología: La presencia de anticuerpos en un hospedero es la consecuencia de la exposición previa al antígeno que induce entonces su producción. Para esta prueba la muestra es el suero del hospedero sobre el que se realizan diluciones seriadas también con factor dos como en HA pero iniciando de la dilución 1:2 hasta alcanzar la de 1:256. Cada dilución del suero se incuba con 4 Unidades Hemaglutinantes de un virus conocido, durante 10min. para permitir el reconocimiento. 10 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Transcurrido este tiempo, se adiciona una suspensión de eritrocitos al 1 %. Al igual que para HA la prueba se efectúa en microplacas o tubos con fondo en U. De esta manera los patrones de sedimentación para los resultados positivos y negativos se observan de la siguiente manera: PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA 11 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICA No. 3 PRUEBA DE HEMAGLUTINACION (HA) PARA EL DIAGNÓSTICO PRELIMINAR DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DEL NEWCASTLE INTRODUCCIÓN. Muchos virones animales posen en su envoltura proteínas codificadas por el genoma viral capaces de unirse con eritrocitos. Tales virus pueden por tanto formar puentes entre los glóbulos para constituir una red. Este fenómeno conocido como Hemaglutinación fue primeramente descrito para el análisis del virus Influenza. En este caso la proteína hemaglutinante (hemaglutinina) en la superficie del virión es una glicoproteína que en adición de la Neuraminidasa se proyecta en la envoltura viral. El virión se unirá a cualquier eritrocito de la especie que sea siempre que lleve los receptores complementarios que en este caso son moléculas de Acido NAcetilNeuramínico. El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro del grupo de los Paramyxovirus; es un patógeno primario de aves en quienes produce infecciones respiratorias y digestivas con trastornos ocasionales en el S.N.C. que conducen a parálisis y muerte; en el humano puede ocasionalmente producir conjuntivitis autolimitada. Se requieren aproximadamente 107 viriones de Newcastle para causar aglutinación, por lo que la Hemaglutinación no es un indicador sensible de la presencia de pequeñas cantidaes de viriones pero por su simplicidad constituye un ensayo conveniente si se dispone de grandes cantidades de viriones. OBJETIVOS: 1. El alumno dominará el manejo de la técnica de la reacción de Hemaglutinación (HA). 2. El alumno determinará la concentración de viriones presentes en una suspensión, la cual expresará en Unidades Hemaglutinantes (UHA). 12 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B MATERIAL Solución reguladora de fosfatos SRF. Microplacas de poliestrireno con fondo en U. Espejo. Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 µl. Puntillas para micopipeta. Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET) Suspensión de glóbulos rojos al 1%. Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml. Solución de Hipoclorito de Sodio. Alcohol y algodón. Tina para recolectar desechos. METODOLOGÍA 1. Realizar con SRF una serie de diluciones del virus a partir de una suspensión concentrada (vacuna viral), con factor de dilución 2, desde 1:10 hasta 1:1280, de acuerdo al esquema de la figura 1; incluir un tubo control que no contendrá virus. El proceso se describe a continuación: a Agregar al pozo No. 1 de la microplaca 180 µl de SRF y del 2 al 9 agregar 100 µl. b Colocar en el pozo 1 20 µl de la suspensión viral (vacuna) y mezclar por aspersión y dispersión de dos a tres veces obteniendo así la dilución 1:10. c Transferir 100 µl de ésta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente de la misma manera que para el paso b. d Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que corresponderá a la dilución 1:1280. e Desechar del pozo 8 100 µl en el recipiente para recolección de desechos. f NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilución viral al pozo No. 9 que sirve como control. 2. Agregar a todos los pozos 100 µl de una suspensión de glóbulos rojos de pollo al 1%. 13 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 3. Agitar la microplaca y dejar reposar a temperatura ambiente el sistema hasta que los eritrocitos del pozo 9 hayan sedimentado. PATRONES DE SEDIMENTACIÓN 1. Los glóbulos rojo normales se asientan en el fondo del pozo formando un botón, mientras que los glóbulos rojos aglutinados forman una malla homogénea. PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA 2. Determinar el título de la muestra, identificando la última dilución en que se presenta una reacción de HA evidente, que corresponderá entonces a 1 UHA por volumen. 3. Identificar la dilución que contiene 4 UHA. VACUNA CONTRA NEWCASTLE e) Desechar 100 µl c y d) Transferir seriadamente 100 µl de cada dilución al siguiente pozo b) 20 µl Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Fig. No 1. Realización de las diluciones virales Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones Pozo a)SRF (µl) Dilución 2) Eritrocitos al 1% (µl) 1 180 1.10 100 2 100 1:20 100 3 100 1:40 100 4 100 1:80 100 5 100 1:160 100 14 6 100 1:320 100 7 100 1:640 100 8 100 1:1280 100 9 100 Control 100 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B CUESTIONARIO 1.- Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba de HA. 2.- Cite dos causas por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la prueba de HA. 3.- Porqué es importante determinar la dilución que contiene 4 UHA. 15 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICA No. 4 PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IHA) PARA EL DIAGNÓSTICO DEFINITIVO DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DEL NEWCASTLE INTRODUCCIÓN La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico presuntivo más no específico de infección por virus del Newcastle, de manera que de resultar positiva no nos permite asegurar que este virus sea el agente causal. Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que demuestre una respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta está representada por la presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se conoce como Inhibición de la Hemaglutinación (IHA). Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la hemaglutinina del virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el receptor celular. Este hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce como neutralización vírica. OBJETIVOS 1. El alumno desarrollará la técnica de Inhibición de la Hemaglutinación para determinar el título de un suero problema. 2. El alumno será capaz de interpretar los resultados obtenidos al realizar la prueba de IHA. MATERIAL Solución reguladora de fosfatos SRF. Microplaca de poliestireno con fondo en U. Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 µl. Puntillas para micopipeta. Vacuna viral ( viriones atenuados, cepa La Sota, INTERVET), preparada en una suspensión con 4 UHA. Suspensión de glóbulos rojos al 1%. Suero problema. Pipetas de vidrio de 1 ml y 5 ml. Solución de Hipoclorito de Sodio. 16 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Alcohol y algodón. Tina para recolectar desechos. METODOLOGÍA Con base en los resultados de la práctica anterior, preparar en un tubo una dilución del virus del Newcastle que contenga 4 UHA en un volumen suficiente para realizar la prueba de IHA. Ejemplo: a Resultado de la práctica de HA: Dilución 1:20 de la vacuna viral = 4 UHA b Volúmen suficiente para realizar IHA= 2ml Entonces..... 100 µl + 1900 µl _________ 2000 µl de dilución con 4 UHA Vacuna viral concentrada SSI Volúmen final 1. Hacer diluciones al doble del suero problema, desde 1:2 hasta 1:256 de acuerdo al esquema de la figura 2; incluir un pozo control que no contendrá antisuero ni virus. El proceso se describe a continuación: a Agregar 75 µl de SSI a los pozos del 1 al 9 de la microplaca. b Colocar en el pozo 1 75 µl del suero problema y mezclar por aspersión y dispersión de dos a tres veces obteniendo así la dilución 1:2. c Transferir 75 µl de ésta dilución al pozo 2 y mezclar homogéneamente de la misma manera que para el paso b. d Repetir sucesivamente este procedimiento hasta el pozo No. 8 que corresponderá a la dilución 1:256. e Desechar del pozo 8 75 µl en el recipiente para recolección de desechos. f NOTA IMPORTANTE: No se debe agregar dilución del suero al pozo No. 9 que sirve como control. 