Download Producción a Nivel Pre-piloto de Enzima Fitasa de Aspergillus

Producción a Nivel Pre-piloto de Enzima
Fitasa de Aspergillus Ficuum, Utilizando
Sistemas de Fermentación en Estado Líquido
y Sólido
Tesis presentada como parte de los
requisitos para optar al grado de
Licenciado en Ciencia de los Alimentos
FRANCISCO ANDRÉS VILLARROEL ROJAS
Valdivia - Chile
2009
PROFESOR PATROCINANTE:
MARCIA COSTA L.
Ingeniero Civil Bioquímico, Diploma Ingeniería
Industrial
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
PROFESORES INFORMANTES:
RENATE SCHÖBITZ T
Tecnóloga Médica, MSc
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
KONG SHUN AH-HEN
Ingeniero en Alimentos, Doctor en Ingeniería
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
i
INDICE DE MATERIAS
Capítulo
1
Página
RESUMEN
1
SUMMARY
2
2
INTRODUCCIÓN
3
3
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
5
3.1
Aspergillus sp
5
3.1.1
Identificación y taxonomía
5
3.1.2
Aspergillus ficuum
6
3.2
Fitasa
6
3.2.1
Efecto de las fitasas sobre la disponibilidad de los nutrientes
8
3.3
Ácido fítico
10
3.4
Producción de fitasa
12
3.4.1
Aspectos físicos
13
3.4.2
Aspectos nutricionales
13
3.5
Producción de enzimas mediante hongos
14
3.5.1
Fermentación en estado sólido (SSF)
14
3.5.1.1
Variables de operación
17
3.5.1.2
Parámetros de diseño para el escalamiento
20
3.5.2
Fermentación en fase líquida o cultivo sumergido (SmF)
22
3.5.2.1
Variables de operación
22
3.5.2.2
Parámetros de diseño para el escalamiento
23
4
MATERIAL Y MÉTODO
25
4.1
Microorganismo y preparación del inóculo
25
4.2
Determinación de actividad enzimática
25
4.3
Fermentación en cultivo sumergido
25
4.4
Fermentación en estado sólido
27
ii
4.4.1
Seguimiento de la producción
28
4.4.2
Extracción y concentración de la enzima
28
5
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
29
5.1
Fermentación en estado líquido
29
5.2
Fermentación en estado sólido
31
6
CONCLUSIONES
33
7
BIBLIOGRAFÍA
34
8
ANEXOS
44
iii
INDICE DE CUADROS
Cuadro
Página
1
Principales microorganismos productores de fitasa
7
2
Fósforo y fosfato total en alimentos para pollos
11
3
Ensayos en cultivo sumergido
26
4
Tabla resumen fermentaciones en sustrato líquido
45
5
Tabla resumen de actividad enzimática para fermentación
48
en sustrato sólido
6
Curva de calibración
52
iv
INDICE DE FIGURAS
Figura
Página
1
Fermentador New Brunswick
26
2
Fermentador en sustrato sólido de confección propia
27
3
Resumen de la evolución de la actividad enzimática neta de
29
las fermentaciones en estado líquido
4
Evolución de la actividad fitásica neta en el tiempo para
32
fermentación en sustrato sólido
5
Variación de actividad enzimática en el tiempo para
45
fermentación en sustrato líquido 0 vvm 200rpm
6
Variación de actividad enzimática en el tiempo para
46
fermentación en sustrato líquido 0 vvm 300 rpm
7
Variación de actividad enzimática en el tiempo para
46
fermentación en sustrato líquido 0 vvm 400 rpm
8
Variación de actividad enzimática en el tiempo para
47
fermentación en sustrato líquido 0,5 vvm 200rpm
9
Variación de actividad enzimática en el tiempo para
47
fermentación en sustrato líquido 0,5 vvm 300 rpm
10
Variación de actividad enzimática en el tiempo para
48
fermentación en sustrato sólido
11
Cultivo de A. ficuum en placa Petri en agar papa dextrosa
49
12
Observación al microscopio de fermentación en estado
49
líquido
v
INDICE DE ANEXOS
Anexo
Página
1
Detalle de fermentaciones líquidas
45
2
Detalle fermentación sólida
48
3
Imágenes de A. ficuum
49
4
Detalle de reacción enzimática para la
50
determinación de actividad
5
Detalle de preparación de sustratos de
53
cultivo
6
Detalle de cálculo de rendimiento de las
fermentaciones
54
1
1. RESUMEN
Producción a nivel piloto de enzima fitasa de Aspergillus ficuum, utilizando
sistemas de fermentación en estado líquido y sólido
Las materias primas de origen vegetal han adquirido cada vez mayor importancia en la
fabricación de alimentos para animales, por su gran aporte proteico, como es el caso de
cereales y legumbres, pero la presencia del ácido fítico restringe su uso. El ácido fítico es
considerado un componente antinutricional no digerible por animales monogástricos,
además de actuar como quelante de varios minerales y proteínas de unión, además
inhibe enzimas como α amilasa, tripsina, tirosinasa y pepsina. Por otra parte, las fitasas
(mioinositol hexafosfato 3-fosfohidrolasas) son fosfatasas ácidas que hidrolizan el ácido
fítico generando mioinositol y fosfato inorgánico, se han constituido en un aditivo
importante en alimentos elaborados a base de cereales y legumbres, ya que aumentan la
disponibilidad de fósforo y otros minerales importantes en la nutrición. Hongos como el
Aspergillus ficuum, Aspergillus niger y Rhizopus oligosporus liberan fitasa extracelular. En
la presente tesis se utilizó una cepa de Aspergillus ficuum para la producción de fitasa
usando como indicador de producción la actividad enzimática neta. La determinación de la
actividad enzimática se basó en la detección colorimétrica de Pi con una reacción
fosfomolíbdica y un reactivo para desarrollar color. Los ensayos se realizaron en sistemas
de cultivo sumergido y sólido. Para la fermentación en cultivo sumergido se utilizó un
fermentador New Brunswick y para la fermentación sólida un fermentador de confección
propia tipo tambor rotatorio. Los rendimientos obtenidos para la fermentación sumergida
fueron de 15,83 U/gss al sexto día, mientras que para la fermentación sólida corresponde
a 67,34 U/gss al séptimo día, lo que demuestra la conveniencia de esta modalidad de
cultivo para la producción de la enzima.
Palabras clave: fitasa, ácido fítico, Aspergillus ficuum, fermentación en cultivo
sumergido, fermentación en estado sólido.
2
SUMMARY
Production of phytase enzyme from Aspergillus ficuum at a pilot level, using
submerged fermentation and solid state fermentation
Vegetal raw material is getting more and more important in the animal food industry due to
its high protein content, like cereals and pulses (leguminous crops), but the presence of
phytic acid limits its use in food production. Phytic acid in pulses and cereals is considered
an anti-nutritional non-digestible component for monogastric animals. It works chelating
various minerals and binding-proteins, also inhibiting enzymes such as amylase, trypsin,
tyrosinase and pepsin. On the other hand, phytase (myo-inositol hexakisphosphate 3phosphohydrolase) catalyses the release of phosphate from phytate (myco-inositol
hexakiphosphate) and has become a main additive in food being elaborated on a cereal
and pulse basis, increasing availability of phosphorus and other important minerals for
nutrition. Fungi like Aspergillus ficuum, Aspergillus niger and Rhizopus oligosporus liberate
extracelular phytase. In the present study a strain of Aspergillus ficuum was used for the
production of the enzyme, using the net enzymatic activity as a production indicator.
Determination of the enzyme activity was made with the detection of the Pi with a
phosphomolybdic reaction and a reagent for developing color. The different assays were
carried out in submerged and solid fermentation. A New Brunswick fermentator for the
submerged fermentation and a self-made rotating drum fermentator for the solid
fermentation were used. The yield obtained for the submerged fermentation is of 15.83
U/gds (dried solid) on the sixth day, whereas for the solid fermentation it is of 67.34 U/gds
on the seventh day, which shows the advantage of this type of culture for the production of
the enzyme.
Keywords: phytase, phytate, Aspergillus ficuum, submerged fermentation, solid
state fermentation.
3
2. INTRODUCCIÓN
La mayoría de los cereales y las legumbres son ricas en proteínas, pero la presencia de
ácido fítico disminuye su uso en alimentos. El ácido fítico presente en legumbres y
cereales es un componente antinutricional no digerible por animales monogástricos.
Funciona como quelante de varios minerales y proteínas de unión, además inhibe
enzimas como α-amilasa, tripsina, tirosinasa y pepsina.
Por esto, la fitasa es un aditivo importante en alimentos elaborados a base de cereales y
legumbres, ya que hidroliza el ácido fítico, aumentando la disponibilidad de fósforo y otros
minerales importantes en la nutrición.
Por otra parte, se han reportado características anticancerígenas del ácido fítico, cuando
es administrado en pequeñas dosis.
Hongos como el Aspergillus ficuum, Aspergillus niger
y Rhizopus oligosporus liberan
fitasa extracelular.
Hipótesis
Si se cultiva Aspergillus ficuum a nivel prepiloto en modalidades de fermentación sólida
(SSF) y sumergida (SmF), sobre desechos agroindustriales vegetales como sustrato, será
posible determinar y definir los mejores parámetros de producción de fitasa.
Para lo anterior se plantearon los siguientes objetivos:
Objetivo General:
Producir elevadas concentraciones de enzima fitasa utilizada en alimentación de animales
monogástricos cultivando Aspergillus ficuum en sistemas de fermentación sólida y
sumergida, sobre sustratos compuestos por subproductos agroindustriales.
