Download Actividad antiviral de cúrcuma y extractos de plantas del género

Universidad Miguel Hernández de Elche
Instituto de biología molecular y celular
Departamento de bioquímica y biología molecular
Área de conocimiento: Virología
Actividad antiviral de cúrcuma
y extractos de plantas del género
Cistus. Efecto sobre el virus de la
septicemia hemorrágica de
salmón.
Autor: Eva María Moya Gonzálvez
Tutor: Luis Pérez García-Estañ
Facultad de ciencias experimentales
Grado en biotecnología (2015 – 2016)
Agradecimientos
Me gustaría agradecer a todas las personas que considero que han estado
vinculadas de alguna manera en este trabajo. Primero, me gustaría dar mi más amplio
agradecimiento a mi tutor del TFG, Luis Pérez García-Estañ, por haberme dado la
oportunidad de aprender cómo se trabaja en un laboratorio y sumirme plenamente en
el campo de la virología.
Asimismo, también me gustaría agradecer a las personas que me han facilitado
los extractos, Enrique Barrajón y Vicente Micol, porque han sido el pilar de este trabajo,
y a Irene Mudarra por su apoyo técnico, sin los cuales este trabajo no hubiera sido
posible.
Por último, agradecer a todas esas personas que han estado ahí, desde
profesores hasta familia y amigos, porque gracias a ellos el camino ha sido mucho más
fácil.
Índice de abreviaturas
EPC: Epitelioma Papullosum Cyprini
CHSE: CHinook Salmo Embryo
RPMI: Medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute
VHSV: Viral Hemorrhagic Septicemia Virus
SVCV: Spring Viraemia of Carp Virus
IPNV: Infectious Pancreatic Necrosis Virus
TCID50: 50% Tissue Culture Infective Dose
MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
Palabras clave
Acuicultura, antivirales, fitoterapia, VHSV, Cistus
Resumen
Las enfermedades de origen viral suponen una seria amenaza para la
Acuicultura, causando lamentables pérdidas económicas. Dos son las formas en las que
se puede abordar este problema: la prevención (mediante vacunas) y la terapia. Las
plantas llevan décadas siendo una fuente de fármacos con actividad antiviral. Este
trabajo evalúa la actividad inhibitoria de compuestos de origen vegetal frente a un virus
de gran importancia en el cultivo de trucha y salmón: el virus de la septicemia
hemorrágica vírica (VHSV).
Se probó el efecto de seis extractos de Cistus (denominados de E1 a E6), a
ciegas, sobre la replicación del virus en una línea celular de carpa (EPC). Dos de los
extractos (E2 y E5) muestran actividad inhibitoria frente a VHSV a una concentración de
20-40 µg/ml al añadirlos durante la infección. Se determinó también su actividad frente
a otro virus de salmón (IPNV) y frente al virus de carpa SVCV.
En base a estudios previos, en los que se ha demostrado la actividad anti-VHSV
de la cúrcuma, se estudió su efecto utilizando tanto una preparación cruda como una
filtrada. Los resultados muestran que la preparación cruda tiene capacidad de inhibir la
replicación de VHSV, pero es poco homogénea y tiende a precipitar. La preparación
filtrada, por el contrario, carece de actividad antiviral significativa.
Abstract
The diseases of viral origin pose a serious threat for the Fish farming, causing
devastating economic losses. Two are the ways to approach this problem: prevention
(by means of vaccines) and therapy. Plants have being for decades being a source of
compounds with antiviral activity. This study evaluates the inhibitory activity of plant
compounds against a great important virus in the culture of trout and salmon: Viral
Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV).
Here we tested the effect of six Cistus's extracts (named of E1 to E6), blindly, on
the replication of the virus in a cellular line of carp (EPC). Two of the extracts (E2 and E5)
show inhibitory activity against VHSV at concentrations of 20-40 µg/ml when we added
them during the infection. E2 and E5 also seems to have activity against another virus of
salmon (IPNV) and against a virus of tent (SVCV).
In previous studies, the anti-VHSV activity of curcumin has been reported, also
the effect on VHSV was studied using so much a raw preparation as a well as a filtered
solution. The results show that the raw preparation can disable VHSV replication, but it
is slightly homogeneous and tends to precipitate. The filtered preparation, on the
contrary, has not significant activity.
Índice
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1
2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS ........................................................................ 9
3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 11
3.1. Cultivos celulares ................................................................................. 11
3.2. Virus y titulación .................................................................................. 11
3.3. Preparación de extractos ..................................................................... 12
3.4. Ensayo de citotoxicidad: ensayo MTT ................................................. 13
3.5. Ensayos de actividad antiviral ............................................................. 14
3.6. Tinciones, absorbancias y cálculos ...................................................... 15
4. RESULTADOS ................................................................................................ 17
4.1. Actividad antiviral de extractos de cistus ........................................... 17
4.1.1.Citotoxicidad de los extractos ......................................................... 17
4.1.2.Actividad anti-VHSV ......................................................................... 18
4.1.3.Actividad sobre otros virus de pez .................................................. 22
4.2. Actividad antiviral de cúrcuma ............................................................ 25
4.2.1.Cúrcuma sin filtrar ........................................................................... 25
4.2.2.Cúrcuma filtrada .............................................................................. 27
5. DISCUSIÓN.................................................................................................... 29
6. CONCLUSIÓN…………………………………………………………………………………………… 35
7. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………………….… 36
1. Introducción
Comer pescado forma parte de la tradición cultural de muchas personas y, en
términos de beneficios para la salud, tiene un excelente perfil nutricional: es una buena
fuente de proteínas, ácidos grasos, vitaminas, minerales y micronutrientes esenciales.
A finales del siglo pasado y a principios del nuevo milenio, la pesca de captura
ha mantenido su producción sin sufrir apenas cambios. En 2013 se alcanzó el máximo
de capturas, que ascendió a 93,8 millones de toneladas, sin llegar a sobrepasar en
ningún momento los 95 millones de toneladas que se auguraba como techo definitivo a
la actividad pesquera.
La estabilización de la pesca en unos niveles prácticamente imposibles de
superar, junto con el aumento incesante de la demanda de productos acuáticos, es lo
que ha impulsado el desarrollo de la acuicultura como alternativa para el abastecimiento
mundial de estos productos. Y es precisamente desde el momento en que se estanca la
actividad pesquera, cuando se produce el despegue definitivo de la acuicultura, llegando
a superar a la pesca por primera vez en 2013 con una producción de 97,20 millones de
toneladas a nivel mundial (Figura 1). Por tanto, más de la mitad del total de los alimentos
de origen acuático consumidos hoy por la población mundial, así como los productos
destinados a usos no alimentarios, procede de granjas acuícolas (Figura 2) en las que se
crían peces, crustáceos, algas, moluscos y otros invertebrados.
1
Figura 1. Evolución de la producción de acuicultura y pesca mundial en el periodo 1951-2013
(FAO 2015).
Figura 2. Evolución porcentual de la producción acuática mundial en el periodo 1970-2013 (FAO
2015).
Casi la mitad de toda la producción mundial de la acuicultura en 2013 consistió
en pescado, el 48,4% (unas 47 millones de toneladas), pero el incremento de la
producción ha tenido lugar en todos los grupos de especies. La cosecha de vegetales
representó el 27,8% de las toneladas, la de moluscos el 16%, crustáceos el 6,9%, el grupo
anfibios-reptiles el 0,5% y otros invertebrados el 0,4% restante (Figura 3).
2
Figura 3. Distribución porcentual de la producción de la acuicultura mundial en 2013 por
grupos según la FAO.
La mayor producción obtenida por la acuicultura Europea engloba a 6 especies
de peces (Figura 4) distribuidas en diferentes posiciones geográficas (Figura 5). En los
últimos 10 años la producción anual más alta fue para el salmón Atlántico Salmo salar
(∼900 kTm/año), la trucha arcoiris Oncorhynchus mykiss (∼320 kTm/año), la dorada
Sparus aurata (∼150 kTm/año), la lubina Dicentrarchus labrax (∼140 kTm/año), la carpa
Cyprinus carpio (∼70 kTm/año) y el pez plano Scophthalmus maximus (∼10 kTm/año)
(Gomez-Casado, Estepa et al. 2011). Mientras que la producción del salmón, la trucha y
la carpa se mantiene estable, la producción de dorada, lubina y rodaballo tiende a
aumentar.