17 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 2. Agregar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del antígeno viral en un volumen de 75 µl. 3. Agitar la microplaca para que reaccionen los sutratos y dejar en reposo durante 10 min. 4. Agregar 75 µl de la suspensión de glóbulos rojos a todos y cada uno de los pozos, agitar y colocar la microplaca a temperatura ambiente hasta que los glóbulos rojos del pozo que no contiene antisuero y sirve como control haya sedimentado. 5. Determinar el título del antisuero identificando la última dilución que presenta IHA. PATRONES DE SEDIMENTACIÓN: PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA Fig. No. 2 Diluciones seriadas del suero problema e) Desechar 75 µl SUERO PROBLEMA c y d) Transferir seriadamente 75 µl de cada dilución al siguiente pozo b) 75 µl Pozo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Volumen de cada Reactivo para realizar las diluciones Pozo a)SSI (µl) Dilución 2) 4 UHA 1 75 1.2 75 4) Eritrocitos al 1% (µl) 75 2 75 1:4 75 3 75 1:8 75 4 75 1.16 75 5 75 1:32 75 6 75 1:64 75 7 75 1:128 75 8 75 1.256 75 9 75 Control ----- 75 75 3) INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 10 MIN 75 75 75 75 18 75 75 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado negativa en la prueba de IHA? 2. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado positivo en la prueba de IHA? 3. Conjuntando las pruebas de HA e IHA, ¿Cómo explica un resultado negativo en la prueba de HA con uno positivo en la prueba de IHA? y ¿Cuál es el diagnóstico final que daría después de analizar ambas pruebas? 19 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICA No. 5 HUEVO FÉRTIL DE AVE COMO MODELO BIOLÓGICO PARA EL CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE VIRUS. (1ª. Parte) INTRODUCCIÓN . Los embriones se han utilizado como el huésped natural para el crecimiento de los virus, propagación y caracterización de los virus aviares y para la producción de vacunas virales. El embrión y sus membranas ayudan a proveer la diversidad de células necesarias para el cultivo de diferentes tipos de virus, depende sobre todo de varias condiciones: 1.- Vía de inoculación 2.- Edad del embrión 3.- Periodo de tiempo de incubación 4.- Volumen y dilución del inóculo utilizado 5.- Temperatura de incubación 6.- El estado inmune de la parvada por el cual los embriones son obtenidos Manejos preliminares. La utilización de huevo fértil en el laboratorio, no debe ser obtenida de parvadas infectadas con agentes virales conocidos u otros agentes microbianos. Después de 4 a 5 días de incubación cuando el embrión puede ser observado fácilmente, estos son ovoscopeados para determinar cuales son fértiles. La incubación es alrededor de 37° C y una humedad de 60 a 70% (un alto exceso de humedad permite un subdesarrollo de la cámara de aire, por lo tanto una baja de humedad permitirá que halla un desarrollo menor). Los embriones deben estar en movimiento varias veces al día, ya sea automáticamente o manualmente, el periodo de incubación antes de la inoculación depende sobre todo de la vía de inoculación. Ovoscopeo. El ovoscopeo consiste en revisar los huevos embrionados contra una fuente de luz intensa en un ovoscopio, de esta manera mostrara el embrión, las membranas asociadas y las cavidades del embrión se observan fácilmente. 20 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 1.- En un cuarto obscuro, colocar el huevo embrionado al ovoscopio y observar el movimiento, las condiciones de las venas de sangre y el estado del embrión. Notar las diferencias con los embriones de diferentes edades. 2.-Con un lápiz, marcar la posición del embrión y la cámara de aire (esta área es mantenida arriba en el ovoscopio). 3.- Comparar los embriones fértiles y los embriones muertos de varias edades, descartar los embriones infértiles y muertos. Estructura del huevo embrionado. Justo bajo el cascarón se encuentra una membrana fibrosa que se disemina a través de la superficie interna del embrión y forma la cámara de aire en el extremo ancho del huevo. Esta membrana en conjunto con el cascarón ayudan al intercambio de gases en el huevo. Esta distribución de gases se facilita por la membrana corioalantoidea altamente vascularizada que sirve como órgano respiratorio del embrión. Esta membrana se forma de manera adyacente a la membrana del cascarón y forma una cavidad conocida como saco alantoideo que contiene entre 5 a 10 ml de fluido alantoideo. El embrión se encuentra envuelto por la membrana amniótica formando el saco amniótico que contiene entre 1 y 2 ml de fluido amniótico. El embrión se encuentra unido al saco vitelino que es su fuente de nutrientes y se encuentra localizado aproximadamente al centro del huevo. Técnicas y/o vías de inoculación. Las cuatro vías más comunes para la inoculación del huevo embrionado fértil son: La vía de saco alantoideo La vía de saco vitelino La vía de membrana corioalantoidea (MCA) La vía de saco amniótico. En situaciones de diagnóstico donde hay un agente no especifico que es sospechoso, es conveniente utilizar muchas vías como sean posibles. Si una elección ha sido hecha, la vía MCA es preferida a causa de su sensibilidad a un gran numero de virus y porque es menos probable para afectarse por contaminación bacteriana. Saco vitelino. 21 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B La inoculación en saco vitelino es utilizada para el aislamiento y propagación del virus de encefalomielitis aviar. Los embriones inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 10 a 13 días postinoculación. Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones al término del periodo de incubación es parálisis de patas. Si los embriones se dejan nacer, a partir del tercer día de nacidos se pueden observar pollos que se sientan en las patas, no se mueven bien y algunos caen hacia los lados. Aparece un ligero pero rápido temblor del cuello y de la cabeza, que especialmente se nota cuando los pollitos afectados se mantienen en la mano. Cavidad alantoidea. La inoculación de embriones en saco alantoideo es utilizada para el aislamiento y propagación de los Paramyxovirus, Myxovirus y Coronavirus. Los embriones inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 4 a 7 días postinoculación. Las lesiones que se presentan en los embriones por los Paramyxovirus y los Myxovirus es que pueden llegar a causar la muerte de los embriones, siempre y cuando se trate de cepas altamente patógenas, pero tanto los Paramyxovirus como los Myxovirus normalmente se evalua a través de fluido alantoideo de los embriones y no tanto por las lesiones. En el fluido alantoideo lo que se tiene que hacer es una prueba de hemoaglutinación con glóbulos rojos de ave al 5 % para determinar la presencia de hemoaglutininas en dicho fluido, que no es otra cosa más que la formación de grumos de color rojo rodeados por espacios transparentes fácilmente visible. Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones por los Coronavirus son enanismo, encorvamiento, desarrollo anormal de la pluma y depósitos de uratos en riñones. Membrana corioalantoidea (MCA). La inoculación de embriones en MCA es utilizada para el aislamiento y pases de Poxvirus y virus Herpes. Los embriones inoculados por esta vía son incubados durante 7 días postinoculación. Las lesiones que presentan los embriones por los virus Herpes y Poxvirus es principalmente en la membrana. Presencia de áreas focales (pústulas) engrosadas con necrosis o un engrosamiento generalizado de la membrana. 22 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Saco amniótico. La inoculación de embriones en saco amniótico es utilizada para el aislamiento inicial de los Myxovirus. Los embriones inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 4 a 7 días postinoculación. Las lesiones que se presentan en los embriones por los Myxovirus son hemorragias generalizadas en todo el embrión y pueden llegar a causar la muerte, siempre y cuando se trate de cepas altamente patógenas, pero también se evalúa por la presencia de hemoaglutininas que se encuentran en el fluido alantoideo del embrión. Intravenosa La inoculación por esta vía no tiene aplicación amplia para el estudio de infecciones experimentales en embriones de pollo. El procedimiento es generalmente empleado para estudios hematológicos. Embriones de 10 a 15 días de edad son los mas adecuados para esta vía. La cantidad de inóculo puede variar de 0.2 a 0.5 ml. Intracerebral. La inoculación puede ser realizada con embriones de 8 a 14 días de edad y el inóculo es de 0.1.a 0.2 ml. Esta vía puede ser empleada en estudios de alteraciones patológicas del cerebro. Los virus de herpes simple y rabia pueden ser cultivados por esta vía. 23 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICA NO. 6 ENSAYOS DE LAS VÍAS DE INOCULACIÓN EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO INTRODUCCIÓN El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible para el cultivo, titulación e identificación de virus. En comparación con los animales de laboratorio empleados en los ensayos virales, el modelo de huevo fértil ofrece diversas ventajas tales como: Son estériles. No tienen funciones inmunológicas desarrolladas. No son costosos. Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza técnica en comparación con otros sistemas biológicos, tales como el mantenimiento y reproducción de Cultivos Celulares. El huevo fértil empleado para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves sanas ALPES, aves libres de patógenos específicos o SPF por sus siglas en inglés, para de esta manera eliminar la presencia de virus que comúnmente afectan a las aves como Adenovirus o Bronquitis Infecciosa Aviar, etc. Para la propagación, cultivo y titulación de virus, es indispensable determinar la viabilidad del embrión, así como dominar las técnicas para las diferentes vías de inoculación debido a la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas células o tejidos. En la figura 3 se presenta en esquema de las diferentes zonas que conforman a un huevo fértil. Una vez realizado el ensayo de la inoculación, deberá observarse el conjunto del huevo fértil para reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema biológico empleado. 24 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 4 3 1 Cavidad Alantoidea 5 2 Saco de Aire 3 Saco Amniótico 2 4 Saco Vitelino 5 Membrana Corioalantoidea 1 Fig.3 Vías de inoculación en huevo fértil de ave. OBJETIVOS: 1. El alumno determinara al ovoscopio la viabilidad del embrión. 2. El alumno dominará las técnicas comúnmente utilizadas para la inoculación de huevos fértiles de ave. 3. El alumno diferenciara las estructuras embrionarias observando la organización de los tejidos fuera de su cutícula. MATERIAL: Huevos fértiles de ave de 10 días de inoculación (+/- 1 día), calidad ALPES. Ovoscopio y pinzas de disección Recipiente para recibir desechos Charola porta embriones Perforadores, bulbos y lápiz. Jeringas de insulina Agujas de 20 x 38 mm. Colorantes Guantes 25 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B DESARROLLO: I.- CONFIRMACIÓN DE LA VIABILIDAD DEL EMBRIÓN Trasluminar cada embrión colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio. Un embrión no viable puede reconocerse a través de: Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna de la cutícula. Falta de irrigación. Falta de movimiento. Cualquier coloración de verde a negra que indica por lo general contaminación bacteriana. II.- TÉCNICAS DE INOCULACIÓN A Cavidad alantoidea a Trasluminar el huevo fértil con ayuda del ovoscopio. b Marcar un punto o cruz de 2 a 3 mm. por arriba del limite de la cámara de aire del lado contrario al embrión y en una zona escasamente irrigada. c Perforar la marca señalada. d Con una jeringa que porte aguja de insulina o tuberculina, inocular en ángulo de 45 grados con respecto al huevo fértil de ave. B Saco vitelino a Localizar la parte más alta del embrión sobre la cámara de aire y marcar con un punto o cruz. b Marcar otro punto o guía que indicara la localización del embrión. c Perforar la marca señalada d Introducir una aguja de 20 x 38mm recta con ligera inclinación opuesta a la localización del embrión C Membrana corioalantoidea a Localizar la parte más alta de la cámara de aire y marcar un punto o cruz (*). b Marcar otro punto en la parte media opuesta a la localización del embrión en un área con la menor irrigación posible. c Perforar ambas marcas. d Succionar con un bulbo de goma a través del punto marcado en la primera posición (*), creando así una cámara de aire falsa en la parte media del embrión. 26 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B e Inocular empleando jeringas con aguja de insulina o tuberculina en el lugar que se desarrollo la cámara de aire falsa. En estos ensayos, se emplearan colorantes para las diferentes inoculaciones con el objetivo de facilitar la visualización del sitio donde se pretendió depositar un volumen determinado de colorante. Una vez realizada la técnica, se abrirán los huevos fértiles de ave para analizar si la vía elegida fue efectivamente inoculada, vertiendo el contenido del embrión sobre cajas de Petri. CUESTIONARIO 1. De acuerdo con lo observado después de abrir los embriones de pollo y según la vía de inoculación empleada; esquematice para cada vía, cuales zonas deben quedar teñidas y cuales no, si la inoculación se realizó correctamente. 27 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICAS NO. 7 y No.8 REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO (1ª Parte) TITULACIÓN DEL VIRUS DE LA BRONQUITIS INFECCIOSA AVIAR (DI50) EN HUEVO FÉRTIL DE POLLO (2ª Parte). INTRODUCCIÓN Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros mamíferos daños severos e incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable es que esta interacción induzca una protección inmunológica al individuo como consecuencia del reconocimiento de antígenos específicos tanto en forma natural como artificial. En el caso de medidas profilácticas, con el empleo de vacunas se procura inducir una Inmunidad Adquirida Activa Artificial. Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de la vacuna. Para las vacunas elaboradas con virus atenuados, la valoración se puede efectuar en sistemas biológicos tales como huevos fértiles de ave que pueden responder a la infección viral dando lesiones características del virión inoculado que afecte directamente al embrión y le produce signos tales como músculos distróficos, enanismo o muerte, o bien, afectan estructuras y líquidos extraembrionarios donde se pueden observar hemorragias, formación de placas o pústulas así como determinar la presencia de hemaglutininas virales. Los virus vacunales o de campo pueden titularse en conjunto de huevos fértiles de ave cuando producen su muerte calculando entonces una Dosis Letal al 50% (DLEP50) o en el caso de virus hemaglutinantes calculando Dosis Infectivas al 50% (DIEP50) empleando la reacción de Hemaglutinación de los fluidos cosechados. OBJETIVOS 1. El alumno dominara las técnicas para propagar y titular una cepa vacunal de virus. 2. El alumno determinará la DLEP50 para la vacuna del Virus de la Bronquitis Aviar (VBA), calculando sus concentración por unidad de volumen. MATERIAL 28 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Huevo fértil de ave de 10 dias de incubación (+/- 1 dia) calidad ALPES. Vacuna de VBA. INTERVET Solucion salina de Dulbecco Lápiz, pegamento blanco y perforadores Hisopos estériles, tintura de yodo. Estufa a 37°C. Ovoscopio. Jeringas de insulina. Mechero. Recipiente para desechos. DESARROLLO: 1. Realizar con solucion salina de Dulbecco diluciones seriadas de la vacuna viral desde 10-1 hasta 10-6 a partir de una suspensión concentrada. 2. Trasluminar el huevo fértil de ave y seguir la técnica de inoculación para cavidad alantoidea 3. Desinfectar el sitio marcado con el punto o cruz de inoculación con tintura de yodo antes y después de perforar 4. Inocular 0.1 ml de las cuatro ultimas diluciones en cada uno de 5 embriones de 9 a 11 días de incubación (20 embriones en total), vía cavidad alantoidea. 5. Desinfectar nuevamente y sellar la perforación con una gota de pegamento blanco 6. Marcar con lápiz sobre cada embrión la dilución y vacuna inoculadas 7. Incubar a 37°C durante 7 dias, revisando diariamente la viabilidad de los embriones al ovoscopio, señalando en el primer dia los embriones que resulten muertos por traumatismo 8. Al termino de la incubación,trasluminar los embriones al ovoscopio y realizar un recuento de embriones vivos y muertos. 