4
Objetivos Específicos:
-
Determinar las mejores condiciones de operación de la producción de fitasa en un
fermentador New Brunswick de 14 L, cultivando Aspergillus ficuum en un medio
líquido basado en subproductos agroindustriales y sulfato de amonio a temperatura
y pH constantes, variando los parámetros de aireación (vvm) y agitación (rpm).
-
Verificar la producción fitasa en modalidad de fermentación sobre sustrato sólido
SSF, usando un prototipo de equipo tipo tambor rotatorio de 2 L, cultivando
Aspergillus ficuum usando un medio basado en subproductos de la agroindustria a
temperatura constante.
5
3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
3.1 Aspergillus sp.
El género Aspergillus incluye una serie de hongos comúnmente considerados como
asexuales, aunque se han encontrado algunos que se reproducen en forma sexual. Están
ampliamente distribuidos en la naturaleza y es posible encontrarlos en una gran variedad
de habitats debido a que son capaces de colonizar una amplia variedad de sustratos.
3.1.1 Identificación y taxonomía. Como en la mayoría de los hongos, el Aspergillus está
principalmente clasificado por su morfología que por sus características fisiológicas,
bioquímicas y genéticas, comúnmente utilizado en la clasificación de bacterias.
La clasificación es la siguiente:
Reino: Fungi
Phylum: Ascomycota
Orden: Eurotiales
Familia: Trichocomaceae
Género: Aspergillus (TSCA, 1997).
El género Aspergillus está definido generalmente como hongos saprófitos asexuales que
producen conidias negras o cafés por largas fiálides que están unidas al conidiosporo.
La clasificación del género Aspergillus se basa fundamentalmente en cuatro
características: presencia de teleomorfo, presencia o ausencia de métulas; disposición de
las métulas o fiálides sobre la vesícula y coloración de las colonias (ABARCA, 2000). Si
las reglas por nombrar son rigurosamente aplicadas, el nombre A. niger podría
desaparecer como un nombre legítimo, causando una gran confusión comercial (TSCA,
1997). Sin embargo, RAPER y FENNEL (1965) proponen el nombre de Aspergillus niger.
Por otra parte, FRISVAD et al., (1990) creen que existe un caso claro por conservar el
nombre de A. niger, porque el A. niger es "la fuente de producción comercial de ácido
6
cítrico y otros ácidos orgánicos alrededor del mundo, y claramente de importancia
económica mayor” (TSCA, 1997).
La taxonomía de los componentes de Aspergillus sección Nigri es una de las más
complejas del género. Basándose en características morfológicas, las doce especies
propuestas por RAPER y FENNELL (1965), se redujeron a cinco especies diferentes por
AL-MUSALLAM (1980).
3.1.2 Aspergillus ficuum. El Aspergillus ficuum presenta algunos problemas al momento
de revisar la literatura, lo que se debe principalmente la nomenclatura escogida. Esto se
puede ver claramente en que algunos autores hacen una diferencia entre Aspergillus
ficuum y Aspergillus niger pero sin especificar el nivel taxonómico de la diferencia
(WODZINSKI y ULLAH, 1996; BRENES et al., 2002; ZHANG, et al., 2000). Otros
simplemente hablan de Aspergillus niger, sin hacer referencia de que cepa se trata. Sólo
algunos textos se indica que Aspergillus ficuum pertenece al grupo de Aspergillus niger,
sin especificar que Aspergillus ficuum es una variedad (SHIEH y WARE, 1968).
La cepa que se utilizará en esta tesis, es Aspergillus ficuum DSMZ 932, que puede ser
encontrada como Aspergillus ficuum MUCL 31164 o Aspergillus ficuum NRRL 3135,
según la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Braunschweig, Germany.
3.2 Fitasa
Las reacciones de fosforilación y desfosforilación son dos aspectos fundamentales de la
vida. Estas reacciones catalizadas por numerosas enzimas son utilizadas para almacenar
y recuperar energías químicas, el metabolismo y señales de transducción. Las fosfatasas
son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de fosfomonoésteres ligados a
sistemas biológicos (SHIN et al., 2001). Estas varían de muchas maneras, por ejemplo, el
pH óptimo, peso molecular, y tal vez la más importante, en que ión metálico es un cofactor
requerido para la catálisis. Las fosfatasas han sido tradicionalmente divididas en, ácidas y
alcalinas (VINCENT, 1992).
Las fitasas son distintas de otras fosfatasas porque prefieren ácido fítico como sustrato.
Muchas fitasas, tales como las de Aspergillus ficuum (ULLAH y SETHUMADHAVAN,
1998) y de E. coli (LIM et al., 2000) han sido clonadas y caracterizadas. Estas fosfatasas
no presentan una secuencia similar entre ellas y con otras fosfatasas conocidas, excepto
7
por la secuencia RHGXRXP conservada en la fosfatasa ácida de alto peso molecular
(SHIN et al., 2001).
Actividad de fitasa ha sido detectada en una gran variedad de microorganismos
(CUADRO 1). De estas fuentes, la enzima está mayormente distribuida entre los hongos,
particularmente entre hongos que se encuentran en el suelo y el agua como los del
género Aspergillus y Rhizopus sp. (WODZINSKI y ULLAH, 1996).
Las fitasas (mioinositol hexafosfato 3-fosfohidrolasas) son enzimas fosfatasas ácidas que
dividen eficientemente las partes de fosfato del ácido fítico (mioinositol hexafosfato),
generando mioinositol y fosfato inorgánico (MITCHELL et al., 1997).
CUADRO 1 Principales microorganismos productores de fitasa
Localización de la
Bacterias
Aerobacter aerogenes
enzima
Unida a la célula
Referencia
GREAVES et al., 1967
POWAR y JAGAANNATHAN,
Bacillus subtilis
Extracelular
Escherichia coli
Unida a la célula
Lactobacillus amylovorus
Pseudomonas sp.
1982
GREINER et al., 1993
Extracelular
SREERAMULU et al., 1996
Unida a la célula
IRVING y COSGROVE,1971
Hongos
A. flavus
Extracelular
SHIEH y WARE, 1968
A. niger
Extracelular
SKOWRONSKI, 1978
Penicillium sp.
Extracelular
SHIEH y WARE, 1968
Mucor spp.
Unida a la célula
CASIDA, 1959
Rhizopus spp.
Unida a la célula
CASIDA, 1959
Levaduras
Candida spp.
Extracelular
NAKAMURA et al., 2000
Kluyveromyces lactis
Extracelular
NAKAMURA et al., 2000
Pichia spp.
Extracelular
NAKAMURA et al., 2000
S. cerevisiae
Extracelular
NAKAMURA et al., 2000
FUENTE: Adaptado de VOHRA y SATYANARAYANA, 2003
8
3.2.1 Efecto de las fitasas sobre la disponibilidad de los nutrientes. En los últimos
años se han realizado un gran número de experimentos con fitasas de distintos orígenes
(microbianas y vegetales) para determinar su eficacia en aumentar la disponibilidad del
fósforo y otros nutrientes en ingredientes vegetales con alto contenido de fósforo fítico
(BRENES et al., 2002).
La introducción de fitasa como suplemento en la dieta animal, tiene importancia desde
dos puntos de vista: la cantidad de fósforo inorgánico requerido disminuye, y el nivel de
fósforo en las excretas se reduce (SCHWARTZ, 1996).
La adición de fitasa mejora la disponibilidad del fósforo fítico de la pasta de soya, sorgo y
gluten de maíz, lo que se refleja en mayor ganancia de peso, consumo de alimento y
mejor mineralización de las tibias de los pollos de engorda (CUCA et al., 2003). Esto
demuestra que la fitasa hidroliza el ácido fítico dejando el fósforo disponible para su
utilización al adicionar 600 FTU 1 /kg de fitasa en la dieta, aumenta el consumo de alimento
en aves de 21 días de edad (DENBOW et al., 1995 y BROZ et al., 1994); también se
menciona que en dietas con pasta de soya y adición de 600 y 800 FTU por kilogramo de
alimento aumenta el consumo (QIAN et al., 1996).
En el caso de los cerdos no existe una respuesta lineal entre la fitasa añadida y la
digestibilidad del fósforo (KORNEGAY y QIAN, 1996), siendo la magnitud de la respuesta
por unidad de fitasa mucho más acentuada con niveles bajos de fitasa (KORNEGAY,
1999).
Después de ciertos niveles de adición de fitasa o fósforo disponible no hay efecto benéfico
en conversión alimenticia, debido a que hay un aumento simultáneo de ganancia de peso
y consumo de alimento (CUCA, 2003).
La adición de fitasa en una dieta de maíz y soya en ratas demostró que en cantidades de
500, 1000 y 2000 U de fitasa por kg, incrementó significantemente la absorción aparente
de zinc. También se apreciaron incrementos en la concentración de zinc en el plasma y
fémur (RIMBACH et al., 1998).
Por otra parte la acción hidrolítica de la fitasa sobre los fitatos en el estómago, no sólo
aumenta la digestibilidad del fósforo proveniente del ácido fítico, sino que también eleva la
1
Una unidad de fitasa (FTU) es la cantidad de enzima que libera un micromol de, fósforo
inorgánico de fitato de sodio por minuto 0.0051 moles/ litro a 37°C y a pH 5,0.
9
digestibilidad del calcio que esta unido a éste. Se ha estimado que se produce una
equivalencia de 0,73 g de calcio para 500 U de fitasa/kg de dieta (KORNEGAY y QIAN,
1996); otros estudios establecen que se producen valores de 0,4 a 0,7 g de calcio
(JONGBLOED et al., 1996).