A pesar del crecimiento que está teniendo la industria de la acuicultura, esta ha
de enfrentarse constantemente con enfermedades de origen bacteriano y vírico. Un
ejemplo es la infección que tuvo lugar en Chile, donde se sitúa el principal mercado
mundial del salmón no salvaje, entre 2007 y 2009. Un brote del virus de la anemia
infecciosa del salmón (ISAV) acabó con millones de salmones de una empresa acuícola,
lo que ocasionó la eliminación de puestos de trabajo y pérdidas económicas de hasta
5.000 millones de dólares. Similar fue el brote vírico que tuvo lugar en unas instalaciones
de Canadá, por el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHN), que ocasionó la
muerte de millones de salmones, con unas pérdidas por valor de 18 millones de dólares
a la empresa acuícola y 100 millones de dólares al gobierno canadiense.
3
Figura 4. Producción relativa durante los últimos años de las principales especies acuícolas
Europeas. Datos de la FEAP (Federation of European Fish Producers, publicado en su página
(http://www.aquamedia.org). (●) Salmon; (■) trucha; (□) carpa; (○) dorada; (▲) lubina; (◊)
rodaballo.
Figura 5. Distribución geográfica aproximada de las enfermedades virales de la acuicultura
Europea. Los virus principales y las especies afectadas son: VNNV (dorada y lubina), IPNV
(salmón), VHSV y IHNV (trucha y salmón), SVCV (carpa), SAV (salmón y trucha) y ISAV (salmón).
(Gomez-Casado, E. et al, 2011)
4
La acuicultura intensiva está creciendo más rápido que el resto de sectores de
producción animal. Para conseguir altos niveles de producción, los problemas asociados
a enfermedades virales deben ser controlados, ya que estos causan altas tasas de
mortalidad con el consiguiente impacto ecológico y las enormes pérdidas económicas.
Por ello, cada vez son más las investigaciones que se llevan a cabo para descubrir nuevos
agentes terapéuticos que puedan combatir estas infecciones. Dos son las formas en las
que se aborda este problema: la prevención (mediante vacunas) y la terapia.
Hay vacunas disponibles para más de 17 especies de peces y estas protegen de
más de 22 enfermedades bacterianas y 6 enfermedades virales. Las vacunas están
disponibles en más de 40 países (Figura 6). A pesar de que un gran número de países
tienen autorizadas algunas de las vacunas, la vacunación es más usada para las especies
industrializadas en los países representados en la figura (Brudeseth, Wiulsrod et al.
2013).
Figura 6. Clasificación de los países de acuerdo al uso y la implementación de la vacunación en
los peces. El verde representa los países donde la vacunación es muy usado. El amarillo
representa los países es usada pero no está totalmente implementada. El rojo representa los
países donde la vacunación de peces no está desarrollado. (Brudeseth BE, et al. 2013).
Además de las vacunas, se han desarrollado una gran variedad de terapias para
combatir las infecciones víricas en peces, que abarcan a una enorme variedad de
compuestos. Un ejemplo es la inyección de un glicano de Saccharomyces a truchas. A
5
los 16 días de la inyección de Saccharomyces se infectó a los peces por inmersión con
IHN, no observándose ninguna mortalidad (LaPatra 1998). También se ha demostrado
en varios estudios que la ribavirina, un nucleósido sintético en el que la base nitrogenada
es la tiazolcarboximida, tiene actividad antiviral frente a varios tipos de virus. En
concreto, inhibe la replicación de ISAV (Rivas-Aravena, Vallejos-Vidal et al. 2011) y de
IHN e IPNV (Virus de la necrosis pancreática infecciosa) en células de salmón (Hudson,
Graham et al. 1988), y del virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV) en células de
trucha (Marroqui, Estepa et al. 2007).
Una fuente de compuestos antivirales con un enorme potencial son las plantas.
Se han descrito una gran cantidad de compuestos procedentes de estas con actividad
antiviral frente a virus de peces. Un caso de compuestos de origen vegetal con actividad
antiviral son el crisofanol y la aloe-emodina, presentes en el extracto de Rheum
Palmatum, una planta medicinal china, que tiene efecto frente aL flavivirus JEV (Chang,
Huang et al. 2014) (Japanese Encephalitis Flavivirus). Otro ejemplo es el alga marina
Eisenia Bicyclis, la cual se ha demostrado que inactiva IHNV al preincubar el extracto de
alga con el virus durante 1 hora (Kamei and Aoki 2007), y Polysiphonia morrowii, cuyo
extracto se ha demostrado que tiene efecto antiviral tanto al pretratar a IHNV como al
pretratar las células (Kim, Kim et al. 2011).
En concreto, en este estudio nos centramos en dos tipos de preparados
vegetales: extractos de plantas del género Cistus y cúrcuma, un compuesto que se
obtiene de la raíz de la planta del mismo nombre.
El género Cistus lo forman especies de matas o arbustos con hojas opuestas, sin
estípulas, con o sin peciolo y con flores grandes y vistosas (Figura 7). Viven en el típico
clima mediterráneo y la Península Ibérica pudo ser el centro de dispersión mundial.
6
Figura 7. Flores de planta del género Cistus. Foto sacada de http://www.perryhillnurseries.co.uk
Se ha demostrado que el extracto de Cistus tienen efecto inhibitorio sobre el
virus de la gripe al incubar las células en un paso previo a la infección (Ehrhardt, Hrincius
et al. 2007) o, también, tratando el virus con el extracto antes de infectar.
Por otro lado, la cúrcuma es una planta de la familia de las cingiberáceas
(Figuras 8). Los rizomas o partes subterráneas se reducen en un polvo que tiene
propiedades medicinales interesantes. Originalmente, el polvo se utilizaba como antiinflamatorio y para tratar diversas enfermedades de la piel. Estudios recientes han
demostrado que este polvo puede tener cierta capacidad antiviral frente a algunos virus
de peces (Chen, Chen et al. 2013, Jeong, Vaidya et al. 2015, von Rhein, Weidner et al.
2016).
Figura 8. Planta de cúrcuma (izquierda) y rizomas de la plata de cúrcuma (derecha). Fotos
sacadas de http://www.plantasmedicinales10.com y http://www.hogarmania.com
7
Según un artículo publicado por Chen TY y cols. en 2013, la cúrcuma tiene cierta
capacidad inhibitoria de la infectividad de virus envueltos, posiblemente al modificar la
bicapa lipídica y afectando a la función de las proteínas de la membrana del virus. Este
efecto se observa tanto al pretratar las células como al tratarlas durante el periodo de
infección (Chen, Chen et al. 2013). El estudio se realizó para virus tanto con genoma RNA
como con genoma DNA, cuya única característica común era la envoltura, por lo que se
sugiere que la cúrcuma podría tener efecto sobre todos los virus con envuelta, entre los
que se incluye el virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV), que es patógeno de
trucha y salmón, especies muy importantes en la acuicultura. En relación a VHSV, que
es uno de los virus que vamos a utilizar en este estudio, se ha demostrado que el
pretratamiento celular con cúrcuma incrementa la supervivencia de las células tras la
infección con VHSV (Jeong, Vaidya et al. 2015).
8
2. Antecedentes y objetivos
En el grupo de virus de peces del Instituto de Biología Molecular y Celular de la
Universidad Miguel Hernández, ya se han realizado previamente estudios para la
determinación de la capacidad antiviral de ciertos compuestos, tanto sintéticos como
naturales.
En cuanto a compuestos sintéticos, se llevó a cabo el estudio de efecto
inhibitorio de la ribavirina y el ácido micofenólico (MPA) sobre la replicación de VHSV e
IPNV (Marroqui, Estepa et al. 2008), en el que demostraron que el ácido micofenólico es
más efectivo en la inhibición de virus de trucha que la ribavirina, especialmente frente
a IPNV. Se observó que el efecto inhibitorio se produce tanto al pretratar las células
como al añadirlo durante la infección.
