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ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN
BIOL 3306 – LAB DE GENÉTICA
JA CARDÉ, PHD
UPR – AGUADILLA
OBJETIVOS
Al completar esta presentación
los estudiantes podrán:
•
Definir lo que son las enzimas de
restricción
•
Describir los criterios para su
nomenclatura
•
Explicar los factores que afectan
la actividad de estas.
•
Mencionar algunas aplicaciones
de importancia de estas.
•
Preparar una reacción de
digestión de DNA con enzimas
de restricción
INTRODUCCIÓN:VECTORES
•
70’s: se crean exitosamente las
primeras moléculas
recombinantes
•
Se ligan fragmentos de DNA de
orígenes distintos
•
Se logra introducir moléculas
recombinantes dentro de células
•
Una vez en célula huésped,
•
•
•
•
se replica
produce varias copias idénticas
del gene
se expresa
esto se le llama clonación.
INTRODUCCIÓN: VECTORES
•
Para clonar un gen la fuente para el gen
es el DNA cromosómico del organismo
que lo tiene.
•
Para hacerlo llegar al interior de la
nueva célula hay que usar un vehículo o
vector
•
Los vectores comúnmente usados en
experimentos de clonación derivan de
plásmidos o de virus
•
La mayoría son plásmidos, pequeños,
circulares, naturales en algunas células,
confieren fenotipos observables
•
•
•
Ori
Secuencias marcador
MCS
VECTOR
ENZIMAS
•
•
•
•
•
Proteínas
Aceleran reacciones
químicas
Reducen la E de activación
E + S  ES  E + P
Ejemplos
• Proteasas
• Lipasas
• amilasas
• Dehidrogenasas
• Girasas
• Ligasas
• Peptidasas
• NUCLEASAS
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
•
•
•
•
•
Descubiertas 1970, Daniel
Nathans
Cortan el enlace azucar-fosfato
del DNA, en ambas cadenas
Aisladas de bacterias, cientos
Función: mecanismo de defensa
de la bacteria contra DNA extraño
(fagos)
Sistema de
restricción/modificación
• Restricción/Metilación
•
Nombre, quien la produce
•
•
•
EcoRI – Escherichia coli (cepa RY13)
Hind II – Haemophilus influenzae
XhoI – Xanthomonas holcicola
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
PALINDROME?
• Reconocen palíndrome,
específicas
• Secuencia que lee lo mismo
en ambas cadenas, en
orientación opuesta
•
•
•
•
•
•
5’3’
3’5’
4, 6, 8 bp
1/256bp, 1/4096bp
Isoesquisomeros
ambiguos-(Py-Pu)
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Cortan el enlace fosfodiester
•
Blunts ends
•
•
Enzima corta simétricamente, en sitios opuestos en ambas cadenas
Sticky or cohesive ends
•
- enzima corta asimétricamente, un pedacito SS se extiende desde
el 5’ o desde el 3’
•
5’ overhangs
•
3’ overhangs
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Cuidados:
• Caras, se venden por unidades
• Unidad: cantidad de enzima necesaria para
digerir 1µg de DNA según las condiciones del
fabricante
• Sensitivas al calor
• -20oC o hielo siempre
• Contaminación cruzada
• Pipeteo: punta nueva siempre!!!
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Reacción, mezclar y sedimentar bien.
