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CAPÍTULO 2.1.4.
VIREMIA PRIMAVERAL DE LA CARPA
1. DEFINICIÓN DE LA ENFERMEDAD
La viremia primaveral de la carpa (VPC) es una infección por rabdovirus (13) capaz de inducir una
viremia hemorrágica y contagiosa aguda en varias especies de carpas y en algunas otras especies de
peces ciprínidos e ictalúridos (11).
2. INFORMACIÓN PARA EL DISEÑO DE PROGRAMAS DE VIGILANCIA
a)
Factores del agente
El agente etiológico es el virus de la viremia primaveral de la carpa (SVCV) de la familia
Rhabdoviridae, y provisionalmente adscrito al género Vesiculovirus (24). El genoma del virus es
una cadena de ARN (monocatenario) con polaridad de antimensajero y no segmentado. El
genoma contiene 11.019 nucleótidos que codifican cinco proteínas en el siguiente orden: una
nucleoproteína (N), una fosfoproteína (P), una proteína matriz (M), una glicoproteína (G) y una
polimerasa ARN dependiente del ARN (L). El genoma no contiene un gen no virión (NV) entre
los genes G y L como el que se encuentra en los rabdovirus de los peces del género
Novirhabdovirus (3). La cepa tipo de SVCV está disponible en la American Type Culture Collection
(ATCC VR-1390, ref. 12). Se han entregado dos secuencias genómicas completas de la cepa tipo
al Genbank (Genbank, número de acceso U18101 por Bjorklund et al. [7] y Genbank número de
acceso AJ318079 por Hoffmann et al. [17]).
Los anticuerpos dirigidos contra SVCV producen reacción cruzada en distintos grados con el
rabdovirus de las crías de lucio (PFRV), lo que indica que los dos virus están estrechamente
relacionados entre sí. Se ha demostrado que los dos virus comparten determinantes antigénicos
comunes en las proteínas G, N y M, pero pueden distinguirse mediante pruebas de neutralización
(23). Ahne et al. (5) mostraron que los dos virus también podían distinguirse mediante la prueba
de protección de la ribonucleasa utilizando una sonda del gen G, lo que sugiere que existen
diferencias genéticas entre los dos virus. Stone et al. (22) realizaron un análisis de secuencia de una
región 550 nucleótidos del gen G para comparar 36 presuntos de SVCV y PFRV de diferentes
especies de peces y de diferentes lugares. Su análisis mostró que los aislamientos podían separarse
en cuatro genogrupos distintos y que todos los aislamientos de SVCV podían asignarse al grupo 1,
compartiendo una identidad de nucleótidos de <61% con los virus de los otros tres genogrupos.
En el análisis posterior también se mostró que el genogrupo 1 de SVCV podía subdividirse en al
menos cuatro sub-genogrupos.
SE ha mostrado que el virus permanece viable fuera del hospedador durante más de 4 semanas en
agua a 10°C y durante más de 6 semanas en el fango del estanque a 4°C.
El virus se inactiva a 60°C durante 30 minutos y a pH 12 durante 10 minutos y a pH 3 durante
3 horas. Los agentes oxidantes, el dodecil sulfato sódico, los detergentes no iónicos y los
disolventes de lípidos son todos efectivos para la inactivación del SVCV. También son efectivos
para la inactivación los siguientes desinfectantes: formalina al 3% durante 5 minutos; hidróxido de
sodio al 2% durante 10 minutes; cloro (540 mg/litre) durante 20 minutos y compuestos de yodo
(250 ppm) durante 30 minutos (12).
b)
Factores del hospedador
Se han registrado infecciones naturales por SVC en la carpa común (Cyprinus carpio carpio) y en la
carpa koi (Cyprinus carpio koi), el carpín (Carassius carassius), el siluro (Silurus glanis), la carpa
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.4. — Viremia primaveral de la carpa
plateada (Hypophthalmichthys molitrix), la carpa cabezona (Aristichthys nobilis), carpa china
(Ctenopharyngodon idella), el pez rojo (Carassius auratus), el orfe (Leuciscus idus), y la tenca (Tinca
tinca). Se ha demostrado que otras especies de ciprínidos eran susceptibles a SVCV mediante
infección experimental por baño, incluyendo el rutilo (Rutilus rutilus) (16) y el pez cebra (Danio
rerio) (21). De modo que es razonable asumir que otras especies de ciprínidos de aguas templadas
son susceptibles a la infección. Algunas otras especies pueden infectarse experimentalmente, por
ejemplo, el lucio (Esox lucius), el gupi (Lebistes reticulatus) y el pez sol (Lepomis gibbosus) (3).
