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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ASIGNATURA: BACTERIOLOGIA Y MICOLOGIA VETERINARIA MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO ELABORARON: M.C. MARIA DEL ROCIO VILLA GONZALEZ MVZ. ERICK CECILIO FERNANDEZ MENESES. M.C. CARLOS GERARDO CASTILLO SOSA OTOÑO 2012 Tecamachalco, Pue. Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas CONTENIDO Pag I. Plan institucional de desarrollo de la Facultad de Medicina 1 Veterinaria y Zootecnia II. Introducción 2 III. Ubicación de la asignatura en el mapa curricular 3 IV. Nivel de desempeño 4 V. Mapa del sistema de practicas 5 VI. Practicas generales de seguridad, reglamentos y procedimientos generales VII. Practica 1: Conocimiento, manejo del material y aparatos del laboratorio Práctica 2: Tinción de Gram Práctica 3: Tinción de Bacterias Ácido alcohol Resistente Práctica 4: Tinción de cápsula Práctica 5: Tinción de esporas Practica 6: Esterilización y Desinfección Práctica 7: Preparación de medios de cultivo Práctica 8: Siembra en medios de Cultivo Práctica 9: Metabolismo Bacteriano Práctica 10: Morfología celular Práctica 11: Susceptibilidad a Quimioterapéuticos Práctica 12: Toma y Envío de Muestras Práctica 13: Diagnóstico Bacteriológico Bibliografía 6 10 15 24 28 33 37 44 53 62 68 76 81 90 91 - 2 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas I. PLAN INSTITUCIONAL DE DESARROLLO DE LA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA MISIÓN Formar Médicos Veterinarios Zootecnistas que coadyuven a la sustentabilidad de los sistemas de producción, bienestar, salud animal y salud pública, con un enfoque integral, innovador y humanista basado en el desarrollo de conocimientos, habilidades, actitudes y valores adquiridos con base en las necesidades del contexto en el que se desarrolla. VISIÓN Ser un programa educativo acreditado y reconocido que de respuesta a las necesidades del entorno regional, nacional e internacional. Tener una planta académica con postgrado, especializada o certificada, líneas de investigación pertinentes, intercambios que fortalezcan la movilidad estudiantil y docente, además de contar con infraestructura y tecnología de punta. El programa será ampliamente aceptado y reconocido socialmente, evidencia dada por la aceptación de los egresados en el ámbito laboral, y su inserción en procesos de desarrollo comunitario. - 1 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas II. INTRODUCCION El presente Manual de Prácticas de Bacteriología surge como una necesidad de contar con un material didáctico que sirva de apoyo para el estudiante de la licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla y pretende ser una guía práctica en su Trabajo de Laboratorio, cabe mencionar que las prácticas aquí propuestas fueron revisadas, analizadas, modificadas y adaptadas a las condiciones que exige nuestro programa de estudios y a la infraestructura propia de nuestra Universidad. En este Manual se han diseñado una serie de prácticas, las cuales serán realizadas en el transcurso del cuatrimestre y obedeciendo al programa de estudios vigente de la materia en la Unidad Académica, que abarcan desde la morfología bacteriana hasta las pruebas bioquímicas características que permiten dar un diagnóstico confirmativo, vinculando así la Teoría con la Práctica. Queremos puntualizar que cualquier material didáctico por sí solo no representa un medio eficaz para la adquisición, comprensión y aplicación de los conocimientos, sino que mucho depende de la forma, el orden y la disciplina con el que sea manejado. Entonces invitamos a ALUMNOS-PROFESOR DE LA MATERIA, PROFESOR DE LABORATORIO Y TODOS LOS QUE LABORAN EN ESTE DEPARTAMENTO a que con juntemos nuestros esfuerzos para que este Manual cumpla con el objetivo para el cual fue creado. Esperamos que después de haber trabajado con este manual realicemos las críticas constructivas pertinentes que permitan mejorarlo. PONGAMOS NUESTRO MAYOR ESFUERZO PARA CONJUNTEMOS UN MISMO OBJETIVO “TRABAJO” QUE TODOS - 2 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas III. UBICACIÓN DE CURRICULAR. LA ASIGNATURA DEJAR UNA EN HOJA EN EL MAPA BLANCO Y NOSOTROS (SECRETARIA ACADÉMICA LA INCLUYE) Periodo Escolar No CODIGO NOMBRE DE LA ASIGNATURA HT/HP por periodo HT/HP por semana Total de Créditos por área Requisitos NIVEL BÁSICO 2) Área de: Básicas 1 MVZM-001 Biología Celular Veterinaria 80 5 5 SR 2 MVZM-002 Etología y Manejo Animal 80 5 5 SR 3 MVZM-003 Anatomía Veterinaria Comparada 80 5 5 SR 4 MVZM-004 Metodología de la Investigación Veterinaria 32 2 2 SR 5 MVZM-005 Fisiología Aplicada Veterinaria 80 5 5 SR 6 MVZM-006 Bioquímica Aplicada Veterinaria 64 4 4 SR 7 MVZM-007 Morfología Veterinaria 80 5 5 Anatomía Veterinaria Comparada 8 MVZM-008 Inmunología Veterinaria 64 4 4 SR 9 MVZM-009 Biología Tisular Veterinaria 80 5 5 SR 10 MVZM-010 Bacteriología y Micología Veterinaria 80 5 5 SR 11 MVZM-011 Parasitología Veterinaria 80 5 5 SR 12 MVZM-012 Virología Veterinaria 64 4 4 SR 13 MVZM-013 Farmacología y Toxicología Veterinaria 80 5 5 SR 14 MVZM-014 Bioestadística Veterinaria 64 4 4 SR 15 MVZM-015 Endocrinología de la Reproducción Veterinaria 64 4 4 SR - 3 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas IV. NIVEL 1 NIVEL 2 NIVEL DE DESEMPEÑO • Se realizan funciones rutinarias de baja complejidad. • Se reciben instrucciones. • Se requiere de baja autonomía • Se realizan un conjunto significativo de actividades de trabajo, variadas y aplicadas en diversos contextos. • Algunas actividades son complejas y no rutinarias. • Presenta un bajo grado de responsabilidad y autonomía en las decisiones. • A menudo requiere de colaboración con otros y trabajo en equipo. NIVEL 3 • Se requiere un importante nivel de toma de decisiones. • Tiene bajo su responsabilidad recursos materiales con los que opera su área, así como control de recursos financieros para adquisición de insumos. NIVEL 4 • Se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar creatividad y recursos para conciliar intereses. NIVEL 5 • Se debe tener habilidad para motivar y dirigir grupos de trabajo. • Se desarrollan un conjunto de actividades de naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar un alto nivel de creatividad, así como buscar y lograr la cooperación entre grupos e individuos que participan en la implantación de un problema de magnitud institucional. - 4 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas V. MAPA DEL SISTEMA DE PRÁCTICAS Tema Práctica UNIDAD I GENERALIDADES • • • UNIDAD II MORFOLOGÍA Y TAXONOMÍA. • • • UNIDAD III NUTRICION Y CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO DE • • • UNIDAD V ACCION • LOS CONOCIMIENTO Y MANEJO DEL MATERIAL TINCION DE GRAM TINCION DE BACTERIAS ACIDO ALCOHOL RESISTENTE TINCION DE DE CAPSULA TINCION DE ESPORAS PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO MORFOLOGIA COLONIAL METABOLISMO BACTERIANO SUSCEPTIBILIDAD QUIMIOTERAPEUTICOS Ámbito de desarrollo Semana Laboratorio 3 Laboratorio 4y5 7,8y9 Laboratorio A AGENTES Laboratorio 10 Laboratorio 6 Laboratorio Y Posta Zootécnica 11 ANTIMICROBIANOS UNIDAD VI. • ESTERILIZACON DESINFECCION VIII. Y DE • TOMA Y MUESTRAS IX. • ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN UNIDAD COLECCIÓN ENVIO MUESTRAS. UNIDAD GÉNEROS BACTERIANOS MICÓTICOS ENVIO Y DE DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO Y DE Laboratorio 12 INTERÉS VETERINARIO - 5 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas VI. PRACTICAS GENERALES DE SEGURIDAD, REGLAMENTOS Y PROCEDIMIENTOS GENERALES REGLAMENTO INTERNO PARA LOS PARTICIPANTES 1. Se prohíbe estrictamente la entrada al laboratorio sin bata. 2. Portar el protocolo de la práctica y conocer el tema así como el procedimiento de la misma. 3. No se permitirá la entrada 10 minutos después de iniciada la práctica. 4. El equipo que no traiga material que se solicitó para la práctica, NO la podrá realizar. 5. Una vez iniciada la practica, no se permitirá la salida del laboratorio. 6. Se prohíbe ingerir alimentos, fumar y hacer desorden. 7. Se prohíbe usar teléfono celular durante la práctica. 8. Solamente se prestara material con vale y credencial de la Facultad. 9. Todos los integrantes de cada equipo de trabajo, se harán responsables del material que se les entregue para la práctica. 10. Todo material deteriorado o destruido por descuido o intransigencia, deberá ser reemplazado a la mayor brevedad posible (durante el periodo escolar que se este cursando), de lo contrario se le suspenderá el desarrollo a prácticas en el Laboratorio hasta su reposición. 11. Al término de la práctica, se deberá dejar el material y la mesa limpia para que sea devuelto el vale y la credencial de préstamo de material. 12. El reporte de la práctica se entregará 8 días después de su realización. 13. Cada práctica, será realizada en hora y fecha preestablecida, salvo previo aviso para su suspensión. 14. No se repondrán prácticas. 15. No ingresar a personas ajenas al grupo y a la práctica. 16. Toda actividad y actitud estará sujeta a evaluación por parte del profesor y/o personal de apoyo académico. - 6 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas 17. De no apegarse a las disposiciones y reglas del presente reglamento puede ser motivo de sanción. El incumplimiento y la reincidencia puede ser motivo de expulsión temporal o definitiva del laboratorio. NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 1. El alumno ingresará al laboratorio con bata, la cual deberá ser blanca y de manga larga. Es indispensable portar la bata abotonada y guardar el comportamiento apropiado durante la estancia. 2. El alumno se familiarizará con los sitios en donde se encuentran localizadas las regaderas, extinguidores, botes de basura. 3. En ningún momento se permitirá la aplicación de cosméticos, fumar, ingerir alimentos o ambos dentro del laboratorio. 4. Limpiar con desinfectante las mesas de trabajo antes y después de cada práctica, así también durante la práctica si se ha derramado un reactivo o muestra biológica. 5. Para evitar quemaduras se deberán apagar mecheros, planchas calientes o ambos, cuando éstos no se utilicen. Así también se deberán emplear gradillas o pinzas para sostener o transportar tubos calientes. 6. Mantener las sustancias químicas inflamables alejadas del fuego, planchas calientes o ambos. 7. No deberá olfatear, probar reactivos o ambos, o las soluciones, no se debe mirar nunca el interior de un tubo de ensaye que se esté calentando, ni apuntar hacia alguna persona porque el contenido podría proyectarse en cualquier momento. La misma precaución debe tomarse cuando se mezclan reactivos o se agiten vigorosamente los tubos. 8. Utilizar gafas de seguridad cuando se manejen ácidos, hielo seco o sustancias desconocidas. 9. Utilizar pipetores o perillas de goma para la medición de los líquidos corrosivos, ácidos, bases, sustancias volátiles, venenos, entre otros. No aspirar con la boca. - 7 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas 10. Evitar agregar agua sobre ácidos para evitar quemaduras por proyección. Para diluir cualquier ácido, se vierte el ácido sobre el agua y NUNCA agua sobre ácido. Emplear baño de hielo o baño de agua fría para preparar diluciones diluidas de ácidos. 11. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar derrames. 12. Lavarse las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio. 13. Reportar inmediatamente el profesor del laboratorio cualquier accidente o lesión que suceda para que se tomen las medidas apropiadas. ACCIONES QUE SE DEBEN TOMAR EN CASO DE ACCIDENTE 1. En caso de que exista contacto de ácidos o bases con la piel, ojo o boca, se recomienda enjuagar el área con abundante agua con el propósito de disminuir su acción por dilución, para ello existen en el laboratorio las tarjas, regaderas y lavaojos. 2. En caso de ingestión de corrosivos, NUNCA provocar vómito. Si existe ingestión de ácidos hacer beber inmediatamente una solución de bicarbonato de sodio (dos cucharadas soperas en dos vasos de agua); en caso de soluciones cáusticas (hidróxido de sodio p potasio), ingerir una cucharada de vinagre o 25 ml. De jugo de limón en agua. 3. Si existe derramamiento de un ácido, neutralizar agregar bicarbonato de sodio y en caso de bases agregar ácido acético (vinagre). NUNCA tratar de adicionar agua. Emplear bata, guantes y gafas durante la limpieza. 4. Al ingerir otras sustancias químicas, hacer vomitar a la persona accidentada, vigilar que exista una ventilación adecuada y mantener las vías aéreas permeables mientras se traslada al hospital. 5. En caso necesario llamar a los teléfonos de emergencia 066. - 8 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas RECOMENDACIONES PARA TENER ÉXITO EN LAS PRÁCTICAS 1. El alumno leerá la práctica completa y la discutirá con el profesor entes de la realización de la misma. 2. Los útiles y aspectos personales deberán ser colocados en el lugar indicado. 3. El asa bacteriológica deberá estar estéril antes y después de la práctica. 4. Antes de preparar las mezclas de reacción, etiquetará apropiadamente cada uno de los tubos con marcador indeleble. 5. Por ningún motivo alterará el orden de adición de reactivos de la práctica. 6. Utilizar agua destilada en todos los experimentos en los que se solicite agregar agua. 7. Mantener los frascos de reactivos tapados, para evitar contaminación, evaporación de los mismos o ambos. 