Investigaciones realizadas sobre la disponibilidad de minerales traza han demostrado que
la adición de 1350 U de fitasa/kg a una dieta a base de maíz-soya reducida en fósforo
(0,3%) y zinc (30 mg/kg), mejora la biodisponibilidad del fósforo y zinc al reestablecer los
valores normales de crecimiento además de los de zinc y fosfatasa alcalina en plasma
(LEI et al., 1993).
Se ha obtenido una elevación significativa en la absorción de magnesio y zinc, para el
caso de los lechones, mediante la suplementación a la dieta de 500 ó 1000 U de fitasa/kg
(PALLAUF et al., 1992).
Se señala que en el caso de los lechones, existe una mejora del crecimiento y de la
retención de los minerales traza zinc, cobre, fósforo y calcio, cuando se suplementan a la
dieta 1500 U de fitasa/kg (ADEOLA et al., 1995). También se sabe que la adición de 1200
U de fitasa/kg produce una hidrólisis del fierro ligado al fitato en una dieta a base de maízsoya, mejorando su biodisponibilidad en lechones (STAHL et al., 1998).
El efecto de las fitasas sobre la digestibilidad de las proteínas y los aminoácidos no está
ampliamente estudiada (BRENES et al., 2002). Se ha estudiado el efecto del ácido fítico
en forma independientemente. Entre los estudios realizados para conocer el efecto de la
fitasa se ha demostrado que en pruebas in vitro, se ha observado que los fitatos quelan
aminoácidos libres, especialmente lisina. Experimentos realizados mediante la incubación
de lisina en HCl con salvado de arroz, que son ricos en fitatos, muestran que un 20% de
esta lisina queda ligada a éstos. La adición de fitasa al medio de incubación libera el 50%
de esta lisina quelada (RUTHERFURD et al., 2002).
En pruebas experimentales realizadas in vivo, se ha observado que la adición de fitasa en
la dieta mejora la digestibilidad aparente de las proteínas y aminoácidos (BIEHL Y
BAKKER, 1996). Señalándose en este sentido, que el empleo de fitasa produce una
mejora a la digestibilidad aparente total de la proteína (JONGBLOED et al., 1996).
Se ha encontrado que existe una reducción significativa en la digestibilidad total de la
grasa, y especialmente de los ácidos grasos insaturados, cuando se incluye fitasa en la
10
dieta. También, se ha demostrado que la adición de vitamina E a la dieta suplementada
con fitasa mejora la digestibilidad de los ácidos grasos (GEBERT et al., 1998). Otros
autores han sugerido que las fitasas podrían cumplir un rol en la oxidación de los ácidos
grasos. Esto debido a que la oxidación de los ácidos grasos, especialmente de los
insaturados, se ve favorecida por los minerales traza que son liberados por la acción de la
fitasa (GEBERT et al., 1999). Debido a esto, se recomienda que además de agregar fitasa
en la dieta, haya una suplementación extra de vitamina E (BRENES et al., 2002).
3.3 Ácido fítico
Mioinositol es el alcohol cíclico derivado de la glucosa (LOEWUS y MURTHY, 2000)
utilizado en muchos procesos metabólicos de las células vegetales y síntesis de
polisacáridos de la pared celular. De sus numerosos derivados fosforilados el mioinositol –
1,2,3,4,5,6 – hexafosfato (IP6) es el más abundante. En un comienzo fue llamado ácido
fítico (AF) y descrito como una abundante forma de fósforo en semillas y otros tejidos y
órganos vegetales, como polen, raíces y tubérculos (COSGROVE, 1980; RABOY, 1997).
Una función clara para el mioinositol – 1,2,3,4,5,6 – hexafosfato en el metabolismo de los
vegetales es el almacenamiento y recuperación de fósforo y mioinositol durante el
desarrollo y la germinación (RABOY, 2003).
La mayoría de los alimentos de origen vegetal contienen de un 50 a un 80 % de su fósforo
total como fitato (HARLAND y MORRIS, 1995).
En la década de los 80 y 90 quedó demostrado que el AF está ampliamente distribuido en
especies eucariontes y es típicamente el Inositol fosfato más abundante en las células
(SASAKAWA et al., 1995). Estudios han demostrado que AF y sus derivados, incluidos los
mayormente fosforilados pirofosfatos, sirven en un una gran variedad de funciones y
procesos, además de almacenamiento de nutrientes. AF
representa la mayor fuente
metabólica en la vía del Inositol fosfato, involucrado en la transducción y regulación de
señales y posiblemente en la transducción de energía y la regeneración del ATP
(SAFRANY et al, 1999).
AF y sus derivados tienen una función en la exportación del ARN, reparación del ADN y la
recombinación del ADN (HANAKAHI y WEST, 2002), en la endocitosis y tráfico vesicular
(SAIARDI et al., 2002) y por último como antioxidante (GRAF et al., 1987).
11
Entre el 60 y 70 % del fósforo presente en el sorgo y la pasta de soya (ver Cuadro 2), que
se utiliza como alimento para pollos en engorda, se encuentra como ácido fítico, que no
puede ser hidrolizado por las enzimas endógenas de los animales monogástricos (CUCA
et al., 2003). Además se señala que sólo entre el 30 y 40 % del fósforo fítico está
disponible, por lo que sería necesario que las dietas se complementen con fósforo
inorgánico, para satisfacer la necesidad del animal (NELSON et al., 1968).
Las plantas utilizan mucho del fósforo que toman del suelo en desarrollar semillas, y las
semillas sintetizan la mayoría de este fósforo en AF. Es por esto que no es sorprendente
que una estimación reciente
de la cantidad neta de AF producida por semillas,
anualmente, sea equivalente a más del 50% del fósforo fertilizado anualmente en el
mundo (LOTT et al., 2000).
CUADRO 2 Fósforo y fosfato total en alimentos para pollos
Ingredientes
P total (%)
Fitato total (%)
% de P total
Maíz
0,39
0,25
64
Arroz
0,15
0,09
60
Trigo
0,44
0,27
61
Sorgo
0,30
0,22
73
Cebada
0,33
0,20
61
Bajra
0,31
0,23
74
Maní
0,60
0,46
77
Poroto de soja
0,88
0,56
64
Semilla de algodón
0,93
0,79
82
Girasol
0,90
0,45
51
Cereales
Harinas de semillas
FUENTE: TYAGI et al., 1998
AF sirve también como una fuente de almacenamiento de cationes minerales, ya que
forma sales de fosfato con Mg, K, Ca, Mn y Zn (OTEGUI et al., 2002).
El ácido fítico es uno de los antioxidantes más prometedores. Su actividad antioxidante se
manifiesta inhibiendo la generación de oxígeno reactivo de H2O2, quelando algunos
metales (MIDORIKAWA et al., 2001).
12
Estudios en animales demuestran el efecto inhibidor de la fibra dietética en el desarrollo
de neoplasmas intestinales, dependiendo del origen de la fibra. La fibra de trigo tiene un
efecto inhibidor mayor, antes que otras fuentes de fibra como la avena o el maíz. La
administración de ácido fítico, que se encuentra en niveles altos en el trigo inhibe la
carcinogénesis de colon (BANDARU, 1999).
El ácido fítico reduce la digestibilidad de de proteínas, almidón y lípidos. El fosfato forma
complejos con las proteínas, haciéndolas menos solubles de manera tal que resisten la
proteólisis (DVORAKOVA, 1998). Polifenoles y el ácido fítico pueden afectar la
digestibilidad del almidón, a través de interacciones con
la amilasa (THOMPSON y
YOON, 1984).
La acción de ciertas enzimas, como las amilasa, tripsina, fosfatasa ácida y tirosinasa, es
inhibida por el ácido fítico. (HARLAND y MORRIS, 1995).
3.4 Producción de fitasa
Fitasa puede ser producida de una gran cantidad de microorganismos que incluyen
bacterias, levaduras y hongos. Es así como, VOHRA y SATYANARAYANA (2003) en su
trabajo presentan información relevante en cuanto a los microorganismos productores de
fitasa, indicando temperatura, pH óptimos además de indicar que para la mayoría de los
microorganismos y en especial los hongos la fitasa es una enzima constitutiva. Sólo
algunas bacterias como Bacillus subtilis presentan inducibilidad en cuanto a la producción.
Durante los últimos 40 a 50 años el uso de hongos filamentosos en la producción de
enzimas ha crecido rápidamente y fitasa no es la excepción a esto (PANDEY et al., 2001).
Fermentación en cultivo sumergido (SmF) ha sido ampliamente empleada como la
tecnología de producción. Sin embargo, en los últimos años, la fermentación en estado
sólido (SSF) ha ganado gran interés en la producción de metabolitos primarios y
secundarios (PANDEY, 1992).
Tanto SmF como SSF han sido utilizados para la producción de fitasa. Tipo de cepa,
condiciones del cultivo, naturaleza del sustrato y disponibilidad de nutrientes son factores
que afectan el rendimiento y son críticos al momento de elegir la técnica. Por ejemplo, un
hongo filamentoso en SmF está expuesto a fuerzas hidrodinámicas, pero en SSF la
superficie de las partículas sólidas actúa como matriz del cultivo. MOO-YOUNG et al.
(1978) establecieron que el crecimiento microbiano en este tipo de sistemas depende de
13
la disponibilidad de nutrientes y de la configuración geométrica de la matriz. PAPAGIANI
et al. (2000) investigaron las relaciones cualitativas entre composición del medio,
morfología de A. níger y producción de fitasa en SmF y SSF.