Por lo general, los peces jóvenes de hasta un año son los más susceptibles a la enfermedad clínica,
pero pueden verse afectados los peces de cualquier edad. Es más, existe una gran variabilidad en
el grado de susceptibilidad a la VPC entre individuos de la misma especie de peces. Aparte del
estado fisiológico de los peces, cuyo papel es apenas conocido, la edad o el estatus de la
inmunidad innata relacionada con la edad parece ser de mucha importancia en el caso de los peces
más jóvenes, cuanto mayor es la susceptibilidad a la enfermedad manifiesta, pero incluso los
reproductores adultos pueden ser susceptibles a la infección. Está claro que la temperatura del
agua es un factor medioambiental crucial para la virulencia de la infección con VPC (11): en los
peces de un año o mayores no es frecuente observar infección por encima de los 17°C mientras
que las crías pueden verse afectadas a temperaturas de 22–23°C. Además de anteriormente citadas
especies de ciprínidos e ictalúridos, parece que los peces muy jóvenes de varias especies de peces
de estanque son susceptibles a la infección con VPC en condiciones experimentales a
temperaturas de agua muy variable. El ejemplo más llamativo es el del lucio europeo (Esox lucius),
que puede infectarse fácilmente en el itinerario del agua (2). Una condición fisiológica pobre
provocada en los peces por un invierno largo es un factor que contribuye a la susceptibilidad a la
enfermedad.
Las variedades de carpa común (Cyprinus carpio) son los principales hospedadores del SVCV y se
consideran como los más susceptibles a la infección por SVCV seguidos, en orden de
susceptibilidad, por otras especies de carpas (incluyendo los híbridos), otras especies de ciprínidos
susceptibles y, finalmente, especies de peces no ciprínidos. Para las muestras recogidas durante los
programas de vigilancia de la VPC, se seleccionan preferentemente la carpa común, o variedades
como la carpa koy o la carpa ghost (koi × común), seguidas por los híbridos de carpa (ej., carpa
común × carpín) luego oras especies de carpa como el carpín, el pez rojo, la carpa china, la carpa
cabezona y la carpa plateada. Si estas especies no están disponibles, entonces deberán usarse en la
muestra otras especies susceptibles conocidas en el siguiente orden de preferencia: la tenca, el
orfe, siluro y, finalmente, cualquier otra especie de ciprínidos disponible. A efectos de vigilancia
de la enfermedad, deberá considerarse que todas las especies de ciprínidos son portadores
potenciales de SVCV. Las especies de ciprínidos se mezclan, por lo común, en sistemas de
pluricultivo y existe un gran riesgo de transmisión del SVCV entre especies durante los brotes de
la enfermedad.
Los reservorios del SVCV son los peces con infección clínica y los portadores asintimáticos del
virus entre los peces cultivados, asilvestrados o silvestres. El virulento virus se disemina por las
heces, la orina, la banquia y la mucosidad la piel y el exudado de las ampollas de la piel o bolsas de
escamas edematosas. Sin embargo, el hígado, el riñón, el bazo, la banquia y el encéfalo son los
órganos en los que más abunda el SVCV durante el curso de la infección manifiesta (10).
La forma de transmisión del SVCV es horizontal, pero no se puede descartar la transmisión
“asociada con los huevos” (comúnmente denominada transmisión “vertical”). La transmisión
horizontal puede ser directa o indirecta, siendo el agua el principal vector abiótico. Lo vectores
animados y los fomites también están implicados en la trasmisión del SVCV. Entre los vectores
animados, los parásitos invertebrados Argulus foliaceus (Crustacea, Branchiura) y Piscicola geometra
(Annelida, Hirudinea) son capaces de transmitir el SVCV de peces enfermos a peces sanos (1).