8. Utilizar solo la cantidad requerida de reactivos para evitar el desperdicio de los mismos. 9. Evitar regresar excedentes de reactivos al frasco de donde se extrajo el mismo. - 9 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRÁCTICA No. 1 CONOCIMIENTO DEL MATERIAL DEL LABORATORIO Y MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: • El alumno conocerá el material básico y su empleo en el laboratorio de bacteriología. • Conocerá las medidas de seguridad que se deben de guardar al trabajar en un laboratorio de bacteriología, para evitar accidentes. INTRODUCCIÓN El éxito de los procedimientos de laboratorio para proporcionar datos que conduzcan al diagnóstico exacto de una enfermedad depende de muchos factores. Los tres mas importantes son: 1) selección y conservación de un número adecuado de muestras tomadas asépticamente de los sitios anatómicos más convenientes durante el estadio adecuado de la enfermedad, para el aislamiento o demostración del o de los patógenos, 2) toma de muestras de suero sanguíneo al tiempo en que el título de anticuerpos es adecuado para el diagnóstico y 3). el conocimiento y la habilidad de los laboratoristas quienes deben seleccionar los procedimientos adecuados por su experiencia en enfermedades similares bajo sospecha y el poderlos aplicar con las precauciones y controles adecuados. Los laboratoristas deberán tener plena confianza en sus equipos. medios de cultivo, cultivos celulares, animales de laboratorio y embriones de pollo, así como en sus reactivos, soluciones, antígenos, antisueros y colorantes. Para que esta confianza sea permanente, es necesario que se ejerza un estricto control de calidad y de esterilidad microbiológica Además el laboratorio como institución deberá actualizar frecuentemente a su personal, mantener un inventario - 10 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas fácilmente disponible de materiales y probar regularmente todo el equipo. El viejo adagio “Lo que bien comienza bien acaba” se aplica perfectamente al trabajo de laboratorio. Sin embargo, el precio que hay que pagar por el éxito es una constante preparación y atención a los pequeños detalles. Existen muchas trampas, en la que caen los incautos. Se pueden obtener resultados falsos e inútiles si los materiales y equipos no han sido esterilizados adecuadamente. Los cultivos celulares y de microorganismos, pueden inhibirse o destruirse si la cristalería, los tapones y los medios de cultivo se contaminan con detergentes o restos de compuestos tóxicos; las placas y los efectos citopáticos observados en los cultivos celulares pueden deberse a las infecciones latentes que pueden reactivarse, los cultivos puros se pueden contaminar y en los pases subsecuentes se pueden perder por el crecimiento de los microorganismos contaminantes, cuando los antisueros para diagnóstico se preparan en animales que no han sido convenientemente probados, pueden contener anticuerpos contra otros antígenos que no fueron inoculados y dar reacciones que resultan en diagnósticos equivocados. Cuando se hacen tinciones pueden aparecer artificios que se confunden con bacterias, hongos o cuerpos de inclusión. Verdaderos desastres ocurren por accidentes o por descuido en las medidas de seguridad en el laboratorio de bacteriología, así pues, se pueden infectar los propios laboratoristas, se pueden escapar los agentes infecciosos e infectar a los animales de la vecindad y las enfermedades se pueden diseminar por medio de productos biológicos contaminados. Otro desastre potencial puede ocurrir por la incapacidad de reconocer o sospechar de una enfermedad exótica a tiempo para evitar su diseminación. Para el clínico de campo y el laboratorista, una historia clínica adecuada y la información acerca de las enfermedades que afectan a la población animal bajo estudio, son de gran ayuda en la evaluación primaria de la enfermedad que se trata de diagnosticar. - 11 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas MEDIDAS DE SEGURIDAD Todos los laboratorios de microbiología deben extremar las precauciones al trabajar con agentes infecciosos para evitar una o más de las siguientes eventualidades: 1) infección accidental o contaminación cruzada dentro del laboratorio que nulificaría o confundiría los resultados experimentales. 2) contaminación o diseminación de la infección a granjas adyacentes, comunidades o zonas amplias 3) infección del personal del laboratorio; y 4) difusión de la infección a través de la liberación de productos biológicos. Probablemente todos los laboratorios de microbiología han sufrido contaminación cruzada, ya sea como contaminaciones mezcladas en los cultivos bacterianos, o como infecciones indeseadas o mixtas en animales y cultivos celulares. Los reajustes para corregir estas faltas son muy costosos y causan pérdidas de tiempo. Centraremos nuestra atención a las medidas de seguridad que se aplican en un laboratorio por las necesidades presentes. ⇒ La desinfección de las mesas o área de laboratorio pueden incluir todas o algunas de las medidas siguientes, de acuerdo al agente infeccioso involucrado: 1. Lavado con agua corriente para desechar excretas, restos de alimento y polvo; 2. Cepillado de toda el área con solución detergente; 3. Enjuague del detergente; 4. Aplicación de aerosoles de un desinfectante adecuado para el germen o inundación del piso con desinfectante si se considera necesario; 5. Desinfección y desalojo de objetos innecesarios; 6. Enjuague del desinfectante En el caso de agentes infecciosos de gran peligro para la salud humana, se puede iniciar el procedimiento con la esterilización gaseosa. El vapor de formaldehído es un desinfectante económico y práctico que puede usarse en habitaciones y gabinetes cerrados. - 12 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas ⇒ Las manipulaciones de las agujas para inoculación, las asas bacteriológicas, las pipetas, las jeringas, las centrífugas, producen partículas de aerosoles cargadas con virus y bacterias que pueden ser inhaladas e infectarte, por lo que antes y después de su uso deben de ser esterilizadas. Por lo que se recomiendan las siguientes técnicas generales para todos los microorganismos. Mantener el área de trabajo limpia y ordenada y que ofrezca protección si hay derrames o goteo de microorganismos. Desinfectar el área de trabajo y desinfectar o esterilizar todos los equipos que entraron en contacto con microorganismos o que potencialmente están contaminados. Es una buena práctica al volver a esterilizar los objetos que estuvieron en el área de trabajo, aun cuando no se hayan utilizado, antes de colocarlos en el área de materiales estériles. Etiquetar claramente todas las preparaciones. El material que se va a congelar deberá guardarse en envases que resistan la congelación y descongelación ya que es difícil desinfectar los congeladores. Siempre que sea posible, los tubos o matraces que contengan material infeccioso deberán ser trasladados de tal forma que el fondo descanse sobre la palma de la mano. El traslado de material infeccioso hacia las áreas de depósito deberá ser con mucho cuidado. Utilizar bata y guantes de hule cuando se manipule material infeccioso. Desinfectar todas las partes expuestas al final de la operación. Evitar pipetear directamente con la boca cualquier material infeccioso o tóxico. Se usarán sólo pipetas con tapón de algodón. Nunca soplar líquidos contaminados que queden como remanentes en las pipetas. Antes de centrifugar, revisar los tubos para detectar cualquier fisura en ellos. Utilizar únicamente jeringas que sellen sobre la cabeza de la aguja. PARTICULARIDADES ∗ La bata será la vestimenta de protección que utilizarás en éste laboratorio - 13 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas ∗ Desinfectarás cada día de práctica la cubierta de las mesas. El espacio físico y todo lo utilizado durante la práctica lo dejarán LIMPIO (en el caso de cultivos bacterianos los depositarás en el área de material y medios contaminados) y ORDENADO. Con el propósito de evitar accidentes en este Laboratorio todo alumno que conscientemente o por negligencia no acate la normatividad estipulada será sancionado con la suspensión de la entrada al mismo. CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________ - 14 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRÁCTICA No. 2 TINCIÓN DE GRAM RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: • El alumno realizará la técnica de tinción de Gram con la modificación de Reed. • Diferenciará las bacterias Gram positivas de las Gram negativas. • Explicará las diferencias estructurales de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. INTRODUCCIÓN En 1884 el médico Danés, Christian Gram, desarrolló un método de tinción que lleva su nombre y que es de valiosa utilidad en cualquier Laboratorio de Bacteriología. La técnica, además de revelar detalles referentes a la forma y agrupación bacterianas como cualquier otra técnica de tinción, permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS. Las paredes celulares, de ambas poseen una capa basal de peptidoglicano responsable de la rigidez característica de la pared. Sin embargo, existen diferencias estructurales en lo que respecta a las capas más externas. Así en las Gram Negativas, existe una membrana externa cuya constitución química es similar a la de cualquier otra membrana biológica (fosfolípidos y proteínas) pero que posee además un alto contenido de lipopolisacáridos (endotoxina). Durante el proceso de tinción, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas, toman el colorante primario. Sin embargo al aplicar el agente decolorante, la pared de las bacterias Gram positivas sufren una deshidratación - 15 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas que impide la salida del colorante. En el caso de las bacterias Gram negativas, el agente decolorante destruye la membrana externa, incrementando así su permeabilidad, lo cual permite la salida del colorante primario. Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar fácilmente en las bacterias Gram positivas debido a la deshidratación de su pared; además de que estas bacterias quedaron previamente teñidas con el colorante primario. Por el contrario las bacterias GRAM (-) se tiñen fácilmente con el colorante de contraste. El resultado final es que las bacterias Gram (+) se tiñen de color violeta y las Gram (-) de rojo. La tinción de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la identificación de las bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos bacterianos en los cuales la tinción de Gram no es de utilidad taxonómica, por ejemplo: las espiroquetas, los micoplasmas, las micobacterias, las clamidias y las riquetsias. El método de la tinción de Gram ha sufrido varias modificaciones y algunas de estas son incluso mejores que el método original. Los objetivos principales para modificar la tinción han sido: 1. Obtener un colorante primario más estable que el original, ya que este se deteriora rápidamente. 2. Reducir el tiempo requerido para completar la técnica. En esta práctica se utilizará la técnica de tinción de Gram modificada por Reed, la cual cumple con los objetivos antes señalados. MATERIAL. Laminillas Lápiz graso Asa bacteriológica (Asa) Microscopio Mechero Bunsen Aceite de Inmersión Cultivo de bacterias en medio líquido y sólido Agua destilada Colorantes para la tinción de Gram. - 16 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PREPARACIÓN DE UN FROTIS FIJO PARA TINCIÓN. Antes de teñir, se debe “fijar” el material que se va a observar. Los portaobjetos o laminillas que se empleen para realizar las extensiones deben estar limpios y bien marcados para su identificación y para la delimitación del área en que hay que colocar la muestra, el portaobjetos puede dividirse en varias secciones con un lápiz graso y colocar varias extensiones en una misma laminilla, a condición de que todas se vayan a teñir de la misma manera. PROCEDIMIENTO: • La técnica para realiza el frotis bacteriano es variable, si el cultivo se encuentra en medio sólido se procederá a colocar una gota de agua destilada en el portaobjetos y con el asa se tomará una asada del cultivo, se mezclará bien. Si el cultivo se encuentra en medio líquido, tomar con el asa una pequeña gota de este cultivo, colocarlo en el portaobjetos y se extiende. • Al extender la gota sobre el portaobjetos formar una capa fina, frotis demasiado gruesos NO SIRVEN. • Secar los portaobjetos al aire o manteniéndolos sobre la llama del mechero de Bunsen. • Cuando se haya secado el frotis, pase el portaobjetos tres veces por la llama del mechero con la cepa hacia arriba, teniendo cuidado de no aplicar el calor en forma excesiva ya que estropearía la morfología normal y la estructura de los microorganismos que se van a teñir. (Ver la figura 2) No es el único método de fijación, pero este será el utilizado en el transcurso de estas prácticas. NOTA: Es importante recordar que la fijación por calor puede no matar las bacterias, por lo que todas las laminillas deben de ser tratadas con el respeto y precaución inherentes a todo objeto presuntamente patógeno. Existen algunas variantes que pueden afectar los resultados de la tinción de Gram, por ejemplo: a) Las bacterias en los cultivos viejos (más de 24 Horas de incubación) liberan enzimas por auto lisis. Estas atacan a la pared celular de las bacterias y - 17 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas modifican sus propiedades estructurales, propiciando