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BACTERIAS ANTAGONISTAS DE HONGOS FITOPATÓGENOS ASOCIADAS A LA RAÍZ DE
Vanilla planifolia Andrews
1
Jacel Adame García
2
Mauricio Luna Rodríguez
2
Ángel Rafael Trigos Landa
RESUMEN
La vainilla es una orquídea tropical que se establece mediante segmentos de tallo que no
presentan variación genética. Por ello, se ve amenazada por plagas y enfermedades, en
particular por la pudrición de raíz y tallo causada por Fusarium. El hongo crece rápidamente en
el tejido y en pocos días puede destruir completamente la raíz. El uso excesivo de fungicidas en
los cultivos de vainilla contra estos patógenos ha perturbado el ciclo de interacción entre hongos
micorrizógenos nativos que integran la rizósfera, disminuyendo la capacidad de absorción de
nutrientes por las raíces adventicias. Por lo que sería muy útil encontrar soluciones alternativas
que disminuyan el uso de productos químicos, como las basadas en las interacciones
microbianas benéficas con las raíces de las plantas, para reducir la incidencia de
enfermedades. Razón por la que se propuso en el presente trabajo obtener a partir de medios
enriquecidos con quitina, cepas bacterianas nativas asociadas al cultivo de vainilla, con
capacidad para el control de especies fúngicas patógenas. A partir de tallos y hojas de vainilla
con daños por pudriciones, se identificaron 3 especies: F. oxysporum, F. solani y F. moniliforme
con patogenicidad en hojas de vainilla variable. Paralelamente, se seleccionaron 19 cepas
bacterianas de rizósfera de vainilla desarrolladas en medio de cultivo agar-cáscara de jaiba. Se
evaluó in vitro e in vivo la capacidad antifúngica de las cepas bacterianas aisladas mediante la
inoculación simultánea del hongo y la bacteria. Seis cepas bacterianas fueron capaces de
inhibir in vitro en más del 90%, el desarrollo de F. oxysporum y F. solani. Las pruebas in vivo
mostraron que las bacterias en estudio inhibieron de manera eficaz el desarrollo de F. solani
solo en tallo y que F. oxysporum presentó mayor resistencia que F. solani, al antagonismo
microbiano.
PALABRAS CLAVE: Vainilla, rizósfera, competencia, biocontrol, Fusarium.
INTRODUCCIÓN
La vainilla es una fuente natural de saborizantes y aromatizantes, la cual es una orquídea
tropical con orígenes en México y Centroamérica (Funk y Brodelius, 1990). Vanilla planifolia
Andrews es originaria de la parte norte de la zona costera del estado de Veracruz y norte de
Puebla, específicamente de la zona conocida como el Totonacapan, donde se presentan las
características de clima y suelo necesarias para la explotación.
Debido a que este cultivo se establece mediante segmentos de tallo (clones) que no presentan
variación genética (Lee-Espinoza et. al., 2008), es una especie susceptible a un gran número de
enfermedades fúngicas, entre ellas aquellas causadas por los géneros Calospora vanillae
(antracnosis), Fusarium sp. (pudrición de raíz y fruto), Phytophthora sp. (pudrición de fruto),
1
Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada, Universidad Veracruzana: [email protected]
Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa, S.C., Universidad Veracruzana
2
Colletotrichum sp. y Gloeralla vanilliae (pudrición de raíz). Particularmente, Vanillae planifolia es
muy susceptible al ataque de F. oxysporum (Nielsen y Siegismund, 1999).
Para prevenir las enfermedades en este cultivo se recomiendan métodos basados en productos
químicos (Anilkumar, 2004). Sin embargo, no existe alguno específico para el control de la
pudrición ocasionada por Fusarium y los empleados, son inefectivos (Xia-Hong, 2007).
Por otro lado, en la agricultura actual el uso indiscriminado de productos químicos, además de
ocasionar contaminación del ambiente, ocasiona problemas tales como resistencia de las
plagas y enfermedades a dichos productos, aparición de organismos oportunistas perjudiciales
para las plantas, daños a los animales y sobre todo, riesgos para la salud humana (Daoubi et
al., 2005; Liu et al., 2000).
De allí que, se plantea que es necesaria la búsqueda de alternativas no tóxicas para combatir
las enfermedades, por lo que se han empleado a los “biopesticidas”, organismos y/o
bioproductos obtenidos de microorganismos competidores naturales, debido a que estos
generalmente no provocan contaminación al ambiente y son de baja toxicidad para el ser
humano (Liu et al., 2000).
