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Facultad de Medicina. Centro Universitario
de Investigaciones Biomédicas
ANÁLISIS DE LOS POLIMORFISMOS -675 4G/5G DEL GEN DE PAI-1 Y
C936T DEL GEN DE VEGF VINCULADOS AL SISTEMA RENINA
ANGIOTENSINA, EN CÁNCER CÉRVICOUTERINO EN UNA POBLACIÓN
DE COLIMA
Tesis que para obtener el grado de:
Maestro en Ciencias Médicas
Presenta:
Hugo Christian Ramos Flores
Médico Cirujano y Partero
Director de Tesis:
D. en C. Laura Leticia Valdez Velázquez
Asesor de Tesis:
D. en C. Luz Margarita Baltazar Rodríguez
Colima, Colima. Enero de 2011
APORTACIONES
Los resultados parciales de esta tesis fueron presentados en el siguiente congreso:
XXXV Congreso Nacional De Genética Humana. Organizado por la Asociación
Mexicana de Genética Humana, con fecha del 17 al 20 de noviembre, en el Centro de
Convenciones William O. Jenkins Puebla, Puebla
Se enviará a una revista indizada el manuscrito: Analysis of -675 4G/5G
polymorphism of PAI-1 gene, VEGF gene C936T and G-800A TGF β1 gene linked to
renin-angiotensin system in cervical cancer in a population of Colima, Mexico. Hugo
Ramos MD, Teresa Romero Q, Victor Montaño, Irma Enriquez MD, Jorge Delgado
MD, Roberto Chaparro MD, Joaquin Chávez, Verónica Rauda, Laura Valdez PhD. En
preparación.
AGRADECIMIENTOS
Agradecimiento al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca
otorgada para la realización de estudios de la Maestría en Ciencias Médicas con
número de registro CVU 292145. Gracias por haberme dado la oportunidad de ser
becario. Todo mi esfuerzo y conciencia social en retribución.
Agradecimiento a la Universidad de Colima, por haberme formado orgullosamente
en ella desde la preparatoria. “Hecho en casa”.
Agradecimiento al PROMEP, por haber apoyado con financiamiento para concluir
esta tesis. Clave: PTC120: “Asociación de polimorfismos génicos del Sistema Renina
Angiotensina en CaCu”
Agradecimiento a mis Asesores y Maestros, por haberme formado.
DEDICATORIA
Te agradezco Dios y Jesús por tu amor y tu fuerza.
A mi madre: Evangelina Flores, por su amor y apoyo incondicional. Sigo tu
ejemplo “mom”.
A mi padre: Hugo Ramos, por sus invaluables consejos. Siempre con palabras
de aliento. Gracias “papá”.
A mis hermanas, Jennifer Ramos y Nancy Ramos, a mi pequeña sobrina
Romina Orozco Ramos. A Fernando Orozco. Gracias “familia”.
A Perla Gutiérrez, gracias por tu amor, apoyo y confianza.
A mi Director de Tesis: Dra. Laura Valdez, gracias por la oportunidad y
confianza en mí para cursar la Maestría.
A mi Asesor de Tesis: Dra. Luz Baltazar, por su apoyo.
A la QFB. Teresa Romero. Por su gran apoyo en esta investigación.
Al Dr. Roberto Chaparro, por su apoyo.
Al Dr. Jorge Eduardo Delgado, por su participación para el logro del trabajo.
Al personal del Laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Regional
Universitario: la Dra. Gabriel Enríquez, y el Tec. Víctor Montaño por su invaluable
participación.
Al personal de enseñanza del Centro Estatal de Cancerología, por su aceptación
del trabajo.
A mis profesores de Seminario: Dr. Oscar Uribarren, Dr. Oscar Newton, Dr.
Miguel Huerta. Por su ayuda en las revisiones de esta tesis.
A mis compañeros del Laboratorio: Verónica Rauda, Joaquín Chávez, por su
ayuda y participación.
A mis amigos: Toño, Paul, Andy, Omar, Lalo, Pancho, Ericka, Sandra,
Christian, Ana, Ángel por su amistad.
Instituciones donde se realizó el proyecto:
Hospital Regional Universitario
Colima, Colima.
Centro Estatal de Cancerología
Colima, Colima.
Centro de Salud Urbano de Colima
Jurisdicción Sanitaria SILOS 1
Laboratorio de Productos Biológicos. Facultad de Ciencias Químicas.
Universidad de Colima
Coquimatlán, Colima.
ÍNDICE
1.- Resumen…………………...…………………..……….…………………………..…………...1
2.- Abstract……......………...……………………….…….…………………………..…………...2
3.- Introducción………….…...………………………..….…………………………..…………...3
4.- Marco teórico…………..………...………………………………………..…….…………..….4
4.1- Consideraciones generales.....…………………….………...…………….........…4
4.2.- Cáncer cervicouterino. Perfil y diagnóstico……………..………….............…4
4.3.- Factores genéticos relacionados con cáncer………………..…...……………..7
4.4.- Polimorfismos y su estudio……………….………..………………...……...…..7
4.5.-
Polimorfismos
relacionados
a
CaCu
y
con
el
sistema
renina
angiotensina……………………………………………………….…………………..…………….9
4.6.- Receptor 1 de la angiotensina II (AGTR1 o AT-1)…………….……………...10
4.7.- Factores relacionados (PAI-1 y VEGF)……………………...…….……………11
4.8.- Inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-1)…..……........……………12
4.9.- Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)…………..……….……..13
4.10.- Conocimiento actual referente……………………….…………..………..…..15
5.- Justificación……………..………………………………………………………….………….16
6.- Planteamiento del problema……………………………….……………………………..…18
6.1.- Pregunta de investigación……………………………..……..…….…...……..…18
7.- Objetivos…….…………………………………………………....…………………………....18
8.- Hipótesis………………..…………………………………….………………………………...19
9.- Material y métodos……..…..…………………………………….……………………….....20
9.1.- Tipo de estudio e investigación…………...………….……..….……..………..20
9.2.- Selección de la muestra………………………..……………………………….…20
9.3.- Variables y escalas de medición...…….…………….……..………..……....…21
9.4.- Metodología…………….…………………………………..….………………….….24
9.5.- Análisis estadístico……………………..……..……………………………….…..26
10.- Aspectos éticos…………………..………………………..……...…………..……………..28
11.- Resultados y discusión...……………………..……………………………………………29
12.- Conclusiones….….…...……………………..………...……………………………………44
13.- Perspectivas……….……………………………..……………………………………………44
14.- Referencias………….……….…………….………..………………...………….………....45
15.- Anexos...……………………………………………………..……………………………......55
15.1.- Instrumentos de recolección……………….…………..………….…………...56
15.2.- Carta de consentimiento informado………...…………..…………….....…..66
15.3.- Glosario…………………………….……………..………………………………...69
15.4.- Oficios……….……………………………………….……….……………………..73
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Clasificación del Cáncer Cervicouterino (CaCu)……….................……..…...5
Figura 2. Factores de Riesgo para CaCu……………….…………………........…………….6
Figura 3. Fases del Sistema Renina Angiotensina (SRA)…………………..…………….10
Figura 4. Efecto de AT-1 (receptor 1 de la angiotensina II)…………..……..………..…11
Figura 5. Estructura del gen que codifica al PAI-1……………………..……..………….13
Figura 6. Estructura del gen de VEGF…………………………………………..…………..14
Figura 7.- Diagrama de flujo de prueba piloto………………………………….……...…..24
Figura 8. Diagrama de flujo…………………………………...…………….……..……...…..25
Figura 9. Geles de poliacrilamida que representan ambos polimorfismos............…26
Figura 10. Muestras de ambos grupos…………….…………….…………………..………26
Figura 11. Frecuencias genéticas polimorfismo PAI-1 -675 4G/5G……………...…..34
Figura 12. Frecuencias genéticas polimorfismo VEGF C936T………………….……...37
Figura 13. Ejemplo de amplificado……………………...……….………………….…….….62
Figura 14. Oficio del Comité de Ética. HRU Colima……………….…………………..….73
Figura 15. Oficio de Aprobación. Lab. de Anatomía Patológica……….………...……..74
Figura 16. Oficio de Aprobación. Centro Estatal de Cancerología……….………....…75
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Variables…………...……………………..………………….………………………….21
Tablas 2.1 a 2.9. Estadística descriptiva variables clínicas controles……....…29 - 31
Tablas 3.1 a 3.4. Estadística descriptiva variables clínicas casos……...……….32 - 33
Tabla 4. Frecuencias genéticas polimorfismo PAI-1 -675 4G/5G……..……………….33
Tabla 5. Tabla de 2X2 para el polimorfismo PAI-1 -675 4G/5G……..…………………35
Tabla 6. Frecuencias genotípicas de PAI-1 -675 4G/5G en otras poblaciones……..36
Tabla 7. Frecuencias genéticas polimorfismo VEGF C936T…………………...........…36
Tabla 8. Tabla de 2X2 para el polimorfismo VEGF C936T.…………………...……...…38
Tabla 9. Frecuencias del polimorfismo VEGF C936T en dos poblaciones………...…38
Tabla 10. Frecuencias génicas de VEGF C936T en dos grupos…….…………..…...…39
Tabla 11. Frecuencias haplotípicas en controles y casos……………….……………….40
Tabla 12. Frecuencias observadas y esperadas de los haplotipos………….….…..….40
ABREVIATURAS
1.-CaCu.
Cáncer cérvicouterino
2.- SRA.
Sistema renina angiotensina
3.- NIC.
Neoplasia Intraepitelial Cervical
4.- VPH.
Virus del Papiloma Humano
5.-PAI-1.
Inhibidor del Activador del Plasminógeno 1
6.-VEGF.
Factor de Crecimiento Endotelial Vascular.
1.- RESUMEN
Ramos Flores HC, Baltazar Rodríguez LM, Valdez Velázquez LL.
INTRODUCCIÓN:
El cáncer cervicouterino (CaCu) representa un problema de salud pública. La
angiotensina II está involucrada en cáncer al fomentar la expresión del PAI-1 y del
VEGF.
OBJETIVO:
Investigar la asociación de los polimorfismos -675 4G/5G del gen de PAI-1 y
C936T del gen de VEGF en tejido cervical con cáncer cervicouterino y normal.
MATERIAL Y MÉTODOS:
Casos
y
controles:
100
mujeres
sanas
y
100
pacientes
con
CaCu,
determinándose el perfil génico por PCR-SSP.
RESULTADOS:
PAI-1 -675 4G/5G: Riesgo (OR) = 1.66: IC 0.90-3.07. VEGF C9356T. No
presentó significancia estadística (p<0.05). Análisis haplotipico: No presentó
significancia estadística (p<0.05).
CONCLUSIONES:
No se encontró asociación entre el polimorfismo
PAI-1 -675 4G/5G y el
polimorfismo VEGF C936T con el CaCu en una población de Colima.
1|Página
2.- ABSTRACT
HC Ramos Flores, Baltazar Rodriguez LM, Velazquez Valdez LL.
INTRODUCTION:
Cervical cancer (CaCu) is a public health problem. Angiotensin II is involved in
cancer by promoting the expression of PAI-1 and VEGF.
OBJECTIVE:
To investigate the association of the -675 4G/5G polymorphism of PAI-1 gene
and VEGF gene C936T in cervical tissue with cervical cancer and normal.
MATERIAL AND METHODS:
Cases and controls: 100 healthy women and 100 patients with uterine cervical
cancer, determining the genetic profile by PCR-SSP.
RESULTS:
PAI-1 -675 4G/5G: Risk (OR) = 1.66, CI 0.90-3.07. VEGF C9356T. Not
statistically significant (p <0.05). Haplotype analysis: not statistically significant (p
<0.05).
CONCLUSIONS:
No association between polymorphism PAI-1 -675 4G/5G and VEGF C936T
polymorphism with uterine cervical cancer in a population of Colima.
2|Página
3.- INTRODUCCIÓN
El
cáncer
es
un
trastorno
caracterizado
por
la
proliferación
celular
descontrolada debida a alteraciones en los genes relacionados con el ciclo celular,
ocurriendo tres procesos: inmortalización, transformación y metástasis; esta
enfermedad se encuentra entre las tres primeras causas de muerte en la población
mundial (Frías y cols., 2005).
El cáncer cervicouterino (CaCu) es una mutación celular de la unión escamo
columnar en el epitelio del cuello uterino, la cual inicia como una lesión (displasia)
que puede ser leve, moderada o severa, y evoluciona a carcinoma in situ y
posteriormente a cáncer invasor (Rodríguez y cols., 2006).
El CaCu es la segunda causa de muerte en la mujer en el mundo. El 80% de
los casos (500,000) corresponde a países en vías de desarrollo. La tasa de defunción
ajustada por edad en los Estados Unidos es de 2.4 por 100,000 habitantes
comparada con 14.0 por 100,000 habitantes en México (Castellanos, 2006). En
Colima, se registraron 49 casos de CaCu en el 2007. En cuanto a las defunciones,
se tuvo un registro de 32. (www.salud.col.gob.mx 2007). En el 2008, Colima
presentó 17 casos en el rango de edad 25 a 44 años, 8 de 45 a 49, 6 de 50 a 59, 6 de
65 y más, para un total de 37 casos. A nivel nacional, en el 2008 se reportaron 7628
casos nuevos de esta patología. (www.cenave.gob.mx 2010).