que las bacterias Gram positivas se tiñan de rojo. Esta misma situación se puede presentar al observar frotis directo de los tejidos de animales infectados. b) Una decoloración excesiva puede ocasionar que las bacterias Gram positivas se tiñan de rojo. c) Una decoloración deficiente puede ocasionar que las bacterias Gram (-) se tiñan de violeta. d) Los frotis gruesos pueden teñirse irregularmente. - 18 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Medio sólido Medio líquido Fig. 2 Preparación de un frotis “fijo” para tinción. - 19 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas 1 Cubre el frotis con la solución de cristal violeta (colorante primario). Cubrir el área del frotis, una o dos gotas son suficientes. Agregar una cantidad igual bicarbonato de la solución de de sodio, la cual alcaliniza y acelera la tinción de las células. Deja actuar esta mezcla por 15 segundos Lava con agua corriente (de la llave) a chorro de agua. Sacude la laminilla para eliminar las gotas gruesas de agua. 2 Aplicar la solución de Iodo (Lugol, mordente) y déjala actuar durante 15 segundos Lava con agua corriente de la llave. Sacude el frotis Procedimiento para la técnica de GRAM - 20 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas 3 Aplicar el Alcohol-Acetona (Agente decolorante) durante 3 a 5 segundos Lava nuevamente con agua de la llave. Sacude la laminilla 4 Agrega la Fucsina básica (colorante de contraste) y déjala actuar durante 15 segundos. Lava con agua corriente de la llave Seca el frotis por presión con una toalla absorbente o al aire, y observa al microscopio con el objetivo de inmersión (100X) ¡RECUERDA!, las bacterias Gram (+) se tiñen de color violeta mientras que las Gram (-) de rojo . - 21 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRUEBA DE HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) AL 3% La prueba de KOH al 3% nos permite ratificar los resultados de la tinción de Gram. Esta prueba consiste en colocar sobre una laminilla una gota de KOH al 3% y con el asa hacer en ella una suspensión de colonias de la bacteria problema, mezclando con movimientos giratorios durante 1 a 3 minutos. Si al separar el asa de la mezcla se forma una hebra viscosa, esto indica que se trata de bacterias Gram (-). Si la hebra no se forma, se trata entonces de bacterias Gram (+). (Ver la siguiente figura) ⇒ Gram Negativas; al separar el asa de la mezcla queda entre ellas una hebra viscosa dentro de los 60 segundos a 3 minutos. ⇒ Gram positivas no existe dicha viscosidad Anota tus observaciones tomando en cuenta lo siguiente: 1) ¿Cuál fue la reacción al método de Gram de cada uno de los microorganismos con que trabajaste? 2) ¿Qué morfología presentaban? 3) ¿Cuál es la utilidad diagnostica de la técnica de Gram? 4) Comparar los tamaños de diferentes bacterias entre sí y con las levaduras. 5) Identificar las formas y agrupaciones de las bacterias 6) Dibuja y colorea tus observaciones - 22 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________ - 23 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRÁCTICA No. 3 TINCIÓN PARA BACTERIAS ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES (B A A R) RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: • Realizará la técnica de tinción de Zielhl-Neelsen para teñir frotis fijos a partir de cultivos bacterianos. • Distinguirá las bacterias ácido-alcohol resistentes de las no ácidoalcohol resistentes. • Conocerá las características estructurales de la pared celular de las bacterias ácido alcohol resistentes. INTRODUCCIÓN: Las bacterias ácido alcohol resistentes forman un grupo de microorganismos se definen con base en sus propiedades tintoriales. Son relativamente impermeables a los colorantes básicos, pero una vez teñidos retienen el colorante con tenacidad, resistiendo la decoloración con solventes orgánicos acidificados (por ejemplo alcohol-ácido). La ácido-alcohol resistencia está determinada por la composición de la pared celular, la cual además de contener peptidoglicano está constituída por un alto porcentaje de glucolípidos hidrofóbicos. Un componente importante de estos, son los ácidos micólicos. La presencia de estas capas hidrofóbicas previenen la penetración de soluciones acuosas, siendo esta la causa por la cual estos microorganismos no pueden teñirse con los métodos convencionales (tinción de Gram). - 24 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Uno de los métodos de tinción mas comúnmente usados para demostrar la ácido-alcohol resistencia es el método de Ziehl-Neelsen. En este método la penetración del colorante primario se facilita debido a que este se encuentra disuelto en fenol ya que es aplicado en presencia de calor. Una vez que el colorante penetra a la célula bacteriana, este se combina con las mismas estructuras con las que se combina en cualquier otra bacteria (ácidos nucleicos, proteínas, etc.) y además reacciona con ácidos micólicos libres, lo cual hace que la pared celular se vuelva aun más hidrofóbica. Con la tinción de Ziehl-Neelsen tanto las bacterias ácido-alcohol resistentes como las no ácido-alcohol resistentes se tiñen con el colorante primario. Sin embargo, al aplicar el agente decolorante, compuesto por una mezcla de alcoholácido, este no solubiliza los lípidos de la pared de las bacterias ácido-alcohol resistentes se decoloran fácilmente, por lo que se vuelven a teñir al aplicar el colorante de contraste. El grupo de bacterias ácido-alcohol resistentes está representado principalmente por el género Mycobacterium. Algunas especies de este género juegan un papel muy importante como agentes etiológicos de la tuberculosis y otras enfermedades crónicas granulomatosas tanto en el hombre como en los animales. En el análisis de un frotis de material clínico sospechoso de contener bacilos tuberculosos, el hallazgo de un solo bacilo ácido- alcohol resistente puede tener valor diagnóstico, ya que en la mayoría de los casos no son abundantes. Sin embargo, la interpretación del hallazgo de un solo bacilo ácido-alcohol resistente debe hacerse con cautela y con base en la historia clínica y otras pruebas de laboratorio, ya que la presencia de especies saprofitas de Mycobacterium podría conducir a un diagnóstico falso. Por otra parte, existen algunas especies de Corynebacterium y Nocardia que ocasionalmente pueden comportarse como bacterias ácido-alcohol resistente. MATERIAL. Laminillas Lápiz graso Asa bacteriológica (Asa) - 25 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Microscopio Platina caliente Trozos de papel filtro Aceite de Inmersión Cultivo de bacterias Agua destilada Colorantes para la tinción de Ziehl-Neelsen. PROCEDIMIENTO: Utilizando una laminilla, prepara un frotis fijo (ya se te indicó el procedimiento anteriormente) a partir del cultivo que vas a trabajar. Tíñelos siguiendo la técnica de Ziehl-Neelsen, que a continuación será descrita. TÉCNICA DE LA TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN. a) Coloca un trozo de papel absorbente sobre el frotis, de tal manera que cubra solo el frotis y no toda la laminilla. b) Humedece el papel con la Fucsina Fenicada (colorante primario). El frotis no deberá secarse, así que añade continuamente colorante para evitar esto. c) Permite la emisión de vapores durante 5 minutos. Retira el frotis de la platina, quítale el papel, déjalo enfriar y lava con agua corriente de la llave. d) Decolora con el Alcohol-Ácido, permitiéndole actuar durante 2 minutos. Es importante realizar la decoloración perfectamente, ya que de no ser así se corre el riesgo de observar reacciones falsas positivas. Lava con agua corriente de la llave. e) Contrasta con azul de metileno de Loeffler durante un minuto. Lava con agua corriente de la llave, seca y observa al microscopio con el objetivo de inmersión. RECUERDA: Los microorganismos ácido -Alcohol-Resistentes se tiñen de color ROJO. Los no ácido-Alcohol-Resistentes de color AZUL. Anota tus observaciones tomando en cuenta lo siguiente: - 26 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas 1. Escribe la composición química de la pared celular de bacterias Gram positivas, negativas y ácido alcohol resistentes. 2. ¿En que tipo de muestras clínicas es recomendable realizar frotis directos y teñirlos mediante la técnica de Ziehl- Neelsen? 3. Dibuja y colorea tus observaciones. 4. ¿Cuál de las dos cepas bacterianas resultó ser ácido alcohol resistente? CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________ - 27 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRÁCTICA No. 4 TINCIÓN PARA ESPORAS RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: • Realizará La técnica de tinción de Schaeffer y Fulton para teñir frotis fijos a partir de cultivos bacterianos. • Mencionará las principales características estructurales de la espora bacteriana, así como su función. • Distinguirá y clasificará a las esporas bacterianas por su localización en la célula bacteriana. INTRODUCCIÓN: La espora bacteriana es una estructura altamente deshidratada y rígida, que es formada por algunos géneros bacterianos. Los géneros bacterianos de interés en Medicina Veterinaria que son capaces de esporular son Bacillus y Clostridium. Estos responden de manera diferente al efecto que las condiciones ambientales tienen sobre la formación de la espora. Por ejemplo; el B. anthracis, microorganismo aerobio estricto, solamente puede formar esporas en condiciones de aerobiosis, de manera similar, los bacilos del género Clostridium anaerobios, no forman esporas en aerobiosis. La esporulación es un mecanismo especializado cuya función es encerrar un genoma en un vehículo aislante que le permita la germinación posterior en un medio adecuado. Las esporas bacterianas mantienen un estado de criptobiosis o vida latente, con escasa actividad metabólica. - 28 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Así mismo, muestran una marcada resistencia al calor, a la desecación, a la congelación, a diversos agentes químicos y radiaciones. La espora bacteriana está compuesta por seis capas de afuera hacia adentro: a) Exosporium b) Capa c) Corteza d) Pared e) Membrana interna f) Centro (Protoplasma) La capa está constituida por proteínas parecidas a la queratina, las cuales vuelven impermeable a la espora y la protegen de la acción de substancias químicas. El centro contiene dipicolinato de calcio, el cual aunado al alto estado de deshidratación del protoplasma, es responsable de la marcada resistencia que muestra la espora al calor y a la desecación. Las esporas son estructuras ovales o esféricas que pueden encontrarse tanto intracelularmente, como fuera de la bacteria (célula vegetativa). Por su localización dentro de la célula pueden ser centrales, subterminales o terminales (como lo representa la Fig. 4) y presentan además variación en su tamaño. Estas características son de utilidad taxonómica para la identificación de algunas especies de los géneros capaces de esporular. En una preparación teñida con la técnica de Gram las esporas aparecen como cuerpos refringentes sin teñir. Para teñirlas se utiliza la tinción de Schaeffer y Fulton en la que es necesario aplicar calor para forzar la entrada del colorante primario (verde de malaquita) y una ves que este ha penetrado, al lavar la preparación y agregar un colorante de contraste (safranina), las células vegetativas se tiñen de rojo y la espora permanece teñida de VERDE. - 29 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Fig. 4 tipos de esporas bacterianas: terminal, subterminal, central, esférica y oval MATERIAL. Laminillas Lápiz graso Asa bacteriológica (Asa) Microscopio Platina caliente Mechero Aceite de Inmersión Cultivo de bacterias esporuladas Agua destilada Colorantes para la tinción de esporas PROCEDIMIENTO: Prepara dos frotis fijos a partir del cultivo que tienes en la mesa de trabajo. Uno de los frotis será teñido utilizando la tinción de Gram y el otro será teñido con el método de Schaeffer y Fulton como se describe a continuación: a) Coloca un trozo de papel absorbente sobre el frotis, de tal manera que cubra solo el frotis y no toda la laminilla. b) Aplica Fulton A (verde malaquita) y calienta en la platina, hasta la emisión de vapores, durante un minuto (recuerda que el colorante no debe - 30 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas evaporarse, por lo tanto a añadirás continuamente colorante para evitar esto). c) Lava con agua corriente de la llave. d) Contrasta con Fulton B (safranina) durante 15 segundos. e) Lava con agua corriente de la llave, seca y observa al microscopio con el objetivo de inmersión (100X). f) El método de tinción de Schaeffer y Fulton puede practicarse en frío, permitiendo actuar al Fulton A durante 10 minutos. RECUERDA: Con la tinción de Gram las esporas se observan como cuerpos refringentes SIN TEÑIR, mientras que con el método de Schaeffer y Fulton las esporas se observan de color VERDE y las formas vegetativas se ven ROJAS. CUESTIONARIO 1. ¿Qué diferencias encontraste entre el frotis teñido por el método de Gram y el frotis teñido por el método de Schaeffer y Fulton? 2. ¿Qué posición tenía la espora dentro del cuerpo bacteriano y qué forma tenía ésta? 3. ¿Cuál es la importancia de las esporas bacterianas? 