3.4.1 Aspectos físicos. Los parámetros más importantes en el crecimiento de
microorganismos y la producción de metabolitos, son el pH, temperatura, agitación,
oxigeno disuelto y presión. Prácticamente todos los microorganismos productores de
fitasa son mesófilos a, excepción de algunos hongos termófilos como Thermomyces
lanuginosus (BERKA et al., 1998), Talaromyces thermophilus (PASAMONTES et al.,
1997) y Sporotrichum termophile (GHOSH, 1997). La temperatura óptima para la
producción de fitasa, para la mayoría de los microorganismos se encuentra en el rango de
los 25 a 37 ºC.
El pH tiene un importante efecto en la producción de fitasa. Para la mayoría de las
bacterias y los hongos el rango se encuentra entre 5,0 y 7,0.
Una aireación y agitación apropiadas del medio son importantes para mantener los
constituyentes del medio, las células microbianas y el oxígeno uniformemente
suspendidos (VOHRA y SATYANARAYANA, 2003).
Para Schwanniomyces castellii, la producción de fitasa se llevo a cabo en un fermentador
continuo aireado a 1 vvm y con agitación a 600 rpm (SEGUEILHA et al., 1992). En la
producción de fitasa con algunos hongos como Aspergillus niger, Aspergillus ficuum
NRRL 3135 y Aspergillus terreus se llevo a cabo con agitación a 270 rpm (SHIEH y
WARE, 1968). Aspergillus carbonarius produce fitasa en una fermentación en estado
sólido (SSF) usando harina de canola como sustrato (AL-ASHEH y DUVNJAK, 1994).
3.4.2 Aspectos nutricionales. La fuente y la concentración óptima de la fuente de
carbono son factores muy importantes en la producción de fitasa. Glucosa ha sido el
sustrato mayormente preferido en su producción. En una concentración del 1% fue óptima
para Lactobacillus amylovorus (SREERAMULU et al., 1996), para Bacillus subtilis se
utilizó una concentración del 2% (KEROVUO et al., 1998). Por otro lado salvado de trigo
en una concentración del 6% se utilizó como fuente de carbono para Bacillus sp. DS11
(KIM et al., 1998).
Para hongos se ha utilizado un medio de cultivo con extracto de levadura. Con fuentes
como glucosa y sacarosa como única fuente de carbono se observaron bajos
14
rendimientos en la producción de fitasa para Aspergillus niger NRRL 3135. Sin embargo
con la utilización de algunos tipos de harina de maíz se obtuvo un rendimiento mayor
(SHIEH y WARE, 1968). En Aspergillus ficuum se utilizó harina de canola con una
suplementación de glucosa (5,2%), en una fermentación en estado sólido y se incrementó
el rendimiento de la producción de fitasa (EBUNE et al., 1995).
El nitrógeno es otro parámetro importante en el medio de cultivo, que influye en el
crecimiento y en la producción de enzima. Fuentes orgánicas de nitrógeno, como peptona
han sido utilizados con Aerobacter aerogenes en una concentración del 1% (GREAVES et
al., 1967). Una fuente de nitrógeno inorgánico como el sulfato de amonio se utilizó en la
producción de la enzima con Pseudomonas sp. (IRVING y COSGROVE, 1971) y
Enterobacter sp. (YOON et al., 1996).
Algunos microorganismos necesitan, además de las fuentes de carbono y nitrógeno,
algunos elementos traza y vitaminas, como es el caso de algunas levaduras (GALZY,
1964). Para microorganismos como Bacillus subtilis (POWAR y JAGANNATHAN, 1967),
E. coli (GREINER et al., 1993) y Aspergillus ficuum NRRL 3135 (SHIEH y WARE, 1968),
no es necesario la adición de éstos.
3.5 Producción de enzimas mediante hongos
Las enzimas son uno de los productos de mayor interés obtenidos a través de fuentes
microbianas. Un gran número de procesos en las áreas industriales, ambientales y de los
alimentos utilizan enzimas en alguna etapa de producción. Los actuales desarrollos en la
biotecnología están desarrollando nuevas aplicaciones para las enzimas. La fermentación
en estado sólido presenta un gran potencial en la producción de enzimas (PANDEY,
2003).
3.5.1 Fermentación en estado sólido (SSF). La fermentación en estado sólido
usualmente ha desarrollado la producción de productos de valor agregado (antibióticos,
alcaloides, factores de crecimiento en plantas, etc.), biocombustibles, enzimas, ácidos
orgánicos, etc. Esta tecnología ha ganado una renovada atención por parte de la
industria, porque se ha convertido en una alternativa más atractiva a la fermentación en
estado líquido (PÉREZ-GUERRA, 2003).
15
La fermentación en estado sólido puede ser definida como “el crecimiento de
microorganismos (principalmente hongos) sobre materiales sólidos húmedos en la
ausencia de agua de flujo libre” (CANNEL y MOO-YOUNG, 1980).
Las principales características de estos sistemas son las que se indican a continuación:
•
La baja disponibilidad de agua reduce la posibilidad de contaminación por
bacterias y levaduras. Esto permite trabajar bajo condiciones asépticas, en
algunos casos (RAIMBAULT, 1998).
•
Permite trabajar en un ambiente parecido a los habitats de los hongos, que son los
principales microorganismos utilizados en SSF.
•
Niveles de aireación mayor, especialmente adecuados para procesos que
demandan un metabolismo oxidativo intenso.
•
La inoculación con esporas (en el caso de los hongos) facilita una distribución
uniforme en el medio.
•
Medios de cultivo bastante simples. El sustrato provee generalmente todos los
nutrientes necesarios para el crecimiento
•
Reactores de diseño simple, con requerimientos de espacio bajos, debido a la
naturaleza concentrada de los sustratos.
•
Bajos volúmenes de efluentes contaminantes. Menos requerimientos de solventes
son necesarios para la extracción del producto, debido a su alta concentración.
La SSF presenta también algunas desventajas, tales como:
•
Sólo microorganismos que pueden crecer a bajos niveles de humedad pueden ser
utilizados.
•
La determinación de la biomasa es más difícil.
•
La naturaleza sólida del sustrato causa problemas en la determinación de los
parámetros del proceso (pH, humedad, oxígeno y concentración de biomasa)
•
Transferencia de masa limitada a la difusión.
16
•
Esporas tienen un periodo de latencia mayor, debido a la germinación.
•
Tiempos de proceso mayores.
En la SSF pueden darse dos tipos de procesos, dependiendo de la naturaleza de la fase
sólida. En el primero, y más utilizado, los sólidos sirven como soporte y como fuente de
nutrientes. Los sustratos son comúnmente heterogéneos e insolubles en agua.
Usualmente son productos de la agricultura o subproductos de la industria de los
alimentos (PANDEY, 1992).
El otro proceso utiliza un soporte inerte, como los residuos de la caña de azúcar (bagazo),
fibra de cáñamo, fibras inertes, resinas, espumas de poliuretano, etc. y que son
impregnadas con un medio líquido que contiene todos los nutrientes (azúcares, lípidos,
ácidos orgánicos, etc.). Esta estrategia es menos usada, pero presenta algunas ventajas.
El uso de un medio líquido definido y un soporte inerte homogéneo, permite un mejor
control, monitoreo y reproducibilidad de la fermentación. En algunos casos el uso de un
soporte inerte presenta algunas desventajas económicas (OOIJKAAS et al., 2000)
En la adhesión a superficies participan proteínas llamadas hidrofobinas y otras moléculas
como glicoproteínas. Éste proceso pude ser dividido en tres etapas:
a) Adhesión, la que es fuertemente incrementada por la hidrofobicidad de las esporas del
A. ficuum.
b) Crecimiento inicial y fase de desarrollo desde la germinación de la espora hasta la
colonización de la superficie.
c) Fase de maduración, en la cual la densidad de la biomasa se ve incrementada.
Para el caso de los hongos fermentaciones en sustrato sólido presentan condiciones
similares a las que encuentran en forma natural, no así en cultivo sumergido. Esta
diferencia podría determinar las diferencias en producción y tal vez diferencias
bioquímicas en los metabolitos producidos, que se ven claramente reflejadas en los
resultados obtenidos.
En cualquiera de los dos casos las características físicas del medio, favorecen la difusión
de los nutrientes y gases, así como la fijación de los microorganismos (MITCHELL Y
LONSANE, 1992). También es necesario tomar en cuenta algunas características físicas
del soporte, que podrían influir en el desarrollo de la SSF: tamaño y forma de la partícula,
porosidad y consistencia del material (MITCHELL y LONSANE, 1992).
17
Las fermentaciones en sustrato sólido presentan rendimientos más altos en comparación
con las fermentaciones en sustrato líquido. Esto contrariamente a lo que usualmente se
piensa, no es debido al bajo contenido de agua, si no a la adhesión del hongo a las
partículas sólidas. Relacionado con esto existen dos principales tipos de procesos. En
primer lugar están los procesos que utilizan sustratos sólidos naturales, tales como
residuos de celulosa, granos o sus subproductos o desechos de la industria azucarera. En
estos casos el sustrato es usado tanto como fuente de carbono como de nutrientes para
el desarrollo microbiano. En segundo lugar se encuentran los procesos que utilizan
sustratos artificiales inertes, tales como espumas de poliuretano. En estos últimos éste es
usado solamente como una
estructura de soporte para los microorganismos
(GUTIÉRREZ- CORREA y VILLENA, 2003).