Existen algunos marcadores polimórficos vinculados en la ruta metabólica del
sistema renina angiotensina (SRA) que han sido asociados a cánceres orales, colon,
mama, entre otros. En el cáncer cervicouterino hay un solo reporte acerca de la
relación mencionada, este estudio es con relación a la expresión génica (Liao y cols.,
2007).
Esto es un motivo para abundar en el conocimiento genético del papel que
juega el sistema renina angiotensina en la fisiopatología del cáncer cervicouterino.
3|Página
4.- MARCO TEÓRICO
4.1.- CONSIDERACIONES GENERALES
La mucosa ectocervical está constituida por un epitelio plano, escamoso,
estratificado, no queratinizado que presenta una maduración ininterrumpida desde
las células basales a las más maduras y diferenciadas de la superficie. La
adquisición de un fenotipo invasivo que permite la diseminación de células
cancerosas representa hoy en día una de las principales causas de mortalidad en los
pacientes oncológicos (Tapia y cols., 1999). La capacidad metastásica del tumor es el
principal problema para su erradicación, y se asocia al 90% de las muertes por
cáncer (Frías y cols., 2005).
4.2.- CÁNCER CERVICOUTERINO. PERFIL Y DIAGNÓSTICO.
El cáncer cervicouterino (CaCu) se manifiesta inicialmente a través de lesiones
precursoras de lenta y progresiva evolución, producidas en etapas de displasia leve,
moderada y severa; evolucionan a cáncer in situ, en grado variable, cuando ésta se
circunscribe a la superficie epitelial, luego a microinvasor y posteriormente a invasor
cuando el compromiso traspasa la membrana basal (Ministerio de Salud, Chile,
2004).
MANIFESTACIONES CLÍNICAS. En el cáncer cervicouterino se presenta
hemorragia uterina anormal, secreciones vaginales, dolor pélvico o abdominal. La
lesión cervical puede ser visible a la inspección como tumor o ulceración. La
citología vaginal suele ser positiva, y debe confirmarse con biopsia. La tomografía
computarizada o la resonancia magnética de abdomen y de la pelvis examinados
bajo anestesia son útiles para la determinación de etapas, que son descritas en la
figura 1(Disaia y cols., 2002).
4|Página
CLASIFICACIÓN
Figura 1. Se muestran las etapas como se clasifica el CaCu (Disaia y cols., 2002).
PERFIL DE RIESGO. Es la mujer con edad de 25 a 64 años, con vida sexual
activa o antecedente de haber tenido vida sexual, que no se ha realizado estudios
previos de citología cervical y presenta cuadros repetitivos de infecciones
transmitidas sexualmente (NOM-014-SSA2-1994 CaCu).
FACTORES DE RIESGO. En un estudio de casos y controles en participantes
del Programa de Prevención y Control del Cáncer Cervicouterino en el estado de
Zacatecas, se identificaron los factores de riesgo para dicha patología, encontrando:
el número aumentado de gestaciones, de los partos, el inicio de las relaciones
sexuales en edad temprana y el uso de anticonceptivos hormonales (Castañeda y
cols., 1998) (ver figura 2).
Además, el virus de papiloma humano (VPH) es un importante factor de riesgo
en esta patología. El Dr. Harald Zur Hausen fue el primero en demostrar en 1975,
por medio de experimentos de hibridación, que las verrugas genitales y los tejidos de
cáncer de cérvix contienen genomas del virus del papiloma humano, de los subtipos
16 y 18 (López y cols., 2006).
El riesgo de contraer un VPH genital está influenciado por la actividad sexual,
por lo que el CaCu sigue un patrón típico de enfermedades transmitidas
5|Página
sexualmente. Con respecto a la promiscuidad, hay una fuerte asociación entre el
número de parejas que han tenido tanto la mujer como su compañero a lo largo de
su vida y la adquisición del VPH y por consecuente, un riesgo considerable para
padecer el cáncer en el cuello uterino (López y cols., 2006).
Figura 2. Tabla donde se exponen los factores de riesgo vinculados (Intervenciones de
enfermería para la prevención del cáncer cervicouterino, 2007).
DIAGNÓSTICO: Se requiere la presencia de células de aspecto maligno en el
estudio citológico, imágenes de apariencia maligna en la colposcopía y la
confirmación por el estudio histopatológico (NOM-014-SSA2-1994 CaCu).
El estudio citológico es descriptivo. Se informa de la siguiente manera:
a.- Negativo a cáncer.
b.- Negativo con proceso inflamatorio.
c.- Displasia leve (NIC 1).
d.- Displasia moderada (NIC 2).
e.- Displasia grave (NIC 3).
f.- Cáncer del cuello del útero in situ (NIC 3).
g.- Cáncer microinvasor e invasor.
h.- Adenocarcinoma.
i.- Maligno no especificado.
6|Página
Tomado
de
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/m014ssa24.html.
NOM-014-SSA2-1994, Para la prevención, detección, diagnóstico, tratamiento,
control y vigilancia epidemiológica del cáncer cérvico uterino.
4.3.- FACTORES GENÉTICOS RELACIONADOS CON CÁNCER
El conocimiento sobre la genética del cáncer se ha expandido, con implicancias
en la prevención, el estudio y el tratamiento de dicho trastorno. Definimos a una
mutación como el cambio en la secuencia usual del ADN de un gen particular y
puede tener efectos dañinos, beneficiosos o neutros; puede ser heredado como rasgo
autosómico dominante, recesivo, ligado al sexo, o ser espontáneo. Las mutaciones
comunes (polimorfismos) pueden favorecer a una predisposición al cáncer (Castillo,
2003).
La historia familiar puede identificar personas con un riesgo aumentado de
cáncer,
en
ellos
pueden
detectarse
polimorfismos
que
influencian
esta
susceptibilidad mediante diversos mecanismos como cambios en la tasa de
metabolización de procarcinógenos o catabolismo de carcinógenos, o efectos en la
reparación del ADN o en la regulación de la división celular (Castillo, 2003).
En algunos casos, exámenes de ADN pueden ser utilizados para confirmar una
mutación específica como causa de este riesgo heredado y permiten determinar qué
individuos portan la mutación (Castillo, 2003).
4.4.- POLIMORFISMOS Y SU ESTUDIO
Un polimorfismo se caracteriza porque diferentes individuos presentan distintos
nucleótidos en una posición concreta del genoma, que se denomina locus. A cada
posible variante se le denomina alelo. Si se trata de un SNP, o polimorfismo de
nucleótido simple, por sus siglas en inglés (es una variación en la secuencia de DNA
que afecta a un solo nucleótido), normalmente serán 2 los posibles alelos en un
locus: por ejemplo, el cambio de T por C (T > C). Si el locus corresponde a un
cromosoma autosómico (del 1 al 22), cada individuo es portador de 2 alelos, uno en
cada copia del cromosoma, que se heredan del padre y madre de manera
independiente. La pareja de alelos observada en un individuo se denomina genotipo
y, para el locus T > C del ejemplo, las 3 posibilidades de parejas de alelos son: TT,
7|Página
TC y CC. Los individuos con los 2 alelos idénticos, sean TT o CC, se denominan
homocigotos y los que tienen diferentes alelos (TC), heterocigotos. En general se
considera variante al alelo menos frecuente, pero esto puede diferir de una
población a otra (Iniesta y cols., 2005).
La mayoría de los polimorfismos son del tipo SNP, y son consecuencia de
variaciones en la secuencia de ADN que afectan a un solo nucleótido del genoma.
Los SNP’s constituyen cerca del 90% de las variaciones genéticas humanas y para
poder ser considerado un SNP, se debe dar la variación genética en al menos 1% de
la población mundial. Estas mutaciones pueden tener como resultado un aumento ó
disminución en la actividad proteínica, incluida la pérdida total de la actividad
(Iniesta y cols., 2005).
La descripción estadística de un polimorfismo consiste, en primer lugar, en
estimar la prevalencia en la población de cada alelo y de cada genotipo posible, lo
que en nomenclatura genética se denomina estimar las frecuencias alélicas y
genotípicas, respectivamente.
Las frecuencias genotípicas se estiman directamente calculando la proporción
de individuos con cada genotipo. Para estimar las frecuencias alélicas simplemente
se duplica la muestra tomando como unidad de observación el cromosoma (cada
individuo contribuye con 2 cromosomas) y se calcula la proporción de cada alelo.
Por ejemplo, si en una muestra de 200 individuos hay los siguientes genotipos: 110
TT, 75 TC y 15 CC. Las frecuencias genotípicas serán: 0.55 TT, 0.38 TC y 0.07 CC,
las frecuencias alélicas serán: 0.74 T y 0.26 C. 0.74 = [110(2)+75)/(2002)] (Iniesta y
cols., 2005).
Con frecuencia son varios los polimorfismos que se analizan simultáneamente.
En este caso, el desequilibrio de ligamiento es muy útil, pues permite localizar
polimorfismos relacionados con la enfermedad. Si aparece una mutación que genera
un polimorfismo responsable de la enfermedad, es posible que otros polimorfismos
cercanos también estén asociados con ella.
Para ello, se identifica el grupo de alelos que se transmiten conjuntamente en
cada cromosoma, de esta manera sería más fácil identificar el polimorfismo causal.
A este conjunto de alelos que se transmiten conjuntamente se le denomina
8|Página
haplotipo. Un individuo, para un conjunto de loci cercanos, posee 2 haplotipos, cada
uno en un cromosoma (Iniesta y cols., 2005).
Los polimorfismos pueden ser provocados por diversos mecanismos como:
mutaciones puntuales, eliminación de bases simples, adición de bases simples,
rearreglo de genes y eliminación del gen completo.
4.5.- POLIMORFISMOS RELACIONADOS A CaCu Y CON EL SISTEMA RENINA
ANGIOTENSINA
En investigaciones actuales, se ha mencionado el riesgo entre ser portador de
algún polimorfismo y el cáncer cervicouterino (Suárez y cols., 2002). Cabe destacar
que dentro de los marcadores moleculares del sistema conocido como renina
angiotensina (SRA), relacionados a cáncer cervicouterino, solamente existe una
publicación al respecto (Liao y cols., 2007). Definimos al SRA como una cascada
proteolítica,
en
el
que
la
renina
escinde
la
angiotensina
I
(AGTI)
del
angiotensinógeno. El AGTI es transformado a angiotensina II (AGTII) por la enzima
convertidora de angiotensina (ECA) (ver figura no. 1). La AGTII actúa uniéndose a los
receptores de AGTII tipo 1, 2 y 4 (AT1, AT2, AT4) (Oparil y cols., 2004). Muchos
tejidos, como vasos sanguíneos, riñón, corazón y cerebro son capaces de generar en
forma local AGTII a través de vías alternas a la ECA (Barrios y cols., 2002) (ver figura
3).
9|Página
Figura 3. Fases del Sistema Renina Angiotensina (SRA) (Santeliz y cols., 2008).
4.6.- RECEPTOR 1 DE LA ANGIOTENSINA II (AGTR1 Ó AT-1)
Es un receptor acoplado a proteína G. Su gen está ubicado en el brazo largo del
cromosoma 3 en 3q21-q25, es largo (45 kilobases), y contiene 5 exones. Este
receptor se localiza en las glándulas suprarrenales, el músculo liso vascular, el
riñón y el corazón. La estimulación del receptor AT-1 por la AGTII fomenta la
vasoconstricción y la contracción muscular e induce la expresión de otros factores,
como el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1), al aumentar la
transcripción del ácido ribonucleico mensajero (RNAm) del PAI-1, e induce la
expresión del ARNm del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), entre otros
(Santeliz y cols., 2008). (ver figura 4).
10 | P á g i n a
ANGIOTENSINA II
AT - 4
AT - 1
Expresión del
PAI -1
Factor de Crecimiento
Endotelial Vascular (VEGF)
Inhibición del
sistema
fibrinolítico
Aumenta la
expresión del
COX - 2
Angiogénesis
Remodelamiento
vascular
Tromboxano A2
Prostaglandinas
Figura 4. Efecto de AT-1 (receptor 1 de la angiotensina II) y AT-4 en la remodelación vascular, la
respuesta inflamatoria y fibrinolítica (Santeliz y cols., 2008).
Se ha considerado que la angiotensina II podría estar involucrada en la
regulación de la angiogénesis del tumor en algunos cánceres, como en el de mama,
el carcinoma de ovario, vía el AT-1, al activarlo en su unión (Herr y cols., 2008; Ino y
cols.,2006). Por ello, la terapia de bloqueo de este receptor se ha empezado a
considerar una estrategia prometedora en el tratamiento de los trastornos
oncológicos.
Se ha estudiado la expresión del receptor AT1 de AGTII en tejido y líneas
celulares de carcinoma cervical escamoso, encontrándose que la AGTII está
involucrada en su progresión, aumentando la actividad de la proliferación de células
cancerosas y causando un aumento de la angiogénesis en tumores (Liao y cols.,
2007).
4.7.- FACTORES RELACIONADOS (PAI-1 y VEGF)
Dentro de este sistema, se han estudiado factores relacionados a algunos tipos
de cáncer, entre ellos el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1) y el
11 | P á g i n a
factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y las posibles implicaciones de
ciertos polimorfismos. En el caso del PAI-1, una de estas mutaciones (-675 4G/5G)
eleva los niveles séricos de esta proteína (Eroglu y cols., 2006), sobreexpresándose.
En el caso del VEGF, otra de estas variantes (C936T) comprobó estar relacionada, al
encontrar los niveles séricos elevados en pacientes con patología inflamatoria
(Kamoun y cols., 2008), al haber esta elevación incrementaría también su expresión
en el organismo. Esto se efectúa tras la activación del receptor 1 de la angiotensina
II (AGTR1 ó AT-1). Se ha fundamentado que algunos elementos de este sistema
fomentan el desarrollo de células cancerosas mediante ciertos mecanismos
proliferativos.