4. ¿Cuando se forman las esporas bacterianas? CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO - 31 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________ - 32 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRÁCTICA No. 5 TINCIÓN DE CÁPSULAS RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: • El alumno realizará las técnicas de tinción de Maneval y tinta china para poner de manifiesto la presencia de cápsula bacteriana. • Distinguirá la presencia de cápsula en un frotis teñido con la técnica de Maneval y con Tinta China. • Describirá la composición química y función de la cápsula bacteriana. INTRODUCCIÓN: Muchas bacterias están rodeadas por compuestos químicos superficiales que se tiñes con mucha dificultad y que ha sido denominada cápsula. La mayoría de las cápsulas bacterianas están constituidas químicamente por polisacáridos, aunque en el género Bacillus consiste en un polipéptido del ácido D-Glutámico. La cápsula desempeña un papel importante en la virulencia de algunas bacterias patógenas, ya que les confiere propiedades antifagocíticas que interfieren con los mecanismos de defensa del organismo. El grosor de la cápsula varía no solo de una especie de microorganismos a otra, sino que también entre las diferentes cepas de la misma especie y dependiendo de la fase de la curva de crecimiento en que se encuentra el cultivo. El diámetro de la cápsula puede ser varias veces mayor al diámetro del cuerpo celular, como en el caso de Streptococcus pneumoniae y Klebsiella pneumoniae. Por el contrario, en otras bacterias su diámetro puede ser mucho menor, - 33 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas poniéndose de manifiesto solamente mediante procesos bioquímicos y serológicos como en el caso de algunas cepas de Pasteurella spp. Las bacterias con cápsula, en los medios de cultivo, forman colonias lisas y mucoides mientras que las bacterias no capsuladas producen colonias rugosas. Las cápsulas bacterianas no pueden observarse en frotis teñidos con las técnicas usuales porque son incapaces de retener el colorante y porque los procesos de fijación al calor y lavado las disuelven. Por lo tanto l mejor método para observarlas es el de las tinciones negativas. La Fig. 5 nos pone de manifiesto la presencia de cápsula bacteriana mediante la tinción negativa con tinta china. Frotis delgado Frotis grueso Fig. 5 Demostración de cápsula bacteriana, utilizando el método de Tinta China. Los siguientes ejemplos son géneros bacterianos y micóticos que pueden presentar cápsula. a) b) c) d) e) Klebsiella Pasteurella Bacillus Escherichia Yersinia a) b) c) d) e) Streptococcus Haemophilus Neisseria Moraxella Cryptococcus - 34 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas • MATERIAL. Laminillas Cubreobjetos Lápiz graso Asa bacteriológica (Asa) Microscopio Mechero de Bunsen Aceite de Inmersión Pulque Tinta China filtrada Colorantes para la tinción de Maneval PROCEDIMIENTO: Determina la presencia de cápsula bacteriana utilizando el pulque que has traído, con los métodos de tinción negativa que a continuación se describen: TINCIÓN NEGATIVA CON EL MÉTODO DE MANEVAL MODIFICADO. Coloca una gota de Maneval A (Rojo Congo) en una laminilla. Toma un poco de pulque y mézclalo con la gota de Maneval A, haciendo movimientos giratorios con el asa. Extiende la suspensión de manera que quede una película delgada. Deja secar la preparación a temperatura ambiente. NO FIJES EL FROTIS AL CALOR. Cubre la preparación con Maneval B (Fucsina ácida) y deja que actúe durante un minuto. Lava suavemente con agua corriente de la llave y seca el frotis mediante un ligero contacto con una toalla de papel. Observa al microscopio Con el objetivo de inmersión. Las cápsulas se observan como halos incoloros. El espacio intercelular se observa de un color oscuro y las células bacterianas de color rojo. TINCIÓN NEGATIVA CON TINTA CHINA. En una laminilla coloca una gota de tinta china y una gota de pulque, suspéndelo homogéneamente. Coloca un cubreobjetos sobre la suspensión y observa al microscopio. - 35 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas La cápsula se observa como un halo incoloro alrededor de los microorganismos, gracias al contraste proporcionado por la coloración negra tanto del espacio intercelular como de las células microbianas Cuestionario Anota tus observaciones tomando en consideración lo siguiente: 1) ¿Por qué este tipo de preparaciones no deben fijarse al calor? 2) ¿Cuál de los dos métodos puso mejor de manifiesto la cápsula bacteriana? 3) Comparar el grosor de la cápsula con el diámetro de la célula. 4) Relacionar el tamaño de la cápsula con la viscosidad del medio. 5) ¿Cuál es la función de la cápsula en una infección bacteriana? CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________ - 36 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRÁCTICA No. 6 MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: • El alumno explicará el proceso de esterilización mediante el método de calor seco y calor húmedo. • El alumno aplicará los conocimientos teóricos seleccionando el o los métodos de esterilización mas adecuados para esterilizar cada uno de los materiales que se le presentan. INTRODUCCIÓN: La esterilización es un proceso que destruye todo tipo de vida en el material o sustancia de que se trate. Esto puede realizarse por métodos físicos o químicos. MÉTODOS FÍSICOS. Dentro de los métodos físicos de esterilización pueden mencionarse: Calor Húmedo I.- CALOR Calor seco Ebullición A 100 ºC por 1015 minutos. Vapor a presión A 121 ºC a 15 lb. (autoclave) de presión por 15 minutos. Flameado Incineración Aire caliente A 160-170 ºC, de (Horno Pasteur) 60-120 minutos II. FILTRACIÓN Filtros de columna Filtros de membrana Con poros de 0.8, 0.6, 0.45, 0.2 y 0.1 µm de diámetro. - 37 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas III. RADIACIÓN Radiaciones ionizantes Rayos α β,γ y X Radiaciones ionizantes no Rayos ultravioleta infrarrojos. e A continuación se describirán cada uno de estos métodos. I. CALOR. El efecto esterilizante del calor se debe a que se desnaturaliza (coagula) las proteínas. El factor que más influye cuando s esteriliza por éste método es la presencia o ausencia de humedad, ya que es ésta la que determina la temperatura exacta a la que mueren los microorganismos. En términos generales, la esterilización por calor húmedo es más eficaz. Ebullición: Por este proceso las formas vegetativas de la mayoría de las bacterias mueren en 10-15 minutos a una temperatura de 90-100 ºC. Sin embargo, las bacterias esporuladas requieren de mayor tiempo de exposición. La ebullición puede utilizarse para esterilizar material de cristalería, instrumental de cirugía, jeringas, recipientes, etc. Vapor a Presión. La esterilización por medio de vapor a presión se realiza en un recipiente herméticamente cerrado (autoclave) (ver figura 6) en el que se produce presión de vapor de agua, lo cual permite lograr temperaturas mayores a las que se obtienen en la ebullición. Durante este procedimiento es importante una completa evacuación del aire del recipiente, ya que la temperatura de la mezcla de Aire-Vapor es más baja que la del vapor puro. A este proceso de eliminación del aire se le denomina “purga del autoclave” y se realiza a través de una válvula de escape que puede variar de acuerdo con las especificaciones del modelo de autoclave que se utilice. Las autoclaves deben de tener un manómetro que indique la presión interna. La presión que debe alcanzarse es de 15 libras /1.1 Kg/cm2), y a esta presión la temperatura alcanzada es de 121 ºC. Para lograr un efecto esterilizante deben mantenerse la presión y temperatura mencionada durante 15 minutos por - 38 -Pag - lo Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas menos, debiendo aumentarse el tiempo cuando el volumen de material es grande. Después de este periodo, el autoclave debe dejarse enfriar hasta que la presión en el manómetro marque cero libras. El autoclave es de utilidad para destruir tanto formas vegetativas como esporas bacterianas presentes en substancias termoestables, material de cirugía y curación, ropa, material de cristalería, filtros, etc. Flameado. Consiste en la aplicación directa de la flama sobre el material a esterilizar. El material puede calentarse al rojo blanco o sumergirse en alcohol y pasarlo por la flama para que éste se consuma. Es utilizado para asas microbiológicas, espátulas, pinzas, tijeras, etc. La Fig. 6 muestra el flameado como método de esterilización. Incineración. Es la forma más eficaz y rápida para la destrucción de hisopos contaminados, material de curación, muestras de desecho, así como cadáveres de animales infectados. Aire caliente. La esterilización por medio de aire caliente se realiza en una cámara (horno Pasteur) (Ver figura 6) que puede compararse con un horno doméstico. En el debe alcanzarse una temperatura mínima de 160 ºC durante l Hr. por lo menos. Es un requisito indispensable que el aire caliente circule para que cada objeto a esterilizar alcance la temperatura deseada y ésta destruya a todos los microorganismos tanto esporulados como no esporulados. El Horno Pasteur es ampliamente usado en la esterilización de material de cristalería y material de cirugía. NO ES RECOMENDABLE para substancias líquidas, algodón, telas y plásticos, ya que estos materiales tienden a deteriorarse por deshidratación a inclusive pueden carbonizarse. II. FILTRACIÓN. Es la remoción mecánica de los microorganismos presentes en una substancia líquida. Para esto se utiliza un tamiz con poros de un diámetro de menor tamaño al de los microorganismos que se desean remover. Los filtros, deben ser esterilizados previamente a su uso y generalmente en el autoclave. La filtración es particularmente útil para la esterilización de soluciones de antibióticos y líquidos termolábiles. - 39 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas III. RADIACIONES De las radiaciones que se utilizan con fines de esterilización existen dos grupos: a) Ionizante (alta energía) b) No ionizantes (baja energía) Radiaciones ionizantes: este tipo de radiaciones son de corta longitud de onda y actúan ionizando moléculas a su paso. Son altamente letales a su efecto sobre al ADN. Ejemplo de este tipo de radiaciones son los rayos alfa ( gamma ( γ α ), beta ( β ), ) y equis ( X ). Radiaciones no ionizantes: Dentro de esta categoría se incluyen los rayos infrarrojos y los rayos ultravioleta. Los primeros son de longitud de onda más larga que la luz visible y se absorben en forma de calor. Su acción esterilizante se debe a la desnaturalización de proteínas generada por el calor. Los rayos ultravioleta tienen una longitud de onda más corta que la luz visible y provocan la muerte de los microorganismos debido a que al ser absorbidos ocasionan “lesiones” en el ADN y en algunas proteínas de la célula microbiana. Las radiaciones, tanto ionizantes como no ionizantes, se utilizan para esterilizar recintos cerrados, materiales plásticos, materias primas para alimentos de animales, papel, hojas delgadas de metal y algodón, entre otros. MÉTODOS QUÍMICOS. Los métodos químicos par esterilización utilizan agentes como el óxido de etileno y l formaldehído, ambos son gases y se les usa para esterilizar recintos cerrados como quirófanos, laboratorios, incubadoras y nacedoras. El óxido de etileno es también utilizado en la esterilización de materiales sólidos termolábiles (materiales plásticos). Desinfección. La desinfección involucra agentes químicos que generalmente no tienen efecto esterilizante, aunque destruyen virtualmente todos los microorganismos patógenos. Solo algunos desinfectantes pueden tener efecto esterilizante cuando se usan apropiadamente, tal es el caso del formaldehído, el fenol, el glutaraldehído, el óxido de etileno, el peróxido de hidrógeno y el ácido paracético. - 40 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Hay desinfectantes que, debido a que no produce daño celular, pueden aplicarse sobre superficies corporales. A estos desinfectantes se les conoce como antisépticos, por ejemplo el alcohol etílico, el iodo, la tintura de benzalconio, el cloruro de benzalconio, el mercurocromo, etc. Los desinfectantes pueden clasificarse según su mecanismo de acción en: 1. Detergentes catiónicos 2. Alcoholes 3. Fenoles 4. Halógenos 5. Agentes alquilantes 6. Agentes oxidantes 7. Colorantes 8. Metales pesados Ejemplo: Cloruro de benzalconio Alcohol etílico Fenol Cloro, Iodo Formaldehído, óxido de etileno Peróxido de hidrógeno, ácido paracético Violeta de genciana, azul de metileno Soluciones de cobre, plata y mercurio. Flameado Vapor a presión Autoclave Flameado Aire caliente Horno Pasteur Fig. 6 Equipo que puede ser utilizado para la esterilización de materiales. - 41 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas MATERIAL: Autoclave Horno Pasteur Jeringas Hisopos contaminados Cultivos bacterianos en medio sólido y líquido Asa microbiológica Espátulas Alcohol Tijeras Guantes de latex Cajas de Petri Tubos de ensaye Pipetas Hisopos Mortero PROCEDIMIETOS: 1. En tu mesa de trabajo encontrarás material para esterilizar, observa, clasifica y selecciona el método a utilizar para la esterilización de dicho material. 2. Espera la explicación del profesor sobre algunas particularidades previas a la aplicación del método de esterilización. CUESTIONARIO 1. Con base en su bibliografía y el trabajo realizado, indicar si aplicó los métodos de esterilización adecuados para el material y medios de cultivo que preparó 2 Indicar si el proceso de esterilización aplicado a los medios de cultivo fue eficiente. 3 Comparar la eficacia del calor seco y del calor húmedo como medios de esterilización. 