También se ha estudiado el efecto de compuestos vegetales, en concreto el
efecto anti-VHSV del extracto de hoja de olivo (Micol, Caturla et al. 2005). Se observó
que tanto el extracto puro de la hoja de olivo como el compuesto oleuropeina producían
una reducción de la propagación del virus cuando se incubaba VHSV con el extracto
previamente a la infección
El presente estudio se basa en el estudio de extractos vegetales y su efecto
sobre ciertos virus. Concretamente, extractos de Cistus y cúrcuma. Los objetivos de este
trabajo son:
1. Estudio de la citotoxicidad de los extractos utilizados en una línea celular de
pez (EPC).
2. Determinación de la capacidad antiviral de los extractos de Cistus. Dentro
de este apartado se incluye la determinación del modo de acción de los
extractos.
3. Determinación del espectro de acción de estos extractos, es decir, ver si
tienen efecto sobre diferentes tipos de virus como son VHSV, SVCV (virus
de la viremia primaveral de carpa), e IPNV.
9
4. Determinar la capacidad antiviral de nuestro preparado de cúrcuma,
fundamentalmente sobre VHSV.
10
3.
Materiales y métodos
3.1. CULTIVOS CELULARES
3.1.1.
Medios de cultivo
Las líneas celulares utilizadas en este trabajo fueron cultivadas con medio RPMI
modificado por Dutch con 20 mM (290 mOsm/Kg) (Gibco BRL-Invitrogen, Barcelona,
España), 2 o 10% de suero fetal bovino (SFB, Linus-Cultek, Madrid), 2 mM de glutamina
(Gibco BRL), 1 mM de piruvato sódico (Gibco BRL), 50 µg/ml de gentamicina (Gibco BRL)
y 1,2 µg/ml de anfotericina (Gibco BRL). En el presente estudio se nombra a este medio
de cultivo como RPMI 2 o 10%, dependiendo del porcentaje de suero fetal bovino en
disolución.
3.1.2.
Líneas celulares
La línea celular EPC (Epitelioma Papullosum Cyprini) procede de un pez de la
familia de la carpa (Pimephales promelas). Fue comprada de la colección europea de
cultivos celulares (identificación ECACC nº 93120820). Las células EPC se mantuvieron
en frascos de cultivo de 25 cm2 y 75 cm2 de superficie, a 25 ºC en medio RPMI 10%. Para
subcultivarlas, las células se despegaron de los frascos con una solución de 0,05 % de
tripsina-EDTA (Sigma-Aldrich) y se diluyeron con medio de cultivo al volumen necesario
para sembrar los nuevos frascos o placas.
La línea celular CHSE (CHinook Salmo Embryo) es una línea celular embrionaria
de salmón (Oncorhynchus tshawytscha). A diferencia de la línea EPC, son susceptibles
de ser infectadas por el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV).
3.2. VIRUS Y TITULACIÓN
3.2.1.
Virus
Se utilizaron tres tipos de virus: VHSV, el virus de la septicemia hemorrágica
vírica, e IPNV (virus de la necrosis pancreática infecciosa), cuyas infecciones se
11
desarrollaron a 14ºC; y SVCV (virus de viremia primaveral de la carpa), cuyas infecciones
transcurren a 22º. Para los tres virus el medio utilizado fue RMPI 2%.
3.2.2.
Titulación
Monocapas de células EPC fueron crecidas hasta el 100 % de confluencia en
placas de 96 pocillos y, posteriormente, infectadas con 100 μl por pocillo de diluciones
seriadas en medio RPMI 2% de sobrenadantes de EPC infectadas y que, a su vez, fueron
tratadas con los respectivos extractos. La infección se mantuvo a 14º C hasta que se
observó efecto citopático. Una vez concluido el período de infección, las monocapas se
fijaron y se tiñeron con 0,1 % cristal violeta disuelto en formaldehído. La detección de
lisis celular añadiendo HCl y midiendo la absorbancia.
El título de virus, expresado como TCID50/ml, se calculó como el inverso de la
última dilución con efecto citopático en el 50 % de los replicados, según la fórmula:
1
10−(log dilución >50%−I)
· 10, donde I = (porcentaje pocillos infectados en la dilución donde
se obtiene más del 50% de infección - 50%) / (porcentaje pocillos infectados en la
primera dilución donde se obtiene más del 50% de infección - porcentaje de pocillos
infectados en la primera dilución donde se obtiene menos del 50% de infección).
3.3. PREPARACIÓN DE EXTRACTOS
3.3.1.
Extractos de Cistus
Los extractos fueron proporcionados por el Dr. Enrique Barrajón (IBMC) bien en
un stock a una concentración de 50 mg/ml o bien en forma de polvo. Su origen preciso
y método de preparación no fueron revelados por lo que sencillamente se les denominó
de E1 a E6. Los stocks de los extractos E1, E2 y E3 estaban disueltos en DMSO 100%,
mientras que los stocks de los extractos E4, E5 y E6 eran polvo.
A partir de los stocks iniciales se preparó un stock a menor concentración, 5
mg/ml, que fue el utilizado en todos los ensayos para preparar las diluciones
correspondientes. Para ello, los extractos E1, E2 y E3 se diluyeron con PBS y estos se
12
mantuvieron a 4ºC. Por otro lado, los extractos E4, E5 Y E6 se diluyeron en PBS y DMSO
en una proporción 9:1, y se mantuvieron a -20ºC.
3.3.2.
Cúrcuma
Se utilizó un extracto refinado de la raíz de la planta Curcuma longa, procedente
de la empresa Labiofam (Cuba). Se preparó un stock de cúrcuma a una concentración
de 20 mM, que fue el utilizado para realizar las diluciones en los ensayos. Para ello, se
diluyo la cúrcuma aportada en 25% DMSO y 75% PBS.
3.4. ENSAYO DE CITOTOXICIDAD: ENSAYO MTT
Este ensayo se empleó para determinar el nivel de toxicidad de los extractos
utilizados en el trabajo. El ensayo de MTT nos da el porcentaje de viabilidad celular.
En primer lugar, se sembraron 70.000 células por pocillo y se dejaron 24 horas
a 28ºC gaseadas con CO2. Una vez confluentes, se añadieron 100 μl por pocillo de los
extractos a concentraciones crecientes y se vuelven a dejar a 28ºC gaseadas durante 48
horas. Transcurrido ese tiempo, se tratan las células con 100 μl de MTT, a una
concentración inicial de 5 mg/ml, diluido en PBS en una relación 1:1 hasta una
concentración final de 1,9 mg/ml. Se deja durante 3 horas a 28ºC y, pasadas las 3 horas,
se retira y se añade 100 μl de DMSO. El DMSO se deja actuar durante 30 minutos a 28ºC.
Pasados los 30 minutos se mide la absorbancia en el espectrofotómetro a 570 nm.
Las células vivas, metabólicamente activas, son capaces de transformar el
bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT), amarillo, en formazán,
de color azul, gracias a la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenada. De esta forma
se puede determinar la funcionabilidad mitocondrial de las células tratadas. Es un
método muy utilizado para medir la viabilidad celular puesto que la cantidad de células
vivas es proporcional a la cantidad de formazán producido.
13
3.5. ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIVIRAL
3.5.1.
Ensayo de tratamiento durante la infección
Con este ensayo se pretendía determinar si los extractos tenían algún efecto en
el proceso de infección.
Para ello, se prepararon diluciones de los extractos con el virus a una moi de
0,01, virus por célula, con medio RMPI 2%, y se añadieron estas diluciones a los pocillos
con células ya crecidas y confluentes. Este ensayo se realizó de dos formas: la primera
fue dejando los extractos en el medio durante la infección, y la segunda fue retirando el
medio con el inóculo del virus a los 90 minutos y añadiendo RPMI2%. Se utilizó la
segunda cuando interesaba recoger sobrenadantes para titular.
3.5.2.
Ensayo de pretratamiento celular
Este ensayo tuvo como finalidad determinar si los extractos tenían algún tipo
de efecto sobre la capacidad de las células de defenderse frente al virus.
Para ello, se añadieron 100 μL por pocillo de las diluciones preparadas de los
extractos. Se dejaron incubar durante 24 horas. Pasadas 24 horas, se retiró por volcado
el medio RPMI 2% en el que estaban diluidos los extractos y se infectaron las células
añadiendo 100 μL de RMPI2% en el que previamente se ha diluido el virus para alcanzar
una multiplicidad de infección de 0,01.