4.8.- INHIBIDOR DEL ACTIVADOR DEL PLASMINÓGENO (PAI-1)
El gen del PAI-1 se localiza en la región q21.3-q22 del cromosoma 7, con 9
exones y 8 intrones. El PAI- 1 es un factor que bloquea la activación del
plasminógeno a plasmina. Ésta se produce por acción de los activadores del
plasminógeno (t-PA, urokinasa), inhibiendo la fibrinólisis, o disolución de coágulos
sanguíneos. Altos niveles de PAI-1 se han asociado con un mal pronóstico en
pacientes con cáncer (Almholt y cols., 2003).
PAI-1 Y CÁNCER. El incremento en la expresión del PAI-1 en pacientes con cáncer
está asociado con un resultado desfavorable, la razón de esta paradoja no está bien
comprendida (Laug y cols., 2001). Previamente se han reportado niveles elevados de
PAI-1 en algunos tipos de tumores primarios avanzados (neuroblastomas). Se ha
demostrado que el PAI-1 es expresado junto con el marcador angiogénico avB3,
presente en los vasos sanguíneos de los tumores citados, sugiriendo que PAI-1
desempeña un papel en la angiogénesis patológica (Laug y cols., 2001).
Para este factor, uno de los polimorfismos estudiados ha sido el PAI-1 -675
4G/5G, ubicado en la región promotora del gen que lo codifica (ver figura 5), se ha
sugerido que podría ser un factor que ayude a determinar el pronóstico clínico de los
pacientes con cáncer de mama en población caucásica (Lei y cols., 2008). Incluso, se
sugiere que este polimorfismo puede contribuir a una predisposición etiopatogénica
para el desarrollo de este cáncer en población asiática (Eroglu y cols., 2006).
12 | P á g i n a
En el cáncer oral, se ha analizado el PAI-1 -675 4G/5G, sugiriendo además que
el alelo 4G, eleva la expresión de PAI-1 y por consiguiente los niveles séricos de la
proteína, es un factor contribuyente en etapas tempranas de dicha carcinogénesis
(Vairaktaris y cols., 2006).
Un estudio referente al cáncer colorectal, consideró al PAI-1, relacionado a otro
polimorfismo (1334G/A). Los resultados sostienen que dicho polimorfismo puede
estar asociado con la incidencia de cáncer colorectal en población asiática (Smolarz
y cols., 2003).
Además, el polimorfismo -675 4G/5G en el promotor del gen fue determinado
en población mestiza y étnica del Occidente de México, La frecuencia alélica
reportada en literatura previa es de 33.4% para el alelo 4G (el cual es el asociado al
factor de riesgo), siendo la primera investigación en su tipo realizada en México, la
cual dio pie a posteriores estudios de asociación que determinen el impacto de este
polimorfismo (Nuño y cols., 2004).
Figura 5. Estructura del gen que codifica al PAI-1, y sitio del polimorfismo (Bosma y cols., 1998)
4.9.- FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF)
Es una glucoproteína homodimérica de 34-46 kiloDaltons (kDa). Su gen está
localizado en el cromosoma 6p21.3 y está organizado en 8 exones, separado por 7
intrones. Este factor actúa sobre las células endoteliales vasculares, contribuyendo
a su vez a la inducción de la angiogénesis por diversos mecanismos (Ferrara y cols.,
2003):
 Crecimiento, proliferación y migración de células endoteliales vasculares.
 Supervivencia de células endoteliales inmaduras (prevención de la apoptosis).
 Aumento de la permeabilidad vascular de los capilares
VEGF Y CÁNCER. En el caso del cáncer, se sabe que la sobreexpresión del
VEGF por las células tumorales estimula la angiogénesis que permite que el tumor
13 | P á g i n a
reciba nutrientes y se disemine escapando a los mecanismos de control del
organismo (Ferrara y cols., 2003). Conviene enfatizar que la angiotensina II puede
inducir la secreción de VEGF por la unión con el AGTR1, y causar el aumento de la
vascularización tumoral (Liao y cols., 2007).
Para el gen VEGF, uno de los polimorfismos estudiado es el C936T, ubicado en
la región 3´ no traducida (3´-UTR) del gen de VEGF (ver figura 6). Chae y cols.,
reportó en el 2008 que dicho polimorfismo puede estar asociado a la susceptibilidad
para padecer cáncer colorrectal. En otro estudio realizado en el mismo año por
Lurge y cols. en población asiática, reporta que el polimorfismo C936T está
relacionado con una recurrencia del tumor en cáncer colorectal, por lo tanto
sugieren que el análisis de los genes relacionados con estos polimorfismos puede
ayudar a identificar grupos de pacientes con alto riesgo de recurrencia del tumor.
Se ha sugerido además que el polimorfismo C936T puede ser determinante
genéticamente para cáncer de colon, en personas coreanas (Bae y cols., 2008), y en
un estudio Taiwanés, se sugirió que el alelo C936T está asociado con una invasión
de tipo vascular, sobre-expresando al VEGF, en carcinoma oral de células
escamosas (Cheng y cols., 2008).
Este polimorfismo (C936T del VEGF) tiene una frecuencia 16% (Kim y cols.,
2003) en población sana, dato documentado en un estudio realizado en población
asiática. El alelo considerado como factor de riesgo es el T.
Figura 6. Estructura del gen de VEGF, el cual muestra el sitio del polimorfismo C936T (Kim S y
cols., 2008)
14 | P á g i n a
4.10.- CONOCIMIENTO ACTUAL REFERENTE
De acuerdo a la revisión de la literatura, el concepto fisiopatológico de los
polimorfismos con el desarrollo del cáncer, está basado en la angiogénesis tumoral
por el incremento en sus expresiones. Si bien los mecanismos precisos y puntuales
son inciertos, los estudios que aquí se han mostrado avalan a estos polimorfismos
ya sea como marcadores pronósticos de la enfermedad, o bien asociados
directamente a ella, es decir, riesgo establecido al cáncer. Lo que es necesario
puntualizar, es que con respecto a lo expuesto, no se ha descrito hasta el momento
una relación directa entre la presencia de estos polimorfismos y el desarrollo del
cáncer cervicouterino, especialmente en nuestra población.
15 | P á g i n a
5.- JUSTIFICACIÓN
El cáncer cervicouterino representa un problema de salud pública. Dicho
cáncer se encuentra dentro de los primeros lugares de morbimortalidad nacional e
internacional (Greenlee y cols., 2001).
Existe un trabajo previo del 2007, que asocia este cáncer con la expresión del
receptor a la angiotensina II (Liao y cols., 2007), que refleja la progresión del
mismo. En relación con el cáncer cervicouterino, Santeliz y cols., 2008, nos señalan
algo interesante, basado en numerosos trabajos (Watanabe y cols., 2005, Tamarat
y cols., 2002, Page y cols., 1997, Nishimura y cols., 1997), que el receptor a la
angiotensina II aumenta la expresión del inhibidor del activador del plasminógeno
tipo 1 (PAI-1), al aumentar su transcripción del ARN mensajero, y aumenta además
la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEFG, factor implicado
en la angiogénesis).
Se ha estudiado la contribución del sistema renina angiotensina en la
producción de factores que fomentan la proliferación de las células tumorales de
diversos cánceres, mediante diversos mecanismos, como la angiogénesis de los
tumores. Dichos cánceres son el de mama, próstata, colon, ovárico, entre otros (en
población caucásica y asiática: Akihiko y cols., 2002; Almholt y cols., 2003; Bae y
cols., 2008; Chae y cols., 2008). Sin embargo, en cáncer cervicouterino los estudios
están en sus inicios, siendo una investigación realizada, ya mencionada en el
trabajo (Liao y cols., 2007), y fue desarrollada en población asiática, de
características genéticas más homogéneas, diferente al de la raza mestiza. Éste es
un término que se aplica a toda persona que comparte las ascendencias europea y
amerindia, sean cualquiera las proporciones de éstas, es característico de México
(González y cols., 2000). Por ende, se dificulta la aplicabilidad total de dicha
investigación, por la genética de poblaciones, debido a que la frecuencia de un
determinado polimorfismo suele variar en las diferentes razas humanas (Kim y
cols., 2003).
No existen investigaciones sistemáticas en México acerca de estudios de
frecuencias de polimorfismos, propios de la población de nuestro país. El conocer
con certeza la frecuencia de los polimorfismos propuestos en el trabajo, permitirá
hacer estudios exactos (si son frecuentes), en la búsqueda de asociaciones con
16 | P á g i n a
diversas patologías, aportando mayor información de las rutas moleculares de la
carcinogénesis.
Lo que se pretende demostrar con esta investigación es que, si se encontrara
elevada la frecuencia de los polimorfismos en el tejido con cáncer, se podría
establecer una asociación entre el ser portador de dicho polimorfismo, y padecer el
cáncer cervicouterino, en términos de una susceptibilidad a dicha malignidad.
El presente trabajo posee una importancia real al tener como objetivo
pacientes del Occidente de México. Recientemente se ha reportado la diversidad
genómica en las poblaciones mestizas mexicanas, por lo tanto, los hallazgos
genéticos pueden variar de una población a otra (Silva y cols., 2009).
Por último, se acentúa que los resultados de este estudio se aplicarían al
encontrar un polimorfismo genético o combinaciones de estos polimorfismos más
frecuentes en este trastorno, apoyando en la prevención, diagnóstico y pronóstico
del cáncer cervicouterino.
17 | P á g i n a
6.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En este trabajo nos planteamos determinar la posible asociación de los
marcadores polimórficos de genes implicados o relacionados funcionalmente en la
ruta molecular del sistema renina angiotensina, en el cáncer cervicouterino.
6.1.- PREGUNTA DE INVESTIGACION
¿Existe asociación de los polimorfismos -675 4G/5G del gen de PAI-1 y C936T
del gen de VEGF en la proliferación del cáncer cervicouterino?
7.- OBJETIVOS
GENERAL
∎Investigar la asociación de los marcadores polimórficos de PAI-1 -675 4G/5G y
VEGF C936T, relacionados en la ruta molecular del SRA en muestras de tejido con
cáncer cervicouterino y tejido negativo a cáncer.
ESPECÍFICOS
∎Determinar el perfil génico: frecuencias alélicas, frecuencias genotípicas,
frecuencias
fenotípicas
y
las
frecuencias
haplotípicas
de
los
marcadores
polimórficos -675 4G/5G del gen de PAI-1 y C936T del gen de VEGF en tejido con
cáncer cervicouterino y tejido normal.
∎Realizar las comparaciones del perfil génico y determinar la razón de momios
donde se haya encontrado diferencia estadísticamente significativa (p<0.05).
∎Evaluar la interacción entre genes relacionados al sistema renina angiotensina,
mediante la estimación de frecuencias haplotípicas bilocus y su significancia.
∎Estimar el desequilibrio de ligamiento entre los marcadores estudiados en cáncer
cervicouterino y población control.
18 | P á g i n a
8.- HIPÓTESIS
HIPÓTESIS CIENTÍFICA
Se conoce que el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1), y el
factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) participan en la ruta molecular
del sistema renina angiotensina (Santeliz y cols., 2008). Posiblemente, dos de los
polimorfismos reportados en sus genes (-675 4G/5G del gen de PAI-1, y el C936T
del gen de VEGF) estén asociados en cáncer cervicouterino.
Además,
se
ha
reportado
que
en
mujeres
asiáticas
con
cáncer
cervicouterino, la angiotensina II está involucrada en la progresión de esta
patología (Liao y cols., 2007), y se conoce que esta proteína participa en la
regulación de la expresión de los factores PAI-1 y VEGF (Santeliz y cols., 2008),
por lo tanto, por lo tanto nuestra hipótesis plantea que los dos polimorfismos
estudiados en este trabajo estén en asociación al cáncer cervicouterino.
HIPÓTESIS ALTERNA
Los marcadores polimórficos -675 4G/5G del gen de PAI-1 y C936T del gen
de VEGF, los cuales participan en la ruta molecular del sistema renina
angiotensina, están asociados con cáncer cervicouterino.
HIPÓTESIS NULA
Los marcadores polimórficos -675 4G/5G del gen de PAI-1 y C936T del gen
de VEGF, los cuales participan en la ruta molecular del sistema renina
angiotensina, no están asociados con cáncer cervicouterino.
19 | P á g i n a
9.- MATERIAL Y MÉTODOS
9.1.- TIPO DE ESTUDIO E INVESTIGACIÓN
El tipo de estudio: Casos y controles.
9.2.- SELECCIÓN DE LA MUESTRA
Universo de estudio: Constituido por dos grupos:
Grupo control: Criterios de selección:
 Inclusión: Muestras de citología cervical de mujeres residentes del Estado de
Colima que acudieron a los Departamentos de Ginecología de unidades del
sector salud, voluntarias sanas con citología cervical previa negativa a
cualquier displasia o malignidad (Anexo 2, apartados 15.2 y 15.4).
 Exclusión: Muestras de citología cervical de pacientes con alguna patología
cervical.
 Eliminación: ADN insuficiente en calidad y cantidad (Anexo 3).
Grupo de casos: Criterios de selección:
 Inclusión: Muestras de bloques de parafina del Departamento de Anatomía
Patológica del Hospital Regional Universitario (HRU) enviadas desde 2007, con
diagnóstico de CaCu, incluido el estadio de Neoplasia Intraepitelial Cervical
(NIC) Grado III (Apartado 15.4).