4 Comparar la resistencia al calor de las células vegetativas de las bacterias con la de las esporas bacterianas. - 42 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas 5 ¿Qué clase de materiales se esterilizan por lo general por filtración? 6 ¿En que se fundamenta la esterilización por tindalización? CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________ - 43 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRÁCTICA No. 7 CLASIFICACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: • Conocerá la importancia del cultivo de bacterias “in vitro”. • Enunciará la utilidad práctica de los medios según sus características físicas. • Preparará y clasificará los medios de cultivo problema. INTRODUCCIÓN: Para realizar el estudio de los microorganismos es necesarios recuperarlos del habitad natural donde se encuentran y hacer que proliferen en medios artificiales que proporcionen sus requerimientos nutricionales, a este procedimiento se conoce como cultivo “in vitro”. La proliferación de bacterias es el resultado de una interacción compleja de diferentes sustancias alimenticias y principios activos en la cual intervienen factores físicos como la temperatura, el pH, el factor redox. Para su crecimiento todos los microorganismos requieren agua, además deben estar presentes en forma utilizable el carbono, oxígeno, nitrógeno, hidrógeno, calcio, fósforo y el fierro, muchos microorganismos dependen además de oligoelementos como el magnesio, molibdeno, zinc, cobre. Los microorganismos exigentes tienen necesidad además de factores de crecimiento como aminoácidos, vitaminas, purinas u otras sustancias que no pueden sintetizar ellos mismos. El carbono se necesita en la mayor parte de las veces en forma e compuestos orgánicos, que luego sirven como fuente de energía, el oxígeno se toma principalmente de la atmósfera, las necesidades de hidrógeno se cubren con compuestos orgánicos y, en casos particulares, también a partir de compuestos - 44 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas inorgánicos. El nitrógeno proviene de sales en forma de nitratos, nitritos o compuestos amónicos, o de componentes más complejos como aminoácidos, peptonas o proteínas. Los otros elementos se toman principalmente de sales. Los medios de cultivo sintéticos están compuestos de una serie de substancias químicas definidas exactamente, los medios de cultivo complejos contienen diferentes extractos, hidrolizados u otros aditivos. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DE LOS MEDIOS a) Medios líquidos Son medios que no contienen agar (agente solidificante), son envasados en tubos, botellas y matraces. b) Medios semisólidos Son medios que contienen 0.5 a 0.75% de agar. Son envasados en tubo. c) Medios sólidos Existen dos tipos, los que contienen 1.5% de agar y los que contienen 3 a 7% de agar llamados medios duros. Pueden envasarse en cajas de Petri, botellas o tubos. El agar-agar es un extracto seco gelificante, obtenido de algunas especies de algas rojas, particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Adanthopeltis. En el medio de cultivo pueden estar presentes colorantes e indicadores cuyo cambio de color será característico para un determinado intervalo de pH. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. Como es lógico suponer no todos los medios de cultivo son utilizados para el aislamiento de todas las cepas bacterianas, utilizados para el aislamiento de todas las cepas bacterianas, en ocasiones no solo son aptos para el aislamiento de microorganismos en general, sino que además poseen la capacidad de inhibir a algunos y favorecer el desarrollo de otros. Basados en el propósito para el cual son fabricados los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente manera: MEDIOS DE CULTIVO BÁSICOS. - 45 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Son medios simples que contienen en general los nutrientes esenciales para promover el desarrollo de microorganismos poco exigentes nutricionalmente. Reciben también el nombre de medios generales y pueden ser utilizados en análisis cuantitativos, para muestreo de medio ambiente, superficies y para conservar cepas. Ejemplos: Caldo nutritivo, caldo tioglicolato, caldo triptosa, agar nutritivo. Agar soya tripticasa. MEDIOS ENRIQUECIDOS. Son medios que se suplen con factores de crecimiento para el desarrollo de bacterias y hongos de requerimientos nutricionales exigentes. Estos medios generalmente contienen uno o más de los siguientes ingredientes: sangre, suero, líquido ascítico, huevo, carne, vitaminas y aminoácidos específicos, entre otros. Ejemplos: Agar sangre, agar Sabouraud con ácido nicotínico, agar LowesteinJensen, caldo infusión cerebro corazón. MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO. Son muy utilizados, sobre todo en cultivos entéricos, estos medios se utilizan para aumentar la propagación de ciertos organismos sin favorecer a otros. Son muy eficaces en el aislamiento de Salmonella a partir de heces. Ejemplos: Caldo selenito de sodio, caldo selenito y cistina, caldo tetrationato, caldo-sal-colistina, agar sangre + levadura de cerveza, agar yema de huevo con leche. MEDIOS SELECTIVOS. Son muy utilizados cuando se trabaja con muestras que provienen de áreas del cuerpo que poseen una flora normal abundante (faringe, boca, piel nariz, vagina, etc.). En estos se incorporan substancias inhibidoras de la propagación de un grupo de bacterias, pero permiten en cambio el crecimiento de otros grupos. Así para el cultivo entérico, los medios usados de modo habitual contienen ciertos colorantes e ingredientes que inhiben los organismos Gram positivos y permiten la propagación de los bacilos entéricos Gram negativos. - 46 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Ejemplos: Agar verde brillante (VB), agar Salmonella Shigella (SS), que son medios selectivos para Salmonella, agar Mac Conkey (Mac C), agar ENDO y agar Eosina azul de metileno (EMB), que son selectivos para enterobacterias, agar manitol sal (MSA), agar Staphylococcus 110 y Chapman Stone, selectivos para Staphylococcus. MEDIOS DIFERENCIALES. Este tipo de medios, debido a los componentes químicos e indicadores que contienen, permiten identificar con cierta facilidad algunos géneros o especies bacterianas, por el aspecto característico que toman sus colonias. Muchos medios selectivos son también diferenciales. Ejemplos: Agar verde brillante, agar Salmonella-Shigella, agar Mac Conkey, agar ENDO, agar eosina azul de metileno. Estos permiten diferenciar enterobacterias fermentadoras de la lactosa (coliformes) de las no fermentadoras de la lactosa (no coliformes). MEDIOS PARA EL ESTUDIO DE CARBOHIDRATOS. En los medios de cultivo, los carbohidratos y glucósidos son muy utilizados como fuente de energía por las bacterias, y particularmente para diferenciar géneros e identificar especies se utiliza generalmente agua peptonada como base para el estudio de los azúcares, las soluciones de carbohidratos empleados para estas pruebas, deben esterilizarse por filtración, ya que al calentarse los azúcares sufren varios fenómenos, como la formación de productos de oxidación y reaccionar con algunos otros componentes de los medios de cultivo como aminoácidos. Ejemplos: Medio basal OF de Hugh y Leifson, medio para MR-VP y todos aquellos en los cuales se pruebe algún azúcar en particular (agua peptonada + glucosa, manitol, sucrosa, sorbitol, galactosa, etc.). MEDIOS DE TRANSPORTE. Son medios utilizados en el envío de muestras de laboratorio, algunos contienen sustancias reductoras, o nutrientes que permiten a los microorganismos conservarse viables hasta llegar al laboratorio. Ejemplos: Medio de transporte de Stuart, caldo tioglicolato, medio de Carry-Blair. MATERIAL: Diferentes medios de cultivo sintéticos - 47 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Matraces Erlenmeyer Mechero Espátulas Cajas de Petri Autoclave Balanza granataria Papel aluminio Tubos de ensaye PROCEDIMIENTO: Los fundamentos de preparación, distribución y esterilización de los medios de cultivo son esencialmente iguales, utilizando las formas deshidratadas o bien añadiendo los distintos ingredientes por separado. Casi todos los medios de cultivo utilizables se encuentran en el comercio en forma deshidratada y se determina simplemente la cantidad necesaria de polvo, según las instrucciones y se añade al agua destilada necesaria. Es importante utilizar un frasco o matraz Erlenmeyer lo suficientemente grande para que se pueda remover o agitar bien para disolver el medio. Una vez preparado el medio, se distribuyen recipientes adecuados mientras están todavía calientes, los métodos de distribución de los medios disueltos en cajas de Petri, tubos o frascos, dependen del tipo de medio y de la finalidad de su empleo. PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO Y SU DISTRIBUCIÓN CAJAS DE PETRI. Ver Fig. 7 Fig. 7 Preparación de un medio de cultivo. Material necesario para la reconstrucción de los medios de cultivo. - 48 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Pesar la cantidad requerida del medio deshidratado utilizando un papel o papel aluminio, evitando con éste pérdidas del polvo sobre la balanza. El medio se añade a una pequeña cantidad de agua destilada o desmineralizada, fría y se distribuye uniformemente por agitación, enseguida añadir la cantidad restante de agua y se homogeniza. Se deja reposar la solución durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, para que el agar pueda hincharse. Para disolver completamente los medios deben calentarse a más de 95ºC. - 49 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Los medios de cultivo clarificados, se esterilizan en autoclave utilizando la forma convencional de 121ºC por 15´ y a 15 lb de presión, estas constantes van a depender del tipo de medio a esterilizar. El medio agarificado, todavía líquido se vierte en las cajas de Petri. El volumen es variable y depende del tamaño de las cajas; se recomienda 15 a 20 ml para las cajas de 31/2 plg. y de 20 a 35 ml para las cajas de 4 plg. Si aparecen burbujas de aire en las cajas, se eliminan pasando la llama del mechero de Bunsen por la superficie. Las cajas se pasan por una prueba de esterilidad que consiste en incubarlas por 24 horas a 37 ºC. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, las cajas y los tubos son revisados. Aquellos que muestren contaminación se desechan; por el contrario, los libres de contaminación se refrigeran entre 4-15 ºC hasta su utilización. NOTA: Para preparar las cajas de Petri, se tendrán que esterilizar primero y a continuación se llenan con el medio, hasta una altura de 3 mm. Hay que dejar - 50 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas enfriar el medio a unos 50-55 ºC con el objetivo de prevenir la condensación de humedad en las paredes del recipiente. 1.- En tu mesa encontrarás diferentes medios de cultivo deshidratados (comerciales). 2.- Clasifícalos de acuerdo a su uso. 3.- Lee las instrucciones de cada uno de los medios. 4.- Procede a prepararlos según las indicaciones de cada uno de ellos y con base al procedimiento antes mencionado; tu profesor te revisara los cálculos matemáticos que realizaste. CUESTIONARIO: 1. Menciona la clasificación de los medios de cultivo según sus características físicas. 2. De acuerdo a la composición química. menciona la clasificación de los medios de cultivo 3. Menciona dos ejemplos de medios selectivos y de transporte. 4. Por que es importante saber que medio de cultivo utilizar para la siembra de bacterias y la siembra de hongos. 5. Que puntos debes de seguir para la preparación de un medio de cultivo. 