Peces infectados regurgitados por garzas (Ardea cinerea) que los habían ingerido con el SVCV
mantuvieron el virus hasta 120 minutos después de la ingesta (20). Los artrópodos acuáticos
también pueden funcionar como vectores del SVCV (3). Un virus similar al SVC se ha aislado de
langostinos peneidos en Hawaii; fue replicado y produjo alteraciones en los tejidos del langostino
blanco (19). Una vez que se establece el SVCV en las existencias de un estanque o en la
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Capítulo 2.1.4. — Viremia primaveral de la carpa
existencias de un criadero de estanques, puede resultar muy difícil erradicarlo sin destruir todo
tipo de vida en el centro de producción de peces.
c)
Patrón de la enfermedad
El patrón de la enfermedad se ve influenciado por la temperatura del agua, la edad y condición de
los peces, la densidad de la población y los factores estresantes. El estado inmune de los peces
también constituye un factor importante, y tanto la inmunidad no específica (el interferón) como
la específica (anticuerpos séricos, inmunidad celular) tienen un papel importante. La enfermedad
clínica predomina a temperaturas del agua por debajo de los 10°C, a las que se suprime o retrasa la
respuesta inmune. Las infecciones secundarias y concomitantes por bacterias o parásitos pueden
incidir en el grado de mortalidad y de manifestación de signos de la enfermedad (11).
La distribución geográfica de la VPC se limitó durante largo tiempo a países del continente
europeo en los que la temperatura del agua es baja durante el invierno. Se ha registrado la
enfermedad en la mayoría de los países europeos y en ciertos estados independientes de la parte
occidental de la extinta Unión Soviética (Bielorrusia, Georgia, Lituania, Moldavia, Rusia y
Ucrania). Sin embargo, en 2.002, se registró por primera vez el SVC en dos lugares separados de
EE.UU. (8, 15), y se confirmó la detección del virus en carpas de la Republica Popular China en
2.004 (18). La enfermedad también se ha registrado en peces rojos de importación en Brasil (6).
d)
Control y prevención
Los métodos para el control de la enfermedad VPC se basan sobre todo en evitar la exposición al
virus junto con buenas prácticas de higiene. Esto es factible en pequeños criaderos abastecidos
con agua de manantial o de pozos y un sistema seguro para evitar que entren peces al criadero por
la vía de los desagües. Entre las medidas higiénicas se debe incluir la desinfección de los huevos
mediante tratamiento con yodóforo (4), desinfección regular de los estanques, desinfección del
equipo del criadero con productos químicos, manipulación cuidadosa de los peces para no
producirles estrés y eliminación de los peces muertos en condiciones de seguridad. La reducción
de la densidad de las existencias de peces durante el invierno y el comienzo de la primavera
disminuirá la propagación del virus. En instalaciones de crianza que cuentan con un entorno
controlado, la elevación de la temperatura del agua por encima de los 19–20°C puede parar o
prevenir los brotes de VPC (12). No se dispone en la actualidad de una vacuna segura y efectiva.
Sin embargo, una serie de preparaciones inactivadas experimentales y de vacunas atenuadas vivas
han producido resultados prometedores (12).
Se han publicado revisiones detalladas de la enfermedad VPC por Wolf (26), Fijan (12) y Ahne et
al. (3).
3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
Se puede lograr un diagnóstico de la VPC en peces clínicamente afectados mediante aislamiento del
virus o, de forma más rápida, por inmunofluorescencia directa o enzimoinmunoensayos (ELISA) (25)
con tejidos infectados. Lo ideal es que el diagnóstico por IF o ELISA se confirme mediante
aislamiento del virus seguido de la prueba de neutralización del virus (NV) o PCR y análisis de
secuencias. Sin embargo, el aislamiento del virus puede no ser posible con muestras clínicas
descompuestas (25), de modo que las presencia de síntomas de la enfermedad VPC y una prueba IF
positiva o un ELISA pueden considerarse suficientes para iniciar las medidas de control.
Debido al conocimiento insuficiente de las respuestas serológicas de los peces a la infección vírica,
hasta ahora no se ha aceptado la detección de anticuerpos de los peces contra el virus como método
rutinario de análisis para evaluar la infección vírica de las poblaciones de peces. Sin embargo, en un
futuro próximo, podría llevarse a cabo la validación de algunas técnicas serológicas para ciertas
infecciones víricas de los peces, dando por resultado una utilización ampliamente aceptada de la
serología de peces con fines de análisis sanitario.
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Capítulo 2.1.4. — Viremia primaveral de la carpa
El material de peces adecuado para examen virológico es:
•
Peces asintomáticos (pez aparentemente sano): riñón, bazo, banquia y encéfalo (pez de
cualquier tamaño).