 Exclusión: Muestras de los bloques de parafina con otra patología.
 Eliminación: ADN insuficiente en cantidad y calidad (Anexo3).
9.3.- VARIABLES Y ESCALAS DE MEDICIÓN
Independiente: Presencia de cáncer y no cáncer cervicouterino.
Clasificación de la variable; escala de medición:
Cualitativa, nominal,
dicotómica.
Definición conceptual: Ausencia de cáncer fue representado por el resultado de
una citología cervical previa negativa a cualquier displasia o malignidad. Cáncer fue
representado por la presencia de células de la zona de transformación del cérvix,
que indiquen malignidad, confirmado por el estudio histopatológico.
20 | P á g i n a
Definición operacional: Para los controles: mujer con reporte negativo a cáncer
o a displasia. Para los casos: Mujer con diagnóstico histopatológico de cáncer
cérvico-uterino (incluyendo el estadio NIC 3 in situ, el carcinoma está ubicado en el
epitelio cervical, en algunos casos incluyendo todo el grosor del revestimiento
cervical), microinvasor o invasor.
Dependiente:
Genotipos (dos variables dependientes, una para cada polimorfismo): categórica
politómica (3 valores), (dos homocigotos y un heterocigoto).
PAI – 1
VEGF
Variable dependiente
Variable dependiente
4G / 4G
T/T
4G / 5G
T/C
5G / 5G (Festa y cols., 2003)
C / C (Kim y cols., 2003)
Tabla 1. Variables. Los alelos en negrita indican el alelo que está asociado a la enfermedad (es
el polimorfismo)
Clasificación de la variable; escala de medición: Cualitativa, nominal.
Definición Conceptual: Genotipo: El código genético heredado de un organismo
para un rasgo específico. Puede ser homocigoto o bien heterocigoto (Iniesta y cols.,
2005).
Definición operacional: Se realizó la determinación de los marcadores
polimórficos, y se agrupó en el genotipo que resultara. Son tres las opciones (1
heterocigoto y 2 homocigotos). El polimorfismo lo identificamos de la siguiente
manera: en PAI-1 -675 4G/5G, las muestras que tuvieron el alelo 4G, presentaron el
polimorfismo. Si son heterocigotos, tuvieron 1 alelo que es el polimorfismo: 4G/5G.
Si son homocigotos, tuvieron 2 alelos que son el polimorfismo: 4G/4G. Ambas
muestras se incluyeron en la asociación, pero una con el 50% de genotipo y la otra
con el 100%. Para el VEGF C936T, el alelo que es el polimorfismo es el T.
El análisis equivalente que es correcto en estudios de polimorfismos es el
modelo aditivo de genotipos (Iniesta y cols., 2005).
21 | P á g i n a
TAMAÑO MUESTRAL
Para este estudio, el tamaño de muestra fue reservado al resultado del estudio
piloto que fue realizado para determinar la frecuencia de los polimorfismos en
ambas poblaciones y realizar la comparación correspondiente. Dicho estudio
comprende 100 casos, es decir, se analizaron 100 muestras, por cada marcador,
y así se estableció el tamaño muestral. Este análisis fue realizado con el programa
Epi Info Version 6 Statcalc, con base en la frecuencia del polimorfismo en población
sana:
1. Frecuencia del polimorfismo -675 4G/5G del PAI-1: 18% (Dato de nuestros
resultados).
2. Frecuencia del polimorfismo C936T del VEGF: 30% (Dato de nuestros
resultados)
De esta manera, se obtuvo el valor que hace falta para poder determinar el tamaño,
pues ya se contaba con los demás datos (Pértegas y cols., 2001):
 Confianza: 95%. α=0.05. (1- α)
Poder: 80%. β=0.2.
(1- β)
 Relación entre pacientes sanos y enfermos: 1: 1
 Frecuencia de exposición en el grupo de sanos: 18% y 16%. p2= 0.18 (PAI-1 675 4G/5G) y p2=0.30 (VEGF C936T)
 Odds Ratio (OR) = w: la cual se desconoce, el programa solicita su valor o bien
el de la frecuencia en enfermos, que es el que se obtuvo.
o Frecuencia de exposición entre los casos: Es la que fue obtenida (22.5%,
38.5%) (p1).
o La frecuencia de la exposición en los controles p2, ya es conocida.
Ambas frecuencias fueron necesarias para obtener el valor de p. (Anexo 6)
EXPLICACIÓN DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA
El argumento en el cual nos hemos basado para la determinación del tamaño
de la muestra es el siguiente: la literatura reporta un número de 100 muestras para
un estudio piloto (Riegelman y cols., 1999). De esta manera, tipificamos 100
muestras de ambos grupos, y las cotejamos, con base en la frecuencia de los alelos
enfermos en controles y en casos. Si el polimorfismo es muy frecuente, el tamaño de
la muestra disminuye, y viceversa. De acuerdo a lo que obtuvimos con el
22 | P á g i n a
polimorfismo PAI-1 -675 4G/5G, se cotejaron 18% vs 22.5%, y el resultado fue 99
muestras por grupo. Y con el polimorfismo VEGF C936T, se cotejaron 30% vs
38.5%, y el resultado fue de 61 muestras por grupo. Así, se pudo hacer la búsqueda
de la asociación con pruebas 2 con las muestras que ya se tenían tipificadas. A
pesar de superar el número mínimo requerido, se incluyeron las 100 muestras de
cada grupo para su análisis.
Si la frecuencia del alelo hubiera sido mayor (32, 35 % etc.), el tamaño
solicitado hubiera disminuido, y viceversa.
Este estudio, está realizado en una sola población, originaria del estado de
Colima. La configuración genética en otras poblaciones de nuestro país pudiera no
ser la misma que la que se obtuvo en esta investigación.
23 | P á g i n a
9.4.- METODOLOGÍA
DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA PUEBA PILOTO DE LOS CASOS
CASOS (100)
Desparafinación*
Cuantificación
Espectrofotométrica
260/280 nm
Extracción de ADN
Método de Fenol –
Cloroformo
(Anexo 3)
Determinación de
pureza e integridad
Tipificación por PCR de los polimorfismos:
PAI-1 (-675 4G/5G) y C936T (VEGF) por PCR
SSP (alelo de secuencia específica).
(Anexo 4)
Electroforesis con gel de acrilamida al 6%
Tinción con plata
Interpretación y análisis estadístico de la frecuencia
observada para poder hacer el cálculo del tamaño muestral
Figura 7.- Diagrama de flujo de prueba piloto.
*Jiménez y cols., 2007
Se procedió a tipificar las muestras del grupo controles, para realizar la
comparación de las frecuencias con el dato de nuestra población y no de otra,
resultando el diagrama de flujo final de la siguiente manera:
24 | P á g i n a
DIAGRAMA DE FLUJO PARA EL TRABAJO
CONTROLES (100)
CASOS (100)
Muestras celulares (negativas
a cáncer) obtenidas con
citocepillo.
Muestras tisulares (bloques
parafinados) positivas a cáncer.
Se sometieron a
desparafinación.
Cuantificación
Espectrofotométrica
260/280 nm
Extracción de ADN
Método de Fenol –
Cloroformo.
(Anexo 3)
Determinación de
pureza e integridad
Tipificación por PCR de los polimorfismos:
PAI-1 (-675 4G/5G) y C936T (VEGF) por PCR
SSP (alelo de secuencia específica).
(Anexo 4)
Electroforesis con gel de acrilamida al 6%
Tinción con plata
Interpretación y análisis estadístico
Figura 8. Diagrama de flujo.
25 | P á g i n a
EJEMPLOS DE LOS CORRIMIENTOS ELECTROFORÉTICOS
Figura 9. A la izquierda, se muestra un gel en poliacrilamida con 5 controles para el
polimorfismo PAI-1 -675 4G/5G. Se aprecian ambos fragmentos (136 y 257 pb) en la muestra 1. Las
muestras 2 al 5 no presentan el alelo 4G (asociado a la enfermedad). A la derecha: polimorfismo
VEGF C936T. Carril 1 con marcador de 100 pares de bases. Carriles 2 y 4 muestras con fragmento
control (1 banda: 257 pb). Muestras 5, 6 y 7 con alelo T (2 bandas: 141 y 257 pb). Muestras 3 y 8 son
controles negativos.
REPRESENTACIÓN GRÁFICA DEL MUESTREO
Figura 10. Muestreo en ambos grupos
26 | P á g i n a
En relación con las pacientes controles, se realizó el muestreo de 100 mujeres
sanas con citología cervical previa negativa a cualquier displasia o malignidad, de
las cuales se hizo la extracción de ADN correspondiente y una posterior dilución del
mismo y almacenaje de la muestra madre en congelación a -80 grados centígrados.
En relación con el grupo casos, se realizó un muestreo con 100 bloques de
parafina, de las cuales se hizo el proceso de desparafinación correspondiente, y la
posterior extracción de ADN del tejido.
9.5.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se contrastó la hipótesis de asociación mediante el test de x2 con una tabla de
contingencia. Para calcular la magnitud de la asociación en caso de presentarse se
calculó la odds ratio.
Las distribuciones alélicas fueron comparadas con el Equilibrio de HardyWeinberg mediante pruebas exactas y 2 (chi cuadrada). Las comparaciones entre
distribuciones alélica, genotípicas y fenotípicas intergrupales (grupo, CaCu y control)
se realizaron mediante pruebas 2 y exactas. El cálculo de Odds ratio (razón de
momios) se realizó para ambos marcadores polimórficos una vez determinando el
valor de p (significativa cuando fue menor a 0.05).
El análisis haplotipico bilocus para ver interacción génica y el de desequilibrio
de
ligamiento,
se
realizó
http://anthro.unige.ch/arlequin,
mediante
basado
en
el
el
programa
método
Arlequin.
de
algoritmo
3.1,
de
maximización de expectaciones (EM). Las comparaciones de los haplotipos se realizó
mediante pruebas exactas y 2. El desequilibrio de ligamiento (DL) se estimó por par
de loci.
27 | P á g i n a
10.- ASPECTOS ÉTICOS
Para las muestras tisulares parafinadas, se procedió con la Reglamentación
correspondiente del Hospital Regional Universitario (trámite de autorizaciones), así
como del Departamento de Enseñanza y el Laboratorio de Anatomía Patológica para
el empleo de los bloques parafinados.
Para la toma de muestras del grupo control se trabajó con cada participante,
sólo bajo su consentimiento informado, proporcionando la libertad para abandonar
el estudio si así lo dispusiera, de conformidad con la Declaración de Helsinki, con la
aceptación por parte del investigador de cumplir con las recomendaciones éticas, así
como por el Reglamento para investigación en Materia de Salud de la Ley General de
Salud, SSA.
De acuerdo a todo lo anterior se clasificó como un estudio con riesgo mínimo.
28 | P á g i n a
11.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
VARIABLES CLÍNICAS VINCULADAS AL CÁNCER CERVICOUTERINO EN AMBOS
GRUPOS
Las siguientes tablas (2.1 a 2.9), muestran la estadística descriptiva de las
variables clínicas más importantes que presentaron las pacientes del grupo
controles en el interrogatorio. Se exponen las frecuencias y el porcentaje acumulado:
Tabla 2.1.- Media y desviación típica de las pacientes controles.
Edad al
Edad
IVSA*
tener el
Menarca
Menopausia
# Cigarros
Edad
fumados
inicio de
al día
fumar
primer hijo
Mujeres con la
variable positiva
Media
Desviación
estándar
100
100
88
100
15
16
16
37.00
18.97
20.31
12.88
47.67
3.19
25.63
14.41
5.29
5.23
1.88
4.30
2.25
12.29
Tabla 2.2. Número de parejas sexuales en su vida en pacientes controles.
Número de parejas sexuales
Frecuencia
0
2
1
57
2
20
3
13
4
4
5
1
6
1
Tabla 2.3. Antecedente familiar de CaCu en pacientes controles.
Familiar
Frecuencia
Madre
6
Abuela materna
3
Tía materna
2
Otra
1
Otro tipo de cáncer
10
Ninguno
78
Total
100
29 | P á g i n a
Tabla 2.4. Pacientes con padecimientos en grupo controles.
Padecimientos
Frecuencia
Diabetes mellitus 2
1
Hiperlipidemia
2
Osteoartritis
1
Hipertensión arterial
5
Asma
1
Hipertensión y diabetes
2
Ninguna
88
Total
100
Tabla 2.5. Uso de anticonceptivos en grupo controles
Método
Frecuencia
Hormonales
26
DIU
23
Condón
5
Quirúrgico
19
Ninguno
27
Total
100
Tabla 2.6. Enfermedades de transmisión sexual en grupo controles.
Trastorno
Frecuencia
Candidiasis
2
Tricomoniasis
1
Gardnerella
1
Ninguna
96
Total
100
Tabla 2.7. Variable fuma en grupo controles.
Frecuencia
Si
16
No
84
Total
100
30 | P á g i n a
Tabla 2.8. Número de cigarros fumados por día en grupo controles.
Cigarros
Frecuencia
1
4
2
2
3
5
4
2
5
2
10
1
Total
16
No fumadoras
84
Tabla 2.9. Fumadoras pasivas en grupo controles.