Desde el punto de vista de la ingeniería los soportes inertes son mejores, ya que no
cambian sus características geométricas ni físicas debido al crecimiento microbiano,
permitiendo un mejor control del calor y de la transferencia de masa.
Los hongos – especialmente mediante los micelios – tienen una mayor posibilidad de
penetrar en el sustrato y de esta manera obtener los nutrientes. Los hongos en general
están naturalmente adaptados a crecer en superficies y es en estas condiciones donde
muestran un comportamiento fisiológico particular, que cambia cuado se encuentra en
sustrato líquido (PÉREZ – GUERRA et al. 2003).
La adhesión a las superficies en el caso de los hongos filamentosos es principalmente
mediante una clase pequeña de proteínas llamadas hidrofobinas y que son producidas
por ascomycetes y basidiomycetes y eventualmente por zygomycetes. Las hidrofobinas
estabilizan la adhesión de esporas y micelios a superficies hidrofóbicas naturales como
inertes (GUTIÉRREZ – CORREA y VILLENA, 2003).
3.5.1.1
Variables de operación.
En SSF son varias las variables de proceso que
pueden ser manejadas, y los efectos de las mismas son diversos. Las variables
frecuentemente operacionalizadas son: contenidos de humedad y aw, densidad del
inóculo,
temperatura,
pH,
tamaño
de
partículas
de
los
sustratos,
aireación,
agitación/mezclamiento.
El contenido de humedad es un factor crítico en el proceso de SSF, debido que este factor
tiene influencia en el crecimiento y la biosíntesis y secreción de diferentes metabolitos
18
(KRISHNA y CHANDRASEKARAN, 1996, ELLAIAH et al. 2002). Un contenido bajo de
humedad causa una reducción en la solubilidad de los nutrientes del sustrato y una alta
tensión del agua. Por otro lado, niveles altos de humedad pueden producir reducción del
rendimiento de la enzima debido a un obstáculo estérico del crecimiento de la cepa
productora por la reducción de la porosidad (espacios entre las partículas) de la matriz
sólida, interfiriendo con esto en la transferencia de oxígeno (LONSANE et al., 1985).
Generalmente el contenido de agua del sustrato oscila entre 30 y 75%. Niveles más bajos
pueden inducir a una esporulación del microorganismo, mientras que niveles más altos
reducen la porosidad del sistema, limitando la transferencia de oxígeno e incrementando
el riesgo de contaminación bacteriana. Durante el proceso de fermentación el contenido
de humedad puede variar, debido a evaporación y actividad microbiana. En general el
resultado de todos estos procesos es la pérdida de humedad, siendo necesario agregar
agua utilizando humidificadores o un flujo de aire saturado de agua (PÉREZ – GUERRA
et al., 2003).
Los requerimientos de agua del microorganismo es mejor definirlo como actividad de agua
(aw) antes que contenido de agua del sustrato (RAIMBAULT, 1998). Desde un punto de
vista microbiológico aw indica el agua disponible o accesible para el crecimiento del
microorganismo. La actividad de agua afecta el desarrollo de la biomasa, las reacciones
metabólicas y los procesos de transferencia de masa (GERVAIS y MOLIN, 2003; BELLON
– MAUREL et al., 2003).
Si bien aw es una función de la concentración de los solutos, en estos sistemas donde las
soluciones están adsorbidas a la matriz, los valores de aw también dependen de la
estructura física y la naturaleza química de ésta. El valor adecuado de aw depende del
producto y de los requerimientos del microorganismo. Generalmente la aw para la
producción de metabolitos es más alta que para el crecimiento (GERVAIS y MOLIN,
2003).
En SSF la transferencia de masa, por difusión, relacionada con gases y nutrientes está
fuertemente influenciada por la estructura física de la matriz y por la fase líquida del
sistema (RAIMBAULT, 1998; GERVAIS Y MOLIN, 2003; RAGHAVARAO et al., 2003).
RAGHAVARAO et al., 2003 describen dos tipos de fenómenos de transferencia de masa,
uno a una micro escala y otro a una macro escala en el exterior de la célula. El primero se
19
relaciona con la transferencia de masa tanto hacia adentro como hacia fuera de las
células del microorganismo. El segundo incluye más factores: la mayor parte del aire fluye
hacia adentro y luego hacia fuera del fermentador, convección natural, difusión y
conducción a través del sustrato, los materiales del fermentador, el daño por corte del
microorganismo y la integridad de las partículas del sustrato.
Dentro de la difusión de gases la aireación tiene esencialmente dos funciones: (1)
suministrar oxígeno para el metabolismo aeróbico y (2) remover el CO2, calor, vapor de
agua y compuestos volátiles producidos durante el metabolismo (GERVAIS Y MOLIN,
2003). El intercambio de O2 y CO2 entre la fase sólida y la fase gaseosa tiene lugar tanto a
nivel inter-particular como intra-particular. Esto depende de aquellos factores que
incrementan la superficie de contacto entre las fases: fracción de vacío de la matriz,
tamaño del poro y diámetro de las partículas, grado de mezclamiento y profundidad de la
matriz, aireación adicional generada por la agitación y el nivel de humedad del sustrato.
En general la difusión de gases aumenta con el tamaño del poro y disminuye con la
reducción del diámetro de las partículas, debido a un compactamiento del sustrato
(CANNEL y MOO-YOUNG, 1980).
En el caso de la difusión de nutrientes, ésta ocurre a un nivel intra-particular e incluye la
difusión de nutrientes hacia las células y la hidrólisis del sustrato sólido por las enzimas
microbianas. Esto último es un punto importante debido a que la mayor parte del sustrato
es agua insoluble (RAGHAVARAO et al., 2003).
La difusión de nutrientes es especialmente importante en SSF de bacterias y levaduras,
no así en SSF con hongos, ya que los micelios penetran más fácilmente el sustrato sólido.
El incremento de la temperatura en SSF es una consecuencia de la actividad metabólica
cuando la eliminación de calor no es suficiente. Esto afecta directamente la germinación
de esporas, crecimiento y la formación de producto. La temperatura está en función del
tipo de microorganismo, la porosidad, el diámetro de las partículas y la profundidad del
sustrato (RAIMBAULT, 1998; RAGHAVARAO et al., 2003).
La transferencia de calor en un sistema SSF es muy baja debido a la capacidad limitada
de transferencia de los sustratos sólidos utilizados. La transferencia total de calor
depende del ritmo de transferencia intra- e inter-particular y de la velocidad con que el
calor es transferido desde la partícula a la fase gaseosa (RAIMBAULT, 1998).
20
El control de la temperatura en sistemas SSF es más complicado que en SmF. Así los
métodos utilizados en SmF no son apropiados para SSF. En un contexto industrial
monitorear y controlar esta variable es crítica para un escalamiento (BELLON – MAUREL,
et al., 2003). Una aireación convencional es el principal método utilizado para controlar la
temperatura del sustrato (RAIMBAULT, 1998; RAGHAVARAO et al., 2003). Debido a que
grandes flujos de aire pueden disminuir la aw del sustrato por evaporación, normalmente
se utiliza aire saturado con agua. La agitación del sustrato también puede ayudar a
controlar la temperatura.
El control y medición del pH es una variable complicada en sistemas SSF. Sin embargo
los sustratos utilizados, normalmente tienen un efecto tampón, debido a su compleja
composición química. En estos casos el control de pH no es necesario. Cuando esta
variable tiene que ser controlada se utilizan soluciones tampón como fase líquida, pero
ésta metodología puede ser inadecuada cuando el proceso es escalado (PÉREZ –
GUERRA et al., 2003). Otra posibilidad de controlar el pH consiste en adicionar una
mezcla de fuentes de nitrógeno con una influencia opositora en la evolución del pH. De
esta manera sales de amonio han sido utilizadas en combinación con urea o sales de
nitrato debido a sus respectivos efectos de acidificación y alcalinización (TORRADO et al.,
1998).
3.5.1.2. Parámetros de diseño para el escalamiento. Los sistemas de SSF involucran
varios y complejos procesos como son transferencia de masa y energía. Estos procesos
son multivariables y difíciles de modelar y por la misma razón de definir o encontrar
parámetros de diseño para el modelamiento.
Importantes parámetros de operación son el nivel de llenado y la velocidad de rotación.
Estos parámetros tienen una influencia directa con la transferencia de masa, transferencia
de calor, mezclamiento y corte. Además de la geometría del sistema, son parámetros de
importancia (SHUTYSER, 2003).
El proceso de mezclamiento puede ser modelado utilizando variados modelos discretos
de partícula. Entre ellos, los que han demostrado entregar convenientes vías de estudio
para el flujo granular son: Simulaciones Monte Carlo (ROSATO, 1986), modelos celulares
automáticos (KTITAREV y WOLF, 1998) y reestructuración del fondo a superficie
(BAUMAN et al., 1994). Sin embargo, el método de simulación más ampliamente utilizado
está basado en simulaciones dinámicas moleculares, donde las fuerzas de interacción
21
son modeladas en partículas individuales. Este método se denomina dinámica granular
(RISTOW, 1994). La limitante de estos métodos es que los cálculos computacionales son
muy extensos y debido a eso el número de partículas involucradas es todavía limitado
(<106).