• DNA: limpio de contaminantes: fenol,
cloroformo, etanol o sales
•
1µg/µl de volumen (no mas)
• Amortiguador: iones, sales, pH, distintos para
cada enzima
•
10X  1X: dilución 1:10 con el volumen
• Enzima: de acuerdo al palíndrome o para
averiguar si esta presente
•
1U/µg de DNA
• Agua para completar volumen
• Incubadora a 37oC por 30-60 minutos
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Factores que afectan la reacción:
• Composición del amortiguador
•
Fuerza iónica: [sales] y Na o K, pH (8)
• Temperatura de incubación
•
•
37C, termofílicas a 50-65oC
Termolábiles, 25oC
• Metilación
•
Cepa de E coli, asegurarse de su actividad de
metilasas
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Aplicaciones
• Clonar- introducir un pedazo de DNA en un
vector
•
Cortar vector y cortar inserto
• Mapas de restricción
•
Determinar lugares de restriccion para enzimas
en algun vector o en una secuencia a clonar
• Southern Blot
•
Detectar la presencia de un gen o una
secuencia dada en una mezcla de fragmentos
de DNA cromosomal
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Aplicaciones
•
Clonar- introducir un
pedazo de DNA en un
vector
- cortar el vector
- cortar DNA fuente del
inserto de interés
- mezclar y ligar
- transformar
- cultivar en medio de
selección por el antibiótico
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Aplicaciones
• Mapas de restricción
- aislar el vector
con
- incubar muestras de este
la enzima de interés o con
combinaciones de estas
- analizar la reacción por
electroforesis (fragmentos se
separan por tamaños)
- comparar estos con un
marcador y determinar sus
tamaños
- deducir (lógica) el mapa del
vector
Tutorial
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
•
Aplicaciones
• Southern Blot
-
Aislar genoma
-
Cortar con enzimas
-
Electroforesis
-
Transferencia
-
Incubar con sonda radioactiva
-
Autoradiografía
-
Cuantas copias hay en un
genoma?
-
Hay deleciones?
-
Se parecen estos genes
-
Zoo blot (parecido entre
especies)
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
•
Aplicaciones
•
Southern Blot
-
Edward Southern -1975
cuantas copias de un gen hay en un
genoma?
-
detección de deleciones pequeñas
(diagnostico clínico)
-
identificación de familias de genes
(varios genes derivados de uno
común.
-
identificar genes homólogos en
distintas especies
-
el gen de interés estará clonado para
usarlo como sonda marcada para
buscar en la mezcla de fragmentos
por complementariedad
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Materiales
Microtubos
Micropipetas y puntas
Incubadora
Agua ultrapura
DNA a cortar (x ugs)
Buffer de la enzima de restricción
Enzima de restricción
Hielo
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Protocolo
1. Analizar la reacción a realizar
2. Calcular los volúmenes a servir en la reacción de cada uno de
los reactivos
3. Rotular 2 microtubos de 500µl o 1.5 ml, Control y: 1G, 1P, 2G,
2P, etc, según aplique.
4. Descongelar los reactivos a utilizar en la reacción
5. Cuidar que la enzima siempre este en hielo
6. Añadir en cada tubo, observando cuidadosamente que se
mezclan, las cantidades correspondientes en el siguiente orden:
•
•
•
•
Agua
Buffer
DNA
Enzima
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Protocolo
7. Mezclar con finger-vortex
8. Centrifugar en la micro-centrifuga 30 seg
9. Incubar por 1 hora a 37oC
10. Guardar a -20oC
11. Analizar por electroforesis de agarosa.
• Ejemplo de Reacción
Reactivo
Conc Inicial
Conc Final
Vol (µl)
Buffer
10X
1X
4
DNA
4µg/µl
0.5
Enzima
10U/µl
0.5
Agua
35
Total
40
PREGUNTAS
Como es mas específico para clonar un fragmento de DNA
en un vector, con una o con dos enzimas? Porque?
Mencione ventajas o desventajas de cada forma.
Si una enzima viene a 22000 U/ml, cuantos µl necesito para
digerir 4 µg de DNA?
Porque las bacterias no digieren su propio DNA con sus
enzimas de restricción?
Derive una formula para calcular cuantos fragmentos de DNA
salen de una molécula de DNA cortada con una enzima de
restricción, si la molécula es lineal vs si es circular?
REFERENCIAS
Brooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis & Principles.
(Quinta Edición). New York, McGraw-Hill Companies, Inc.