Al retirar el medio en el que está diluido el extracto y añadir el medio con el
virus, lo que conseguimos es que en el medio no haya extracto. Por tanto, el efecto que
se observe únicamente se deberá al cambio que haya producido en la célula
previamente a la infección y no el efecto que pueda tener sobre el virus al estar en el
medio en el momento de la infección.
14
3.5.3.
Ensayo de acción directa sobre el virus
En este ensayo se trató el virus con los extractos en un paso previo a la infección
con el fin de determinar si los extractos tienen cierto efecto sobre la capacidad de
infección del virus.
Los extractos se diluyeron junto con el virus en RPMI 2% hasta la concentración
a la cual queríamos determinar su efecto. El virus debe quedar a una concentración
superior a la concentración de infección. Así, posteriormente se diluye de tal forma que
el virus queda a un multiplicidad de 0,01, que es la que interesa para infectar, mientras
que el extracto queda a una concentración muy por debajo de a la cual tendría actividad.
Esto se hace así para asegurar que el efecto observado se deba al efecto que puede
tener el extracto sobre el virus y no sobre la infección o la célula.
Se dejaron actuar durante 90 minutos y, transcurrido ese tiempo, se añadieron
100 μL por pocillo de la preparación anterior, diluyéndolo con RMPI 2%, de tal forma
que el virus alcanza una moi de 0,01.
3.6. TINCIONES, ABSORBANCIAS Y CÁLCULOS
3.6.1.
Tinciones con cristal violeta y con Giemsa
Esta tinción se empleó para obtener una medida cualitativa de la viabilidad
celular. Una vez se observa un efecto citopático claro en las placas mediante el
microscopio electrónico, se añaden 75 μL por pocillo de violeta de metilo (cristal violeta)
disuelto en formaldehído, sin retirar el medio, y se deja tiñendo una hora. Este colorante
tiñe las células fijadas al plástico de los pocillos, permitiendo diferenciar los niveles de
infección entre pocillos por inspección ocular.
En los casos en los que interesaba realizar fotografías en el microscopio óptico,
se tiñeron las placas con Giemsa. Para ello, en primer lugar se retira el medio y se añaden
100 μL por pocillo de metanol. Pasados 15 minutos se retira y se deja secar. Una vez esta
seca la placa, se añaden 100 μL de Giemsa por pocillo y se deja teñir media hora. En esta
tinción, el efecto citopático debe ser menor que en el caso de teñir con cristal violeta
15
puesto que el metanol es más agresivo y levanta la células si no están suficientemente
fijadas.
3.6.2.
Medida de la absorbancia
Para obtener una medida cuantitativa de los resultados, en algunos
experimentos se realizó una medición espectrofotométrica. Para ello, tras la tinción, se
añadieron 100 μL de ácido clorhídrico 0,1 N por pocillo y la dilución se midió en un
espectrofotómetro de lectura de placas multipocillo. La longitud de onda a la que se
midió la absorbancia fue a 620 nm en el caso del Giemsa y, en el caso de la tinción con
cristal violeta, se utilizaron dos longitudes: 570 nm es el pico de absorción pero, en los
casos en los que el espectrofotómetro daba error de saturación, se aumentó la longitud
de onda a 620 nm.
3.6.3.
Cálculo del % de supervivencia y del % de protección
Los resultados están expresados en porcentaje de viabilidad celular, en el
ensayo de MTT o porcentaje de supervivencia celular y, en algunos casos, están
expresados en % de protección.
El porcentaje de viabilidad celular se calcula considerando que la media de los
valores de absorbancia de los controles sin tratar representa un 100% de viabilidad
celular y el resto de valores se sacan en base a ese porcentaje. El porcentaje de
supervivencia celular se calcula considerando que la media de los controles sin infectar
representa el 100% de supervivencia celular y el resto de valores se sacan en base a ese
valor. El porcentaje de protección se calcula considerando 100% a la diferencia entre los
controles sin infectar y los controles infectados.
En los tres casos, los experimentos se realizan por triplicado y se calcula la
media y la desviación estándar del triplicado.
16
4. Resultados
4.1. ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE EXTRACTOS DE PLANTAS DEL GÉNERO CISTUS
Como se indicó anteriormente, partimos de seis extractos (E1 a E6) cuya
preparación y composición era desconocida para nosotros.
4.1.1.
Citotoxicidad de los extractos
El ensayo MTT se realizó para determinar la citotoxicidad de los extractos E1,
E2, E3, E4, E5 Y E6 a 5 concentraciones crecientes, en células EPC. Los resultados están
recogidos en la figura 9. Se observó un descenso de la viabilidad celular en el extracto
E4 del 100% al 36% a una concentración de 40 μg/ml y al 3.8% a una concentración de
80 μg/ml. En el resto de los extractos la viabilidad descendió un poco con respecto al
control sin tratar, pero no fue un descenso tan marcado como en el caso del extracto
E4.
Figura 9. Ensayo de citotoxicidad MTT de los diferentes extractos a concentraciones crecientes
en la línea celular EPC a los 2 días de tratamiento. La absorbancia se midió a 570 nm y se
determinó el % de viabilidad considerando como control las células no tratadas (100% viabilidad
celular). El ensayo se realizó por triplicado y se representan las medias con sus respectivas
desviaciones estándar.
17
4.1.2.
Actividad anti-VHSV
Para determinar la actividad anti-VHSV de los extractos se procedió a realizar
tres tipos de ensayos: ensayo de pretratamiento celular, ensayo de acción directa sobre
el virus y ensayo de tratamiento durante la infección.
a) Ensayo de tratamiento durante la infección
En este ensayo se procedió a añadir los respectivos extractos en el momento
de la infección con VHSV. Para ello, se preparó una dilución del virus junto con los
extractos para obtener una moi final de 0,01 y concentraciones crecientes de los
extractos (5, 10, 20 y 40 μg/ml). Se añadieron las diluciones preparadas a los pocillos
con las células ya crecidas y confluentes. Se paró la infección a los 7 días y se tiñó con
cristal violeta. Los resultados aparecen recogidos en la figura 10A y B. Aparecen por
separado puesto que los experimentos se realizaron independientemente.
A
18
B
Figura 10. Inhibición de la proliferación de VHSV en EPC a una multiplicidad de infección de 0,01
por los extractos E1, E2, E3, E4 (A) y E5 y E6 (B) a concentraciones crecientes. Parada de la
infección a los 7 días post infección. Las células fueron teñidas con cristal violeta seguido de una
dilución con HCl 0,1M. Se midió la absorbancia a 570 nm. El porcentaje de viabilidad celular se
determinó comparándolo con el control no infectado (100% viabilidad). En las gráficas se
muestran las medias de los triplicados con sus correspondientes desviaciones estándar.
Se observó que los extractos que producían un mayor aumento de la
supervivencia celular son E2 y E5. El extracto E2 incrementa la supervivencia celular de
un 57,2% a un 78,6% a una concentración de 40 μg/ml, mientras que para el extracto E5
se observó un incremento de la supervivencia celular del 30% al 77,2% a 20 μg/ml y al
86,4% cuando se aumenta la concentración a 40 μg/ml.
Para confirmar los datos obtenidos, se realizó por segunda vez el experimento
incluyendo en este caso los 6 extractos en el mismo experimento, obteniéndose los
resultados que se observan en la figura 11.
19
Figura 11. Inhibición de la proliferación de VHSV en EPC a una multiplicidad de infección de 0,01
por los extractos E1, E2, E3, E4, E5 y E6 a concentraciones crecientes. Parada de la infección a
los 7 días post infección. Las células fueron teñidas con cristal violeta seguido de una dilución
con HCl 0,1M. Se midió la absorbancia a 570 nm. El porcentaje de viabilidad celular se determinó
comparándolo con el control no infectado (100% viabilidad). En las gráficas se muestran las
medias de los triplicados con sus correspondientes desviaciones estándar.
A pesar de algunas diferencias, con el resultado obtenido se puede confirmar
que E2 y E5 son los extractos que producen un incremento de la supervivencia celular a
una concentración de 40μg/ml. Nuevamente se repite que el E4 es el más tóxico para
las células a 40 µg/ml.