•
Peces clínicamente afectados: alevín entero (longitud corporal < o = 4 cm), vísceras
completas, incluyendo el riñón y el encéfalo (> 4 cm y longitud corporal < e = 6 cm) o, con peces
de mayor tamaño, hígado, riñón, bazo y encéfalo.
a)
Métodos de diagnóstico de campo
Durante un brote de la enfermedad VPC se dará un aumento notable de la mortalidad en la
población. Por lo general, los peces jóvenes de hasta 1 año son muy susceptibles a la enfermedad
clínica, pero pueden verse afectados a cualquier edad. Los peces se vuelven letárgicos, se separan
del fondo y se reúnen en la entrada del agua o en los lados del estanque y algunos de ellos pueden
experimentar pérdida del equilibrio. Los peces enfermos tienen un color más oscuro. Al examinar
más de cerca los peces individuales, se observan síntomas clínicos típicos, como exoftalmos,
branquias de color pálido, hemorragias en la piel, base de las aletas y la cola, distensión abdominal
o hidropesía y el conducto anal sobresale a menudo con hilillos de restos fecales mucoides.
b)
Métodos clínicos
No hay lesiones patognomónicas manifiestas. El diagnóstico final debe esperar a la detección
directa del antígeno vírico en tejidos o al aislamiento e identificación del virus. Puede que no haya
lesiones en caso de muerte repentina. Los síntomas generales pueden incluir exceso de líquido
ascítico en la cavidad abdominal que normalmente contiene sangre, degeneración de las laminillas
de las branquias e inflamación de los intestinos, que contienen mucosidad en vez de alimento. Es
común la observación de edema y hemorragia de las vísceras. Pueden verse hemorragias
petequiales o focales en el músculo y el tejido adiposo y también pueden observarse en la vejiga
natatoria.
Pueden observarse alteraciones histopatológicas en todos los órganos más importantes. En el
hígado, los vasos sanguíneos muestran perivasculitis edematosa que se va convirtiendo en
necrosis. El parénquima del hígado muestra hiperemia con necrosis focales múltiples y
degeneración. El corazón muestra pericarditis e infiltración del miocardio que desembocan en
degeneración y necrosis. El bazo muestra hiperemia con hiperplasia del retículoendotelio y
centros melanomacrófagos agrandados, y el páncreas se inflama con necrosis multifocal. En el
riñón, el daño se observa en el tejido excretor y hematopoyético. Los túbulos renales están
obstruidos con cilindros granulosos y las células sufren degeneración hialina y vacuolación. El
intestino muestra inflamación perivascular, descamación del epitelio y atrofia de las vellosidades.
El peritoneo se inflama y los vasos linfáticos se llenan de detritus y macrófagos. En la vejiga
natatoria la lámina epitelial cambia de una monocapa a una multicapa discontinua y los vasos de la
sub-mucosa se dilatan por infiltración de linfocitos cercanos.
c)
Métodos de detección e identificación del agente
•
Métodos de detección directa
i) Aislamiento del SVCV en cultivo celular
•
Línea celular a utilizar: EPC o FHM
a) Extracción de virus
Se utiliza el procedimiento descrito en el capítulo I.1 (sección B.3.2).
b) Inoculación de monocapas celulares
i)
Se hacen dos diluciones decimales seriadas de 1/10 de los sobrenadantes del
homogeneizado de órganos y se transfiere un volumen apropiado de cada una
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Capítulo 2.1.4. — Viremia primaveral de la carpa
de esas dos diluciones a monocapas celulares de 24 horas. Se inoculan al menos
2 cm2 de monocapa celular escurrida con 100 µl de cada dilución.
ii)
Se inocula directamente o se deja adsorber durante 0,5–1 hora a 10–15°C y, sin
retirar el inóculo, se añade el cultivo celular tamponado a pH 7,6 y
suplementado con 2% de suero fetal bovino (SFB) (1 ml/pocillo para placas de
cultivo celular de 24 pocillos, y se incuba a 20º C.
c) Control de la incubación
i)
Se sigue el curso de la infección en controles positivos y otros cultivos celulares
inoculados mediante examen microscópico diario a 40–100 aumentos durante
7 días. Se recomienda el microscopio de contraste de fases.
ii)
Se mantiene el pH del medio de cultivo celular entre 7,3 y 7,6 durante la
incubación. Eso puede lograrse añadiendo al medio de cultivo celular tampón
bicarbonato estéril (para frascos de cultivo con cierre hermético) o medio
tamponado con HEPES (HEPES = ácido N-2-hidroxietil-piperazina-N-2etanosulfónico) o 2 M de solución tamponada con Tris/HCl (para placas de
cultivo celular).
iii) Si aparece efecto citopático (ECP) en los cultivos celulares que han sido
inoculados con las diluciones de sobrenadantes del homogeneizado analizado,
deben aplicarse procedimientos de identificación de forma inmediata (véase la
sección 3.c.ii más adelante).