Las aproximaciones adoptadas del modelo de dinámica granular se pueden dividir en dos
grandes grupos, dependiendo de la densidad y características del flujo granular
modelado. Una partícula esférica se aproxima a baja densidad y flujo rápido; y una
partícula esférica blanda se aproxima a una densidad alta y flujo lento. En estudios
recientes el modelo de la partícula blanda fue aplicado para estudiar dinámicas de flujo de
partículas, tambores rotatorios (DURY y RISTOW, 1997), lechos fluidizados (HOOMANS,
2000; MIKAMI, et al., 1998), flujos de tuberías (TSUJI et al., 1992), y llenado de silos
(CLEARY, 2000). Debido a que estos estudios están orientados a flujos de polvos finos o
mezclas de partículas finas es que se presentan similitudes con mezclas de las partículas
de los sustratos en SSF, sería posible utilizar esta metodología
para estudiar el
mezclamiento en SSF.
Utilizando una aproximación de partícula discreta es posible de determinar el flujo de calor
entre partículas individuales en un sistema rotatorio de tambor mixto. Una ventaja clara
de este modelo es que puede ser fácilmente usado para predecir los flujos de
transferencia de calor para diferentes geometrías de reactores, debido a que la
conductividad térmica del aire (0,025 Wm-1 K-1 a 20ºC) es baja en comparación con la
conductividad de los sólidos. La contribución de la convección a la transferencia de calor
es despreciable, el aire inter-particular tiene una baja conductividad térmica y la
transferencia de calor se produce por puntos de contacto entre dos partículas adyacentes
(SHUTYSER, 2003).
Algunos estudios recientes han involucrado la distribución de líquido durante el proceso
(GOLDSCHMIDT, 2001; LITSTER et al., 2001). Durante la granulación el líquido sirve
como conector en la aglomeración de polvos a gránulos más grandes y la distribución del
líquido tiene que ser controlada para obtener el tamaño deseado. En el caso que las gotas
del líquido sean considerablemente más pequeñas que las partículas del sustrato, éstas
pueden ser despreciadas al momento de los cálculos, ya que no influyen. (SHUTYSER,
2003).
22
3.5.2 Fermentación en fase líquida o cultivo sumergido (SmF). La fermentación en
estado líquido tiene una larga historia. En un comienzo, en los años 40, esta técnica fue
utilizada para la producción de penicilina y estreptomicina (HUMPHREY, 1998). Se
utilizaban fermentadores de acero al carbón pero con el tiempo y el uso estos se corroían
fácilmente. En los siguientes 40 años la industria de la fermentación presentó un
desarrollo inmenso, cambiando los reactores por acero inoxidable, que si bien eran más
caros pero tenían una duración mayor. Esta fermentación utiliza un soporte y fuente de
nutrientes en solución líquida.
Las principales características de la fermentación en sustrato líquido se indican a
continuación:
•
Tiene que ser vigilado constantemente
•
Las fuentes de carbono y nitrógeno pueden ser obtenidas de glucosa y extracto de
levadura, p.ej.
•
El sustrato permite la determinación de los parámetros del proceso (pH, humedad,
oxigeno y concentración de biomasa), fácilmente.
•
Tiene una gran cantidad de agua disponible
•
Los reactores se encuentran ampliamente distribuidos.
Este tipo de fermentación también presenta sus desventajas:
•
Medios de cultivo caros
•
Debido a que hay una gran disponibilidad de agua y nutrientes, existe un mayor
riesgo de contaminación con algún microorganismo no deseado.
•
Los costos de producción son más elevados
•
Generación de metabolitos no deseados como ácido oxálico, azúcares residuales
y micelio en el caso de los hongos.
3.5.2.1 Variables de operación. En esta tesis las variables a estudiar corresponden a la
aireación y agitación del medio. Debido a que la cantidad y tamaño de las burbujas de aire
es difícil de determinar, el área es frecuentemente expresada con el coeficiente de
transferencia de masa kLa. En este caso la “L” en kL indica que la resistencia de la película
líquida es predominante para un gas poco soluble como lo es el oxígeno. La relación
entre la concentración de oxígeno y el crecimiento es del tipo de Michaelis – Menten.
Cuando el proceso está limitado por el oxígeno, el coeficiente específico de respiración
(QO2) aumenta a medida que también aumenta la concentración de oxígeno disuelto,
23
hasta alcanzar un estado de equilibrio. Esta concentración se denomina concentración
crítica de oxígeno y fluctúa frecuentemente de 0,5 a 2,0 ppm para bacterias, levaduras y
hongos distribuidos uniformemente, que crecen a temperaturas de 20 a 30ºC. Sobre esta
concentración crítica el consumo específico de oxígeno sólo aumenta levemente al
aumentar la concentración de oxígeno disuelto.
3.5.2.2 Parámetros de diseño para el escalamiento.
Un apropiado medio de escalamiento para procesos aeróbicos es la medición del nivel de
oxígeno disuelto que es necesario en equipos pequeños y ajustar las condiciones en la
planta hasta que este nivel de oxígeno disuelto es alcanzado. Antiguos métodos de
escalamiento de fermentaciones insisten en similitudes geométricas basadas en
dimensiones físicas proporcionales. Se pensaba que aplicando la misma energía por
unidad de volumen que en el equipo piloto se conseguirían rendimientos equivalentes en
grandes fermentadores. Como los dispositivos de mezcla tienen áreas (dimensiones
cuadradas) para mover volúmenes (dimensiones cúbicas), métodos basados en
similitudes dimensionales no son recomendados. Escalamientos basados en la
equivalencia del coeficiente de transferencia de oxígeno, kLa has resultado exitosos
(PERRY, 1999).
Otros factores de escalamiento son la agitación, tiempo de mezclamiento, número de
Reynolds, momentum y el mezclamiento debido a las burbujas ascendentes. La agitación
puede ser estimada de la siguiente ecuación:
⎛ Di
S s = S l ⎜⎜
⎝ Di
s
l
⎞
⎟⎟
⎠
1
3
(1)
Donde los subíndices s y l representan pequeño y grande respectivamente y Di es el
diámetro del agitador (STEEL et al., 1962).
Algunas fermentaciones de hongos presentan esporulaciones tempranas, rompimiento del
micelio y bajos rendimientos si es que la agitación es excesiva. Una velocidad de 250
cm/s a 500 cm/s es considerada aceptable. El mezclamiento se ha propuesto como un
factor de escalamiento pero poco se puede hacer para implementarlo en un fermentador
debido a que gigantes motores serían necesarios para lograr un mezclamiento adecuado.
24
La constante de Reynolds no es utilizado para el escalamiento de fermentaciones; hay
solamente un factor en la aireación. Esto también se aplica al considerar los mezcladores
como una bomba e intentar escalar a través del momentum constante.
En fermentaciones de biomasa la productividad frecuentemente varia de 2 a 5 g/l h esto
representa una demanda de oxígeno del rango de 1,5 a 4 gO2/l h. En un fermentador de
500 m esto significa alcanzar niveles del coeficiente de transferencia de oxígeno del orden
250 a 400 h-1. Estas capacidades de transferencia de oxígeno pueden ser alcanzadas con
flujos de aireación de 0,5 vvm (volumen de aire por volumen de medio) y agitación
mecánica con energías que van de 2,4 a 3,2 KW/m.
25
4. MATERIAL Y MÉTODO
4.1 Microorganismo y preparación del inóculo
La cepa utilizada en la tesis, es la Aspergillus ficuum DSM 932, que puede ser encontrada
como Aspergillus ficuum MUCL 31164 o Aspergillus ficuum NRRL 3135, según la DSMZDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig,
Germany.
El medio para su propagación inicial fue agar papa dextrosa en tubo inclinado. Luego se
transfirió a una placa Petri con el mismo medio. Ambos se cultivaron a 25 – 30ºC hasta
que el hongo cubrió la totalidad de la placa. Posteriormente, las esporas fueron removidas
y transferidas a un Medio Líquido de Cereales (MLC) para la preparación del inóculo y
llegar a un volumen de 2 l aproximadamente.
4.2 Determinación de actividad enzimática
La medición de la actividad se realizó mediante un método de HARLAND y HARLAND
(1980), modificado el cual se basa en el uso del reactivo de Taussky-Shorr, que mide la
cantidad de fósforo inorgánico (Pi) liberado por la acción enzimática (ANEXO 4).
4.3 Fermentación en cultivo sumergido
Se trabajó en el fermentador New Brunswick (FIGURA 1) a una temperatura de 28 ºC y a
un pH de 5,5. Se realizaron 5 fermentaciones (CUADRO 3) de 7 días cada una 2 .
Se tomaron dos muestras al día durante cada uno de los ensayos. Estas muestras fueron
centrifugadas a 10.000 rpm por 10 minutos. Se utilizó el sobrenadante para realizar la
prueba de actividad enzimática. Las muestras fueron refrigeradas y analizadas todas
juntas una vez terminado el ensayo.
26
El MLC está compuesto por subproductos de la agroindustria (chuchoca, afrechillo, harina
integral de trigo), agua destilada, y sulfato de amonio (ANEXO 5).
El CUADRO 3, presenta el diseño experimental llevado a cabo en las fermentaciones en
cultivo sumergido donde se varía la oferta de aire al cultivo.
CUADRO 3. Ensayos en cultivo sumergido
vvm
Velocidad de rotación del agitador, rpm
0
200
300
400
0,5
200
300
---
FIGURA 1.
Fermentador New Brunswick usado en las fermentaciones en cultivo
sumergido.
2
Inicialmente se planificaron 9 fermentaciones, pero debido a la destrucción del equipo no fue
posible desarrollarlas todas.