En algunos casos es posible que el efecto antiviral del extracto quede algo
enmascarado por su toxicidad. Por ello, se decidió realizar un ensayo para determinar si
se producía reducción del título de virus en presencia de los extractos. Para ello, se
preparó una placa de 24 pocillos, donde se añadieron los extractos a una concentración
de 20 μg/ml junto con VHSV a una moi de 0,01. Tras 6 días de infección se recogieron
los sobrenadantes y se cuantificó el virus mediante una titulación por dilución límite. Los
resultados obtenidos se recogen en la figura 12.
20
Figura 12. Efecto de los distintos extractos sobre la producción de VHSV. Células EPC fueron
infectadas con VHSV a multiplicidad 0,01 en presencia de los extractos (20 μg/ml). Tras 6 dpi, se
recogieron muestras de sobrenadantes y se cuantificó el virus mediante ensayo de dilución
límite.
Se observó una disminución del título de VHSV para los extractos E3, E4 Y E5
con respecto al control sin extracto. El extracto E1 produce una subida del título de virus
de dos órdenes de magnitud que no podemos explicar.
b) Otros ensayos de actividad antiviral

Ensayo de acción directa sobre el virus
Para determinar si el extracto tenía efecto directo sobre el virus, se preparó una
dilución en la que el virus estaba a una concentración superior a la concentración final
deseada (moi=0.01), y el extracto a la concentración a la que queríamos observar el
efecto (20 μg/ml). Tras dejarlo actuar durante 90 minutos, se diluyó hasta que el virus
quedó a una moi=0,01, de tal forma que se diluye el extracto hasta una concentración a
la que ya no es activo. Se paró la infección a los 6 días y se tiñó la placa con Giemsa,
obteniéndose los resultados que se muestras en la figura 13.
21
Figura 13. Inhibición de la infectividad de VHSV en células EPC con una multiplicidad de infección
(moi) de 0,01 por los diferentes extractos a una concentración de 20 µg/ml. La infección se
detuvo a los 6 días post infección. Las células fueron fijadas con metanol, teñidas con Giemsa y,
posteriormente, disueltas en HCl. Se midió su absorbancia a 620 nm. La viabilidad celular se
obtuvo tomando como control las células no infectadas (100% viabilidad).
Los resultados mostraron que a 20 μg/ml solo el extracto E4 produce un
incremento de la viabilidad celular con respecto al control infectado, aumentando el
porcentaje de un 31.8% a un 51.6%.

Ensayo de pretratamiento celular
En el ensayo de pretratamiento, los extractos se añadieron a las células
confluentes a 4 concentraciones distintas: 5, 10, 20 y 40 μg/ml. Una vez preparados los
extractos, se retiró el medio de la placa y se añadieron las diluciones preparadas de los
extractos. Se dejaron incubar durante 24 horas y pasado ese tiempo se infectaron las
células con VHSV a una multiplicidad de infección de 0,01. Se paró la infección a los 6
días post infección. No se observó un incremento de la viabilidad celular en ninguno de
los extractos (no mostrado).
4.1.3.
Actividad sobre otros virus de pez
Para determinar si los extractos tenían efecto sobre otros virus, se procedió a
realizar ensayos con un virus de la misma familia que VHSV (SVCV, rhabdoviridae) y otro
de familia distinta (IPNV, birnaviridae).
22
a) Efecto sobre SVCV

Ensayo de tratamiento durante la infección
Como SVCV plaquea muy bien se procedió a realizar el ensayo de tratamiento
durante la infección por reducción de calvas. Para ello se añadió el virus a una moi de
0,01. Se dejó actuar durante 90 minutos y, pasado este tiempo, se retiró el virus y se
añadió el extracto junto con metilcelulosa 100% en un proporción (1:1) de forma que el
extracto queda a una concentración final de 20 μg/ ml y la metilcelulosa al 50%. A los 4
días post infección se paró la infección y se tiño la placa con cristal violeta. Los resultados
se muestran en la figura 14. Se observa que en los pocillos de los extractos E1, E2, E3 y
E5 hay menos efecto citopático.
Figura 14. Inhibición de la replicación de VHSV (500 virus por pocillo) por los diferentes extractos
a una concentración de 20 µg/ml en metilcelulosa al 50%. Tinción con cristal Violeta a los 4 días
post infección.

Ensayo de acción directa sobre el virus
Como SVCV es un virus envuelto, al igual que VHSV, se procedió a realizar el
ensayo de acción directa para ver si el efecto era similar al que tenía lugar en VHSV. Se
realizó por calvas, de forma que se incubo el virus junto con el extracto a 2
concentraciones distintas (20 y 40 μg/ml) y tras 90 minutos de incubación se añadió a
las células con metilcelulosa 100%. El resultado es el que se observa en la figura 15.
23
Figura 15. Inhibición de la infectividad de SVCV (100 pfu/poc) para el extracto E4 a una
concentración de 20 y 40 µg/ml en metilcelulosa al 50%. Tinción con cristal Violeta a los 3 días
post infección.
Se observó que para el extracto E4 el número de calvas es menor que para el
control infectado, resultado que concuerda con el obtenido para VHSV.
b) Efecto sobre IPNV
Se procedió a determinar si algún extracto podría también tener efecto sobre
IPNV. Para ello se realizó un ensayo de tratamiento durante la infección, ya que IPNV no
hace calvas, en el que se infectaron las células confluentes con IPNV a una moi de 0,01
y, tras dejar actuar al virus durante 90 minutos, se retiró por volcado y se añadieron los
extractos a distintas concentraciones finales (5, 10, 20 y 40 μg/ml). Se dejaron 5 días y,
pasado este tiempo, se paró la infección y se tiñó la placa con cristal violeta. Los
resultados se muestran en la figura 16. Se observa un incremento de la viabilidad celular
con respecto al control sin infectar del 30% al 90% para los extractos E4 y E5 a partir de
20 μg/ml.
Es curioso hacer notar que en las células CHSE el extracto E4 no resulta tan
tóxico como en las EPC. Al ser células de distinta especie y naturaleza es posible que la
diferente composición de membrana les haga menos susceptibles al E4.
24
Figuras 16. Inhibición de la proliferación de IPNV en células CHSE con a una multiplicidad de
infección de 0,01 por los extractos E1, E2, E3, E4, E5 y E6 a concentraciones crecientes. Parada
de la infección a los 5 días post infección. Las células fueron teñidas con cristal violeta y,
posteriormente, diluidas con HCl 0,1M para medir la absorbancia a 570 nm. El porcentaje de
viabilidad celular se determinó comparándolo con el control no infectado (100% viabilidad). En
la gráfica se muestra la media del triplicado con su correspondiente desviación estándar.
4.2. ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE CÚRCUMA
4.2.1.
Cúrcuma sin filtrar
Se realizó un ensayo para comprobar si la cúrcuma tenía efecto anti-VHSV al
pretratar las células o al tratarlas en el momento de la infección. Para ello, se prepararon
concentraciones crecientes de cúrcuma (15, 30, 60, 120 y 240 μM) y se añadieron 100
μL por pocillo, dejándola actuar 24 horas. Pasadas las 24 horas, se retiró la cúrcuma y se
añadió VHSV a una moi de 0,01. De forma paralela, en la misma placa, se realizó en
ensayo de tratamiento durante la infección. Para este ensayo se prepararon diluciones
de virus a una moi de 0,01 junto con la cúrcuma a las respectivas concentraciones y una
vez preparadas se añadió 100 μl por pocillo a las células confluentes de la placa. A los 6
días post infección se paró la infección y se tiñó con Giemsa. Los resultados
representados tanto en porcentaje de supervivencia celular como en porcentaje de
protección, se muestran en la figura 17A y B.
25
A
B
Figura 17. Inhibición de la proliferación de VHSV en EPC a una multiplicidad de infección de 0,01
por la cúrcuma a concentraciones 15, 30, 60, 120 y 240 μM al pretratar las células previamente
a la infección (PRE, ○, color naranja) o al añadir el extracto al mismo tiempo que el virus (INF, ■,
color azul). Parada de la infección a los 6 días post infección. Se les añadió HCl 0,1M a las células
para posteriormente medir la absorbancia en es espectrofotómetro a 620 nm. Se calculó el
porcentaje de supervivencia celular considerando el 100% la media de las no infectadas (A) y el
porcentaje de protección considerando la media entre infectadas y no infectadas como el
100%(B).