9. Anotar los resultados obtenidos y realizar los cálculos para determinar la DLEP50 / 0.1 ml empleando el metodo de Reed & Muench, con base en el siguiente ejemplo 29 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B RESULTADOS DEL RECUENTO DE EMBRIONES VIVOS Y MUERTOS DILUCION EMBRIONES MUERTOS VIVOS INOCULADOS -3 5 4 1 -4 5 3 2 -5 5 2 3 -6 5 1 4 1) ACUMULADOS 2) ACUMULADOS 3) RADIO DE 4) PORCENTAJE MUERTOS VIVOS MORTALIDAD 10 1 10 / 11 90.9 6 3 6/9 66.6 3 6 3/9 33.3 1 10 1 / 11 9.09 10 10 10 10 CALCULOS Para una mejor explicación, se desgloza a continuación la realización de los cálculos para cada columna: 1) Realizar la suma acumulada de embriones muertos desde la dilución mas alta hasta la mas baja. 2) Realizar la suma acumulada de embriones vivos desde la dilución mas baja a la mas alta. 3) Calcular el cociente dado por los acumulados muertos sobre la suma de acumulados muertos mas acumulados vivos de cada dilución. CALCULAR EL VALOR DE INTERPOLACIÓN (V.I.) % Positividad > 50% - 50% V.I. = 66.6 – 50.0 = % Positividad > 50% - % Positividad < 50% 16.6 = 66.6 – 33.3 33.3 V.I. = 0.49 Multiplicar el logaritmo negativo del radio de dilución por el valor de interpretación para así calcular el valor de interpolación corregido. Para este caso: log Neg de 10 X V.I. = -1 x 0.49 = V.I.C. 30 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de mortalidad En el ejemplo: 10-4 y 10-5 Estimar la DLEP50 sumando el V.I.C. al exponente de la dilución que presente mayor al 50% de efecto. En el ejemplo : 10-4 + (-0.49) = 10-4.49 = DLEP50 El titulo se obtiene con el inverso de la DLEP50. Finalmente: Titulo = 104.49 CUESTIONARIO 1. Además de la titulación viral, que otras pruebas se deben realizar a un lote vacunal antes de salir al mercado. 2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra viral. 31 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICA No.9 CULTIVOS DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS PARA LA REPLICACIÓN DE VIRUS ANIMALES: OBTENCIÓN, PROLIFERACIÓN Y MANTENIMIENTO En 1949 John Enders, Thomas Séller y Frederick Robbins descubrieron que el poliovirus podía cultivarse en células de origen no neuronal, lo que les valió el premio Nobel en Fisiología y Medicina en 1954. Desde entonces, Los cultivos celulares reemplazaron a los animales de laboratorio convirtiéndose en el principal método para la propagación de virus y son utilizados en prácticamente todos los campos de la bio-medicina. Un Cultivo Celular (CC), es entonces un modelo biológico conformado por un grupo de células con características específicas que se mantienen adecuadamente bajo condiciones in vitro. En este sentido deberemos entender que las células deben ser obtenidas a partir de un tejido vivo y para su mantenimiento y propagación in vitro, requieren de medios de cultivo especiales que provean de los nutrientes que cubran sus necesidades de crecimiento, tal y como se encontraban en sus condiciones originales. Para la preparación de un CC se puede considerar el siguiente orden. 1) El tejido se obtiene del modelo original, que puede ser en un caso, cualquier tejido sano de algún animal, por ejemplo, células epiteliales de intestino, embriones de rata, etc. En otro caso los CC provienen de tejido anormal que se puede obtener directamente de tumores cancerosos o bien de tejidos que inicialmente son normales y que por exposición a algún mutágeno se transforman en el laboratorio. 2) Las células que se obtienen inicialmente de los tejidos se disocian en una suspensión celular mediante métodos mecánicos, como maceración. De esta manera, se tienen trozos de tejido, más pequeños que el original, pero sin células individuales. Para disgregar a las células, el procedimiento continúa con una…. 3) Digestión con enzimas proteolíticas. 4) Centrifugación 32 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 5) Las células se suspenden en un medio de cultivo y se colocan en recipientes o placas de plástico, conforme las células se dividen van cubriendo la superficie. Las células de fibroblastos o epiteliales se adsorben al plástico y van formando una monocapa, mientras que células como las sanguíneas o los linfocitos, sedimentan pero no se adhieren. 6) El medio adecuado para las células consiste de una solución isotónica de sales, glucosa, vitaminas, coenzimas y aminoácidos mantenidos en buffers a un pH entre 7.2 y 7.4 Y se complementan con antibióticos para inhibir el crecimiento microbiano. Frecuentemente se adicionan diferentes tipos de suero para proveer a las células de una fuente rica de factores de crecimiento Existen principalmente tres tipos de cultivos celulares: O Cultivos celulares primarios O Cepas celulares diploides O Líneas celulares continuas Dado que el desarrollo de una línea celular es un proceso costoso, la gran mayoría de líneas celulares de amplia utilización, son depositadas en y distribuidas desde centros de reposición. Existen unos pocos de estos centros en el mundo, el principal en EEUU es el American Type Culture Collection (ATCC). Algunos ejemplos de líneas celulares que se distribuyen con origen y calidad certificados ATCC son: Vero E-6, Vero C-76, BHK-21, MDCK, MDBK, HEp-2 entre otras. Además del análisis viral, los Cultivos Celulares pueden emplearse en diferentes áreas y aplicaciones como: Actividad y flujo intracelular, movimientos del RNA, de proteínas etc. Ecología celular, Interacciones celulares, Inmunología, Ingeniería de proteínas, Estudios de diferenciación y desarrollo celular, Aplicaciones diagnósticas. Medicina, Farmacología,etc. 33 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 34 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B RECONOCIMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO DE CELULAS INFECCION VIRAL CAMBIO MORFOLÓGICO EFECTO CITOPATICO (ECP) Sin cambio aparente: Hemadsoción Hemaglutinación. Interferencia Alargamiento TIPOS DE EFECTO CITOPATICO Vacuolización Monocapa confluente de células Redondeamiento Cuerpos de inclusión Lisis Formación de sincitios 35 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B HEMADSORCIÓN Virus con HA Eritrocitos con el receptor adecuado Monocapa confluente de células INTERFERENCIA A Muestra presuntiva de Rubéola Sin efecto aparente Línea celular B Infección con Rinovirus Redondeamiento Línea celular C Infección con Rinovirus Interferencia Línea celular, previamente infectada con Rubéola 36 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICA No.11 PROLIFERACIÓN DE CULTIVOS CELULARES MEDIANTE SUBCULTIVO O PASE 1:2 INTRODUCCIÓN El diagnóstico de laboratorio de las infecciones virales requiere frecuentemente del aislamiento de virus en cultivos celulares. Para tal efecto, monocapas celulares son inoculadas con un espécimen clínico adecuado y entonces son observadas para detectar cambios citológicos inducidos por la reproducción de virus. El término efecto citopático (ECP) es aplicado para indicar los cambios celulares que inducidos por virus, son observables al microscopio óptico. Estos cambios incluyen el redondeamiento o lisis de células, la formación de células gigantes multinucleadas (sincitios) y la producción de inclusiones en el núcleo y citoplasma de células infectadas. La obtención de cultivos de células eucarióticas en el laboratorio de Virología, es una de las mayores contribuciones históricas para toda el área de las ciencias naturales, en especial para la Biología Celular y Molecular. La labor de los investigadores que sentaron estas bases, ha sido reconocida con el otorgamiento de varios premios Nobel en Fisiología y Medicina. Con base en lo anterior, resulta conveniente conocer el procedimiento de reproducción de cultivos celulares a través de un subcultivo o pase en relación 1:2, ya que de esta manera, se pueden obtener monocapas de células en cultivo para la reproducción de virus en condiciones de laboratorio. OBJETIVO Realizar un subcultivo in vitro de células eucarióticas para promover su proliferación por división mitótica y obtener monoestratos celulares. MATERIAL Y EQUIPO Gabinete de bioseguridad Incubadora con fuente de CO2 Microscopio con circuito cerrado de televisión Medidor de pH Pipeteador automático Bomba de vacío 37 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Equipo de esteriliación por filtración Etanol al 70% Cultivo celular MRC-5 Frascos para cultivo celular de 25 cm2 Medio para cultivo de células Mínimo Esencial (MEM) Suero fetal de ternera Solución de tripsina en regulador de pH de Dulbecco Agua desmineralizada DESARROLLO 1. Desinfectar el área de trabajo en el interior del gabinete de bioseguridad con etanol al 70%. 2. Introducir todo el material y equipo que se empleara en el proceso y encender la luz ultravioleta por espacio de 30 minutos, evitando observar en forma directa la fuente de radiación. 3. Apagar la luz ultravioleta y encender la iluminación convencional del gabinete de bioseguridad. 4. Disolver en condiciones asépticas, el medio mínimo esencial en agua desmineralizada y ajustar el pH a 7.0 5. Esterilizar el medio de cultivo por filtración con vacío a través de una membrana con diámetro de poro de 0.22 micrometros. 6. Decantar el medio del frasco de cultivo original que contiene células MRC- 5. 7. Agregar 2.0 ml de solución de tripsina y dejar interaccionar con las células durante 30 segundos; retirar el exceso de la solución de tripsina. 8. Incubar a 37° C durante 5 a 10 minutos; observar al microscopio que las células se hayan redondeado (disgregación celular). 