iv) Si no aparece ECP en los cultivos inoculados (a pesar de la progresión normal
del ECP en los controles del virus), deberían subcultivarse los cultivos
inoculados durante otros 7 días. Si en el control de virus no se produce ECP, se
debe repetir el proceso con células susceptibles frescas y nuevos lotes de
muestras.
d) Procedimiento de subcultivo
i)
Se recogen alícuotas de medio de cultivo celular procedente de todas las
monocapas inoculadas con diluciones de cada uno de los sobrenadantes de los
homogeneizados de órganos.
ii)
Se inoculan todas las monocapas como se describió anteriormente en la sección
3.c.i.a.
iii) Se incuban y controlan como se describió anteriormente en la sección 3.c.i.b.
iv) Si no se produce ECP, la prueba puede declararse negativa.
ii) Identificación del virus aislado en cultivo celular
• Métodos presuntivos rápidos
a) Prueba de inmunofluorescencia indirecta
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i)
Se preparan monocapas de células en pocillos de 2 cm2 en placas de plástico
para cultivo celular o en cubreobjetos a fin de alcanzar en torno al 80% de
confluencia dentro de las 24 horas de incubación a 30°C (se siembran seis
monocapas celulares por cada aislamiento del virus a identificar, más dos para el
control positivo y dos para el control negativo). El contenido en suero fetal
bovino del medio de cultivo celular puede reducirse a 2–4%. Si se han de
identificar numerosos aislamientos de virus, se recomienda encarecidamente el
uso de placas de Terasaki.
ii)
Cuando las monocapas celulares están listas para la infección, es decir, el mismo
día de la siembra o un día después de la misma, se inoculan las suspensiones del
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Capítulo 2.1.4. — Viremia primaveral de la carpa
virus a identificar haciendo diluciones decimales seriadas directamente en los
pocillos o en los frascos de cultivo celular.
iii) Se diluyen las suspensiones víricas control de SVCV de forma similar, a fin de
obtener un título vírico de en torno a 5.000–10.000 unidades formadoras de
placas (UFP)/ml en el medio de cultivo celular.
iv) Se incuba a 20°C durante 24 horas.
v)
Se elimina el medio de cultivo celular, se lava una vez con 0,01 M de solución
salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, luego brevemente otras tres veces
con acetona fría (mantenida a –20°C) para cubreobjetos, o una mezcla de
acetona al 30%/etanol al 70%, también a –20°C, para pocillos de plástico.
vi) Se deja que actúe el fijador durante 15 minutos. Un volumen de 0,5 ml es
adecuado para 2 cm2 de monocapa celular.
vii) Se deja que las monocapas celulares se sequen al aire durante al menos
30 minutos y se procesan de forma inmediata o se congelan a –20°C.
viii) Se prepara una solución de anticuerpo purificado o suero contra SVCV en
0,01 M de PBS, pH 7,2, que contenga 0,05% de Tween 80 (PBST), a la dilución
adecuada (que se haya establecido previamente o que es proporcionada por el
proveedor de reactivos).
ix) Se rehidratan las monocapas celulares secas mediante cuatro pasos de lavado
con solución PBST, y se elimina completamente el tampón tras el último
lavado.
x)
Se tratan las monocapas celulares con la solución de anticuerpo durante 1 hora
a 37°C en una cámara húmeda impidiendo que se produzca evaporación. El
volumen de la solución a utilizar es 0,25 ml/2 cm2 pocillo.
xi) Se lava cuatro veces con PBST como anteriormente.
xii) Se tratan las monocapas celulares durante 1 hora a 37°C con una solución de
anticuerpo conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) contra la
inmunoglobulina usada en la primera capa y preparada de acuerdo con las
instrucciones del proveedor. Esos anticuerpos FITC son la mayoría de las veces
anticuerpos de conejo o de cabra.
xiii) Se lava cuatro veces con PBST.
xiv) Se examinan de forma inmediata las monocapas celulares tratadas en placas de
plástico, o se montan los cubres con solución salina de glicerol a pH 8,5 antes
de la observación microscópica.
xv) Se examina bajo luz UV incidente utilizando un microscopio con lente ocular
de ×10 y lente objetivo de ×20–40 con abertura numérica de >0,65 y >1,3,
respectivamente. Los controles positivos y negativos deben proporcionar los
resultados esperados antes de cualquier otra observación.
b) Enzimoinmunoensayo
i)
Se recubren los pocillos de las microplacas diseñadas para los ELISA con
diluciones apropiadas de inmunoglobulina (Ig) purificada específica para SVCV,
en 0,02 M de tampón carbonato, pH 9,5 (200 µl/pocillo). La Ig puede ser
policlonal o monoclonal procedente casi siempre de conejo o de ratón,
respectivamente. Para la identificación del SVCV, son adecuados anticuerpos
monoclonales (MAbs) específicos para ciertos dominios de la proteína de la
nucleocápsida (N).
ii)
Se incuba toda la noche a 4°C.