26
Según se puede observar en las gráficas, el porcentaje de supervivencia
aumentó ligeramente al pretratar las células, observándose desde la concentración más
baja de cúrcuma (15 μM). Solo se observa un aumento de la supervivencia cuando se
trató al mismo tiempo de la infección cuando se utilizó una concentración de 240 μM.
Sin embargo, el porcentaje de supervivencia celular en el control infectado es muy alto
de partida, por lo que las diferencias se observan mejor tratando los datos de otra
manera. Si lo observamos en base al porcentaje de protección, calculado como 100% de
protección la diferencia de los valores de absorbancia entre células no infectadas e
infectadas, las diferencias son más claras. Se observa un efecto dosis/respuesta mayor
al pretratar las células que al tratarlas durante la infección, obteniéndose el máximo de
protección en los dos casos a la concentración de 240 μM, con un 74% de protección en
las células pretratadas y un 63% en las tratadas durante la infección.
4.2.2.
Cúrcuma filtrada
En los ensayos con cúrcuma anteriores observamos que el stock de cúrcuma
utilizado tendía a precipitar. Para evitar este problema, se procedió a preparar un nuevo
stock de cúrcuma, igual que el anterior, a una concentración de 100 μM, pero está vez
seguido de un paso de filtrado.
Para ello, una vez preparado el stock, se sometió a sonicación para disgregar
los grumos lo máximo posible y, posteriomente, se filtró haciéndolo pasar por un filtro
de 0,45 nm.
Se procedió a realizar un ensayo MTT para determinar posible toxicidad de la
cúrcuma a distintas concentraciones. Las concentraciones de cúrcuma utilizadas fueron:
20, 40, 80, 120, 180, 240 y 300 μM. Los resultados obtenidos se recogen en la figura 18.
27
Figura 18. Ensayo de citotoxicidad MTT de cúrcuma a distintas concentraciones en la línea
celular EPC tras 2 días de tratamiento. La absorbancia se midió a 570 nm y se determinó el % de
viabilidad considerando las células sin tratar como control negativo (100% viabilidad).
Una vez filtrada la cúrcuma, se procedió a realizar el mismo ensayo que con la
cúrcuma sin filtrar, pero en este caso con la cúrcuma filtrada, a concentraciones
crecientes de hasta 600 μM. Los resultados mostraron que el tratamiento con cúrcuma
filtrada no incrementaba la supervivencia células ni el % de protección (no se muestra).
28
5. Discusión
La amenaza de las enfermedades víricas en el sector acuícola es considerado
un tema relevante, como en el resto de actividades intensivas, debido a las pérdidas
económicas que conlleva. Hasta la fecha, se han descubierto un gran número de
enfermedades víricas que afectan a la industria acuícola (Biering, Villoing et al. 2005). En
particular, el virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV), que es el más estudiado
en este trabajo, es considerado uno de los virus más importantes que afectan a la
acuicultura europea, causando pérdidas de alrededor de 40 millones de libras por año
(Hill 1992). La septicemia hemorrágica viral es una enfermedad de declaración obligada
(EOI 2015).
Para controlar las infecciones víricas en peces se han desarrollado algunos tipos
de vacunas, así como terapias con diferentes tipos de compuestos. Los extractos
vegetales son una fuente muy amplia de compuestos antivirales. En las últimas décadas,
un gran número de fitoquímicos han sido reconocidos como compuestos capaces de
controlar las infecciones causadas por virus (Abad, Guerra et al. 2000).
Siguiendo en la línea de trabajo citada anteriormente, buscando compuestos
de origen vegetal con actividad antiviral, en el presente trabajo se ha tratado de
identificar si ciertos compuestos de origen vegetal tienen actividad frente a algunos virus
de peces, en concreto la cúrcuma y diferentes extractos de Cistus.
5.1. EXTRACTOS DE PLANTAS DEL GÉNERO CISTUS
En estudios previos se había determinado la capacidad antiviral de los extractos
de Cistus frente al virus de la gripe (Ehrhardt, Hrincius et al. 2007), con lo que estábamos
interesados en determinar si también afectaba a virus de importancia en acuicultura,
como son VHSV, SVCV e IPNV, virus que infectan a diferentes especies, como son la
trucha, el salmón y la carpa, de alto valor económico.
Se probaron seis extractos a ciegas, nombrados del E1 al E6. Se observó que al
añadir los extractos E2 y E5 durante el periodo de infección de células EPC con VHSV, a
29
una concentración de 40 μg/ml, el porcentaje de supervivencia celular aumentaba con
respecto al control sin extracto en un 22 y un 56%, respectivamente. De estos resultados
se dedujo que estos extractos tienen cierto efecto inhibidor sobre VHSV, inhibiendo la
replicación, lo que conlleva una menor producción de partículas víricas y, por ello, una
menor capacidad de infección, manifestándose en una mayor supervivencia celular.
Para poder determinar si el número de partículas virales decrecía se titularon
sobrenadantes de VHSV de las células tratadas con los diferentes extractos a una
concentración de 20μg/ml. El menor título se observó para el extracto E5, seguido de
los extractos E3 y E4, respectivamente, con un título de 10 6. Esto supone un orden de
magnitud menos con respecto al control, que obtuvo un título de 107. Se esperaba, por
los resultados del experimento anterior, que se obtuviese un menor título para E2, ya
que el porcentaje de supervivencia celular era mayor. Sin embargo, a diferencia de E5
que sí presentó un título más bajo, para E2 no ocurrió lo mismo. Esta discrepancia se
puede explicar porque ambos ensayos no miden exactamente los mismos parámetros.
Al calcular el porcentaje de supervivencia celular se tiene en cuenta, además de
actividad antiviral, la citotoxicidad de los extractos, mientras que en la titulación se mide
únicamente actividad antiviral. Además, la titulación se realizó a 20 μg/ml,
concentración a la cual en el ensayo de tratamiento durante infección se obtuvo para
E3 y E2 un porcentaje de supervivencia celular similar.
Con el fin de determinar si algún extracto producía efecto a nivel celular o a
nivel de partícula viral, se realizaron otros dos tipos de ensayo: pretratamiento celular y
tratamiento del virus. En el primero de ellos no se observó el efecto de ningún extracto,
a diferencia de los resultados obtenidos en otros estudios para el extracto de olivo
(Micol, Caturla et al. 2005), en el que se obtuvo una reducción del porcentaje de
infectividad de VHSV del 62% cuando se pretrataban células EPC. Se descartó, por tanto,
que alguno de ellos dotase a la célula de cierta capacidad para combatir al virus. En el
segundo caso, al preincubar el virus con cada uno de los seis extractos, se observó un
incremento en el porcentaje de supervivencia celular del 20% cuando se incubó VHSV
junto con el extracto E4 a una concentración de 20 μg/ml. De estos resultados se dedujo
que E4 tenía capacidad virucida, esto es, que tiene un efecto directo sobre las partículas
30
del virus, causándoles un daño que disminuye su capacidad de infectar células. El hecho
de que E4 tenga capacidad de dañar la membrana explicaría su considerable toxicidad.
Es típico de los extractos vegetales que tengan un amplio espectro de acción,
por ello se decidió realizar los mismos ensayos para otros virus: SVCV. Al tratar células
infectadas con SVCV con los diferentes extractos, a una concentración de 20 μg/ml, en
un ensayo de calvas se observó que el efecto citopático era menor en los extractos E1,
E2, E3 y E5 que en el control infectado, sugiriendo que los extractos también tienen
capacidad inhibitoria de la replicación de SVCV. Sería necesario realizar más
experimentos para llegar a una conclusión definitiva, pero nuestros resultados sugieren
que E2 y E5 tienen capacidad de inhibir rhabdovirus.
Para SVCV, se obtuvo un menor efecto citopático con respecto con control
infectado cuando se añadieron los extractos E1, E2, E3 y E5 a 20 μg/ml durante el
periodo de infección, lo que sugiere que estos extractos pueden tener cierto efecto
sobre la replicación de SVCV. Además, se observó que el efecto citopático era menor
también cuando se trataban las células con el virus previamente incubado con el
extracto E4 a una concentración de 20 μg/ml, indicando que E4 podría tener actividad
virucida, al igual que frente a VHSV, frente SVCV.