Frecuencia
Si
31
No
69
Total
100
DISCUSIÓN (DESCRIPCIÓN DE LAS TABLAS): Los resultados muestran que el
grupo control si bien se encontraba en un riesgo por la presencia importante de las
variables clínicas relacionadas con el cáncer, éstas no fueron tan incidentes. El
inicio de vida sexual activa se promedió cercano a los 19 años. La mayoría de las
pacientes presentaron una sola pareja sexual en toda su vida. Casi el 80% de las
pacientes no han tenido familiares con CaCu. En ningún caso se tuvo una paciente
infectada con el VPH, y sólo 16 pacientes presentaron el tabaquismo como hábito.
En contraste, sólo 5 pacientes han empleado el condón como método anticonceptivo,
y por ende, preventivo de infecciones. Las demás tablas complementan la
información.
A continuación se expone la estadística descriptiva de las variables clínicas
(tablas 3.1 a 3.4) que presentaron las pacientes del grupo casos tras el diagnóstico
de cáncer cervicouterino. Se muestran las frecuencias y el porcentaje acumulado:
31 | P á g i n a
Tabla 3.1. Diagnóstico de cáncer en grupo casos.
Frecuencia
NIC 3
54
Carcinoma epidermoide invasor
43
Adenocarcinoma
3
Total
100
Tabla 3.2. Enfermedades asociadas en grupo casos.
Frecuencia
Ningún padecimiento agregado
94
VPH
6
Total
100
Tabla 3.3. Número de cápsulas en histopatología en grupo casos.
Frecuencia
1
68
2
2
3
3
4
6
5
7
6
4
7
1
8
2
9
1
10
2
12
1
13
1
14
1
18
1
Total
100
32 | P á g i n a
Tabla 3.4. Características del cáncer en grupo de casos.
Frecuencia
Extensión glandular
17
Sin extensión glandular
71
No queratinizante
6
No queratinizante con extensión glandular
5
Extensión vascular
1
Total
100
DISCUSIÓN (DESCRIPCIÓN DE LAS TABLAS): Los resultados muestran que el
diagnóstico de cáncer predominante en el grupo de casos fue la neoplasia
intracervical grado 3, con más de la mitad de las pacientes. En este grupo se
presentaron 6 pacientes con el diagnóstico de VPH. En cuanto a variables de
histopatología, la mayoría de los tejidos (68 muestras) se almacenaron en una sola
cápsula, y se encontró la ausencia de extensión vascular como característica
predominante en cáncer, con 71 muestras.
Para enfatizar el análisis estadístico, una perspectiva fue realizar un análisis
estratificado para descartar algún factor de confusión con estas variables
posiblemente intervinientes. Sin embargo, como ninguna variable fue compartida en
ambos grupos, fue prescindible su realización.
RESULTADOS. POLIMORFISMO PAI-1 -675 4G/5G
En el siguiente cuadro se exponen los resultados totales de los genotipos para
este factor:
Locus
PAI-1
-675
4G/5G
Grupo
Genotipo
Alelo
4G/4G 4G/5G 5G/5G
Fenotipo
4G
5G
4G
5G
33
67
Controles
3
30
67
36
164
(N=100)
(3%)
(30%)
(67%)
(18%)
(82%)
Casos
0
45
55
45
155
(N=100)
(0%)
(45%)
(55%)
(22.5%)
(33%) (67%)
45
55
(77.5%) (45%) (55%)
Tabla 4. Frecuencias genéticas polimorfismo PAI-1 -675 4G/5G.
33 | P á g i n a
Se realizó la prueba del Equilibrio de Hardy Weinberg. Los hallazgos son los
siguientes:
n=100
(3;30;67). p = 1.0000… Chi cuadrada = 0.0264. Indica que nuestra
población control no está en desequilibrio de ligamiento y puede ser comparada con
la población de casos.
Al realizar las comparaciones intergrupales estos fueron los resultados:
1.- Comparación de genotipos entre controles y casos: p = 0.015
2.- Comparación de frecuencias alélicas: p = 0.594
3.- Comparación de fenotipos: p = 0.102
En la siguiente gráfica se exponen las frecuencias genotípicas, alélicas y
fenotípicas para este polimorfismo:
Figura 11. Frecuencias genéticas polimorfismo PAI-1 -675 4G/5G
34 | P á g i n a
Se construyó el siguiente cuadro:
Enfermedad
+
Polimorfismo +
-
45
55
33
67
Tabla 5. Tabla de 2X2 para el polimorfismo PAI-1 -675 4G/5G.
Resultados: Odds ratio de 1.66. (IC 0.90 – 3.07).
DISCUSIÓN:
ASOCIACIÓN DE GENOTIPOS DE PAI-1 CON CÁNCER
Se tomó como referencia un estudio realizado en la ciudad de Guadalajara
Jalisco, donde la frecuencia de este polimorfismo en población sana fue de 30%
(Nuño y cols., 2004). Cabe destacar que nuestro hallazgo del 18% en este tipo de
población fue menor al reportado en la referencia, a pesar de que ambos grupos de
estudio son originarios del Occidente de México.
En nuestra investigación no se encontró relación entre el polimorfismo -675
4G/5G y el cáncer cervicouterino en la población estudiada, de manera aislada. Sin
embargo la literatura actual demuestra datos de interés.
Se ha demostrado, que el PAI-1 es un factor que juega un papel en el cáncer
por medio de la angiogénesis, ya que es coexpresado con marcadores angiogénicos
de tipo integrinas. Este efecto se ha visto en neoplasias del sistema nervioso central
(Isogai y cols., 2001) como el neuroblastoma.
Ya se ha documentado el efecto sistémico que posee el polimorfismo -675
4G/5G: elevar los niveles séricos de la proteína PAI-1. (Eroglu y cols. 2006).
Posiblemente, éste sea el mecanismo por el cual se le ha vinculado asociación con
otros tipos de cáncer, como el de mama (Lei y cols., 2008), al estar incrementada su
expresión y por tanto su vinculación angiogénica, que le permitiría al tumor su
expansión.
35 | P á g i n a
De hecho, el genotipo 5G, se le ha vinculado como factor de protección en
diversos trastornos, como la diabetes mellitus postrasplante y la diabetes
gestacional (Chang y cols., 2010) en población asiática.
La influencia de este marcador está muy vinculada en la enfermedad de
ovarios poliquísticos, mediante la hipofibrinólisis, siendo esto un factor de riesgo
muy importante (Lin y cols., 2009).
A continuación se exponen frecuencias genotípicas reportadas en otras
poblaciones de este polimorfismo (Festa y cols., 2003):
Caucásicos no hispanos
28%
47%
25%
4G/4G
4G/5G
5G/5G
Hispanos
15%
47%
38%
Negros
9%
39%
52%
Tabla 6. Frecuencias genotípicas de PAI-1 -675 4G/5G en otras poblaciones.
Los resultados contrastan bastante con los nuestros, ya que el genotipo
4G/4G fue encontrado con una frecuencia de 3%, y el genotipo 5G/5G, fue
encontrado con una frecuencia de 67%. Esto podría deberse a la gran diversidad
genética que caracteriza a nuestro país (Silva y cols., 2009).
Por último, una posible hipótesis acerca de la no asociación en nuestro
estudio, es el tipo de tejido que está originando el tumor. En el caso del cáncer
cervicouterino, es de tipo epitelial, y la participación del polimorfismo ha sido
reportada con mayor fuerza cuando el tumor proviene de tejido nervioso (Isogai y
cols., 2001) o bien cuando está vinculado con el endotelio (Adamski y cols., 2009).
Es evidente que será necesario realizar estudios prospectivos al respecto.
RESULTADOS. POLIMORFISMO C936T DEL GEN DE VEGF:
El siguiente cuadro muestra los genotipos para este factor:
Locus
Grupo
Genotipo
Alelo
Fenotipo
T/T
C/T
C/C
T
C
T
C
Controles
11
39
50
61
139
50
50
VEGF
(N=100)
(11%)
(30%)
(70%)
C936T
Casos
21
77
123
(N=100)
(21%)
(39%) (50%)
35
44
(35%) (44%)
(50%) (50%)
56
44
(38.5%) (61.5%) (56%) (44%)
Tabla 7. Frecuencias genéticas polimorfismo VEGF C936T.
36 | P á g i n a
Se realizó la prueba del Equilibrio de Hardy Weinberg. Los hallazgos son los
siguientes:
N=100
(11;39;50). p = 0.42. Chi cuadrada = 0.64. Indica que nuestra
población control no está en desequilibrio de ligamiento y puede ser comparada con
la población de casos.
Al realizar las comparaciones intergrupales estos fueron los resultados:
1.- Comparación de genotipos entre controles y casos: p = 0.17
2.- Comparación de frecuencias alélicas: p = 0.13
3.- Comparación de fenotipos: p = 0.46
En la siguiente gráfica se exponen las frecuencias genotípicas, alélicas y
fenotípicas para este polimorfismo:
Figura 12. Frecuencias genéticas polimorfismo VEGF C936T
37 | P á g i n a
Se construyó el siguiente cuadro:
Enfermedad
+
Polimorfismo +
-
56
50
44
50
Tabla 8. Tabla de 2X2 para el polimorfismo VEGF C936T.
Resultados: Odds ratio de 1.27. (IC 0.70 – 2.31).
ASOCIACIÓN DE GENOTIPOS DE VEGF CON CÁNCER:
Se tomó como referencia un estudio realizado en población austriaca y
asiática el cual muestra las siguientes frecuencias del polimorfismo:
Población
Austriacos
Koreanos
Individuos
123
207
Genotipo T/T
3.4%
3.9%
Genotipo C/T
25.2%
28.5%
GenotipoC/C
71.4%
67.6%
Alelo C
84%
82%
Alelo T
16%
18%
Tabla 9. Frecuencias del polimorfismo VEGF C936T en dos poblaciones (Kim y cols., 2003).
Cabe destacar que nuestro hallazgo del 30% en este tipo de población fue
mayor al reportado en la referencia (en las dos poblaciones). Es un polimorfismo
muy frecuente en mujeres del Occidente de México.
En este estudio se encontró que no existe relación entre el polimorfismo
C936T del VEGF y el cáncer cervicouterino, en la población estudiada. La posible
asociación fue incluso menor al polimorfismo PAI-1 4G/5G. La literatura actual
reporta información contrastante. Estas son las frecuencias de un estudio que lo
asoció con el cáncer gástrico en población asiática:
38 | P á g i n a
Genotipo
Grupo
Controles
VEGF
(N=229)
C936T
Casos
(N=154)
T/T
C/T
AleloT
C/C
1.3%
24.9% 73.8%
13.8%
4.5%
37.7% 57.8%
23.4%
Tabla 10. Frecuencias génicas de VEGF C936T en dos grupos (Bae y cols., 2008).
Nuestro estudio reportó frecuencias más altas del polimorfismo: 30% para el
grupo controles y 38.5% para el grupo casos, este último dato con una diferencia de
más del 15% con respecto al estudio mencionado. Sin duda, es un contraste
importante de dos poblaciones genéticamente diferentes: la mestiza de México y la
asiática de Corea.
Literatura reciente ubica al polimorfismo VEGF C936T como un factor de
riesgo muy alto para padecer neoplasias de la glia en pacientes chinos ( Bao y cols.,
2010). En esta población, ya se ha reportado el riesgo que implica este polimorfismo
para el adenoma colorrectal, siendo este un posible tumor que antecede al cáncer
colorrectal (Wu y cols., 2010).
Paradójicamente, en el cáncer de mama se encuentran discrepancias. Debido
a la trascendencia epidemiológica de este cáncer, se ha intentado asociar el
polimorfismo C936T con dicha neoplasia, pero los hallazgos no lo encuentran
asociado. Un estudio indica que el polimorfismo no afecta el riesgo de cáncer de
mama en asiáticas (Yang y cols., 2010) y en un meta análisis de este año se
concluyó lo mismo (Qiu y cols., 2010).
En cáncer oral, ya se documentó su asociación en pacientes chinos (Xu y
cols., 2010). En cuanto a enfermedades crónico – degenerativas, un estudio muy
interesante, (Kim y cols., 2009) reportó que el C936T del gen VEGF puede ser un
factor importante para determinar los niveles plasmáticos de dicho factor y que está
relacionado con la retinopatía diabética. Al contrario de lo que se podría hipotetizar
al analizar este dato, los niveles urinarios de VEGF no se asocian con los niveles
plasmáticos de VEGF pero sí se asocian con la etapa de la nefropatía diabética.
39 | P á g i n a
Esto refuerza los conocimientos que se tiene acerca de la repercusión
sistémica del polimorfismo en el cáncer. Se sabe que este factor es sobreexpresado, y
provee al tumor de los nutrientes necesarios, por medio de la angiogénesis (Ferrara y
cols., 2003).
En nuestro caso, no se encontró asociado al cáncer cérvicouterino. Podemos
hipotetizar que las características de las células anaplásicas que surgen en la zona
de transformación del cérvix uterino son morfológicamente diferentes a las de los
otros tumores donde se ha asociado (como los gliomas, Bao y cols., 2010) y esto
posiblemente sería un factor que interviniera en la no asociación. Sin embargo, los
estudios prospectivos serán indispensables para aclarar estas afirmaciones.
FRECUENCIAS HAPLOTÍPICAS Y DESQUILIBRIO DE LIGAMIENTO
Se analizaron ambos polimorfismos en conjunto, mediante las frecuencias
haplotípicas. Los resultados son los siguientes:
CONTROLES (100)
CASOS (100)
HAPLOTIPOS
-675G/936C
115 (57.5%)
108 (54%)
-675G/936T
49 (24.5%)
47 (23.5%)
-675A/936C
20 (10%)
16 (8%)
-675A/936T
16 (8%)
29 (14.5%)
Tabla 11. Frecuencias haplotípicas en controles y casos.