6. Una vez preparados los medios en que tipo de recipientes se pueden distribuir y por que. CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO - 51 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ___________________ - 52 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRACTICA No. 8 SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: • El alumno aplicará las técnicas de sembrado en medios de cultivo líquidos, semisólidos y sólidos. INTRODUCCCION La mayoría de las bacterias pueden multiplicarse formando colonias visibles en medios de cultivo artificiales, los cuales, una vez preparados y listos para ser inoculados con bacterias, pueden tener varias presentaciones en cuanto a su consistencia, la cual está determinada por la concentración de agar presente en el medio o la ausencia del mismo. El instrumento más utilizado para la inoculación (sembrado) de bacterias es el asa bacteriológica, la cual puede ser de alambre de platino, nicromo u otro material parecido el cual se inserta en un mango. Existen en el mercado asas microbiológicas calibradas para tomar un volumen constante de inóculo, las más utilizadas con este fin son las de 0.01 y 0.001 ml, las cuales son utilizadas para el análisis bacteriológico cuantitativo de agua y orina sin diluir. El sembrado de cada uno de los medios de cultivo, se realiza de manera diferente de acuerdo al fin que se persigue, el aislamiento de las bacterias de las muestras remitidas al laboratorio, se realiza casi siempre por sembrado en la superficie de una placa de agar en líneas paralelas por medio de un asa este procedimiento asegura la suficiente dilución, permitiendo el desarrollo de colonias aisladas que pueden emplearse para la obtención de “ cultivos puros”, en los que se puede realizar la identificación. A partir del inóculo se realizan una serie de estrías como lo muestra la Fig. 8., donde se explica el procedimiento para el sembrado de medio sólido en caja - 53 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas de Petri. Es indispensable que se emplee una técnica adecuada para la siembra ya que la mayor parte de estas colonias aisladas serán “cultivos puros”. - Con un asa esterilizada, se colocan dos asadas del material cerca del borde de la placa y se realiza una estría inicial - Se esteriliza es asa en la llama del mechero y se deja enfriar. - Después, se emplea el asa para distribuir la muestra en la placa en estrías, presionando ligeramente sin romper el agar. - Recordar que el asa de inoculación deberá esterilizarse cada entre cambio de estría utilizando la flama del mechero de Bunsen. - 54 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Fig. 8 Procedimiento para el “sembrado” en medio sólido. - A partir del extremo de la primera estría se realiza una segunda y así sucesivamente hasta completar las cuatro estrías. - Al concluir el sembrado en la placa, esterilizamos nuevamente el asa, evitando con esto, posibles contaminaciones a otros medios. - Aspecto final de la placa sembrada, utilizando la técnica descrita anteriormente. Las placas una vez inoculadas se incuban en posición invertida con los medios hacia arriba a 37 C y se examinan a intervalos de 24-48 horas. Después de que la placa ha sido incubada y para la obtención de cultivos puros, cualquier colonia bien aislada es removida con un asa, pero tal vez sea más conveniente emplear el asa recta sobre todo si las colonias están muy juntas. La colonia es suspendida en - 55 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas un medio líquido, o bien sembrada directamente en otra caja conteniendo algún medio específico dependiendo del agente que se sospeche. Para cierto tipo de muestras, por ejemplo, las de orina o sangre, se coloca una cantidad determinada de la muestra en una placa de Petri estéril y se vierta encima del agar derretido (enfriado a 50 C), luego se hace rotar la placa para mezclar minuciosamente el material con el medio. Una vez que se haya solidificado a temperatura ambiente de invierte la placa, se incuba a 37 y se examinan las colonias, esta técnica ofrece la ventaja de dar una determinación cuantitativa de las bacterias. Si las muestra están muy contaminadas, es necesario realizar una dilución. El resembrado de las colonias obtenidas en el aislamiento primario, asegura la purificación de las diversas cepas bacterianas y por lo tanto, la obtención de “ cultivos puros”. INOCULACIÓN DE TUBOS CON AGAR INCLINADO. Los cultivos en una superficie de agar inclinado, se realizan con frecuencia para mantener las cepas puras y para efectuar ciertos estudios bioquímicos. La inoculación, se realiza a partir de una colonia aislada, tomada de una placa con el asa, se traslada el inóculo a la superficie del medio que se siembra enteramente por estrías (Ver Fig. 9), a veces es necesario practicar una incisión en la superficie del agar, por ejemplo en el agar TSI para organismos entéricos, la incisión nunca llega hasta el fondo. La Fig. 10 nos muestra diferentes tipos de crecimiento sobre agar inclinado Fig. 9 “Sembrado” agar inclinado en - 56 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas 1.ARBORECENTE 2. DIFUSO 3. ESPINOSO 4. RIZOIDE 5.ARROSARIADO 6.- PILIFORME 1 2 3 4 5 6 Fig. 10 Diferentes tipos de crecimiento sobre agar inclinado INOCULACIÓN DE TUBOS CON MEDIO SÓLIDO HORIZONTAL. La inoculación de algún medio sólido presentado en tubo de ensayo con superficie horizontal, se realiza utilizando es asa recta. El método de sembrado consiste en quitar la tapa con el dedo meñique, flamear la boca del tubo e inocular por picadura evitando llegar hasta el fondo del medio ( Ver Fig. 11). Fig. 11 Inoculación de un medio sólido por picadura. - 57 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas INOCULACIÓN DE MEDIOS SEMISÓLIDOS. Los medios semisólidos se emplean para los estudios de movilidad (medio de SIM), carbohidratos (medio basal OF) o bioquímicos (gelatina) se inoculan utilizando un alambre recto, tratando de que la incisión no llegue al fondo del tubo. (Ver Fig. 12) Fig. 12 “Sembrado” por picadura de un medio semisólido - 58 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas INOCULACIÓN EN MEDIOS LÍQUIDOS La inoculación de los caldos de cultivo, se efectúa con asa recta, a partir de la muestra u otros cultivos, agitándola dentro del medio como lo muestra la Fig. 13. El crecimiento en estos medios se manifiesta de tres formas: 1. enturbiamiento, una opacidad más o menos densa 2. Formación de velo: pequeña masa de Fig. 13 “Sembrado en medios líquidos células que flota en la parte superior del cultivo, 3. Sedimento: deposito celular que permanece en la parte inferior del cultivo. MATERIAL: Medios de cultivo líquidos (Caldo nutritivo). Medios de cultivo sólido. Asa. Mechero. Cepas bacterianas. Portaobjetos. Juego de colorantes para la tinción de Gram. - 59 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PROCEDIMIENTO: 1. En tu mesa de trabajo encontrarás medios de cultivo líquidos, semisólidos y sólidos, los cuales inocularás según la técnica descrita anteriormente, según corresponde. 2. Espera la instrucción del profesor para saber que cepas inocularás en cada uno de los medios 3. Realiza la tinción de GRAM de cada cepa inoculada. 4. Marca perfectamente los tubos y cajas inoculadas para evitar confusiones con las demás. 5. Inocula los medios de cultivo (Todos) a 37 C en la estufa bacteriológica, durante 24 horas. 6. Después de las 24 horas, sacarás tus cultivos y los guardarás en el refrigerador, para utilizarlos en la siguiente práctica. CUESTIONARIO: 1. Menciona los calibres de las asas mas utilizados para el análisis bacteriológico cuantitativo. 2. Cuales son los diferentes tipos de sembrado de acuerdo al fin que se persigue. 3. Después de sembrar las placas que se debe realizar con ellas. 4. Como debe ser la inoculación de medios de cultivo semisólidos. 5. Como se puede manifestar el crecimiento de bacterias en los medios líquidos. CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en practica Puntualidad SI NO la - 60 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ______________________________________________________ - 61 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRACTICA No. 9 MORFOLOGÍA COLONIAL Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS. RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: • Definirá el concepto de colonia bacteriana • Describirá la morfología de diferentes colonias bacterianas y mencionará la utilidad diagnóstica que ésta representa. INTRODUCCIÓN: El estudio de la morfología de las colonias es de gran importancia debido a que gracias a ésta puede iniciarse una identificación preliminar de microorganismos aislados. Cuando una célula bacteriana prolifera sobre una superficie sólida, ésta da lugar a la formación de un acumulo de millones de bacterias que pueden observarse a simple vista y reciben el nombre de colonia Las colonias bacterianas presentan características morfológicas muy variadas, mismas que son constantes para cada especie de bacteria en idénticas condiciones de cultivo. Estas características pueden modificarse cuando factores tales como humedad relativa, medio de cultivo, temperatura y atmósfera de incubación varían. La descripción de las colonias bacterianas debe realizarse cuando éstas se encuentran separadas unas de otras en el medio de cultivo, tomando en cuenta las siguientes características: tamaño, color, superficie, borde, opacidad, elevación - 62 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas y estructura interna. La bacterianas en cuanto a Fig. 14 nos presenta el aspecto de las colonias su forma, borde y elevación (para más detalle clasificaremos posteriormente de acuerdo a estos criterios a las colonias bacterianas). Tamaño. El tamaño de una colonia bacteriana puede variar desde unos cuantos milímetros hasta varios centímetros. Los micoplasmas, por ejemplo, forman colonias tan pequeñas que para poder observarlas es preciso utilizar el microscopio estereoscópico. Estas colonias no aumentan su tamaño en forma significativa aún después de varios días de incubación. Por otra parte gérmenes como Brucella, E. coli y otros, forman colonias pequeñas cuando el cultivo es joven, pero aumentan considerablemente su tamaño cuando la incubación se prolonga. Existen casos extremos como en el caso de Mycobacterium paratuberculosis, donde debido a la baja velocidad de crecimiento las colonias no son visibles sino hasta después de varias semanas de incubación. Asimismo, existen algunas especies de los géneros Proteus, Bacillus y Clostridium que invaden todo el medio de cultivo dando el aspecto de una colonia única de varios centímetros de diámetro. - 63 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas A)Plana, B) Elevada, C) Convexa, D) Pulvinada, E) Umbilicada, F) Bajo la superficie Fig. 14 aspectos de colonias bacterianas en cuanto a su forma, borde y elevación. Color: Hay especies bacterianas capaces de sintetizar pigmentos muy diversos, los cuales son detectados fácilmente debido al color característico que le imparten a las colonias o por la difusión de dichos pigmentos en los medios de cultivo ( sólido y líquido) que no poseen colorantes o indicadores de pH. Algunos ejemplos de bacterias productores de pigmento son: 2. Pseudomonas aeruginosa: pigmento verde amarillento. 3. Micrococcus roseus: Pigmento rosa- anaranjado. 4. Serraría marcescens: pigmento anaranjado- rojo. 5. Staphylococcus equi: pigmento rosa. 6. Mycobacterium spp:pigmento amarillo- rojo . - 64 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas En el caso de las bacterias del género Mycobacterium, la producción de pigmento tiene un valor taxonómico. Las características de la superficie, borde, opacidad, elevación y estructura interna, están sujetas a la interpretación subjetiva del observador. Para describirlas es necesario el uso del microscopio estereoscópico, por lo que su valor descriptivo es menos relevante. De acuerdo a estos criterios, las colonias pueden clasificarse de la siguiente manera: Lisas Superficie Granular Estructura Mucoide interna Rugosas Filamentosa Translúcidas Opacidad Opacas Brillantes Enteras Onduladas Borde Lobuladas Umbilicadas Elevación Difusas Erizadas Planas Filamentosas Convexas - 65 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Otro dato útil en la identificación preliminar de colonias bacterianas es la producción de hemolisinas. Estas se ponen de manifiesto en medios de cultivo adicionados con sangre, donde la producción de hemolisinas conduce a la formación de un halo de lisis de eritrocitos alrededor de la colonia. Al hacer la identificación de las colonias bacterianas aisladas no siempre será necesario detallar todas las características morfológicas mencionadas, generalmente se toman en cuneta aquellas que son más relevantes. MATERIAL 1. Diferentes cultivos bacterianos ( trabajos en la práctica 7) 2. Asa 3. Mechero 4. Portaobjetos colorantes para la tinción de GRAM. PROCEDIMIENTO: 1. Realiza la descripción morfológica de las colonias que crecieron en el medio de cultivo sólido y elabora un cuadro de comparación de éstas características, el cual te permita hacer la diferenciación morfológica entre ellos. 2. Realiza la tinción de Gram, de una colonia de cada uno de los medios de cultivo que trabajaste y compara este resultado con el que hiciste en la práctica 7 (en cuanto a tinción de Gram se refiere). CUESTIONARIO 1. ¿Qué es un cultivo puro? 2. ¿Qué es un cultivo mixto? 3. Describe como obtienes un cultivo puro 4. Cual es la importancia de determinar la morfología colonial - 66 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ______________________________________________________ - 67 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRACTICA No. 10 METABOLISMO E IDENTIFICACIÓN BACTERIANA RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. INTRODUCCIÓN. El interés de la bacteriología médica se centra alrededor de la identificación de microorganismos aislados de muestras clínicas, con el fin de poder relacionarlos con grupos previamente clasificados. Para la identificación de las bacterias, el laboratorio de bacteriología necesita conocer las características físicas y metabólicas de las mismas. Dentro de las características físicas, se toman en cuenta: agrupación, reacción a la tinción de Gram y algunas otras particularidades estructurales que se pueden apreciar con tinciones específicas así como la morfología de las colonias observadas en placas de agar. Conocidas las características físicas de la bacteria, se analizan sus reacciones metabólicas tales como producción de enzimas, metabolitos intermedios, oxidación, oxidación y fermentación, entre otras. Esto se logra a través de pruebas estandarizadas que se elaboran a partir de preparados comerciales que son medios de cultivo conteniendo el compuesto sobre el cual las enzimas bacterianas actúan e indicadores que ponen de manifiesto la reacción que se llevó a cabo. Una vez determinadas estas características se deben consultar esquemas, cuadros o tablas de identificación, los cuales son variados, pero en todos los casos conducen de una manera ordenada al conocimiento del género y especie bacteriana que se desea identificar - 68 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas La tendencia actual es la de utilizar una serie de complementos tales como : pruebas biológicas, fagotipificación, análisis cromatográfico, serología. Nosotros nos auxiliaremos de las pruebas bioquímicas: A continuación se explicarán algunas de las pruebas más usadas en el laboratorio 1. ACIDO SULFHIDRICO. INDOL. MOVILIDAD. (S.I.M.) MEDIO: Semisólido en tubo y debe sembrarse por picadura con asa recta hasta que las 2/3 partes del medio queden inoculadas. La siembra en un solo tubo sirve para las 3 pruebas. PRINCIPIO. Este medio sirve para realizar tres pruebas a la vez que deben ser leídas y reportadas por separado, ejemplo: S.I.M. +/-/- indica: ácido sulfhídrico positivo, indol negativo y motilidad negativa. S.