Por otra parte, se ha demostrado que las enfermedades de las plantas se suprimen de manera
natural debido a la interacción de la microflora nativa con el vegetal, protegiéndola del ataque
de los patógenos (Alabouvette et al., 1993). Algunas cepas bacterianas asociadas a raíces,
denominadas rizobacterias promotoras del crecimiento (PGPR) (Kloepper y Schroth, 1978),
pueden ser empleadas como control biológico de enfermedades causadas por hongos, donde
además de disminuir el ataque de estos patógenos (Barea et al., 2005), pueden estimular el
crecimiento aumentando la producción (Jiménez et al., 2001). El uso de PGPR está ganando
importancia debido a los beneficios que han aportado a la agricultura, sin embargo en lo que
respecta al cultivo de vainilla no se ha encontrado información al respecto, por lo que se
considera que no se han realizado.
Por todo lo anterior, bajo la hipótesis de que bacterias nativas asociadas a la rizosfera y
rizoplano de la vainilla, poseen propiedades controladoras de especies fúngicas patógenas de
este cultivo, se propuso llevar a cabo este trabajo con el objetivo de obtener a partir de medios
enriquecidos con quitina, cepas bacterianas nativas asociadas al cultivo de vainilla en el estado
de Veracruz, con capacidad para el control de especies fúngicas patógenas aisladas de
problemas fitosanitarios locales.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento de hongos fitopatógenos
Se aislaron hongos patógenos de tallos y hojas de vainilla con daños por pudriciones. Los
tejidos infectados se lavaron con agua corriente y la superficie se desinfectó por inmersión en
solución de hipoclorito de sodio comercial al 2 % durante 1 min, y enjuagues posteriores con
agua destilada estéril, y secado con papel absorbente. Se cortaron fragmentos de tejido (~2 x 2
x 2 mm) no deteriorado, a partir del límite de la lesión. 2 fragmentos de tejido se colocaron en
cajas Petri con medio papa-dextrosa-agar (PDA) y medio Czapek Dox. Las cajas fueron
incubadas a 26° C ± 1 durante 5 días en incubadora microbiológica (BG®).
Parte de los micelios desarrollados se transfirió a medio PDA mediante inoculación con aguja
de disección. Cada cepa desarrollada se resembró hasta asegurar su purificación. Las cepas
aisladas fueron caracterizadas por morfología y se identificaron empleando los criterios de
Romero (1988).
Se comprobó la patogenicidad de las cepas mediante la inoculación en hojas de vainilla
incubados en cámara humeda a 22º C y 100 % de humedad relativa. Un disco de agar (5 mm
de diámetro) con micelio de 7 días de incubación se colocó en la superficie de las hojas, y
fueron incubados durante 20 días bajo 12 h de oscuridad y 12 h de luz.
Aislamiento de cepas bacterianas asociadas a la rizósfera de vainilla
Durante el mes de marzo de 2009 se llevó a cabo la recolección de rizósfera de vainilla en
cultivos establecidos en la localidad de Francisco Sarabia, municipio de Papantla, Veracruz. Las
muestras se colocaron en bolsas de plástico y se transportaron al Laboratorio de Alta
Tecnología de Xalapa, S. C. (Universidad Veracruzana). En el laboratorio, las raíces se cortaron
en fragmentos de 5 mm y se colocaron 10 g en 90 de solución estéril de fosfatos 0.25 M (NOM110-SSA1-1994). La solución fue agitada a 120 rpm durante 10 min en un agitador orbital (Lab
Line®).
A partir de dicha solución se hicieron cinco diluciones adicionales (1:9); se dispersaron 100 µL
de las diluciones 10-5 y 10-6 en medio de cultivo cáscara de jaiba (3, 6 y 9%), y se incubaron a
26º C ± 1 durante 72 h.
Evaluación de la capacidad antifúngica de las cepas bacterianas aisladas, sobre las
especies fitopatógenas
Se evaluó in vitro e in vivo la capacidad antifúngica de las colonias bacterianas que presentaron
mejor desarrollo en medio de cáscara de jaiba, sobre las especies fitopatógenas aisladas de
tallos y hojas de vainilla.
La capacidad antifúngica in vitro se probó en medio agar nutritivo y PDA mediante el método de
caja vaciada, que consistió en inocular 100 µL de solución bacteriana (1x108 UFC) y adicionar
20 mL de medio, girando hacia la derecha e izquierda para distribuir el inóculo. Se dejó
solidificar el medio y se colocó una muestra de micelio con aguja de disección, guardando la
relación de dos cajas por cepa fúngica a evaluar.