Frecuencias
Frecuencias
X2
D’
p
observadas
esperadas
CONTROLES N= 100
-675G/936C
115(57.5%)
110.7
-675G/936T
49(24.5%)
53.3
2.85
0.0911
0.17
-675A/936C
20(10%)
24.3
-675A/936T
16(8%)
11.7
CASOS N=100.
-675G/936C
96.1
108(54%)
-675G/936T
58.9
47(23.5%)
17.23
>0.001
0.42
-675A/936C
27.9
16(8%)
-675A/936T
17.1
29(14.5%)
Tabla 12. Frecuencias observadas y esperadas de los haplotipos. La comparación de los haplotipos
Haplotipos
entre ambos grupos fue no significativa. (p =0.22). D´= desequilibrio de ligamiento.
40 | P á g i n a
ANÁLISIS DEL DESEQUILIBRIO DE LIGAMENTO Y DE LOS HAPLOTIPOS
El desequilibrio de ligamiento (DL) es el fenómeno por el cual aquellos alelos
que están suficientemente cercanos en el genoma (haplotipo) tienden a ser
heredados juntos, y determinar su valor es de gran utilidad, pues permite localizar
polimorfismos relacionados con una enfermedad en específico. Si aparece una
mutación que genera un polimorfismo responsable de la enfermedad, es posible que
otros polimorfismos cercanos estén asociados con ella a su vez. De ahí que estemos
evaluando una interacción génica. El resultado se interpreta como interacción (es el
valor D normalizado, y va desde -1 a +1, idéntico a una correlación lineal; la
interacción es mayor mientras más cercanía haya hacia el 1) (Griffiths y cols., 2002).
En este estudio, los dos sitios (PAI-1 y VEGF) están relacionados en su ruta
metabólica. Sin embargo, no hubo evidencia de una posible interacción entre ellos,
pues las proporciones de los distintos haplotipos entre pares de locus no se
desviaron de las aquéllas predichas por ley mendeliana del surtido independiente
para genes no ligados. Los valores observados y esperados dieron consistentemente
diferencias no significativas. La combinación de los genes PAI-1/VEGF en el grupo
de casos tiene el valor de DL más alto (42%, p>0.001). Es típico que en el grupo de
casos el valor de DL sea diferente al de los controles, ya que se trata de una
patología y puede estar distorsionando su valor (Valdez y cols., 2007).
La literatura actual no reporta el análisis haplotípico de estos dos
polimorfismos en alguna patología. Por ello se comparan y exponen los resultados de
estudios donde se analizaron haplotipos de ambos genes de manera individual:
PAI-1. Investigaciones recientes han tratado de vincular haplotipos del gen de
PAI-1 (incluyendo el polimorfismo -675 4G/5G) a diversas patologías, entre ellas el
infarto al miocardio, encontrando resultados contrastantes. En un estudio, no se
encontró asociación en estas circunstancias en una población alemana (Koch y cols,
2010), donde estudiaron el polimorfismo PAI-1 -675 4G/5G junto con otros siete
polimorfismos. Además, se ha reportado que diversos genotipos asociados con
incremento en la expresión de PAI-1 (como en nuestro estudio, en su caso fueron el
PAI4G/5G, PAI2846 y el PAI7343) se han asociado con una mayor susceptibilidad a
neumonías en población geriátrica caucásica (Yende y cols, 2007).
41 | P á g i n a
Paradójicamente, haplotipos relacionados a este marcador podrían ser
benéficos en algunos trastornos (PAI-1 4G/5G y -844G/A), como el accidente
cerebrovascular (Saidi y cols, 2007). El efecto protector del alelo 4G sugiere la
participación del polimorfismo PAI-1 -675 4G/5G en el ictus a través de un
mecanismo no relacionado con la fibrinólisis, y esto es razonable. Si el inhibidor
impide que se degraden coágulos sanguíneos, el haplotipo al encontrarse en una
situación patológica podría permitir la degradación de dichos coágulos.
Como se ha analizado, el alelo 4G se asocia con mayores niveles de PAI-1, pero
un estudio no apoya una asociación de los polimorfismos del gen PAI (-675 4G/5G y
otros seis polimorfismos del gen) con el riesgo de infarto de miocardio o accidente
cerebrovascular (Ding y cols, 2006).
En cuanto a estudios en población asiática, se ha demostrado que los
haplotipos de este gen pueden interactuar con otras variables (-6754G/5G y A844G). Un análisis haplotípico indicó que los alelos A y el alelo 4G, ambos del PAI-1,
pueden aumentar el riesgo de enfermedad coronaria entre los no fumadores en
pacientes chinos (Su y cols, 2006).
VEGF. Para este factor, los haplotipos involucrados con el polimorfismo
C936T, se han vinculado significativamente con algunas patologías, como la
nefropatía hipertensiva(C-2578A, G-1154A, C-460T y C936T), precisamente en
pacientes hispanos (Yang y cols, 2010). Además, se han vinculado en cáncer
colorrectal (C1498T y C936T), tanto de manera aislada como en los análisis
haplotípicos (Wu y cols, 2010).
Se ha visto relación de haplotipos de este gen (incluido el C936T) no sólo con
enfermedades cancerícenas (cáncer gástrico con G+405C T-460C y C+936T,
carcinoma hepatocelular con C-2578A C-1203T G-1190A A-1179T G-1154A C-634T
C-7T y C+936T, y melanoma maligno con C-2578A, G-1154A, G+405C y C+936T (AlMoundhri y cols, 2009, Kong y cols, 2007, Howell y cols, 2002 respectivamente),
sino también con otro tipo de trastornos como la atresia biliar (con A-2578C, G634C y C+936T) y la endometriosis (con A-2578C T-460C G+405C y C+936T) (Lee y
cols, 2010; Zhao y cols, 2008, respectivamente), aunque es importante destacar, que
en un estudio realizado en Japón, los haplotipos no incrementaron el riesgo de
42 | P á g i n a
padecer carcinoma endometrial (C-460T, G+405C, y C+936T, Amano y cols, 2008).
Sin embargo, ya se ha reportado su vinculación a enfermedades donde participa la
atopia, como el asma (C+936T G-634C y -2549 -2567 deleción 18, Lachheb y cols,
2008).
Su papel como factor protector se ha reportado en un menor número de
investigaciones, destacando contra enfermedades como la artritis psoriásica
(haplotipos de VEGF C936T, y polimorfismos de los genes del Factor de Crecimiento
Epidérmico EGF, y de los Factores de Crecimiento Fibroblásticos 1 y 2, FGF1 y
FGF2, Butt y cols, 2007).
En nuestra investigación, no se encontró una interacción de estos haplotipos
para el cáncer cervicouterino (p>0.05), con una D normalizada de .17 y .42 para
controles y casos, respectivamente. Por lo tanto podemos afirmar que ambos
polimorfismos no se asocian a dicho cáncer tanto en análisis genotípico como
haplotípico (de manera aisalada y en conjunto).
43 | P á g i n a
12.- CONCLUSIONES
1.
La frecuencia del alelo 4G fue mayor en mujeres con cáncer
cervicouterino que en el grupo control.
2.
No se corroboró la asociación entre el polimorfismo PAI-1 -675 4G/5G y
el cáncer cérvicouterino.
3.
Para el polimorfismo VEGF C936T, no se encontró asociación con cáncer
cervicouterino.
4.
El alelo 936T fue mucho más prevalente en nuestra investigación que en
los estudios de referencia, esto en casos y en controles.
6.
La concordancia de las proporciones haplotípicas bilocus indicó que los
genes del PAI-1 y del VEGF estudiados segregan independientemente, por lo que no
parece haber entre ellos interacción génica.
7.
Los haplotipos en el grupo de casos presentan por sí mismos un leve
desequilibrio de ligamiento con una alta significancia estadística. Esto debido a las
diferencias para el haplotipo -675A/936T. Pero es un dato que puede esperarse por
ser el grupo que presenta como variable de interés la patología en estudio.
13.- PERSPECTIVAS
La investigación genética está en constante cambio. Los criterios de definición
de polimorfismos se actualizan día con día. Con base en esta investigación, se
recomienda realizar estudios prospectivos con un mayor número de pacientes y de
controles, así como con otros polimorfismos ubicados en los genes que codifican las
proteínas PAI-1 y el factor VEGF.
44 | P á g i n a
14.- REFERENCIAS
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http://www.dicciomed.es/php/diccio.php
http://www.glosario.net/
http://www.respyn.uanl.mx/especiales/2006/ee-052006/carteles/genetica_de_poblaciones.htm
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/m014ssa24.html. NORMA OFICIAL
MEXICANA NOM-014-SSA2-1994, PARA LA PREVENCIÓN, TRATAMIENTO Y CONTROL DE
CÁNCER DEL CUELLO DEL ÚTERO Y DE LA MAMA EN LA ATENCIÓN PRIMARIA
http://genome.csdb.cn/cgi-bin/hgPcr
http://www.cenave.gob.mx
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/168ssa18.html. NORMA OFICIAL
MEXICANA NOM-168-SSA1-1998, DEL EXPEDIENTE CLINICO.
54 | P á g i n a
15.- ANEXOS
55 | P á g i n a
15.1.- INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN
(ANEXO 1) UNIVERSIDAD DE COLIMA. FACULTAD DE MEDICINA.
MAESTRÍA EN CIENCIAS MÉDICAS
ASOCIACIÓN DE POLIMORFISMOS DE GENES RELACIONADOS FUNCIONALMENTE EN LA RUTA
MOLECULAR DEL SISTEMA RENINA ANGIOTENSINA, EN CÁNCER CERVICOUTERINO
ENCUESTA.
PACIENTE CASO: ______________
PACIENTE CONTROL: ____________
NOMBRE DEL ENCUESTADOR: ____________________________________________ FECHA: _________
I. NOMBRE DE LA PACIENTE: ______________________________________________ EDAD: _______
FACTORES DE RIESGO:
1.- ¿A QUE EDAD INICIÓ RELACIONES SEXUALES? ________
2.- ¿CUÁNTAS PAREJAS SEXUALES HA TENIDO DURANTE TODA SU VIDA: ______
3.- ¿CUÁNTAS PAREJAS SEXUALES HA TENIDO EL ÚLTIMO AÑO: _______
4.- FUM _________
5.- ANTECEDENTES OBSTÉTRICOS: G ___ P ___ A ____ C ___
EDAD PRIMER HIJO: ________ FUP _________
FUA ________ FUC _________
EDAD MENARCA: _______ EDAD MENOPAUSIA: _______ FUM _________
6.- ¿PADECE ALGUNA ENFERMEDAD? ¿DESDE CUÁNDO?_________________________________
(HIPERTENSIÓN, DIABETES, HIPERTRIGLICERIDEMIA, PROBLEMAS TROMBÓTICOS ETC).
7.- EN CASO DE PADECERLA, ¿QUÉ TRATAMIENTO LLEVA A CABO?______________________
_________________________________________________________________________________________
8.- ANTECEDENTES FAMILIARES CACU:
1) MADRE 2) ABUELA MATERNA 3) HERMANA 4) TÍA MATERNA 5) OTRA: _____
NO (
)
9.- ¿SE HA REALIZADO CITOLOGÍAS ANTERIORES A ESTA? NO ( ) SI ( ) FUDOC ________
REPORTE: __________
∎POLIMORFISMO -675 4G/5G DEL GEN DE PAI-1 _________________________________________
∎POLIMORFISMO C936T DEL GEN DE VEGF
_________________________________________
56 | P á g i n a
(ANEXO 2) TOMA DE LA MUESTRA. INSTRUMENTOS Y PROCEDIMIENTO
1. Espejo vaginal para toma de muestra de citología exfoliativa.
2. Citobrush
3. Guantes estériles de látex.
4. Bata.
5. Cubrebocas.
6. Mesa de exploración ginecológica con pierneras.
7. Bata para el paciente.
Recolección de la muestra
Con el previo consentimiento por escrito del paciente y una explicación del
procedimiento, con total consideración de la Declaración de Helsinki, se procedió a
realizar la toma de citología exfoliativa a la paciente, colocándola en posición
ginecológica, empleando con cuidado el espejo vaginal sin lubricación. Al ubicar el
orificio cervical, se inmovilizó el espejo con los tornillos auxiliares, y se procedió a
emplear el citobrush, introduciéndolo en el orificio cervical, y retirándolo
suavemente con un leve giro, procediendo a introducirlo dentro del tubo de 1.5 de
PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con 500 microlitros de la solución
amortiguadora preservante de ADN*, se agitó vigorosamente, retirando el citobrush y
tapando el tubo. Se guardaron en una hielera con 2 geles refrigerantes de 250 ml
cada uno (proporcionan una temperatura de 2 a 8 grados centígrados por 6 - 8
horas). Se colocaron envueltos en una pequeña bolsa de plástico individual, en
posición vertical, encima de los geles. Al final de la jornada se trasladaron las
muestras al laboratorio para mantenerlos refrigerados. Se almacenaron por un
tiempo aproximado de 24 meses, a una temperatura que oscila entre -6 y -12 grados
centígrados, en el congelador del Laboratorio de Genética Molecular.
*”Solución amortiguadora preservante de ADN”. Se prepara para 100 mililitros:
0.36 gramos de Na2HPO4. No. 53264
0.052 gramos de NaH2PO4  H2O
0.85 gramos de NaCl
57 | P á g i n a
(ANEXO 3). EXTRACCIÓN DE ADN
Método de Fenol – Cloroformo. Muestra de citocepillo:
1.- Centrifugar a 4°c por 25 minutos a 14,000 rev por minuto y quitar sobrenadante
con cuidado de no tirar el botón.