9. Añadir al frasco de cultivo con las células disgregadas, 14 ml de medio para cultivo celular adicionado de 5% de suero fetal de ternera y homogenizar por pipeteo hasta formar una suspensión celular homogénea. 10. Dispensar 7 ml de la suspensión celular obtenida a cada uno de dos frascos estériles para cultivo celular. 11. Incubar a 37° C en la incubadora con una concentración de 5% de CO2, durante 24 a 48 horas. 38 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 12. Observar al microscopio que en ambos frascos de cultivo se tenga una confluencia del 100% (monoestrato celular). 13. Cambiar el medio de cultivo celular, por un medio de mantenimiento que solo contenga 0.5 % de suero fetal de ternera, hasta el momento de emplear el cultivo de células MRC-5 para la reproducción de virus. CUESTIONARIO 1. ¿Que significa confluencia? 2. ¿Que función tiene el Suero de ternera adicionado al medio de cultivo para células? 3. ¿Explique el efecto que produce la adición de tripsina a la monocapa celular? 39 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B SESIÓN No. 12 REPLICACIÓN VIRAL EN CULTIVOS CELULARES: OBSERVACIÓN DE MONOESTRATOS CELULARES NORMALES Y CON EFECTOS CITOPÁTICOS INTRODUCCION. Entre los modelos disponibles para el estudio de virus, encontramos a los animales de laboratorio, el embrión de pollo y los cultivos celulares. Estos últimos ofrecen ventajas como la reproducibilidad de los resultados, la diversidad de virus que pueden ser analizados y sobre todo la posibilidad de conocer los diferentes eventos que ocurren dentro de ese compartimiento esencial para la supervivencia del virus, la célula. Debido a estas propiedades las células en cultivo representan el estándar de oro para la validación de pruebas efectuadas tanto en investigación como a nivel industrial para la producción y control de calidad de vacunas. Su mayor limitante recae en el alto costo de la infraestructura requerida para su implementación, situación que vuelve inaccesible su aplicación en el diagnóstico clínico de rutina. La técnica consiste en inocular una muestra de prueba sobre células en monocapa, que posteriormente se incuban bajo condiciones adecuadas efectuando un observación diaria de los cambios presentados. Los cambios que son perceptibles como modificaciones morfológicas en la célula, inducidos y característicos de cada virus analizado se conocen como Efecto Citopático ECP. Existen diferentes tipos de ECP como: redondeamiento, alargamiento, formación de Sincicios, vacuolización, cuerpos de inclusión, lisis, etc. En algunos casos el ECP presentado es tan característico que se relaciona con un solo tipo de virus, en otros, la diversidad de virus que inducen a un mismo ECP merece la aplicación de otras técnicas. Sin embargo el modelo de Cultivos Celulares se requiere para el primo aislamiento de los virus a partir de un espécimen dado. OBJETIVOS 1.- El alumno valorará la importancia de los cultivos celulares para el aislamiento de virus. 2.- El alumno será capaz de determinar la presencia de virus en una muestra reconociendo el ECP inducido en células en monocapa. 40 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B MATERIAL Y REACTIVOS 2 Botellas de 25 cm2 con células en monocapa con un 80% de confluencia. Inóculo viral (Vacuna viral, muestra clínica, stock viral) Microscopio invertido. Campana de Flujo Laminar. Estufa de incubación con 5% de CO2 Micro pipetas con volumen variable de 20-200 µl y de 100-1000 µl. Puntillas amarillas y azules estérilizadas. Solución Salina de Fosfatos (SSF) estéril. Pipetas Pasteur esterilizadas. Pipetas de 5 y 10 ml esterilizadas Plancha de agitación. Medio Mínimo Esencial (MME) esterilizado por filtración. Suero fetal de ternera esterilizado por filtración. DESARROLLO 1. Revisar en el microscopio invertido la integridad de la monocapa celular de las dos botellas. 2. Asignar una de las botellas como control y la otra como botella de prueba. 3. Decantar el medio de cultivo de ambas botellas. 4. Adicionar 7 ml de SSF a cada una de las botellas y lavar las células, aspirando y dispensando por pipeteo la SSF sobre las monocapas. Desechar la solución y repetir el procedimiento dos veces más. 5. Adicionar 500 µl de MME a la botella control y 500 µl del inóculo viral a la botella de prueba. 6. Colocar ambas botellas en la plancha de agitación y mantener a temperatura ambiente por una hora. 7. Adicionar a cada botella 5 ml de MME complementado con 0.5% de suero de ternera e incubar a 37° C dentro de una estufa de CO2 en posición horizontal. 8. Observar diariamente, la botella control debe mantener la integridad de la monocapa mientras en la botella de prueba se presentan cambios morfológicos. 41 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 9. Registrar los cambios especificando el tiempo en que se presentaron los primeros cambios morfológicos y a cual de los ECP conocidos corresponde. CUESTIONARIO 1. Cite tres ejemplos de ECP, los virus que los producen y el tipo de cultivo celular en que se presentan. 2. Además del ECP, de que otra manera se puede mostrar la infección de un virus empleando como modelo las células en cultivo. 42 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICA No. 13 REPLICACIÓN DE BACTERIÓFAGOS LÍTICOS EN ESCHERICHIA COLI. Introducción Las bacterias son huéspedes de un grupo particular de virus denominados bacteriófagos o simplemente fagos. Los fagos constituyen modelos ideales para estudios sobre la infección a nivel celular, la relación huésped parásito, la multiplicación viral y estudios de ingeniería genética. Por otro lado, también son muy útiles en la tipificación de cepas bacterianas. En los bacteriófagos lisogénicos, también denominados temperados, el genoma del fago se replica sincrónicamente con el genóforo bacteriano, pasando a la progenie cada vez que la bacteria se divide por fisión binaria. En este estado lisógenico, los fagos integrados al genóforo bacteriano adquieren genes de la bacteria durante su separación. Estos genes permiten a la bacteria lisógenica expresar nuevas actividades y producir diferentes proteínas. El genoma del fago lisógenico puede modificar la estructura del polisacárido bacteriano y su antigenicidad, así como codificar la producción de toxinas bacterianas que causan enfermedades tales como la difteria, la escarlatina, el botulismo y el síndrome urémico hemolítico. Por otra parte, los bacteriófagos líticos o virulentos se replican dentro de la bacteria huésped y causan su muerte por lisis, liberando nuevos fagos. Los fagos líticos más extensamente estudiados son los de Escherichia coli, mismos que se designan con la letra T y diferentes números (bacteriófagos de la serie T). Los fagos virulentos al destruir a las bacterias producen placas de lisis o calvas que se tornan evidentes en cultivos sobre placas de agar. 43 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Objetivo El alumno aprenderá a desarrollar bacteriófagos en el laboratorio y conocerá su importancia en la Microbiología. Material y equipo • Incubadora bacteriológica • Pipeteador automático • Pipetas Pasteur • Pipetas serológicas de 1 y 5 ml • Tubos de ensaye de 13 x 100 • Gradillas • Asa bacteriológica • Cajas Petri • Suspensión de bacteriófago T2 • Cultivo en caldo de Escherichia coli • Etanol al 70% • Solución salina fisiológica • Agar cerebro corazón • Caldo cerebro corazón Desarrollo 1. Prueba cualitativa: a) Siembre una placa de agar cerebro corazón, depositando en la superficie 0.2 ml de una suspensión de Escherichia coli, que será el huésped específico del fago. b) Enseguida distribuya el inóculo homogéneamente con un asa bacteriológica. c) A continuación, marque 4 puntos separados en el reverso de la misma caja y en cada uno deje caer una gota de suspensión del fago T2, utilizando una pipeta Pasteur. d) Incube a 37º C por 24 hrs. e) Observe las áreas circulares sin crecimiento de la bacteria, equivalentes a zonas de bacterias lisadas por replicación del fago. 44 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B II. Prueba cuantitativa por dilución en placa: a) Haga diluciones de una suspensión del fago de la siguiente manera: En un tubo estéril coloque 0.5 ml de la suspensión del fago, más 4.5 ml de caldo cerebro corazón. b) Transfiera 0.5 ml a otro tubo conteniendo 4.5 ml de solución salina fisiológica (S. S. F.) y continúe haciendo diluciones con S. S. F. hasta obtener una dilución de 1:1000 000. c) De cada dilución del fago, transfiera 0.1 ml a tubos que contengan 0.1 ml de Escherichia coli. Mezcle e incube a 37º C por 20 min. d) Al cabo de este tiempo adicione a cada tubo 4 ml de