27
4.4 Fermentación en estado sólido
Se realizó una fermentación por quince días. Para este ensayo se utilizó un fermentador
de confección propia prototipo de tambor rotatorio de 2 L sin agitación interior (FIGURA
2). El Medio Sólido de Cereales (MSC) está compuesto por subproductos de la
agroindustria (chuchoca, afrechillo, harina integral de trigo) y sulfato de amonio (ANEXO
5). La humedad necesaria la entregó el inóculo. La cantidad de MSC utilizada fue de 365
g y el inóculo fue preparado de la misma manera que para la SmF y corresponde a 190
ml. Luego todo se introdujo todo en una botella Schott de dos litros a modo de
fermentador de tambor rotatorio.
3
5
4
2
1
1) Termostato; 2) fuente de calor; 3) botella
contenedora del medio; 4) motor; 5) rodillos de
movimiento y soporte
FIGURA 2.
Fermentador en sustrato sólido de confección propia. Prototipo de
tambor rotatorio de 2 L sin agitación interior. Equipo montado sobre
rodillos en movimiento (3 rpm) dentro de una caja de poliestireno
expandido dotado de calefactor y termostato (+1°C)
28
4.4.1 Seguimiento de la producción. La toma de muestra se realizó una vez al día. La
muestra consistía en una cantidad del mismo cultivo de aproximadamente 6 gramos
tomadas en forma aséptica. Las muestras fueron almacenadas y refrigeradas en tubos
Falcon estériles de 50 mL y que facilitaron la posterior extracción de la enzima para el
análisis. Estos recipientes fueron previamente tarados, para poder calcular el peso neto
de muestra recolectada.
4.4.2 Extracción y concentración de la enzima. En este caso se realizó una extracción
sólido – líquido para separar la enzima de los sólidos. Se utilizó una solución al 0,1% de
Triton X-100 para la extracción de ésta. La proporción utilizada de Tritón X-100 para la
elusión fue de 5 mL por cada gramo de muestra. Posteriormente los tubos fueron
colocados en un agitador orbital a 200 rpm por 1 hora a 25ºC. Luego las muestras fueron
centrifugadas a 10.000 rpm por diez minutos a 4ºC. Para el ensayo de actividad
enzimática se utilizó el sobrenadante, a modo de extracto enzimático.
29
5. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
5.1 Fermentación en estado líquido
Como puede apreciarse en la FIGURA 3, para la fermentación 0 – 200 (sin incorporación
de aire adicional, sólo 200 rpm de agitación) la máxima actividad de enzima se produjo al
quinto día con una actividad 0,0133 U/ml. En el caso de la 0 – 300 el pico de actividad se
produjo al sexto día con valor de 0,383 U/ml. La fermentación con las variables 0 – 400
tiene su máxima actividad al sexto día siendo esta de 0,244 U/ml. Las fermentaciones de
0,5 – 200 y 0,5 – 300 tuvieron actividades de 0,226 U/mL y 0,245 U/ml respectivamente,
ambas en el sexto día.
0 vvm - 200 rpm
0,4
0 vvm - 300 rpm
A c tiv id a d fitá s ic a n e ta (U /m L )
0 vvm - 400 rpm
0.5 vvm - 200 rpm
0,3
0.5 vvm - 300 rpm
0,2
0,1
0,0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
-0,1
Tiempo (días)
FIGURA 3.
Resumen de la evolución de la actividad enzimática neta de las
fermentaciones en estado líquido.
30
La fermentación 0 – 200 presentó la actividad más baja de todos los ensayos. En el caso
de los ensayos 0 – 400, 0,5 – 200 y 0,5 – 300 se obtuvieron resultados similares en
cuanto a los niveles de actividad. La fermentación 0 – 300 presentó el nivel de actividad
más elevado de todos los ensayos alcanzando un nivel de 0,383 U/ml (CUADRO 4). El
máximo nivel de actividad se alcanzó en casi todos los ensayos en el sexto día a
excepción del ensayo 0 – 200 que ocurrió en el quinto día. Para los ensayos 0 – 200 y 0,5
– 200, donde se mantuvo constante la variable de agitación, pero incrementó el nivel de
aireación, se observa un incremento de 12.62 veces la actividad. Este incremento de la
actividad indicaría que un aumento de la aireación sería beneficioso para la producción de
enzima. La transferencia de oxígeno en fermentaciones en estado líquido se ve limitada
cuando los medios de cultivo son demasiado viscosos o cuando el microorganismo, en
este caso un hongo, forma micelios. La limitación puede ser contrarrestada aumentando
la velocidad de agitación o aireación y de esta manera obtener un flujo más turbulento del
medio; así también se pueden romper los micelios aumentando la transferencia de
oxígeno (PAPAGIANI, 1999).
De la misma manera si analizamos el par de ensayos 0 – 300 y 0,5 – 300 observamos
que el incremento de la aireación produjo un efecto negativo en cuanto a la producción de
enzima, ya que el nivel de actividad alcanzado en el ensayo con adición de aire es de casi
la mitad al alcanzado por el ensayo sin aireación, contrariamente a lo que presentan
algunos autores PAPAGANI (1999) o KAUR y SATAYANARAYANA (2005), donde se
obtuvieron mejores resultados en un fermentador de 22 l, con un buen mezclamiento de
los nutrientes y a una mejor oxigenación del medio de cultivo.
Si se toma en cuenta la variable de agitación (ensayos 0 – 200, 0 – 300, 0 – 400) se
observa que al incrementar la agitación también se incrementan los niveles de actividad,
pero sólo hasta un cierto punto. Al incrementar la velocidad de agitación de 200 a 300 rpm
el incremento en la actividad es de casi 30 veces, pero en el siguiente incremento (300 a
400 rpm) se produce una baja a prácticamente la mitad de la actividad, con respecto al
ensayo 0 – 300.
Dependiendo de las condiciones del cultivo y del genotipo de la cepa, el hongo puede
presentar dos condiciones de crecimiento, una formando pellets y otra filamentosa, cada
una con sus características de crecimiento y que pueden afectar los procesos de
transferencia de masa (NIELSEN, 1996). El fenómeno de la disminución en los niveles de
actividad con el incremento de la agitación o la aireación, podría deberse a que en un
cierto punto la turbulencia del medio de cultivo es tan elevada que afecta la estructura del
31
hongo, impidiendo que éste continúe produciendo la enzima y privilegie el desarrollo
celular.
Para el ensayo en SmF de mayor producción (0 – 300) se calculó un rendimiento de 15,83
U/g de sólidos secos, a partir de los cuales se produjo la enzima.
5.2 Fermentación en estado sólido
La FIGURA 4 muestra la evolución de la actividad enzimática neta experimentada por la
fermentación en estado sólido llevada a cabo en el presentó la máxima producción de
enzima al séptimo día con una actividad de 1,293 U/ml.
En la SSF desarrollada en esta tesis el sustrato utilizado cumplía con la función de servir
como soporte y además como fuente de nutrientes para el microorganismo, tal como lo
señala PEREZ-GUERRA, et al. (2003) pues el hongo ve facilitado su penetración en el
sustrato y con ello la obtención de nutrientes. La composición del sustrato (MSC) le
confiere una cierta granulosidad al medio de cultivo, además el equipo construido no
contaba con paletas interiores que facilitara el desmembramiento del MSC. Esta situación
permitía que se formaran aglomerados de MSC facilitado por la humedad que aportó el
inóculo. Ésta situación evitaba, tal vez, que los micelios del hongo resultaran dañados y
así un comportamiento más parecido al natural del hongo. Esto como ya ha sido
mencionado podría ser una respuesta a los altos rendimientos obtenidos en comparación
con la SmF.
La baja en la actividad después del pico de producción en el día 7 podría deberse a la
falta de disponibilidad de nutrientes en el medio, resultados similares encontraron
KRISHNAN et al. (2006), cultivando Mucor racemosus en granos de trigo.
En estudios anteriores donde se llevó a cabo SSF y SmF para comparar los distintos
niveles de producción los resultados obtenidos también concuerdan con que la SSF
obtiene mayores niveles de producción. Este es el caso de LERCHUNDI (2006), sobre
sustratos de composición muy similar al de esta tesis en que el máximo de producción se
produce al 4º día. El nivel de producción alcanzado en ese estudio es de 0,695 U/ml en
SSF mientras que en la presente tesis es de 1,293 U/ml. Esto significa un aumento del
doble la producción de fitasa en SSF.
32
Actividad fitásica neta (U/mL)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
0
2
4
6
8
10
12
14
Tiempo (días)
FIGURA 4. Evolución de la actividad fitásica neta en el tiempo para fermentación
en sustrato sólido.
Es posible que esta diferencia se deba a la utilización del equipo de fabricación propia, ya
que, permite una mejor mezcla del medio de cultivo con el inóculo, además de presentar
ventajas en la aireación. En el trabajo de de LERCHUNDI (2006) se utilizó un medio
sólido en placas Petri estáticas de 11 cm inoculando la superficie del medio con una
suspensión concentrada de esporas del hongo.
El rendimiento calculado para la SSF es de 67,34 U/gss (U/g sólido seco), a partir de los
cuales se produjo la enzima.
En resumen, con la información recabada en la tesis, se demuestra el gran potencial que
presenta la fermentación en estado sólido en cuanto a los niveles de producción de
enzima alcanzados (1,293 U/ml o 67,34 U/gss) en contraste de los obtenidos en SmF
(0,383 U/ml o 15,83 U/gss). Esto adquiere gran importancia debido a la creciente
utilización de aditivos enzimáticos en la alimentación animal, favoreciendo la absorción de
variados nutrientes
(minerales y proteínas), aumentando el rendimiento del animal y
también reduciendo la contaminación ambiental disminuyendo los niveles de Pi
excretados.