- Producción de ácido sulfhídrico: algunas bacterias son capaces de degradas la cistina y otros compuestos que contienen azufre, dando como resultado la formación de ácido sulfhídrico (H2S). Para la detección de dicho ácido el medio contiene sales de metales pesados (sulfato ferroso) que al combinarse con el ácido sulfhídrico forman respectivos sulfuros. RESULTADOS: Positivo. Formación de zonas negras. Negativo. El medio permanece del color inicial. I.- Producción de indol. Se trata de detectar la producción de indol a partir del triptofano del medio, por medio de la triptofanasa de la bacteria, que hidroliza dicho ácido. Para detectar la liberación del anillo indólico del triptofano, que es el único aminoácido que lo contiene, se agrega al medio después de la incubación, una o dos gotas del reactivo de Kovac’s, la reacción es inmediata. RESULTADOS: Positivo. El reactivo se torna rojo. Negativo. Cuando no hay cambio en el reactivo que es amarillo. M. Motilidad: la motilidad de las bacterias está dada por flagelos, misma que puede apreciarse por una sola picadura con asa recta en un medio semisólido como éste. - 69 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Algunas veces la producción excesiva apreciación de ácido sulfhídrico impide la de la motilidad, por lo tanto es necesario realizar una preparación húmeda a partir de un cultivo en caldo. RESULTADOS: Positivo. Se manifiesta por una zona nebulosa más allá de la línea de inoculación por picadura, se debe a la invasión del medio (dada a su baja concentración de agar) por las bacterias flageladas. Negativo. Solo se observa crecimiento en la línea de inoculación. INCUBACIÓN: De 24 a 48 horas a 37 C. 2.- UREASA. MEDIO. Urea que es medio de color amarillo muy claro, sólido inclinado en un tubo que se siembra por estría continua; contiene urea y rojo de fenol como indicador de pH, PRINCIPIO: Detectar la producción de ureasa por parte de la bacteria con el consiguiente desdoblamiento de la urea en amoniaco y nitrógeno. INCUBACIÓN: De 24 horas a siete días a 37 C. El citrato como única fuente de carbono y a la sal de amonio como fuente de nitrógeno. INCUBACIÓN: De 24 horas a siete días a 37 C. RESULTADOS: Positivo. Una marcada alcalinidad del medio debida a la producción de amoniaco (NH3), hace que el rojo de fenol se ponga de manifiesto con un intenso color rosa mexicano Negativo. El medio permanece con un color original. 3.- CITRATO. MEDIO: Citrato de Simmo’s. Es un medio de color verde oscuro de superficie inclinada en tubo. Se siembra por estría continúa en la superficie. Contiene citrato de sodio, una sal de amonio y un indicador de pH que es el azul de bromotimol. PRINCIPIO: Saber si la bacteria utiliza RESULTADOS: Positivo. Color azul en el medio (pH alcalino) Negativo. Permanece color original. - 70 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas 4.-CARBOHIDRATOS (azúcares) MEDIO: Es un medio líquido de color rojo se siembra por agitación del asa. Contiene solo uno de los carbohidratos ( solo el que desea probarse) que se mencionan después y un indicador de pH, el rojo de fenol. Los azúcares que pueden probarse son los siguientes: adonitol, arabinosa, celobiosa, dextrosa (glucosa), dulcitol, galactosa, glicerol, inositol, inulina, lactosa, fructosa, maltosa, manitol, manosa, rafinosa, rhamnosa (isoducitol), salicín, sorbitol. sucrosa, trealosa y xilosa. PRINCIPIO: Detectar si la bacteria problema es capaz de utilizar los carbohidratos con o sin producción de gas. Es necesario que el tubo ya inoculado se incuba con el tapón flojo. Si la bacteria utiliza el azúcar puede producirse ácidos y gas, en algunos casos solo se produce ácidos. INCUBACIÓN: De 24 horas a seis días a 37 C. RESULTADOS: Positivo. Esta indicado por un cambio de color del medio de rojo a amarillo. Se recomienda incubar un tubo testigo: es decir sin inocular, para verificar pequeñas variaciones en el color del medio. Negativo. El color del medio permanece sin variaciones. 5.- CATALASA. REACTIVO: Agua oxigenada (H2O2). PRINCIPIO: Detectar si la bacteria problema produce la catalasa, que es una enzima que desdobla el agua oxigenada (peróxido de hidrógeno) en agua y oxígeno libre, que se aprecia en el reactivo como formación de burbujas. TÉCNICA: en un portaobjetos limpio y seco se coloca una gota del reactivo y sobre ésta una asada de la colonia problema. RESULTADOS: Positivo. Está indicado por una efervescencia o burbujeo inmediatamente. Negativo. No hay formación de burbujas. - 71 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Nota: Cuando la colonia problema se encuentra cultivada en gelosa sangre, el asa no debe enfriarse en el espesor del medio, como se hace rutinariamente, ni debe tocar la superficie del agar ya que las células sanguíneas contenidas en la gelosa sangre, producen peroxidasas que pueden provocar reacciones positivas falsas. El siguiente diagrama puede ser utilizado como una guía general para la identificación de los principales géneros bacterianos de interés veterinario: CARACTERÍSTICAS PRUEBAS GENERALES PRIMARIAS GÉNERO Catalasa Staphylococcus Coagulasa, manitol, Micrococcus urea. Positivos. Aerobios - Streptococcus Bacillus (aerobio) + Bacilos y cocobacilos. Gram positivos Aerobios y anaerobios Esporas PRUEBAS COMPLEMENTARIAS + Cocos Gram ALGUNAS Clostridium (anaerobio) Listeria - Erysipelothrix O-F, pigmento, Utilización de carbohidratos; CAMPesculina, NaCl 6.5% Motilidad, hemolisis, pruebas biológicas, Análisis cromatográfico Catalasa, hemolisis, utilización de carbohidratos, H2S Corynebacterium - 72 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Bacilos y cocobacilos Oxidasa Moraxella Brucella + Bordetella Pasteurella Pseudomonas TSI, SIM, urea, citrato, reducción de nitratos, utilización de carbohidratos, H2S, fagotipificación Enterobacterias - Haemophilus Fusobacterium (anaerobio) TSI, SIM, urea, citrato, utilización de carbohidratos, requerimientos de factores X y Y Gram negativos. Aerobios y anaerobios Crecimiento +Actinomyces microaerobiosis, catalasa. Filamentos Gram positivos Crecimiento en anaerobiosis Bacilos ácido alcohol resistente Velocidad de crecimiento, morfología de colonias y producción de pigmento Espiroquetas y Vibrios Crecimiento en aerobiosis - Nocardia en Tinción de Kinyoun, hidrólisis de caseína, xantina y tirosina Síntesis de niacina, producción de Mycobacterium pirazinamidasa + Leptospira Treponema Campylobacter Micro aglutinación Crecimiento en micro aerobiosis, susceptibilidad a quimioterapéuticos, serología. - 73 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Síntesis de pared Formas “L” pleomórficas + formas “L” Micoplasma - Ureaplasma Acholeplasma celular en ausencia de antibióticos + Chlamydia Inclusiones citoplasmáticas basofílicas Bacterias Intracelulares - Riquetsias Según morfología y tinción de Gram, filtrabilidad (0.45 nm, Digitonina, urea, Inhibición de crecimiento y de metabolismo mediante antisueros específicos Producción de glucógeno, susceptibilidad a sulfas inmunofluorescencia Morfología microscópica, inmunofluorescencia MATERIAL: Diferentes pruebas bioquímicas Asa Mechero Estufa bacteriológica Portaobjetos. PROCEDIMIENTO. 1. En tu mesa de trabajo encontrarás diferentes pruebas bioquímicas. 2. Tu profesor te dará una explicación de cómo debes realizarlas 3. Anota tus resultados para identificar tu bacteria problema. CUESTIONARIO: 1. Cual es la importancia de sembrar las pruebas bioquímicas 2. Investiga el fundamento de las siguientes pruebas bioquímicas OF, TSI ( agar hierro triple azúcar), LIA, Gelatina nutritiva - 74 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_______________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________________________________________ - 75 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRÁCTICA No. 11 PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA A QUIMIOTERAPÉUTICOS RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: • El alumno realizará la prueba de difusión en agar según el método de Bauer et al. • Interpretará la susceptibilidad a los quimioterapéuticos mediante la observación de los halos de inhibición. INTRODUCCIÓN: Se piensa que los quimioterapéuticos actúan de forma similar en las en las infecciones; Sin embargo, existe diversidad tanto en los grupos de antibióticos y sus mecanismos de acción, como en los microorganismos causantes de infección y susceptibilidad a aquellos, así como también debe considerarse al individuo afectado y su estado inmunitario, sitio de infección de cronicidad y sensibilidad a la droga. Por esto es necesario realizar la prueba de susceptibilidad a los quimioterapéuticos para tratar adecuadamente un caso problema. El uso indiscriminado de los antimicrobianos ha originado la selección de cepas bacterianas multirresistentes, por lo que resulta difícil predecir la susceptibilidad con base en la sola experiencia clínica. Muchas cepas de microorganismos tradicionalmente sensibles a ciertos antibióticos, son ahora resistentes, principalmente debido a la amplia distribución de plásmidos de resistencia múltiple (plásmidos R). - 76 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas La susceptibilidad de microorganismos in vitro a los antimicrobianos puede medirse en el laboratorio, ya sea por pruebas de difusión en agar o de dilución en caldo. También puede efectuarse mediante pruebas químicas sensibles para pone de manifiesto algunas de las enzimas bacterianas como la penicilinasa que inactiva a las penicilinas. Las pruebas in vitro de susceptibilidad bacteriana por dilución en agar o en caldo son pruebas cuantitativas que permiten conocer la concentración mínima inhibitoria para un determinado microorganismo. En estas pruebas se hacen diluciones de un quimioterapéutico en un medio de cultivo apropiado al que se agrega una concentración constante de bacterias. Después de la incubación se determina la dilución máxima del quimioterapéutico en la que hay desarrollo bacteriano, correspondiendo la concentración del antibiótico en esta dilución a la concentración mínima inhibitoria o MIC (Minimal Inhibitory Concentration). Este resultado nos permite determinar la concentración necesaria del quimiterapéutico en los tejidos afectados y por tanto ofrece al clínico una base de objetividad de decisión terapéutica. Las pruebas de susceptibilidad bacteriana por el método de difusión en agar son pruebas cualitativas en las que se utilizan discos de papel impregnado con concentraciones conocidas de los diferentes quimioterapéuticos. Estos discos se colocan sobre la superficie de las cajas de agar previamente inoculadas con la cepa problema. Después de la incubación se observan halos de inhibición del desarrollo bacteriano alrededor de los discos con quimioterapéuticos a los cuales el microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la bacteria es resistente hay crecimiento alrededor del disco. Dentro de las pruebas de difusión en agar se encuentra el método de Bauer et a., en el cual, además de estandarizar el inóculo, se toma en cuenta el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano para determinar el grado de susceptibilidad del microorganismo (RESISTENTE, INTERMEDIO O SUSCEPTIBLE), por lo tanto la lectura del diámetro de inhibición del crecimiento en mm debe interpretarse de acuerdo a una tabla de referencia, ver figuras (15, - 77 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Fig. 15. técnica de difusión del disco en agar mostrando la zona de inhibición. Para poder evaluar epidemiológicamente este tipo de interpretación se tomaron en cuenta los valores de los MIC’S de cientos de cepas de cada especie bacteriana clínicamente importante en humanos. Estos valores fueron correlacionados con el diámetro de los halos de inhibición y con los niveles séricos alcanzados por cada droga a dosis terapéuticas, otro factor Sensible considerado fue la experiencia clínica obtenida durante muchos años en la terapéutica, otro factor considerado fue la experiencia clínica obtenida durante muchos años en la terapéutica antimicrobiana de infecciones bacterianas. En Medicina Veterinaria no existen métodos similares estandarizados para cada una de las especies animales por lo que la aplicación de los estándares establecidos por Bauer et al. deben interpretarse con cautela. El clínico debe estar consciente de las limitaciones de las pruebas de susceptibilidad in vitro y, por lo tanto el resultado del laboratorio deberá ser solo uno de los muchos criterios a considerar en la elección de un quimioterapéutico clínicamente útil. MATERIAL. Cultivo bacteriano en medio líquido. Hisopos estériles Medio de cultivo líquido - 78 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas Caja de agar Müeller Hinton (MH) Pipeta Pasteur Estándar de turbidez 0.5 de Mac Farland Tarjeta para comparación de turbidez Discos de papel filtro impregnados con quimioterapéuticos (“sensidiscos”) Pinzas Frasco con alcohol PROCEDIMIENTO. 