agar cerebro corazón “blando” (0.5%), mezcle y vacíe en cajas de Petri estériles con agar cerebro corazón. e) Deje solidificar e incube a 37º C durante 24 hrs. Determine las placas líticas o calvas y cuéntelas. f) Para calcular el número de partículas virales / ml, cuente el número de placas líticas en las cajas de cultivo que presenten pocas calvas y emplee la siguiente fórmula: UFP / ml = PV x FD Donde: PV = número de placas virales FD = Factor de dilución UFP / ml = unidades formadoras de placas por ml de suspensión original del fago. Cuestionario 1. Anote Usted un ejemplo de bacteriófago temperado 2. En que mecanismo de recombinación genética entre bacterias se involucra la participación de bacteriófagos 3. Realice un esquema en donde se representen los principales componentes estructurales de los bacteriófagos de la serie T 45 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 4. Investigue Usted el porque ciertas cepas de Escherichia coli son capaces de producir colitis hemorrágica 46 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICA No. 14 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) EN EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE VIRUS: FUNDAMENTO, APLICACIONES Y LIMITACIONES El diagnóstico de las entidades virales es uno de los mayores retos a los que se enfrenta la medicina actual ya que para estos agentes, una cosa es lo que idealmente deseamos tener y otra la realidad con la que contamos. Durante las últimas décadas, el desarrollo progresivo de nuevas y mejores herramientas para evidenciar las etiologías de tipo viral, hace posible que estas entidades se puedan descubrir y estudiar no sólo a nivel de laboratorios especializados, sino también en los de diagnóstico de rutina. ¿Qué es lo ideal? Identificar plenamente el agente viral. Resultados en corto tiempo. Una sola prueba. ¿Cuál es la realidad? No se hace diagnóstico directo del agente viral (descarte). Se requiere la complementación entre la clínica y el laboratorio. Recurrir al análisis por pruebas pares. Diagnosticar si una infección es de etiología viral es muy importante porque determina un cambio en la conducta clínica y en el manejo terapéutico del paciente, además de que ayuda a realizar un seguimiento clínico de la entidad. Llevada con ética, esta actitud impacta social y económicamente, puesto que la administración oportuna del tratamiento correcto reduce aspectos como el tiempo de hospitalización y directamente el gasto a familiares. 47 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRUEBAS SEROLÓGICAS Al igual que la mayoría de los microorganismos, los virus se pueden descubrir ya sea de una forma directa o indirecta. Las pruebas directas son las que evidencian al virus o algunos de los antígenos virales que se pueden encontrar presentes en los tejidos o fluidos humanos. Las pruebas indirectas son las que se utilizan con más frecuencia y básicamente demuestran un contacto del huésped con el agente viral mediante la determinación de anticuerpos específicos contra el virus. En el laboratorio clínico se cuenta con las pruebas serológicas que tanto de forma directa e indirecta son la principal herramienta que se aplica en el diagnóstico viral. En estos ensayos se aprovechan las características fisicoquímicas de los anticuerpos, así como su especificidad. Los principales aspectos a considerar son: ¾ Se pueden detectan antígenos virales. ¾ Se pueden valorar anticuerpos con especificidad antiviral en el paciente. ¾ Requiere del análisis de sueros pares. En muestras tomadas con periodos de separación de 10-14 días, un incremento de 4 veces o más en el título de la segunda muestra con respecto a la primera, es considerado significativo para una infección viral en curso. ¾ Puede diferenciar entre infecciones primarias y crónicas. La presencia de Ig M específica es más rápido y detectable a pocos días del inicio de la enfermedad Las pruebas serológicas con mayor aplicación en el diagnóstico clínico viral son: 9 INMUNOFLUORESCENCIA a) Directa (Antígenos virales) b) Indirecta (Anticuerpos de respuesta) 9 ENSAYOS ENZIMÁTICOS a) Directo (Antígenos) b) Indirecto (Anticuerpos de respuesta) 9 WESTERN-BLOT 48 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS: ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay) ELISA Directo Ensayos de captura del antígeno (sandwich). Son inmunoensayos en fase sólida donde se fijan los anticuerpos específicos para el virus en la superficie de una matriz, tubo o microplaca y luego se pone en presencia del suero o muestra que contiene el antígeno que se quiere demostrar; una vez que ocurre la reacción antígeno-anticuerpo, se hace un lavado y se agrega un anticuerpo marcado (Fig 1A). En la técnica ELISA el anticuerpo se marca con una enzima que puede ser la fosfatasa alcalina (FA) o la peroxidasa de rábano (PR) y para revelar la reacción se coloca el sustrato específico para la enzima que es modificado por ésta y produce un compuesto coloreado. En el caso de la FA el sustrato es el paranitrofenilfosfato y para la PR es el peróxido de hidrógeno en una solución de ortofenilendiamina (OPD) que hace visible la reacción. Para la cuantificación se mide la absorbancia en una longitud de onda determinada en un espectrofotómetro. La absorbancia será directamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra. Estas técnicas se utilizan ampliamente en el diagnóstico de hepatitis A y B, rotavirus, el agente Norwalk, parainfluenza, influenza A y B. Para la hepatitis B la demostración de antígeno de superficie diagnóstica la infección activa así como el estado de portador; el diagnóstico de rotavirus con este método ayuda a obtener un resultado rápido en niños menores de dos años con cuadros diarreicos, donde este virus es el principal causante de dichos cuadros; por otro lado para VIH la demostración del antígeno p 24 es útil en el diagnóstico de la infección en niños y en pacientes que se encuentran en ventana inmunológica y además es de gran utilidad en el pronóstico y la progresión de la infección así como en el control de la terapia antirretroviral. ELISA Indirecto Estas técnicas serológicas se emplean para determinar la existencia de anticuerpos contra determinado agente viral, teniendo en cuenta que la exposición al 49 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B agente produce una respuesta por parte del sistema inmune que genera la producción de anticuerpos específicos. La prueba ELISA indirecta tiene un principio semejante al de ELISA directa, en este caso, un antígeno específico está unido a una fase sólida que puede ser un tubo, microplaca o perlas de vidrio; luego se añade el suero del paciente que posee los anticuerpos y después se adiciona el conjugado constituido por un antianticuerpo IgG o IgM unido a una enzima; posteriormente se adiciona el sustrato específico para la enzima, que lo va a modificar y produce un compuesto coloreado, cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpo en el suero del paciente (Fig. 1B). Esta prueba se utiliza ampliamente; más aún, con el advenimiento y la disponibilidad de los sistemas automatizados se puede efectuar en un periodo de 1 a 2 horas. Su utilidad en virología es básicamente para determinar anticuerpos contra antígenos específicos del virus dengue, herpesvirus, VIH, sincitial respiratorio, Citomegalovirus, rubéola, hepatitis A, B y C principalmente, y en infecciones por Virus Epstein-Bar se usa para demostrar marcadores serológicos tempranos de la infección, que se pueden utilizar en el manejo de huéspedes inmunocomprometidos. La especificidad de las pruebas de ELISA, depende de la calidad de los sustratos adsorbidos en la fase sólida, lo cual se aprecia principalmente en los diferentes tipos de ELISA indirecto donde de acuerdo con el antígeno que se utilice la prueba puede ser: a. De primera generación Son pruebas incipientes donde se utilizan antígenos crudos sin mayores procesos de purificación, como p.e., el virus completo inactivado, es el caso de las primeras técnicas de ELISA para VIH. Sin embargo, estos ensayos presentaban como resultado muchas reacciones inespecíficas. 