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Capítulo 2.1.4. — Viremia primaveral de la carpa
iii) Se lava cuatro veces con 0,01 M de PBS que contenga 0,05% de Tween 20
(PBST).
iv) Se bloquea con leche desnatada (5% en tampón carbonato) u otra solución
bloqueadora durante 1 hora a 37°C (300 µl/pocillo).
v)
Se lava cuatro veces con PBST.
vi) Se añade 2% de detergente no-iónico (Tritón X-100 o Nonidet P-40) a la
suspensión del virus a identificar.
vii) Se distribuyen 100 µl/pocillo de diluciones de dos o cuatro veces del virus a
identificar, y del cultivo no infectado recogido (control negativo), y el virus
control SVCV (control positivo); Se deja que reacciones con el anticuerpo
recubierto contra SVCV durante 1 hora a 20°C.
viii) Se lava cuatro veces con PBST.
ix) Se añade a los pocillos 200 µl de anticuerpo contra el SVCV Mab o policlonal
conjugado con peroxidasa de rábano; o IgG policlonal contra SVCV o MAb
contra la proteína N específico para un dominio diferente al del Mab de
recubrimiento y conjugado previamente con biotina.
x)
Se incuba durante 1 hora a 37°C.
xi) Se lava cuatro veces con PBST.
xii) Se añaden 200 µl de estreptavidina conjugada con HRPO o ExtrAvidin (Sigma)
a los pocillos que han recibido el anticuerpo conjugado con biotina y se incuba
durante 1 hora a 37°C.
xiii) Se lava cuatro veces con PBST.
xiv) Se añaden 200 µl del substrato y el cromógeno. Se detiene el desarrollo de la
prueba cuando reaccionan los controles positivos, y se leen los resultados.
xv) Alternativamente, se añade substrato y cromógeno a los pocillos que contienen
anticuerpo conjugado con peroxidasa y se procede como anteriormente.
• Métodos de identificación confirmativa
a) Prueba de neutralización
i)
Se recoge medio de cultivo celular de las monocapas celulares que muestren
ECP y se centrifuga a 2.000 g durante 15 minutos a 4°C, o se filtra con una
membrana de poros de 0,45 µm para eliminar los restos celulares.
ii)
Se diluye el medio que contiene el virus de 10–2 a 10–4.
iii) Se mezclan alícuotas de cada dilución con volúmenes iguales de solución de
anticuerpo contra SVCV, y se tratan de forma similar alícuotas de cada dilución
de virus con medio de cultivo celular.
(La solución de anticuerpo de neutralización [NAb] debe tener un título de
reducción del 50% de placas de al menos 2.000 basado en la neutralización de
50–100 UFP del virus SVC.)
iv) De forma paralela, se pueden realizar otras pruebas de neutralización contra:
• una cepa del virus homólogo (prueba de neutralización positiva)
• una cepa del virus heterólogo (prueba de neutralización negativa).
v)
Se incuban todas las mezclas a 20°C durante 1 hora.
vi) Se transfieren alícuotas de cada una de las mezclas anteriores a monocapas
celulares (se inoculan dos cultivos celulares por dilución) y se deja que produzca
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Capítulo 2.1.4. — Viremia primaveral de la carpa
adsorción durante 0,5–1 hora a 15–20°C; para este propósito son adecuadas
placas de cultivo celular con 24 o 12 pocillos, usando un inóculo de 50 µl.
vii) Cuando se haya completado la adsorción, se añade a cada pocillo medio de
cultivo celular, suplementado con 2% FCS y tamponado a pH 7,4–7,6, y se
incuba a 20°C.
viii) Se comprueba si comienza el ECP en los cultivos celulares y se leen los
resultados tan pronto como aquél ocurra en los controles no neutralizados (las
monocapas celulares están protegidas en los controles de neutralización
positivos). Se registran los resultados bien tras un simple examen microscópico
(preferiblemente de contraste de fases) o bien después de eliminar el medio de
cultivo celular y teñir las monocapas celulares con una solución al 1% de cristal
violeta en 20% de etanol.
ix) El virus analizado se identifica como SVCV cuando se evita o se retarda
notablemente el ECP en los cultivos celulares que recibieron la suspensión de
virus tratada con el anticuerpo específico contra SVCV, mientras que el ECP es
evidente en todos los demás cultivos celulares.