1. En tu mesa de trabajo encontrarás un cultivo bacteriano en medio líquido. 2. Estandariza el inóculo agregando unas gotas del cultivo en el tubo que contiene medio líquido, hasta alcanzar una turbidez igual a la el tubo de 0.5 de Mac Farland. Compare la turbidez de ambos tubos auxiliándose con la tarjeta que te fue proporcionada para este fin. La suspensión estandarizada debe ser inoculada en la caja de agar antes de que transcurran 15 minutos, de lo contrario puede alterarse la cuenta bacteriana. 3. Sembrar el microorganismo de Müeller- Hinton usando un hisopo. 4. Humedecer el hisopo con la suspensión bacteriana, quitando el exceso del caldo presionándolo y girándolo sobre la pared interna del tubo por arriba del nivel del caldo. 5. Sembrar en tres direcciones para obtener un sembrado uniforme. Dejar reposar la placa de 2-5 minutos para que se seque el inóculo. 6. Flamea las pinzas en alcohol y con ellas coloca los sensidiscos. 7. Incuba las cajas de agar en posición invertida a 37 C y durante 24 horas Determina el patrón de sensibilidad y resistencia de la cepa observando los halos de inhibición alrededor de los sensidiscos - 79 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas CUESTIONARIO: 1.- Investiga cuales son los mecanismos, por los cuales las bacterias crean resistencia a los quimioterapéuticos. 2.- Solicita al auxiliar de laboratorio o a tu profesor la tabla quimioteréuticos para realizar de los la lectura correspondiente de los halos de inhibición. Interpreta y discute tus resultados. CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_____________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ - 80 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRACTICA No. 12 TOMA, ENVIO Y MANEJO DE MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO Y MICOLÓGICO. RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: El alumno aplicará los procedimientos generales para la toma, envío y manejo de muestras clínicas al laboratorio para el diagnóstico bacteriológico y micológico, mediante la colección de una muestra problema. INTRODUCCIÓN: La bacteriología y micología diagnóstica es el estudio de las muestras tomadas a partir de pacientes de los cuales se sospecha de una infección que involucre a estos agentes. El laboratorio puede apoyar al clínico de la siguiente manera: - Confirmar el diagnóstico presuntivo. - Sugiere la quimioterapia de la enfermedad. - Colabora en el conocimiento epidemiológico de las enfermedades. - Permite la elaboración de autobacterinas. Los resultados del examen bacteriológico y micológico, así como la rapidez con que éstos sean obtenidos, no dependen solo de los métodos de laboratorio empleados, sino también de la forma en que sean colectadas y enviadas las muestras clínicas. Dichos resultados pueden verse influenciados por la presencia de microorganismos que son parte de la microflora normal, por la migración bacteriana post-mortem o por la aplicación de antimicrobianos antes - 81 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas del envío de la muestra. El clínico debe tener en mente estos factores para realizar la interpretación de los resultados emitidos por el laboratorio. TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS. Los problemas más frecuentes para la identificación bacteriana y micológica en el laboratorio son: 3. Envío de muestras en condiciones inadecuadas (sangre hemolizada, suero turbio contaminado, orina de más de 4 horas, hisopos sin medio de transporte, muestras no refrigeradas). 4. Envío de muestras en condiciones inadecuadas (sangre hemolizada, suero turbio contaminado 5. Envío de muestras no representativas de la lesión en cuestión 6. Toma de muestras sin antisepsia. 7. Falta de una historia clínica completa y de un diagnóstico presuntivo. Por lo anterior, es indispensable que el clínico tenga un conocimiento sobre la correcta obtención y envío de muestras al laboratorio. A continuación se menciona algunas normas generales a considerar. 1.- Tomar la muestra del sitio anatómico más representativo del problema, de preferencia en la etapa aguda de la enfermedad. 2.- Las muestras obtenidas a partir de animales muertos deberán tomarse dentro de las primeras 3 horas de ocurrida la muerte o el sacrificio. 3.- Las muestras deben colocarse bajo estrictas condiciones de antisepsia (limpiar la piel con alcohol al 70 % y posteriormente iodo por un minuto). Tanto el material de colección como el recipiente en el que la muestra sea transportada deberán ser estériles. Este último preferentemente debe tener un tapón de rosca 4.- Los especimenes colectados no deben entrar en contacto con desinfectantes. 5.- Las muestras deben identificarse con los siguientes datos: especie, raza, edad, sexo, arete o nombre del animal a partir del cual fueron identificadas, - 82 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas así como dirección, teléfono y nombre del propietario del animal. (Etiqueta de identificación). 6.- Una vez colectadas las muestras deben enviarse dentro de las siguientes 424 horas al laboratorio en condiciones de refrigeración ( 4 C). Esto puede lograrse utilizando hielo o refrigerantes en cajas de poliuretano. 7.- Cuando sea necesario el uso de hisopos para la colección de las muestras hay peligro de desecación por ello estos deben enviarse en medios de transporte, que ayudan a la preservación de la bacteria pero no a la multiplicación. 8.- Debe anexarse una historia clínica, que incluya la hora de la muerte del animal, número de animales afectados, si el animal del que proviene la muestra fue tratado con antimicrobianos, cuales y durante cuanto tiempo y un diagnóstico presuntivo con base en signos clínicos y epidemiológicos. 9.- Es importante hacer notar que el manejo de las muestras clínicas deben realizarse con precaución debido a que algunos agentes involucrados en las enfermedades infecciosas de animales constituyen un riesgo de zoonosis para la salud del clínico y bacteriólogo. 10.- Si no son consideradas estas normas, el laboratorio podrá rechazar la muestra para el análisis bacteriológico y micológico. En las siguientes páginas aparecen las recomendaciones en forma de cuadros para la toma y envío de muestras, de acuerdo a las condiciones patológicas específicas. MATERIAL: - Será el que se requiera, en función a la muestra que se va a trabajar y será solicitado por el equipo de trabajo al profesor de laboratorio. PROCEDIMIENTO: 1.- De acuerdo a la información anterior, realiza correctamente tu toma de - 83 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas muestra según corresponda. 2.-Una vez tomada la muestra transpórtala al laboratorio para que puedas procesarla. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuándo tomar ese tipo de muestra? 2. ¿Cantidad de muestra a utilizar? 3. Materiales requeridos para la toma de muestra. 4. Técnica señalando paso a paso en la toma de la muestra 5. Cuidados que se deben guardar en la toma de la muestra para que ésta sea de calidad. 6. Medio o medios de transporte a utilizar para la muestra ( en caso necesario) 7. Cuidados a guardar en el envío de la muestra, 8. Microorganismos más frecuentes encontrados en la muestra. 9. Nombre de la enfermedad CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO - 84 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas OBSERVACIONES:__________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________________________________ RECOMENDACIONES:_____________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ - 85 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas RECOMENDACIONES PARA LA TOMA Y ENVIO DE MUESTRAS DE ACUERDO A CONDICIONES PATOLÓGICAS ESPECIFICAS CONDICIÓN TIPO DE MUESTRA Y CANTIDAD FORMA DE COLECCIÓN Y OBSERVACIONES PATOLÓGICA. RECOMENDA ENVIO -FETO COMPLETO O CONTENIDO FRASCOS. EL BOLSAS DE PLÁSTICO ENVIARSE HISOPOS CUANDO JERINGAS CLAMIDIASIS ABOMASAL (1 ML) -PULMÓN, BAZO, HÍGADO Y ABORTOS RIÑÓN FETAL. (6 CM POR LADO). FETO Y ÓRGANOS EN SE PUEDEN CONGELACIÓN. SOSPECHA ENVIAR DE HÍGADO -PLACENTA Y PLACENTOMAS MEDIO DE TRANSPORTE ESPECIAL. -SECRECIÓN VAGINAL (1 ML) ALIMENTO -LECHE (15 ML) AFLATOXICOSIS. EN CASO EN DE -ALIMENTO (100 G) ABSCESOS, -EXUDADO PURULENTO (1 ML) JERINGAS EN CASO DE GRANULOMAS GRANULOMAS -ABSCESO COMPLETO HISOPOS SOSPECHOSOS DE TUBERCULOSIS Y EXUDADOS -BIOPSIA FRASCOS DEBEN EXTREMARSE PRECAUCIONES. BOLSAS DE PLÁSTICO. ARTRITIS - LÍQUIDO SINOVIAL (1 ML) JERINGAS DESINFECTAR PIEL ANTES - ARTICULACIÓN COMPLETA. HISOPOS ARTROCENTESIS. DE BOLSAS DE PLÁSTICO. - 86 -Pag - LA Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas OBSERVACIONES CONDICIÓN TIPO DE MUESTRA Y CANTIDAD FORMA DE COLECCIÓN Y PATOLÓGICA. RECOMENDA ENVIO CLOSTRIDIASIS -MÚSCULO NECRÓTICO (10 CM FRASCOS ENVIAR RÁPIDAMENTE AL BOLSAS DE PLÁSTICO. LABORATORIO EN ATMÓSFERA INVASIVA (MIOSITIS NECRÓTICA, HEPATITIS POR LADO). -TEJIDO SUBCUTÁNEO ANAEROBIA. EN ESTE CASO NO ES EDEMATOSO (10 CM POR LADO). RECOMENDABLE LA REFRIGERACIÓN. -HÍGADO (10 CM POR LADO) NECRÓTICA). -INTESTINO SEGMENTO LIGADO ENTERO -ÓRGANOS AFECTADOS, DE INTESTINO TOXEMIA NÓDULOS LINFÁTICOS, EN FRASCO ENVIAR EN REFRIGERACIÓN. RIÑÓN, HÍGADO Y BAZO DERMATOFITOSIS -PELOS. FRASCOS NO ES NECESARIO QUE LOS -ESCAMAS. SOBRES DE RECIPIENTES ESTÉN ESTÉRILES. LAS PAPEL NUEVOS MUESTRAS DEBEN TOMARSE DE LA PORTAOBJETOS PERIFERIA DE LA LESIÓN. - 87 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas -ORINA (6 ML) CATÉTER, LAS INFECCIONES -RIÑÓN COMPLETO Ó 6 CM JERINGA, DENTRO DE LAS SIGUIENTES 2 HORAS URINARIAS POR LADO FRASCO ESTÉRIL. A SU COLECCIÓN. CONDICIÓN TIPO DE MUESTRA Y CANTIDAD FORMA DE COLECCIÓN Y OBSERVACIONES PATOLÓGICA. RECOMENDA ENVIO -INTESTINO SEGMENTO LIGADO EN GRANDES ESPECIES TOMAR LAS -HECES (1 G). DE INTESTINO HECES DIRECTAMENTE DEL RECTO Y -N. LINFÁTICOS MESENTÉRICOS. EN FRASCO ESTÉRIL, EN PEQUEÑAS ESPECIES CON HISOPO. -VESÍCULA BILIAR, FRASCOS, BOLSAS, EN CASO SOSPECHOSO A -ALIMENTO (100G) Y HISOPOS Y PARATUBERCULOSIS ENVIAR AGUA (100 ML). GUANTES DE PALPACIÓN RASPADO Y MUCOSA INTESTINAL. -EXUDADOS (1ML) HISOPOS, JERINGAS, SI SE SOSPECHA DE -LAVADOS PREPUCIALES O FRASCOS O BOLSAS DE CAMPILOBACTERIOSIS, INFECCIONES VAGINALES (10 ML) PLÁSTICO (EN EL CASO LEPTOSPIROSIS O MICOPLASMOSIS, GENITALES -ÓRGANOS: TESTÍCULO, DE LOS ÓRGANOS) LAS MUESTRAS DEBEN ENVIARSE DIARREAS MUESTRAS DEBEN ENVIARSE EPIDÍDIMO, ÚTERO ETC. DENTRO DE LAS SIGUIENTES 3 HORAS (COMPLETOS Ó 10 CM POR LADO) A SU COLECCIÓN Y EN REFRIGERACIÓN. - 88 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas _____________________________________ - 89 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas PRACTICA No. 13. SEGUIMIENTO BACTERIOLÓGICO PARA EL DIAGNÓSTICO EN UNA MUESTRA PROBLEMA. RESPONSABLE: PROFR. DE LA MATERIA No. DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA: 20 ALUMNOS En equipos de 3 a 4 alumnos. PROPOSITOS ESPECIFICOS: • El alumno investigará el procedimiento que le permitirá hacer el aislamiento e identificación de las bacterias presentes en su muestra. • El alumno aplicará los conocimientos adquiridos durante las diferentes sesiones de laboratorio y pondrá en práctica desde la toma de muestra hasta la identificación de bacterias presentes en su muestra problema y poder emitir el diagnóstico confirmativo de su muestra problema MATERIAL :El necesario, en función a la muestra que se va a trabajar y será solicitado por el equipo de trabajo al profesor de laboratorio. PROCEDIMIENTO: 1. Habrás notado que no existe una introducción en lo que respecta a esta práctica, por lo que realizarás una investigación sobre el procedimiento a seguir y poder identificar las bacterias que estén presentes en tu muestra problema. 2. Elabora un cronograma del procedimiento que seguirás, que incluya desde la toma de muestra hasta la susceptibilidad a quimioterapéuticos. - 90 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas 3. Presenta al profesor de la materia este cronograma, antes de empezar tu trabajo en el laboratorio. CRITERIOS DE EVALUACION: ACTITUD Participación en la practica Puntualidad Presentación (Bata blanca manga larga) Responsabilidad Buen manejo del equipo y material Buen lenguaje SI NO OBSERVACIONES:_______________________________________________ _______________________________________________________________ __________________________________________ RECOMENDACIONES:____________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ - 91 -Pag - Bacteriología y Micología Veterinaria - Prácticas BIBLIOGRAFÍA. 1. Difco: Manual de medios de cultivo y reactivos para microbiología 10ª. Ed. Laboratorio Difco, Michigan, USA. 2. García, T. R., Manual Ilustrado para Laboratorio de Bacteriología y Micología Veterinaria. Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura. México D. F. 1988. 3. López, A. J. Barajas, R. J. A.: Manual de Laboratorio para Bacteriología y Micología Veterinaria. Departamento de Bacteriología. FMVZ-UNAM. 1982. 4. Mac Faddin, J. F.: Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Médica Panamericana. México, D. F. 1984. 5. Miranda, M. R. E.: Material didáctico para Laboratorio de Bacteriología Y Micología. Departamento de Bacteriología. FMVZ_ UNAM. 1994. 6. Pérez; M, J. A.: procedimientos de Laboratorio para bacteriología y Micología Veterinarias. Departamento de Bacteriología. FMVZ_ UNAM. 1994. - 92 -Pag -