50 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Marcaje Marcaje Anticuerpo secundario Anti-IgG Antígeno viral Anticuerpo en la muestra (IgG o IgM) Anticuerpo de captura Antígeno viral Fase sólida Fase sólida A) ELISA Directo B) ELISA Indirecto Fig. 1. Diagrama esquemático de las pruebas de ELISA b. De segunda generación En este caso los antígenos son proteínas recombinantes, que se producen mediante ingeniería genética en bacterias y son sometidas a procesos de purificación lo que da más especificidad a la prueba pues se descubren anticuerpos particulares contra las proteínas consideradas más inmunogénicas. c. De tercera generación Son las más utilizadas actualmente y las más específicas, donde se emplean péptidos sintéticos (fabricados en un sintetizador en el laboratorio) con secuencias más específicas del virus: tal es el caso de las pruebas diseñadas para determinar sólo anticuerpos contra VIH2 y VIH1. En otra modalidad de ELISA se usa el sistema biotina/avidina-estreptavidina, método que se fundamenta en sistemas con distintos marcadores unidos a la biotina y demostrados por reacciones enzimáticas, de color o quimioluminiscentes que portan la avidina, la estreptavidina o la biotina. La biotina ligada a un anticuerpo, nucleótidos, proteína o lecitina, se une a una molécula blanco que puede ser anticuerpo (indirecta) o antígeno (directa), la avidina o estreptavidina se marcan con una molécula demostrable como una enzima, una sustancia fluorescente o un metal. 51 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B PRACTICA No. 15 ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE CITOMEGALOVIRUS, RUBÉOLA, HEPATITIS B Y HIV. ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO INDIRECTO DE FASE SÓLIDA (EIA), PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA LOS VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA (HIV). INTRODUCCIÓN El virus de inmunodeficiencia humana (HIV) es un retrovirus, identificado en 1983 como el agente etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Aunque se trata de un síndrome, es decir, un conjunto de signos y síntomas, y no de una sola enfermedad, por ser valido y más sencillo de aquí en adelante nos referimos al SIDA como enfermedad. Por lo pronto no existe tratamiento ni vacuna contra el virus, por lo que una vez que se desarrolla, casi inexorablemente, a la muerte en un tiempo muy corto. En nuestro país, el informe, descripción y análisis de esta singular enfermedad, ha sido objeto de múltiples actividades académicas, clínicas, e incluso culturales. A partir de abril de 1987, el SIDA se convirtió en una enfermedad sujeta a vigilancia epidemiológica; la notificación de los casos tiene carácter de obligatoria e inmediata. Hasta ahora se conocen dos variables genéticas del virus, en función del antígeno de superficie que los clasifica en VIH-1 y VIH-2. Para el VIH-1 la glicoproteína externa es la gp120 y la de transmembrana es la gp41; para el VIH-2 la gp externa es la 140 y la de transmembrana es la gp36. Desde que se reconocieron los primeros casos de SIDA, una de las primeras líneas de investigación ha sido lo referente a la transmisión del virus; conociéndose hasta el momento las siguientes vías: 1. Sexual: homosexual, heterosexual. 2. Sanguínea: transfusión de sangre y/o hemoderivados. 3. Perinatal: durante el embarazo, en el parto, después del parto (leche materna). Para el diagnostico de VIH se cuenta con: 52 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Métodos directos (determinan estructuras de los virus), como: Aislamiento del virus en cultivos celulares Detección de antígenos virales con anticuerpos monoclonales Reacción en cadena de la polimerasa Hibridización con sonda de DNA marcadas Métodos indirectos (donde se valoran anticuerpos contra el virus), como: Pruebas de Inmunoenzayo enzimatico (ELISA) Aglutinación pasiva con partículas de látex Inmunoelectrotransferencia (Western-Blot) OBJETIVO: El alumno aprenderá una de las técnicas empleadas para el diagnostico de infección por los virus del Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (SIDA) MATERIAL Y REACTIVOS: Equipo Inmuno Comb HIV 1+2 PBS-Orgenics Micropipetas con puntillas para 25, 50 y 100 µl Tijeras Perforador Reloj Papel desechable Sueros problema Sueros control positivo y negativo Solución de hipoclorito de Sodio METODOLOGÍA o Realizar un plan de distribución que identifique plenamente la localización de los sueros problema, control positivo y negativo o Deposito de muestra. Compartimiento A. Deposite por separado 50 µl de los sueros dentro de cada pozo del compartimiento A perforando la cubierta de papel aluminio y descargando la muestra en el fondo del pozo. Mezcle los sueros con el diluyente contenido en el compartimiento A mediante carga y descarga del a solución en varias ocasiones. Utilice una puntilla por cada muestra y deséchela 53 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Desarrollo de la prueba o Reacción antígeno-anticuerpo. Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa apuntando hacia usted. Reinserte el peine varias veces para mover las burbujas de aire. Incube durante 10 min. a temperatura ambiente. Al final de la incubación extraiga el peine del compartimiento y seque el líquido sobrenadante tocando con la orilla del peine el papel desechable y perfore con las pinzas el papel que cubre los pozos del siguiente compartimiento. NOTA: Este último procedimiento se repetirá siempre antes de pasar de un compartimiento a otro. o Lavado. Compartimiento B Inserte el peine en el compartimiento B, para lograr un lavado adecuado mueva el peine hacia atrás y adelante durante un periodo 2 min. o Conjugado. Compartimiento C. Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte el peine varias veces. Incube durante 10 min. a temperatura ambiente. o Lavado. Compartimiento D. Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B. o Lavado. Compartimiento E. Realice el mismo procedimiento que para el compartimiento B. o Reacción de color. Compartimiento F Inserte el peine dentro del compartimiento F; Reinserte el peine varias veces durante 10 min. a temperatura ambiente. o Detección de la reacción. Compartimiento E. Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E, después de 1 min. retire el peine y séquelo al aire completamente. CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el fundamento de está prueba? 2. ¿Cuándo se dice que el paciente es seropositivo? 3. ¿Cuál es la diferencia entre un paciente seropositivo y uno con SIDA? 54 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 4. ¿Cómo se puede prevenir el SIDA? 5. ¿Cómo se trata la enfermedad del VIH? 55 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ANTICUERPOS IgG CONTRA EL VIRUS DE LA RUBÉOLA EN EL SUERO O PLASMA HUMANO. INTRODUCCIÓN El virus de la rubéola es miembro de la familia Togavirus. La familia está formada por un grupo de agentes virales pequeños que contienen ácido ribonucléico en su genoma y una envoltura lipídica, de donde deriva la palabra “toga”. Es considerable el avance alcanzado en el conocimiento del virus de la rubéola a partir de que se logro cultivar in vitro en 1962. Esto condujo a la posibilidad de hacer estudios moleculares del virus, de estudiar la infección y su replicación. El virus de la rubéola es sensible al éter y fácilmente inactibable por agentes químicos y por radiación ultravioleta; es relativamente termolábil, perdiendo su in efectividad si permanece durante una hora a 37ºC, mientras que es capaz de mantener su viabilidad a temperatura de refrigeración si se encuentra en una solución que contenga proteínas. Son partículas esféricas y de diámetro de 60 a 70 micras; posee una nucleocápside rodeada de doble membrana lipídica con espículas con capacidad hemaglutinante, se cultiva en varios tipos de líneas celulares, principalmente las provenientes de mono (RK-13, VERO y AGMK). El único resrvorio del virus de la rubéola es el humano y la enfermedad se propaga por medio de las secreciones faríngeas, la orina, líquido cefalorraquideo y sangre de personas infectadas, tengan o no síntomas clínicos, desde varios días antes de aparecer el exantema y hasta después de una semana, manifestándose con una multitud de formas clínicas posibles desde la infección inaparente, hasta un cuadro clínico clásico de exantema linfadenopatía y fiebre. Puede haber complicaciones de tipo meningoencefalítico. La enfermedad es endémica en todo el mundo y aparece en epidemias periódicas, principalmente en la infancia, aunque es más frecuente en los adultos, común entre los estudiantes universitarios. El período de incubación es de 14 a 21 días con un promedio de 17 días. En los adultos la enfermedad puede presentarse en forma más severa, con poliartralgias tan frecuentes que se consideran típicas de la enfermedad. La infección posnatal es benigna, en contraste con la infección prenatal, particularmente si ocurre durante las primeras 16 semanas del embarazo. Las 56 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B consecuencias de la rubéola in utero son variadas e impredecibles y pueden variar desde la afectación severa con muerte fetal, en nacimientos vivos con malformaciones evidentes o en productos normales sin evidencia clínica de la infección. El diagnostico de la rubéola puede establecerse en base a dos procedimientos: virológico que se refiere al cultivo del virus a partir de muestras del paciente y el serológico que se refiere a la demostración de anticuerpos que se han adquirido como resultado de la infección, existen varios métodos tales como la fijación del complemento, hemaglutinación, hemólisis en gel aglutinación en latex, anticuerpos fluorescentes, métodos inmunoenzimaticos, radioinmunoanálisis y gran variedad de pruebas especificas para detección de IgM. La vacuna HPV 77 (Meyor-Parkman)es preparada en cultivo celular de embrión de pato y está indicada en niños desde 1 año hasta la pubertad. OBJETIVO El alumno aprenderá el manejo de la técnica del ensayo inmunoenzima´tico indirecto de fase sólida (EIA), empleada para el diagnóstico de anticuerpos Ig G contra el virus de la rubéola. MATERIAL Y REACTIVOS Equipo Inmuno Comb II para la rubeola IgG Micropipetas con puntilla 10, 25 y 100 ul Perforador Tijera. Reloj Papel desechable Sueros control Suero problema Hipoclorito de Sodio. METODOLOGIA Pre dilución de muestras y controles. 