Además la utilización del equipo de confección propia fue exitosa y demuestra las
ventajas de la SSF sobre la SmF en cuanto a los niveles de actividad y abre un camino
para el perfeccionamiento del diseño del mismo.
33
6. CONCLUSIONES
Con la información obtenida de los ensayos realizados, es posible establecer las
siguientes conclusiones:
•
Es posible cultivar A. ficuum en sistemas de fermentación sumergida y sólida
sobre subproductos de la agroindustria como sustratos a un nivel prepiloto y
detectar importantes niveles de actividad fitásica.
•
Las fermentaciones en cultivo sumergido sobre subproductos de la agroindustria
indican que las mejores condiciones para la producción de fitasa se presentan
cuando el cultivo recibe una agitación media y no es aireado (0 vvm – 300 rpm).
•
De los resultados obtenidos es posible concluir que SSF es una tecnología más
eficiente para producir fitasa con A. ficuum sobre subproductos de la agroindustria,
al presentar niveles de actividad de 67,34 U/gss, es decir 4,25 veces superiores al
SmF (15,83 U/gss).
34
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44
8. ANEXOS
45
Anexo 1. Detalle de fermentaciones líquidas
CUADRO 4. Tabla resumen fermentaciones en sustrato líquido
Actividad fitásica neta (u/ml)
Día
0 vvm - 200 rpm
0 vvm - 300 rpm
0 vvm - 400 rpm
0.5 vvm - 200 rpm
0.5 vvm - 300 rpm
0
0
0
0
0
0
1
0,004
0,004
0,003
0,001
2
0,003
-0,022
-0,019
-0,021
3
0,003
-0,056
-0,055
-0,053
-2,46E-04
-0,038
4
0,007
-0,017
0,037
0,029
0,039
5
0,013
0,183
0,173
0,164
0,160
6
0,009
0,383
0,244
0,226
0,245
7
-0,009
0,034
0,075
0,067
0,072
4,91E-04
Actividad fitásica neta (U/mL)
0,015
0,01
0,005
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
-0,005
-0,01
Tiempo (días)
FIGURA 5. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en
sustrato líquido 0 vvm 200rpm
46
Actividad fitásica neta (U/mL)
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
-0,05 0
1
2
3
4
5
6
7
8
-0,1
Tiempo (días)
FIGURA 6. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en
sustrato líquido 0 vvm 300 rpm
Actividad fitásica neta (U/mL)
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
-0,05
0
1
2
3
4
5
6
7
-0,1
Tiempo (días)
FIGURA 7. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en
sustrato líquido 0 vvm 400 rpm
8
47
Actividad fitásica neta (U/mL)
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
-0,05
-0,1
Tiempo (días)
FIGURA 8. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en
sustrato líquido 0,5 vvm 200rpm
Actividad fitásica neta (U/mL)
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
-0,05
0
1
2
3
4
5
6
7
-0,1
Tiempo (días)
FIGURA 9. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en
sustrato líquido 0,5 vvm 300 rpm
8
48
Anexo 2. Detalle fermentación sólida
Actividad fitásica neta (U/mL)
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
0
2
4
6
8
10
12
14
Tiempo (días)
FIGURA 10. Variación de actividad enzimática en el tiempo para fermentación en
sustrato sólido
CUADRO 5. Tabla resumen de actividad enzimática para fermentación en sustrato
sólido
Día
Actividad (U/mL)
Día
Actividad (U/mL)
Día
0
0
5
1
1,07E-03
6
1,04
11
5,99E-01
2
-3,84E-02
7
1,29
12
5,78E-01
3
-3,95E-02
8
1,23
13
5,38E-01
4
3,13E-01
9
1,01
14
5,32E-01
6,30E-01
10
Actividad (U/mL)
7,71E-01
49
Anexo 3. Imágenes de A. ficuum
FIGURA 11. Cultivo de A. ficuum en placa Petri en agar papa dextrosa
FIGURA 12. Observación al microscopio de fermentación en estado líquido
50
Anexo 4. Detalle de reacción enzimática para la determinación de actividad
El análisis corresponde a un ensayo de tiempo fijo, en el que se mide la cantidad de
fósforo inorgánico (Pi) el cual es liberado en la reacción enzimática.
La reacción enzimática se realizará en tubos de ensayos en las siguientes condiciones y
por duplicado para cada muestra
-
En
un tubo de ensayo, se realiza la reacción enzimática en condiciones de
reacción positiva (Rx. (+)).
-
En otro tubo de ensayo, se realiza la reacción enzimática en condiciones de
reacción negativa (Rx. (-)).
La medición de la absorbancia (abs.) correspondiente a la cantidad de Pi liberado por la
reacción enzimática, se calcula mediante las siguientes formulas:
Abs. Pi liberado = [Abs. muestra Rx. (+) - abs. muestra Rx. (-)]
concentrac
ión del Pliberado
⎛
Abs . Pi liberado
= [Pi ] = ⎜⎜
⎝ pendiente curva calibració
⎞ (2)
⎟
n ⎟⎠
Preparación del ensayo. A continuación se detalla la reacción enzimática positiva y
negativa.
Reacción enzimática en condiciones de reacción positiva (Rx. (+)). Para ello se
procederá de la siguiente manera:
i. Agregar:
- 1,0 mL MgSO4 0,1M en buffer acetato 0,2 M pH 5,15
- 0,6 mL del extracto con la enzima o muestra
- 2,4 mL de solución de ác. Fítico 6,82 mM en buffer acetato 0,2 M pH 5,15
51
ii. Incubar por 1 hora a 55ºC.
iii. Agregar:
- 0,5 mL de ácido tricloroacético (TCA) al 10% para detener la reacción
- 1,0 mL de H2O d y refrigerar por 20 min, para disminuir la temperatura.
- 2,4 mL del reactivo de Taussky-Shorr.
Esperar 30 min y medir Abs. A 660 nm.
Reacción enzimática en condiciones de reacción negativa (Rx. (-)). Se procede de la
siguiente manera:
i. Agregar:
- 1,0 mL MgSO4 0,1M en buffer acetato 0,2 M pH 5,15
- 0,6 mL de Extracto con la enzima (muestra)
- 0,5 mL de ácido tricloroacético (TCA) AL 10% (Para detener la reacción).
- 2,4 mL de solución de Ácido Fítico 6,82 mM en buffer acetato 0,2 M pH 5,15
Esperar por 1 h a Tº ambiente.
ii. Agregar:
- 1,0 mL de H2Od y refrigerar por 20 min. (Para equiparar el volumen y la
temperatura con los ensayos de Rx. (+)).
iii. Agregar:
- 2,4 mL del reactivo de Taussky-Shorr.
Esperar 30 min y medir Abs. A 660 nm.
52
Curva de calibración. Se construyó una curva de calibración en el rango de 0,04 a 1
uM/mL de KH2PO4 para el reactivo de Taussky-Shorr (Cuadro 6)
CUADRO 6. Curva de calibración
Tubo
Concentración
Volumen (mL)
Volumen (mL)
Volumen
Volumen (mL)
Pi (μmol/mL)
Pi 2 μmol/mL
H2Od
(mL)
MgSO4 0,1 M
TCA
en buffer
10%
acetato 0,2 M
pH 5,15
1
1,00
1,50
2,50
0,50
1,00
2
0,83
1,25
2,75
0,50
1,00
3
0,60
0,90
3,10
0,50
1,00
4
0,40
0,60
3,40
0,50
1,00
5
0,30
0,45
3,55
0,50
1,00
6
0,20
0,30
3,70
0,50
1,00
7
0,10
0,15
3,85
0,50
1,00
8
0,08
0,12
3,88
0,50
1,00
9
0,04
0,06
3,94
0,50
1,00
Blanco
-
-
4,00
0,50
1,00
Cálculo para la medición de actividad de fitasa. Se define como una unidad de
actividad enzimática de la fitasa (U), como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de Pi
en un minuto, bajo las condiciones que se realizó el ensayo.
Después de obtener la concentración del Pi liberado [Pi] la cual corresponde a los μmoles
Pi liberado en 1 h, por una solución de enzima diluida; la actividad se mide de la siguiente
forma:
⎛ [Pi ] ∗ N º de dilución de muestra
U = ⎜⎜
min utos de ensayo
⎝
⎞
⎟⎟ = μ moles / min
⎠
(3)
53
Anexo 5. Detalle de preparación de sustratos de cultivo
Composición medio líquido a base de desechos agroindustriales
• Chuchoca
0.5 %
• Afrechillo
0.25 %
• Harina integral de trigo
0.25 %
• NH4SO4
1.7 %
• H2O
97.3 %
Composición medio sólido a base de desechos agroindustriales
• Chuchoca
18.6 %
• Afrechillo
9.2 %
• Harina integral de trigo
9.2 %
• NH4SO4
63
%
La humedad necesaria es aportada por el inóculo.
54
Anexo 6. Detalle de cálculo de rendimiento de las fermentaciones
Fermentación en cultivo sumergido
actividad de fitasa
U
ml
U
* 1000
= actividad de fitasa
ml
l
l
actividad de fitasa
U volumen de cultivo l
U
*
= actividad de fitasa
l
g sustrato sólido
g sustrato
(4)
Fermentación en cultivo sólido
actividad de fitasa
U
volumen de muestra ml
U
*
* factor dilución = actividad de fitasa
ml g sustrato sólido en muestra * % humedad
g sustrato sólido sec o
(5)