2.- Agregar 250 microlitros de solución tampón de lisis (STL) y 45 microlitros de
Proteinasa K 10mgf/ml y 10 microlitros de SDS 10%.
3.- Mezclar gentilmente e incubar a 55°c 3 a 5 horas.
4.- Inactivar la proteinasa K con vórtex 8 minutos.
5.- Agregar volumen igual de 250 microlitros de fenol cloroformo alcohol isoamílico
25:24:1. Mezclar bien con vórtex separar las dos fases por centrifugación a 14,000
(13.2) durante 10 minutos (13´). Tomar la fase acuosa cuidando de no tomar la
interfase, transfiriendo a otro tubo (arriba).
6.- Agregar 2 volúmenes de absoluto frío y una décima de volumen de acetato de
amonio (150 microlitros) 3M a un pH de 5.2 y permitir que el ADN precipite a -20°c
durante al menos 1 hora.
7.- Centrifugar a 7000 rpm durante 10 minutos. Eliminar sobrenadante cuidando
de no tirar el botón blanco.
8.- Lavar dos veces con etanol al 70% 500 microlitros, 10 minutos a 7000 rpm.
9.- Dejar secar.
EXTRACCIÓN ADN BLOQUES DE PARAFINA
(Desparafinación):
El corte, de 10μm aproximadamente (con microtomo) se desparafina (dos
veces) en 1ml de xilol por 30 minutos a 65°C; se centrifuga a 12 000g, 10 minutos,
se descarta el sobrenadante. Se repite este paso. Después se agrega 1ml de etanol al
100%, se agita manualmente, se espera 30 minutos, se centrifuga y descarta el
sobrenadante (se repite este paso) (Jiménez y cols., 2007).
Técnica de extracción:
Igualmente se agrega 1ml de etanol al 70%, y 1ml de PBS (dos veces). Se
agrega 500μl de amortiguador de lisis (50μl Proteinasa K 20mg/ml; 10μl Tris- HCl
1M; 2μl EDTA 0,5M; 100μl SDS 10% y 838μl agua destilada) y se incuba toda la
58 | P á g i n a
noche
a
52°C
en
agitación
continua.
Se
agrega
500μl
de
fenol
l:cloroformo:isomilalcohol (25:24:1) (500 microlitros de fenol, 480 microlitros de
cloroformo, y 20 microlitros de alcohol isoamílico), se agita con vórtex 10 minutos y
se centrifuga a 12,000 rpm por 10 minutos.
El sobrenadante se remueve a otro microtubo, se agrega 0,1 volumen de
acetato de sodio 3M (50 microlitros) y se agita manualmente (50 veces). Se adicionó
un volumen de isopropanol (550 microlitros) y se almacena toda la noche a -20°C.
Se centrifuga a 12,000 rpm 10´, el sobrenadante se descarta y el precipitado se lava
una vez con 1ml de etanol 70%, se centrifuga y descarta el sobrenadante. El ADN
seco se disolve en 50μl de solución T.E. o bien agua bidestilada estéril y se almacena
a -20°C (o bien en el ultracongelador) (Jiménez y cols., 2007).
Preparación de la proteinasa K, TRIS y EDTA.
1.- 0.020 gramos en 1000 microlitros de proteinasa K.
2.- 0.121 gramos en 1000 microlitros de TRIS.
3.- 0.146 gramos en 1000 microlitros de EDTA.
Diluciones: Para trabajar con las muestras, se requiere realizar la dilución
respectiva para 100 microlitros de agua inyectable. Por lo tanto, dividimos 10,000
entre la cantidad que obtuvimos de ADN de una muestra. El resultado es la
cantidad de microlitros que se emplearán de la muestra concentrada de T.E.
(solución en la cual se conserva el ADN, concentración 1 ng/μl), y se agrega agua
inyectable hasta completar 100 microlitros.
Ejemplo: Muestra número 68 de controles:
Se obtuvo en el cuantificador 1299 microgramos por mililitro: dividimos
10,000 entre esa cantidad y resulta 7.7. Son los microlitros de ADN. Agregamos 92.3
microlitros de agua inyectable y tenemos la dilución para 100 microlitros.
59 | P á g i n a
(ANEXO 4) DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA DE TIPIFICACIÓN DE LABORATORIO
Determinación del polimorfismo inserción / deleción -675 4G/5G del gen
de PAI-1.
Este polimorfismo será evaluado por la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), usando un alelo específico (SSP), (Festa y cols., 2003). Los oligonucleótidos
utilizados serán los siguientes:
- 5'-AAGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-3'.
- 5'-AGAGTCTGGACACGTGGGGA-3'.
- 5'-AGAGTCTGGACACGTGGGGG-3'.
- 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTCTAG-3'.
Método de PCR SSP (sequence-specific primers = alelos de secuencia
específica):
Se basa en el principio de que los iniciadores completamente coincidentes se
usan más eficazmente en la amplificación de una secuencia diana que un iniciador
no coincidente por Taq polimerasa recombinante. Los pares de primers están
diseñados para tener coincidencias perfectas sólo con un único alelo o grupo de
alelos. En PCR, los pares de iniciadores coincidentes dan lugar a la amplificación de
las secuencias diana (es decir, un resultado positivo), mientras que los pares de
primers no coincidentes no provocan amplificación (es decir, un resultado negativo).
La interpretación de los resultados de la PCR-SSP se basa en la presencia o
ausencia de un fragmento específico de DNA amplificado (One Lambda, 2009).
Condiciones para el polimorfismo 4G/5G del gen de PAI-1.
Una vez extraído el ADN (anexo 3), las condiciones termocicladoras para el alelo
4G (32 ciclos) fueron: desnaturalización (94°C para 35 segundos), alineaminento
(65°C para 35 segundos), y extensión (72°C para 70 segundos). Las condiciones
termocicladoras para el alelo 5G fueron idénticas, excepto los últimos 22 ciclos, ya
que fueron alineados a 58°C. Previa electroforesis, todos los amplificados se
visualizaron por geles de acrilamida al 6%, teñidos con plata (Anexo 5).
60 | P á g i n a
Técnica de PCR
La reacción de alelo específico 4G (25 microlitros de volumen) contuvo 1
ng/microlitro de ADN, 0.4 microlitros de TAQ polimerasa, 0.8 mmol/L MgCl2, 50
mmol/L dNTP, 200 nmol/ del iniciador control, y 400 nmol/L de cada iniciador de
alelo específico. La reacción de PCR de 5G fue idéntica excepto por 1.1 mmol/L de
MgCl2. Estas condiciones fueron estandarizadas a nuestro laboratorio.
Los fragmentos de pares de bases esperados:
Homocigoto 4G/4G: 257 y 136 bp para la reacción 4G, y 257 para la reacción 5G.
Heterocigoto 4G/5G: 257 y 136 bp para las dos reacciones.
Homocigoto 5G/5G: 257 bp para la reacción 4G, y 257 y 136 bp para la reacción
5G.
Determinación del polimorfismo C936T del gen de VEGF.
El polimorfismo de VEGF C936T fue evaluado por PCR - SSP usando la
siguiente secuencia de oligonucleótidos. Fue creada mediante el programa UCSC InSilico PCR, disponible en el sitio web http://genome.csdb.cn/cgi-bin/hgPcr:
Iniciador 1: TAAATGTATGTATGTGGGTGGGTGTGTCTACAG
Iniciador 2: GGGCGGGTGACCCAGCAc
Iniciador 3: GGGCGGGTGACCCAGCAt
Una vez extraído el ADN (anexo 3), las condiciones termocicladoras para la
reacción del primer y segundo iniciador (32 ciclos) fueron: desnaturalización (94°C
para 35 segundos), alineaminento (65°C para 35 segundos), y extensión (72°C para
70 segundos). Las condiciones termocicladoras para la reacción del primer y tercer
iniciador fueron estandarizadas. Previa electroforesis, todos los amplificados se
visualizaron por geles de acrilamida al 6%, teñidos con plata (Anexo 5).
Técnica de PCR
Contuvo 1 nanogramo/microlitro de ADN, 0.1 microlitro de dNTP´S 50 mmol,
0.7 mililitros de 1.8 mmol de MgCl2, 30 pmol de cada iniciador (0.5 microlitros), y
0.05 microlitros de Taq polimerasa. Previa electroforesis, todos los amplificados se
visualizaron por geles de acrilamida al 6%, teñidos con plata (Anexo 5).
Estas condiciones fueron estandarizadas a nuestro laboratorio.
61 | P á g i n a
El fragmento de restricción para ambos alelos (C y T) fue de 141 pares de
bases, esperando esos fragmentos en muestras homocigotos si solo aparecía una
banda (en las dos PCR) y heterocigotos si aparecían ambas bandas.
Como referencia para distinguir el peso molecular de todos los fragmentos, se
utilizó una escalera, la cual pudo ser de 50 ó 100 pares de bases como marcador.
EJEMPLO
El siguiente amplificado, nos muestra cómo diferenciar entre una muestra
homo o heterocigota, dependiendo del número de bandas que se presenten. Si
aparecen dos bandas, la muestra es heterocigota, si aparece una banda es
homocigota. La línea de 490 pares de bases es el alelo I, y la línea de 190 pares es el
alelo D:
Figura
13.
El
homocigoto
I/I
se
observa en los carriles 2, 4, 5, 7,9 y 11; el
homocigoto
D/D
en
el
carril
10;
el
heterocigoto en los carriles 1, 3 y 6. El
marcador de talla molecular (MTM) de 50 pb
se muestra en el carril 8. Imagen de un gel
realizado en el Centro de Investigaciones
Biomédicas de Occidente del IMSS.
62 | P á g i n a
(ANEXO 5) CONDICIONES Y PREPARACIONES
Limpiar bien las placas de vidrio con alcohol y una vez secas colocarlas en los
armadores interponiendo los separadores correspondientes entre ambas. La placa de
vidrio más grande es la posterior. Hay que vaciar la mezcla para preparar el gel:
1.- Para preparar el gel:
1.- Acrilamida biscarilamida al 6%: 25 ml.
2.- Persulfato: 400 microlitros.
3.- TEMED: 50 mililitros. (En este orden)
Esperar 20 minutos tras la mezcla.
2.- Condiciones de electroforesis:
1.- 200 voltios.
2.- 400 miliamperes.
Por 10 minutos inicialmente (para pre-correrlo) y finalmente 60 minutos.
3. -Tinción de gel:
1.- Solución fijadora 10 minutos. Se prepara aforando a 1000 mililitros: Etanol
ABS al 10% 100 ml, y ácido acético 0.5% 5 ml.
2.- Nitrato de plata: 8 minutos. Se prepara 0.2 gramos de nitrato de plata aforando
a 100 ml con solución fijadora.
3.- Enjuagar con agua destilada.
4.- Solución reveladora hasta que aparezcan las bandas. Aforar a 1000 ml, 30
gramos de hidróxido de sodio y 5 mililitros de formaldehido.
Soluciones:
Mezcla de persulfato para preparar el gel:
5 gramos persulfato y 50 mililitros de agua destilada.
Mezcla para gel (Acrilamida):
63 | P á g i n a
100 mililitros de acrilamida.
50 mililitros de Buffer 5X
Aforar a 500 mililitros de agua destilada.
Acrilamida:
29 gramos de acrilamida.
1 gramo de bisacrilamida.
100 mililitros de agua destilada, aforar.
Marcador de talla molecular:
10 microlitros de jugo azul.
82.5 microlitros de agua pura inyectable.
7.5 microlitros de marcador (25 ó 50 pares de bases).
Preparación de Buffer 1X: 200 ml de buffer TBF 10 X aforar a 2000 mililitros.
Preparación de buffer 0.5X:
100 mililitros buffer 10X
Aforar con agua destilada 2000 mililitros. = 2 litros TBF 0.5X
Preparación de buffer 1x:
400 mililitros de buffer TBF 5X
1600 mililitros de agua oxigenada. = 2000 mililitros de TBE 1.0 X
ANEXO 6 FÓRMULA PARA CALCULAR EL TAMAÑO DE LA MUESTRA
Fórmula general:
Z1-α/2 = 1.96
Z1-β = 0.84
64 | P á g i n a
Para calcular la relación entre las dos frecuencias.
Para calcular frecuencia de exposición entre los casos.
W=Odds ratio
Referencia: (Pertegas y cols.,2002).
65 | P á g i n a
15.2.- CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO
UNIVERSIDAD DE COLIMA. SECRETARÍA DE SALUD
Facultad de Medicina. Facultad de Ciencias Químicas
Km 9 carretera Colima –Coquimatlán, México
Tel/FaxCarta
01 312 31 de
6 11 63
e-mail: [email protected],
[email protected]
Consentimiento
Informado
MCP Hugo Christian Ramos Flores, Médico Ginecoobstetra Roberto Chaparro
Mejía, Dra. Luz Margarita Baltazar Rodríguez, Dra. Laura Leticia Valdez
Velázquez.
1. Nombre del estudio: “Frecuencia de polimorfismos de genes relacionados
funcionalmente en la ruta molecular del sistema renina angiotensina, en cáncer
cervicouterino”
2. Propósito del estudio: La estamos invitando a participar en un estudio de
investigación que se lleva a cabo en el Laboratorio de Genética Molecular de la
Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Colima, en conjunto con las
Unidades de Ginecología y Obstetricia del sector salud de la ciudad de Colima.