Para las pruebas in vivo, se consideraron solo 2 cepas fúngicas que mostraron mayor
agresividad (H2 y H9) y 6 aislados bacterianos que presentaron capacidad antifúngica en la
prueba in vitro, probados en conjunto (6 aislados) y uno (B15), de manera independiente,
considerado por mostrar la mejor respuesta inhibitoria in vitro. Se emplearon fragmentos de tallo
(esquejes) de 15 cm de longitud de Vanillae planifolia Andrews, colectados en la localidad de
Francisco Sarabia, Veracruz. Se evaluaron 8 tratamientos y se consideraron 7 controles
(Cuadro 1).
Cuadro 1. Tratamientos para probar la capacidad antifúngica de las cepas bacterianas
seleccionadas contra los hongos fitopatógenos en plantas de vainilla.
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Abreviatura
Bp+H2*+R
Bp+H2+T
Bp+H9*+R
Bp+H9+T
B15+H2+R
B15+H2+T
B15+H9+R
B15+H9+T
C1-1
C1-2
C2-1
C2-2
C2-3
C2-4
C3-1
Descripción
Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 2 en la raíz
Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 2 en el tallo
Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 9 en la raíz
Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 9 en el tallo
Bacteria 15 + Hongo 2 en la raíz
Bacteria 15 + Hongo 2 en el tallo
Bacteria 15 + Hongo 9 en la raíz
Bacteria 15 + Hongo 9 en el tallo
Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 34, 61)
Bacteria 15
Hongo 2 raíz
Hongo 2 tallo
Hongo 9 raíz
Hongo 9 tallo
Planta raíz
*H2=Fusarium oxysporum, H9=Fusarium solani
Se indujo a la producción de raíces de los esquejes mediante su inmersión en agua corriente
durante un mes. Para la prueba en tallo, se inoculó el tallo de 12 esquejes con dispersión
superficial de 1 ml de una solución acuosa de esporas fúngicas de 1×106 esporas/mL; y para la
prueba en raíz, se inocularon 10 ml de la solución de esporas indicada en suelo esterilizado (15
psi/120° C/30 min) contenido en recipientes de plástico de 2 L.
Posteriormente, para la prueba en tallo, se asperjó a cada esqueje, 1 ml de una solución acuosa
bacteriana de 1x108 UFC/ml, mismos que fueron sembrados en recipientes plásticos de 2 L sin
inóculo (fúngico y bacteriano). En tanto que para la prueba en raíz, se aplicaron 10 ml de la
solución bacteriana indicada, por cada recipiente con suelo inoculado con esporas fúngicas, y
se sembraron en él, esquejes sin inóculo (fúngico y bacteriano), en relación de un esqueje por
recipiente. Los recipientes fueron colocados en vivero a temperatura ambiente (± 30° C). Cada
recipiente se colocó separadamente para evitar la interferencia entre ellos, y cada tratamiento
se repitió dos veces. Se evaluó la respuesta de la vainilla (pudrición), siguiendo el desarrollo de
la enfermedad cada 5 días durante 1 mes.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento de hongos fitopatógenos
Se aislaron 37 cepas de hongos a partir de micelios desarrollados a los tres días después de la
siembra de los tejidos enfermos en cajas con medio PDA y Czapek Dox. Estas, fueron
agrupadas para su identificación en 9 hongos diferentes, de acuerdo a las características
morfológicas macroscópicas del micelio (color, forma, consistencia).
La evaluación microscópica reportó que 7 de los hongos correspondían al género Fusarium spp
y 2, al género Colletotrichum spp.
Los aislamientos de Fusarium sp., mostraron diferencias en las características macro y
microscópicas, a partir de lo cual, se identificaron 3 especies: F. oxysporum, F. solani y F.
moniliforme.
La patogenicidad de estos aislamientos en hojas de vainilla fue variable, donde el aislamiento
de F. oxysporum mostró mayor capacidad patogénica al provocar pudrición del tejido en un
radio de 7 mm alrededor del inóculo a los 5 días después de la siembra. En tanto que, a los 10
días después de la inoculación, F. solani produjo un daño de similar intensidad al provocado por
F. oxysporum a los 5 días, sin embargo, el desarrollo del daño fue más acelerado, logrando
abarcar la totalidad de la superficie foliar a los 12 días, a diferencia de los 15 días necesarios
para F. oxysporum. El aislamiento de F. moniliforme no ocasionó daño durante los 20 días del
experimento.