1. Para cada muestra y control. Colocar 100 ul de diluyente de la muestra de cada microtubo. 57 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B 2. Añadir a cada microtubo 10ul de la muestra o del control positivo o negativo Mezcle cargando y descargando repetidamente la solución con la pipeta. -Realizar un plan de distribución que identifique plenamente la localización de los sueros muestra, control positivo y negativo. -Depósito de muestra. Compartimiento A. Deposite por separado 20 ul de los sueros problema y controles de cada pozo de compartimiento A, perforando la cubierta de aluminio con el perforador y descargar la muestra en el fondo del pozo. Mezcle los sueros con el diluyente contenido en el compartimiento A mediante carga y descarga de la solución en varias ocasiones. -Reacción Ag-Ac. Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa apuntando hacia usted. Reinserte la tarjeta varias veces para remover las burbujas de aire. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación extraiga el peine de compartimiento y seque el líquido sobrenadante tocando con la orilla del peine el papel desechable y perfore con el perforador el papel que cubre los pozos del siguiente compartimiento. NOTA: Este último procedimiento se repetirá siempre antes de pasar de un compartimiento a otro. -Lavado. Compartimiento B. Inserte el peine en el compartimiento B e incube por 2 minutos, para lograr un lavado adecuado, mueva periódicamente el peine hacia atrás y adelante durante la incubación. -Conjugado. Compartimiento C Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte e peine varias veces para remover las burbujas de aire. Incube durante 20 min. a temperatura ambiente. - Lavado. Compartimiento D. Inserte el peine en el compartimiento D e incube por 2 min., para lograr un lavado adecuado mueva periódicamente el peine hacia atrás y hacia delante durante la incubación. -Lavado. Compartimiento E. Repetir el procedimiento como para el compartimiento D. - Reacción de color. Compartimiento F. 58 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Inserte el peine en el compartimiento F. Reinserte el peine varias veces para remover las burbujas de aire. Incube durante 10 min. a temperatura ambiente. - Detección de la reacción. Compartimiento E. Vuelva a insertar el peine al compartimiento E. Después de 1 min. retire el peine y séquelo al aire completamente. CUESTIONARIO. 1.- ¿Cuál es el fundamente de esta prueba? 2.- ¿Cuál es la diferencia entre rubéola congénita y neonatal? 3.- Mencione mecanismos de prevención y tratamiento para la rubéola. 59 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B ENSAYO INMUNOENZIMATICO PARA LA DETERMINACIÓN DEL ANTIGENO DE SUPERFICIE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B (AgsHB). INTRODUCCIÓN La hepatitis viral es una enfermedad generalizada que afecta principalmente al hígado. Es causada por los siguientes agentes: 1. Virus de la Hepatitis A (agente causal de la hepatitis infecciosa) 2. Virus de la Hepatitis B (asociado a la hepatitis sérica) 3. Virus de la Hepatitis C (causa de muchos casos de hepatitis postranfucional) 4. Virus de la Hepatitis D requiere de la presencia de del VHB. Asimismo, se ha identificado el agente causal de otra de las formadas de la antes llamada hepatitis no A-no B 5. Virus de la Hepatitis E Otros virus que tambien pueden ser agentes causales de la Hepatitis se encuentran: virus Epstein Bar, rubéola, citomegalovirus, coxsakie, varicela zoster entre otros. El virus de la Hepatitis B pertenece al grupo hepadnavirus y su transmisión es vía parenteral (sangre y derivados, fomites contaminados por el virus). Al virus se le conoce como partícula DANE, presente diversos antigenos que estimulas anticuerpos, lo cual se utiliza en el diagnostico de la enfermedad, este puede detectarse de manera completa (virión completo) o en partes del mismo, la cubierta proteínica se determina antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y la partícula interna antígeno core (o central) de la hepatitis B (HBcAg). Resiste la temperatura a 37ºC por 1 hora, 60ºC por 10 horas, 25ºC por una semana, 100ºC un minuto y 20ºC por 5 años. El hipoclorito de sodio al 0.5 % lo inactiva en 3 minutos. La infección tiene un periodo de incubación de 60 a 180 días; su comienzo es insidioso, con poca o ninguna fiebre. Pudiendo presentarse a cualquier edad. OBJETIVO 1. El alumno aprenderá el manejo de la técnica del Ensayo inmunoenzimático indirecto de fase sólida (EIA), empleado para el diagnostico de HBsAg. MATERIAL Y REACTIVOS Equipo Inmuno Comb II para HBsAg 60 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Micro pipetas con puntillas para 10, 25, y 100 ul Estufa a 37ºC Tijeras Perforador Reloj Papel desechable Suero problema Suero control positivo y negativo Solución de hipoclorito de sodio METODOLOGÍA Realizar un plan de distribución que identifique plenamente la localización de los sueros problema, control positivo y negativo. Deposito de muestra compartimiento A. Deposite por separado 75 ul de los sueros problema, control positivo y negativo dentro de cada poza del compartimiento A (cada una por separado en el pozo A correspondiente para cada muestra), perforando la cubierta de papel aluminio con el perforador y descargando la pipeta con la muestra en el fondo del pozo. Mezcle vaciando y cargando repetidamente la solución con la pipeta. Deseche la punta de la pipeta. Inserte el peine dentro de los pozos del compartimiento A con la cara impresa apuntando hacia usted. Reinserte varias veces para remover las burbujas de aire, incube por 30 minutos a 37ºC. Al final de la incubación extraiga el peine del compartimiento y seque el liquido sobre nadante con el papel desechable y perfore el papel que cubre los pozos del siguiente compartimiento. NOTA: Este ultimo procedimiento se repetira siempre antes de pasar de un compartimiento a otro. Lavado. Compartimiento B Inserte el peine en el compartimiento B e incube por dos minutos; para lograr un lavado adecuado mueva periódicamente el peine hacia atrás y adelante durante la incubación. Enlace anti-HBs. Compartimiento C. 61 Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE VIROLOGÍA Q.F.B Inserte el peine en el compartimiento C. Reinserte el peine varias veces para remover las burbujas de aire. Incube durante 20 minutos a 37ºC. Reacción con fosfatasa alcalina. Compartimiento D. Inserte el peine en el compartimiento D. Reinserte el peine varias veces para remover las burbujas de aire. Incube durante 20 minutos a 37ºC. Lavado. Compartimiento E. Inserte el peine en el compartimiento E y agite vigorosamente por 2 minutos, moviendo el peine hacia atrás y adelante. Reacción de color. Compartimiento F. Inserte el peine en el compartimiento F. Reinserte varias veces igual que en A, e incube durante 10 minutos a 37ºC. Detección de la reacción. Compartimiento E Vuelva a insertar el peine en el compartimiento E. Después de un minuto retire el peine y séquelo al aire completamente. CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es le fundamento de esta prueba? 2. ¿Cuál es la diferencia entre los tipos de hepatitis? 3. ¿Cuáles son las formas de transmisión de los diferentes tipos de hepatitis y cuáles serían los mecanismos de prevención? 4. Describa otros métodos para diagnosticar hepatitis, diferente a la hepatitis B. 62