El estudio tiene como propósito evaluar una posible asociación de un marcador
genético que probablemente predisponga a padecer cáncer cervicouterino. Usted ha
sido invitada a participar en este estudio porque cumple con los criterios de
inclusión establecidos.
3. Procedimientos: Si usted acepta participar ocurrirá lo siguiente:
a) Se le pedirá que responda un cuestionario en el que le preguntaremos sobre:
(edad, número de hijos, antecedentes familiares, antecedentes ginecoobstétricos).
b) Toma de muestra de citología cervical. Para poder realizarle la toma de muestra
de citología cervical no deberá encontrarse dentro de los días de su menstruación.
Tomaremos una muestra de células de su cérvix, para realizarle algunos estudios de
laboratorio.
Deseamos estudiar si algunos de sus genes favorecen o disminuyen la presencia de
cáncer cervicouterino. Nuestros genes son un código especial que todos heredamos
de nuestros padres y es este código el que define el color de nuestra piel, ojos, pelo y
66 | P á g i n a
de muchas otras características de cada quien. En el caso del cáncer cervicouterino,
hay muchas cosas que puede hacer que se manifieste, y los genes aunque no es el
único factor, sí puede ser uno de ellos. Por este motivo, nos gustaría saber más
sobre sus genes. Estas mediciones nos pueden ayudar a entender las razones por
las que algunas personas padecen dicho cáncer.
4. Posibles beneficios que recibirá al participar en el estudio. No recibirá un
pago por su participación en este estudio, ni implica gasto alguno para usted.
Si bien los beneficios directos para usted pudieran no existir, los resultados del
presente estudio contribuirán al avance en el conocimiento de la cadena causal del
cáncer cervicouterino.
5. Participación o retiro. Su participación en este estudio es voluntaria. Si usted
decide no participar, de cualquier manera recibirá la atención médica que suele
recibir. Puede hacer las preguntas que desee.
6. Privacidad y confidencialidad. La información que nos proporcione que pudiera
ser utilizada para identificarla/o (como su nombre, teléfono y dirección) será
guardada de manera confidencial y por separado al igual que sus respuestas a los
cuestionarios y los resultados de sus pruebas, para garantizar su privacidad.
7. Para el estudio de genes: por favor marque con una X una de las opciones
cajas que se presentan abajo (únicamente debe indicar la opción que
corresponda)
[__] No autorizo que se tome la muestra para las pruebas genéticas
[__] Sí autorizo que se tome la muestra para las pruebas genéticas de este estudio
únicamente
[__] Sí autorizo que se tome la muestra para las pruebas genéticas de este estudio y
su empleo para estudios futuros
Declaración de consentimiento informado
Estoy de acuerdo en participar en los estudios que se me han descrito.
67 | P á g i n a
______________________________________
____________________________________
Nombre y firma del Participante
Fecha
Firma del encargado de obtener el consentimiento informado
______________________________________
____________________________________
Nombre y firma del encargado de obtener el CI
Fecha
Firma de los testigos
____________________________________
Firma del Testigo 1
____________________________________
Firma del Testigo
_______________
Fecha
________________
Fecha
68 | P á g i n a
15.3.- GLOSARIO
Alelo. Cada uno de los genes de un par, que ocupan el mismo lugar en dos
cromosomas homólogos. Ejercen una misma función sobre un carácter o rasgo de
organización, v. gr.: color o forma, con efectos diversos.
Angiotensina I. Decapéptido que resulta de la acción de la enzima proteolítica
renina sobre la prohormona angiotensinógeno.
Angiotensina 2. Agente circulante en la sangre con efecto vasoconstrictor, que
actúa en diferentes lugares regulando la presión arterial entre otras funciones.
Angiotensinógeno. Una globulina producida por el hígado que, por efecto de la
renina, se transforma en angiotensina.
Ácido ribonucleico mensajero (ARNm). Ácido ribonucleico que contiene la
información genética procedente del ADN para utilizarse en la síntesis de proteínas
Angiogénesis.
Formación
de
vasos
sanguíneos
nuevos
a
partir
de
vasos
preexistentes
Apoptosis. Muerte celular programada; es parte integral del desarrollo de los tejidos
tanto de plantas como de animales pluricelulares. Cuando una célula muere por
apoptosis, empaqueta su contenido, lo que evita que se produzca la respuesta
inflamatoria característica de la muerte accidental o necrosis.
Citocina.
Cualquier
proteína
inmunorreguladora
como
la
interleuquina,
el
interferon, que segregan células del sistema inmunitario, generalmente fagocíticas.
Chi cuadrada. Prueba no paramétrica que mide la discrepancia entre una
distribución observada y otra teórica (bondad de ajuste), indicando en qué medida
las diferencias existentes entre ambas, de haberlas, se deben al azar en el contraste
de hipótesis.
Digestión enzimática. Técnica que radica en el corte con endonucleasas de
restricción de los productos amplificados por PCR. Si dos amplificados presentan
una variación de la secuencia nucleotídica, en los sitios de reconocimientos de las
enzimas de restricción, generarán distintos patrones de fragmentos.
Desequilibrio de ligamiento. El cálculo del nivel de polimorfismo calculado según
el número de alelos es inferior al que realmente se presenta en la población.
Corresponde a la diferencia entre la frecuencia observada para una combinación
69 | P á g i n a
particular de alelos y la esperada con base en las frecuencias de los mismos en los
distintos individuales.
Enzima convertidora de angiotensina. Dicarbopeptidasa que
convierte la
angiotensina I en su forma activa, la angiotensina II.
Electroforesis. Migración de sustancias por la acción de un campo eléctrico. La
técnica aplica el fenómeno con fines analíticos.
Equilibrio de Hardy-Weinberg. Establece que la composición genética de una
población permanece en equilibrio mientras no actúe la selección natural ni ningún
otro factor y no se produzca ninguna mutación. Es decir, la herencia mendeliana,
por sí misma, no engendra cambio evolutivo.
Exón. Secuencia de polinucleótidos en un ácido nucleico que codifica información
para la síntesis proteínica. Se copia y se divide junto con otras secuencias
semejantes para formar el RNA mensajero.
Fibrinólisis.
Proceso
de
descomposición
de
los
coágulos
sanguíneos
por
descomposición de la fibrina que los forman.
Frecuencias alélicas. Frecuencia alélica o frecuencia génica es la proporción que se
observa de un alelo específico respecto al conjunto de los que pueden ocupar un
locus determinado en la población.
Frecuencias genotípicas. Es la frecuencia de cada uno de los genotipos posibles
que aparecen en esa población mendeliana determinada.
Frecuencias fenotípicas. Es la proporción o frecuencia de los distintos fenotipos en
esa población.
Frecuencias haplotípicas. Es la proporción o frecuencia de los distintos haplotipos
en esa población.
Frecuencias haplotípicas bilocus. Es la proporción o frecuencia de los distintos
haplotipos con dos posiciones del gen en el cromosoma, en dicha población.
Genotipo. Conjunto o parte de la constitución genética de un individuo.
Haplotipo. Se define como la constitución genética de un cromosoma individual. Un
haplotipo es una combinación de alelos ligados a múltiples locus que se transmiten
juntos.
70 | P á g i n a
Heterocigoto. También heterocigótico o híbrido, según la genética mendeliana,
individuo que posee dos variantes o alelos distintos para un mismo gen, presenta
alelos distintos en un locus determinado del mismo par cromosómico.
Homocigoto. Célula o individuo con alelos idénticos en uno o más loci de
cromosomas homólogos, posee alelos idénticos en un locus determinado del mismo
par de cromosomas.
Inserción/Deleción.
Polimorfismo
de
inserción/delección
(I/D)
Involucra
la
presencia (alelo I), o la ausencia (alelo D) de una secuencia repetida de un
determinado número de pares de bases en algún punto del gen.
Intrón. Sección de ADN que no codifica información para la síntesis proteínica y que
se elimina antes de pasar a ARN mensajero.
Kilobase (kb). Unidad de tamaño de los ácidos nucleicos, igual a una longitud de
1000 nucleótidos.
KiloDalton. Unidad de masa molecular equivalente a 1. 000 daltons
Loci. Lugar que ocupan una serie de genes. Plural de locus.
Locus. Es la posición relativa del gen en el cromosoma.
Metástasis. Reproducción de un padecimiento en órganos distintos de aquel en que
se presentó en principio.
Método de Fenol – Cloroformo. Método estándar para eliminar proteínas de
soluciones de ácidos nucleicos, (la finalidad es la extracción de ADN).
Método de algoritmo de maximización de expectaciones. Se usa en estadística
para encontrar estimadores de máxima verosimilitud de parámetros en modelos
probabilísticos que dependen de variables no observables.
Oncogene. Gen que contribuye a la conversión de una célula normal a una célula
cancerosa.
Oligonucleótido. Secuencia lineal de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster,
habitualmente no mayor de 50 nucleótidos.
Odds ratio (razón de momios). Es el cociente entre la probabilidad de que un
evento suceda y la probabilidad de que no suceda.
PCR SSP: Método que se basa en el principio de que los iniciadores de
oligonucleótidos son más eficaces en la amplificación de una secuencia diana que
un primer oligonucleótido no coincidente por polimerasa Taq recombinante.
71 | P á g i n a
Pruebas exactas. Pruebas aplicadas para la solución de problemas de datos
categóricos y no paramétricos, para conjuntos de datos pequeños. Entre ellas se
encuentran las pruebas de una muestra, de dos muestras, pruebas de bondad de
ajuste y pruebas sobre medidas de asociación.
Proteína G. Las proteínas G forman una familia de proteínas caracterizadas por la
fijación de GTP (Guanosín trifosfato) y su posterior hidrólisis a GDP (Guanosín
difosfato) durante su ciclo funcional, a lo cual deben su nombre. Su utilidad en la
fisiología celular es la de actuar como interruptores biológicos mediante la
transducción de señales.
Polimerasa. Enzima capaz de transcribir o replicar ácidos nucleicos.
Polimorfismo. Propiedad de los ácidos nucleicos y las proteínas que pueden
presentarse bajo varias formas moleculares. Es un fenómeno importante en la
genética y en la patología molecular.
Plasminógeno. Es una glicoproteína sintetizada por el hígado, presente en el
plasma sanguíneo y la mayor parte del fluido extracelular como el precursor inactivo
de una enzima proteasa (plasmina).
Urokinasa. Trombolítico que actúa sobre el sistema fibrinolítico endógeno para
convertir el plasminógeno a plasmina rompiendo directamente el enlace argininavalina en el plasminógeno.
Renina. Enzima proteolítica que segregan y almacenan los riñones; su función en la
sangre es la de convertir el precursor de la angiotensina (angiotensinógeno) en
angiotensina.
Transcripción. Primer proceso de la expresión genética. Se transfiere la información
contenida en la secuencia del ADN hacia la secuencia de proteína utilizando
diversos ARN como intermediarios.
tPA. Factor que activa el plasminógeno en plasmina, en el sistema fibrinolítico.
Fuente: Diccionario Médico – Biológico. http://www.dicciomed.es/php/diccio.php
Glosario. Apartado de Genética, http://www.glosario.net/
72 | P á g i n a
15.4.- OFICIOS
Figura 14. Oficio de Aprobación del Comité de Ética e Investigación. Departamento
de Enseñanza del Hospital Regional Universitario
73 | P á g i n a
Figura 15. Oficio de Aprobación. Departamento de Enseñanza del Hospital Regional
Universitario. Uso de bloques de parafina del Laboratorio de Anatomía Patológica.
74 | P á g i n a
Figura 16. Oficio de Aprobación del Comité de Ética e Investigación. Departamento
de Enseñanza del Centro Estatal de Cancerología.
75 | P á g i n a
DR. JOSÉ SALAZAR AVIÑA
SECRETARIO DE SALUD DEL ESTADO DE COLIMA
AV. CALZADA GALVAN No.100, COL. CENTRO,
COLIMA, COL.
P R E S E N T E.
Colima, Colima, 21 de mayo de 2009.
AT¨N: DR. CARLOS CÉSAR ROMERO MORENO
DIRECTOR DE SERVICIOS DE SALUD
|Por medio de la presente, solicito a Usted, la autorización para realizar tomas
de citología exfoliativa (papanicolaou) a pacientes dentro de los Sistemas Sanitarios
de la Secretaría de Salud del Estado de Colima, con el fin de reunirlas para el
proyecto de “Asociación de Polimorfismos de Genes relacionados Funcionalmente en
la Ruta Molecular del sistema Renina Angiotensina, en Cáncer Cervico Uterino”, del
Programa de la Maestría en Ciencias Médicas de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Colima; en dicho programa me encuentro inscrito actualmente.
De acuerdo con la Ley General de Salud y el Reglamento de Investigación en materia
de salud, el Proyecto de investigación se clasifica como un estudio con Riesgo
Mínimo, por implicar únicamente la toma de una muestra mediante un
procedimiento no invasivo.
Mi disponibilidad de horario es la siguiente: días miércoles, jueves y viernes,
de 8:00 AM a 12:30 PM.
Quedo en espera de sus indicaciones, de antemano agradezco su apoyo y su
fina atención.
Sin otro particular reciba un cordial saludo.
ATENTAMENTE
__________________________________________
Hugo Christian Ramos Flores
Médico Cirujano y Partero
Alumno de la Maestría en Ciencias Médicas
Ccp. Dr. Antonio Fermín Torres del Toro. Subdirector de Prevención y Control de
Enfermedades. Para su conocimiento.
76 | P á g i n a