De acuerdo con Nielsen y Siegismund (1999), Vanillae planifolia es muy susceptible al ataque
de F. oxysporum, donde el hongo crece rápido y en pocos días puede destruir completamente
el tejido colonizado. Xia-Hong (2007) aisló a partir de tejidos de vainilla infectados y suelo, tanto
a F. oxysporum como a F. solani, indicando que F. oxysporum es primaria y frecuentemente
colonizador de tejidos de vainilla, en tanto que F. solani tiene menor frecuencia.
Aislamiento de cepas bacterianas asociadas a la rizósfera de vainilla
Se seleccionaron 19 cepas bacterianas, a partir de 61 colonias morfológicamente distintas,
desarrolladas en las tres concentraciones de cáscara de jaiba empleadas en la preparación del
medio. El desarrollo de colonias bacterianas se observó a partir de los 4 días después de la
siembra del inóculo.
Evaluación de la capacidad antifúngica de las cepas bacterianas aisladas, sobre las
especies fitopatógenas
A los 5 días de incubación, 6 de las 19 cepas bacterianas probadas, mostraron capacidad de
inhibición in vitro del desarrollo micelial. Las cepas 1, 12, 29 y 22 inhibieron en un 90% el
cuerpo micelial de los aislamiento de F. oxysporum y F. solani, en tanto que la cepa 61 inhibió
en un 95 % el crecimiento de ambos hongos. Fue sobresaliente, el hecho de que la cepa
bacteriana 15 mostró mayor poder de inhibición, 96 % para F. oxysporum y 98 % para F. solani.
La evaluación in vivo de la capacidad antifúngica reportó que a los 30 días de duración del
ensayo, los tratamientos 1, 2, y 5, así como los controles 11, 12, 13 y 14, el daño a las plantas
de vainilla fue del 100%. En tanto que, para los tratamientos 3, 4, 6, 7 y 8, y los controles 9 y 10,
los esquejes de vainilla no presentaron daño. Al respecto, se resalta el hecho de que F. solani
fue inhibido eficazmente en tallo tanto por el conjunto de bacterias como por el aislamiento B15,
sin embargo para la prueba en raíz, solo se evidenció respuesta satisfactoria empleando el
conjunto de bacterias, considerando resultados similares tenidos para la prueba con F.
oxysporum en raíz. Lo anterior puede tener como explicación que la acción de la cepa B15 fue
afectada por las características del suelo (agua, temperatura y microflora) (Davies y Whitbread,
1998) o bien que, la combinación de los microorganismos eleva el nivel y consistencia de la
supresión de hongos fitopatógenos de acuerdo a Raupach y Kloepper (1998), Whipps (2001) y
Lutz et al. (2004). Al respecto, Pierson et al. (1998), Lutz et al. (2004) y Maurhofer et al. (2004),
mencionan que la producción de antibióticos por bacterias antagonistas del suelo se puede
incrementar cuando éstas son confrontadas con otros microorganismos.
La prueba in vivo de la actividad bacteriana inhibitoria sobre F. oxysporum mostró que
únicamente el tratamiento en tallo con la cepa B15 tuvo resultados satisfactorios, lo que
demuestra que este patógeno presenta mayor resistencia que F. solani al antagonismo
microbiano. En concordancia con lo señalado por Duffy et al. (2003), al indicar que, así como
los antagonistas microbianos utilizan un arsenal diverso de mecanismos para dominar las
interacciones con los patógenos, los patógenos tienen sorpresivamente diversas respuestas
para contrarrestar el antagonismo.
Lo antes expuesto, conlleva a establecer nuevas estrategias de ensayo, entre estas, asegurar
previamente una interacción directa entre las bacterias y el tejido vegetal antes del
enfrentamiento con el fitopatógeno, así como, el uso de combinaciones de bacterias
aparentemente no antagonistas desarrolladas a partir de la rizosfera, o bien, tratamientos del
tejido vegetal con productos de la fermentación bacteriana.
CONCLUSIONES
Se identificaron tres especies de Fusarium: F. oxysporum, F. solani y F. moniliforme, a partir de
pudriciones de hojas y raíz de Vanilla planiflolia Andrews. F. oxysporum mostró, in vivo, mayor
capacidad patogénica.
El uso de medios de cultivo adicionados con quitina a partir de cáscara de jaiba, permiten el
aislamiento de bacterias con capacidad antagonista ante hongos fitopatógenos.
Se aislaron de la rizosfera de vainilla, seis cepas bacterianas capaces de inhibir in vitro en más
del 90%, el desarrollo de F. oxysporum y F. solani.
Las bacterias en estudio inhibieron de manera eficaz el desarrollo de F. solani en tallo.
F. oxysporum mostró mayor resistencia que F. solani, al antagonismo microbiano.
LITERATURA CITADA
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