Puesto que tanto VHSV como SVCV son Rhabdovirus, quisimos estudiar el
efecto sobre otro virus perteneciente a otra familia: IPNV (Birnavirus). En el caso de
IPNV, con el cual se realizó un ensayo donde se calculó el porcentaje de supervivencia
celular, se observó que la supervivencia aumentó a un 90% cuando se trataba con los
extractos E4 y E5 a una concentración de 20 μg/ml, sugiriendo que estos dos extractos
puedes tener cierta capacidad de inhibición de la replicación de IPNV.
Finalizada la parte experimental de este trabajo, nos revelaron el origen y la
composición de los extractos que presentaron mejor actividad antiviral: E2, E4 y E5. Los
extractos E2 y E5, los cuales presentaron actividad al tratar las células durante la
infección, eran un extracto cetónico de la especie Thymus moroderi (cantueso) y un
extracto hidroalcohólico de Cistus albidus, respectivamente. Entre los componentes
mayoritarios de ambos extractos se encuentran la catequina y la quercetina (TomasMenor, Morales-Soto et al. 2013). Por otro lado, el extracto E4, para el cual se observó
31
actividad virucida, se correspondía con la fracción polifenólica de un extracto acuoso de
Cistus salviifolius.
Estudios anteriores revelaron que al añadir catequina durante la infección, se
observaba en células infectadas un efecto inhibitorio del virus de la gastroenteritis
transmisible, un coronavirus (Liang, He et al. 2015). También se ha estudiado con
anterioridad la capacidad antiviral de la quercetina (Chiow, Phoon et al. 2016). En este
estudio, al tratar células infectadas con el virus de la hepatitis de ratón y con el virus del
dengue, se observó una inhibición de la proliferación viral. Estos trabajos tienen en
común con nuestro estudio que todos los virus tienen genoma de RNA de cadena
sencilla y, además, que son virus envueltos. Esto apoya la idea de que, tanto la catequina
como la quercetina tienen algún efecto sobre la replicación de virus con genoma RNA
de cadena sencilla y con envoltura, como VHSV o SVCV.
Además, E2 y E5 tienen otro componente común, aunque en menor
concentración que los anteriores: los flavonoides. También se ha descrito con
anterioridad (Kang, Kang et al. 2012) la capacidad antiviral de los flavonoides
procedentes de Rhus verniciflua frente a VHSV e IHNV, virus envueltos de genoma de
RNA de cadena sencilla. En el citado estudio se sugiere que los flavonoides pueden
ejercer su efecto antiviral induciendo la apoptosis de células infectadas, siguiendo la
línea de estudios previos en los que se había demostrado que los flavonoides inducían
la apoptosis de diferentes líneas celulares de cáncer (Jang, Kook et al. 2005) (Ying, Yang
et al. 2012). Si la inducción de apoptosis en la célula fuera el mecanismo de acción de E2
o E5, esto concuerda con que no se observe efecto virucida, y que únicamente se
manifieste efecto cuando se trata con el extracto durante el periodo de infección.
Además, también se sugiere que puede ser el grupo OH del carbono 3, común en todos
los flavonoides, el responsable de su capacidad antiviral, como ya se había descrito
anteriormente para el virus de la mieloblastosis aviar (Inouye, Yamaguchi et al. 1989),
en el cual los flavonoides inhiben su transcriptasa inversa.
En cuanto al E4, que no es un extracto completo, sino sólo la fracción
polifenólica, los resultados concuerdan con los obtenidos en otros estudios de
compuestos polifenólicos, en los que se describe la actividad virucida de estos. Es el
32
caso del trabajo realizado por Lee JH y cols (Lee, Oh et al. 2016) dónde se describe que
uno de los polifenoles presentes en la especie Rubus coreanus presenta efecto
inhibitorio del virus de la gripe; y el estudio realizado por Calland N y cols (Calland, Sahuc
et al. 2015), donde se describe la capacidad antiviral de un polifenol de origen natural,
la delfinidina. Además, en este último artículo se sugiere la delfinidina actúa
directamente sobre la partícula viral, induciendo
deformaciones a modo
de”hinchazones” en la membrana del virus.
5.2. CÚRCUMA
Está descrito que la cúrcuma tiene actividad antiviral frente a diferentes virus
con envoltura (Chen, Chen et al. 2013) y, específicamente, frente a VHSV (Jeong, Vaidya
et al. 2015).
Al realizar el ensayo de pretratamiento celular con cúrcuma sin filtrar se
observó un incremento del 23,2% en términos de viabilidad y de un 73,8% en términos
de protección, a una concentración de 240 μM. Estos datos coinciden con los obtenidos
en estudios previos (Chen, Chen et al. 2013), dónde se obtuvo un porcentaje de
viabilidad mayor del 90% cuando se pretrataban las células con cúrcuma en un rango de
concentraciones entre 15 y 120 μM, recuperando el 100% de viabilidad a los 120 μM.
Estos resultados sugieren que el pretratamiento con cúrcuma es capaz de inducir algún
tipo de estado antiviral en las células, de forma que se produce una reducción de la
replicación de VHSV. Esto tendría interesantes implicaciones prácticas de funcionar in
vivo, ya que al administrárselo a los peces les haría más resistentes a posteriores
infecciones con VHSV.
Al añadir la cúrcuma durante el periodo de infección, se observa un incremento
de la viabilidad al 90% a una concentración de 240 μM, con lo que sí tiene cierto efecto
antiviral, pero es menor que el que se produce cuando se pretratan las células. Estos
resultados coinciden con estudios previos (Jeong, Vaidya et al. 2015) en los que se
describe que el pretratamiento con cúrcuma incrementa la viabilidad celular de células
infectadas con VHSV de forma directamente proporcional a la concentración y que este
efecto es mucho menor cuando se añade la cúrcuma una vez que se ha producido la
33
entrada viral. Los resultados en ambos casos muestran la mayor actividad en el rango
de 100 a 300 μM. Además, en un estudio realizado en Chen Tzu-Yen (Chen, Chen et al.
2013), se comparó el efecto antiviral de la cúrcuma sobre virus envueltos y sobre virus
no envueltos, obteniendo efecto antiviral sólo en aquellas células infectadas con virus
envueltos Una posibilidad es que la cúrcuma interaccione con las proteínas de
membrana del virus, pero esto es sólo una hipótesis.
Durante la realización de los ensayos con cúrcuma se observó que la disolución
stock no se mantenía homogénea y que tendía a precipitar, por lo que se decidió filtrarla.
Al filtrarla, se comprobó que no era tóxica en el rango de concentraciones entre 0 y 300
μM, pero al realizar el ensayo de actividad anti-VHSV no se obtuvo actividad de la
cúrcuma incluso a concentraciones de 600 µM. Esto podría ser debido a que hay
pérdidas de material que queda retenido en el filtro.
34
6. Conclusiones y perspectivas futuras
Las conclusiones que se pueden obtener a raíz de este trabajo son las
siguientes:
1. Los extractos E2 (de Thymus) y E5 (de Cistus) inhiben algún paso del ciclo de
replicación viral de VHSV.
2. El extracto E4 tiene actividad directa sobre la partícula viral de VHSV y SVCV.
3. Los extractos E4 y E5 inhiben virus de dos familias distintas, con lo que
podrían tener amplio espectro de acción.
4. El preparado no filtrado de cúrcuma induce en las células EPC protección
frente a VHSV.
En cuanto a los pasos futuros de este estudio sería precisar la concentración
inhibitoria 50& (IC50) de los compuestos con mayor efecto anti-VHSV: E2, E4, E5 y
cúrcuma, así como comprobar posibles sinergias entre compuestos. En cuanto a los
extractos E2 y E5, determinar la actividad antiviral de algunos de sus componentes
mayoritarios (catequina, quercetina). El siguiente avance sería determinar el mecanismo
de acción de los extractos sobre VHSV así como evaluar la posibilidad de su empleo in
vivo, en el modelo de pez cebra.
35
Bibliografía
1. Abad, M. J., J. A. Guerra, P. Bermejo, A. Irurzun and L. Carrasco (2000). "Search for
antiviral activity in higher plant extracts." Phytother Res 14(8): 604-607.