NOTA: Los aislamientos de SVCV presuntivos identificados mediante ELISA o
IFAT no pueden neutralizarse por NAb contra SVCV. Además, algunos subgenogrupos de SVCV no pueden ser totalmente neutralizados por NAb. Cuando la
neutralización por NAb contra SVCV no se produce o es incompleta, se recomienda
el análisis de secuencias de nucleótidos de los productos de la PCR para confirmar la
presencia de SVCV.
b) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
i)
El genoma del SVCV consta de una única cadena de ARN de
aproximadamente 11 kb, con polaridad negativa. La amplificación de un
fragmento de 714 pb cADN de SVCV se realiza usando cebadores derivados de
las secuencias de la región codificadora del gen de la glicoproteíana: 5’-TCTTGG-AGC-CAA-ATA-GCT-CAR*-R*TC-3’ (SVCV F1) y 5’-AGA-TGGTAT-GGA-CCC-CAA-TAC-ATH*-ACN*-CAY*-3’ SVCV R2), empleando
una versión modificada del método de Stone et al. (22).
ii)
Se extrae ARN total de 100 µl de sobrenadante vírico procedente de células
EPC infectadas y disuelto en 40 µl de agua grado biología molecular, libre de
DNasa y RNasa (BHD). (Existen en el mercado varios juegos de extracción de
ARN total que producirán ARN de gran calidad, adecuado para la PCR de
transcripción inversa (RT). Por ejemplo, Trizol Reagent™ [BRL, Life
Technologies, Paisley, UK], SV Total RNA isolation system [Promega] y
Nucleospin® RNA [AB gene].)
iii) Para la síntesis de cADNs, se emplea una reacción de transcripción inversa
realizada a 37°C durante 1 hora en un volumen de 20 µl que consta de tampón
para reacción RT 1 × M-MLV (50 mM de Tris, pH 8,3, 75 mM de KCl, 10 mM
de DTT, 3 mM de MgCl2) que contenga 1 mM de dNTP, 100 pmoles de
cebador R2 SVCV, 20 unidades de transcriptasa inversa M-MLV (Promega,
Southampton, UK) o transcriptasa inversa equivalente y 1/10 del ARN total
extraído anteriormente.
iv) La PCR se realiza en un volumen de reacción de 50 µl con 1 × tampón para
PCR (50 mM de KCl, 10 mM de Tris/HCl, pH 9,0, y 0,1% de Tritón X-100)
que contenga 2,5 mM de MgCl2, 200 µM de dNTPs, 50 pmoles de cada uno de
los cebadores SVCV R2 y SVCV F1, 1,25 unidades de ADN polimerasa
RedHot (AB Gene, Epsom, UK) o ADN polimerasa Taq equivalente, y 2,5 µl
de la mezcla para la reacción de transcripción inversa. La mezcla para la
reacción se cubre con aceite mineral y se somete a 35 ciclos de temperatura de
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.4. — Viremia primaveral de la carpa
1 minuto a 95°C, 1 minuto a 55°C y 1 minuto a 72°C seguido de un paso de
extensión final de 10 minutos a 72°C. Se analiza el ADN amplificado (714 pb)
mediante electroforesis en gel de agarosa.
v)
Si los efectos citopáticos en cultivos no son extensivos, es posible que el
producto no se genere utilizando un solo ciclo de amplificación. Para evitar
tales problemas se utiliza en un ensayo semi-anidado empleando los cebadores:
5’-TCT-TGG-AGC-CAA-ATA-GCT-CAR*-R*TC-3’ (SVCV F1) y 5’-CTGGGG-TTT-CCN*-CCT-CAA-AGY*-TGY*-3’ (SVC R4), según Stone et al.