2. Biering, E., S. Villoing, I. Sommerset and K. E. Christie (2005). "Update on viral vaccines
for fish." Dev Biol (Basel) 121: 97-113.
3. Brudeseth, B. E., R. Wiulsrod, B. N. Fredriksen, K. Lindmo, K. E. Lokling, M. Bordevik, N.
Steine, A. Klevan and K. Gravningen (2013). "Status and future perspectives of vaccines
for industrialised fin-fish farming." Fish Shellfish Immunol 35(6): 1759-1768.
4. Calland, N., M. E. Sahuc, S. Belouzard, V. Pene, P. Bonnafous, A. A. Mesalam, G.
Deloison, V. Descamps, S. Sahpaz, C. Wychowski, O. Lambert, P. Brodin, G. Duverlie, P.
Meuleman, A. R. Rosenberg, J. Dubuisson, Y. Rouille and K. Seron (2015). "Polyphenols
Inhibit Hepatitis C Virus Entry by a New Mechanism of Action." J Virol 89(19): 1005310063.
5. Chang, S. J., S. H. Huang, Y. J. Lin, Y. Y. Tsou and C. W. Lin (2014). "Antiviral activity of
Rheum palmatum methanol extract and chrysophanol against Japanese encephalitis
virus." Arch Pharm Res 37(9): 1117-1123.
6. Chen, T. Y., D. Y. Chen, H. W. Wen, J. L. Ou, S. S. Chiou, J. M. Chen, M. L. Wong and W.
L. Hsu (2013). "Inhibition of enveloped viruses infectivity by curcumin." PLoS One 8(5):
e62482.
7. Chiow, K. H., M. C. Phoon, T. Putti, B. K. Tan and V. T. Chow (2016). "Evaluation of
antiviral activities of Houttuynia cordata Thunb. extract, quercetin, quercetrin and
cinanserin on murine coronavirus and dengue virus infection." Asian Pac J Trop Med 9(1):
1-7.
8. Ehrhardt, C., E. R. Hrincius, V. Korte, I. Mazur, K. Droebner, A. Poetter, S. Dreschers, M.
Schmolke, O. Planz and S. Ludwig (2007). "A polyphenol rich plant extract, CYSTUS052,
exerts anti influenza virus activity in cell culture without toxic side effects or the tendency
to induce viral resistance." Antiviral Res 76(1): 38-47.
9. EOI (2015). "Viremia primaveral de la carpa. Manual de las Pruebas de Diagnóstico para
los Animales Acuáticos."
10. FAO, F. a. A. O. o. t. U. N. (2015). "La Acuicultura en España."
11. Gomez-Casado, E., A. Estepa and J. M. Coll (2011). "A comparative review on Europeanfarmed finfish RNA viruses and their vaccines." Vaccine 29(15): 2657-2671.
12. Hill, B. (1992). "Impact of viral diseases on salmond fish in Europe." Proceedings of the
OJI International symposium on salmonid diseases.
13. Hudson, J. B., E. A. Graham and M. F. Simpson (1988). "The efficacy of amantadine and
other antiviral compounds against two salmonid viruses in vitro." Antiviral Res 9(6): 379385.
14. Inouye, Y., K. Yamaguchi, Y. Take and S. Nakamura (1989). "Inhibition of avian
myeloblastosis virus reverse transcriptase by flavones and isoflavones." J Antibiot
(Tokyo) 42(10): 1523-1525.
15. Jang, H. S., S. H. Kook, Y. O. Son, J. G. Kim, Y. M. Jeon, Y. S. Jang, K. C. Choi, J. Kim, S. K.
Han, K. Y. Lee, B. K. Park, N. P. Cho and J. C. Lee (2005). "Flavonoids purified from Rhus
36
verniciflua Stokes actively inhibit cell growth and induce apoptosis in human
osteosarcoma cells." Biochim Biophys Acta 1726(3): 309-316.
16. Jeong, E. H., B. Vaidya, S. Y. Cho, M. A. Park, K. Kaewintajuk, S. R. Kim, M. J. Oh, J. S. Choi,
J. Kwon and D. Kim (2015). "Identification of regulators of the early stage of viral
hemorrhagic septicemia virus infection during curcumin treatment." Fish Shellfish
Immunol 45(1): 184-193.
17. Kamei, Y. and M. Aoki (2007). "A chlorophyll c2 analogue from the marine brown alga
Eisenia bicyclis inactivates the infectious hematopoietic necrosis virus, a fish
rhabdovirus." Arch Virol 152(5): 861-869.
18. Kang, S. Y., J. Y. Kang and M. J. Oh (2012). "Antiviral activities of flavonoids isolated from
the bark of Rhus verniciflua stokes against fish pathogenic viruses In Vitro." J Microbiol
50(2): 293-300.
19. Kim, S. Y., S. R. Kim, M. J. Oh, S. J. Jung and S. Y. Kang (2011). "In vitro antiviral activity
of red alga, Polysiphonia morrowii extract and its bromophenols against fish pathogenic
infectious hematopoietic necrosis virus and infectious pancreatic necrosis virus." J
Microbiol 49(1): 102-106.
20. LaPatra, S. E. L., K.A. (1998). "Resistance to IHN virus infection in rainbow trout is
increased by glucan while subsequent production of serum neutralizing activity is
decreased".
21. Lee, J. H., M. Oh, J. H. Seok, S. Kim, D. B. Lee, G. Bae, H. I. Bae, S. Y. Bae, Y. M. Hong, S.
O. Kwon, D. H. Lee, C. S. Song, J. Y. Mun, M. S. Chung and K. H. Kim (2016). "Antiviral
Effects of Black Raspberry (Rubus coreanus) Seed and Its Gallic Acid against Influenza
Virus Infection." Viruses 8(6).
22. Liang, W., L. He, P. Ning, J. Lin, H. Li, Z. Lin, K. Kang and Y. Zhang (2015). "(+)-Catechin
inhibition of transmissible gastroenteritis coronavirus in swine testicular cells is involved
its antioxidation." Res Vet Sci 103: 28-33.
23. Marroqui, L., A. Estepa and L. Perez (2007). "Assessment of the inhibitory effect of
ribavirin on the rainbow trout rhabdovirus VHSV by real-time reverse-transcription PCR."
Vet Microbiol 122(1-2): 52-60.
24. Marroqui, L., A. Estepa and L. Perez (2008). "Inhibitory effect of mycophenolic acid on
the replication of infectious pancreatic necrosis virus and viral hemorrhagic septicemia
virus." Antiviral Res 80(3): 332-338.
25. Micol, V., N. Caturla, L. Perez-Fons, V. Mas, L. Perez and A. Estepa (2005). "The olive leaf
extract exhibits antiviral activity against viral haemorrhagic septicaemia rhabdovirus
(VHSV)." Antiviral Res 66(2-3): 129-136.
26. Rivas-Aravena, A., E. Vallejos-Vidal, M. Cortez-San Martin, F. Reyes-Lopez, M. Tello, P.
Mora, A. M. Sandino and E. Spencer (2011). "Inhibitory effect of a nucleotide analog on
infectious salmon anemia virus infection." J Virol 85(16): 8037-8045.
27. Tomas-Menor, L., A. Morales-Soto, E. Barrajon-Catalan, C. Roldan-Segura, A. SeguraCarretero and V. Micol (2013). "Correlation between the antibacterial activity and the
composition of extracts derived from various Spanish Cistus species." Food Chem Toxicol
55: 313-322.
28. von Rhein, C., T. Weidner, L. Henss, J. Martin, C. Weber, K. Sliva and B. S. Schnierle
(2016). "Curcumin and Boswellia serrata gum resin extract inhibit chikungunya and
vesicular stomatitis virus infections in vitro." Antiviral Res 125: 51-57.
37
29. Ying, T. H., S. F. Yang, S. J. Tsai, S. C. Hsieh, Y. C. Huang, D. T. Bau and Y. H. Hsieh (2012).
"Fisetin induces apoptosis in human cervical cancer HeLa cells through ERK1/2-mediated
activation of caspase-8-/caspase-3-dependent pathway." Arch Toxicol 86(2): 263-273.
38