(22).
vi) El segundo ciclo de PCR se lleva a cabo en un volumen de reacción de 50 µl
con 1 × tampón para PCR (50 mM de KCl, 10 mM de Tris/HCl, pH 9,0, y
0,1% Tritón X-100) que contenga 2,5 mM de MgCl2, 200 µM de dNTPs,
50 pmoles de cada uno de los cebadores SVCV R4 y SVCV F1, 1,25 unidades
de ADN polimerasa RedHot (AB Gene, Epsom, UK) o ADN polimerasa Taq
equivalente, y 2,5 µl de producto del primer ciclo. La mezcla para la reacción se
cubre con aceite mineral y se somete a 35 ciclos de temperatura de 1 minuto a
95°C, 1 minuto a 55°C y 1 minuto a 72°C seguido de un paso de extensión final
de 10 minutos a 72°C. Se analiza el ADN amplificado (714 pb) mediante
electroforesis en gel de agarosa.
vii) Se confirman todos los productos amplificados como SVCV en origen
mediante clonación y secuenciación, y se identifica el subtipo de SVCV (Ia–Id)
mediante una búsqueda BLAST (http://www.ebi.ac.uk/blastall/index.html) o
por análisis filogenético usando secuencias de SVCV que están disponibles en la
base de datos fishpathogens.net. El análisis filogenético se lleva a cabo utilizando
una región de 550 pb que corresponde a los nucleótidos 405–954 del gen de la
glicoproteína.
viii) En algunos casos en los que se da efecto citopático extensivo y el virus se
replica hasta un título elevado, habrá suficiente amplicón PCR para la
secuenciación directa. Cuando el producto amplificado es débil se recomienda
insertar el producto en un vector de secuenciación adecuado (ej., pGEM-T,
pCR® 4- TOPO®) antes de realizar la secuenciación. A fin de eliminar errores
potenciales en las secuencias debidos a la polimerasa Taq, se deben realizar dos
acciones independientes de amplificación y secuenciación.
NOTA: Los sitios de hibridación de los cebadores de SVCV se identificaron por
alineamiento de las secuencias de aminoácidos publicadas para la glicoproteína del
SVCV (ref. 7; Genbank, número de acceso U18101), y el virus de la estomatitis
vesicular (VSV) New Jersey (ref. 14; Genbank, número de acceso V01214), y cepas
de Piry (Genbank, número de acceso D26175). Después se diseñaron cebadores para
hibridarse a las regiones que codifican los aminoácidos conservados utilizando la
secuencia publicada para el SVCV (7) como esqueleto, e introduciendo bases
degeneradas en los términos 3’ para permitir posibles diferencias en el uso de los
codones. Se han utilizado y señalado (*) los códigos IUB adecuados en los lugares en
que es apropiado.
iii) Métodos de diagnóstico para peces clínicamente enfermos
• Detección directa en tejidos de peces
a) Prueba de Inmunofluorescencia indirecta
148
i)
Se sangra completamente el pez.
ii)
Se hacen improntas de riñón en portas de vidrio limpias o en el fondo de los
pocillos de las placas de cultivo celular de plástico.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.4. — Viremia primaveral de la carpa
iii) Se guardan los trozos de riñón (como se indicó en el capítulo I.1. sección B.3.1)
junto con los otros órganos necesarios para el aislamiento del virus, por si este
se precisara más tarde.
iv) Dejar que el frotis se seque al aire durante 20 minutes.
v)
Se fija con acetona o con etanol/acetona y se seca como se indicó en la sección
3.c.ii.a, pasos (v–vii).
vi) Se rehidratan los preparados anteriores (véase la sección 3.c.ii.a, paso [ix]) y se
bloquea con 5% de leche desnatada o 1% de seroalbúmina bovina, en PBST
durante 30 minutos a 37°C.
vii) Se lava cuatro veces con PBST.
viii) Se tratan los frotis con la solución de anticuerpo contra SVCV y se lava como
se indicó en la sección 3.c.ii.a, pasos (viii–xi).
ix) Se bloquea y se lava como se hizo anteriormente en los pasos (vi) y (vii).
x)
Se revela la reacción con anticuerpo conjugado con FITC adecuado, se lava y se
observa como se indicó en la sección 3.c.ii.a, pasos (xii–xv).
Si la prueba es negativa, se procesan las muestras de órganos guardadas a 4°C, para
el aislamiento del virus en cultivo celular, como se describió en la sección 3.c.i.
b)
Enzimoinmunoensayo
i)
Procesamiento de las microplacas
Tal como se describió en la sección 3.c.ii.b del presente capítulo hasta el paso
(iv) (inclusive).
ii)
Procedimientos de muestreo
Véanse las siguientes secciones del capítulo I.1:
B.1 para la selección de ejemplares de peces
B.2 para la selección de los materiales de la muestra.
iii) Procesamiento de las muestras de órganos
Véanse las siguientes secciones del capítulo I.1:
B.3.1 para el transporte
B.3.2 para la extracción de virus y la obtención de homogeneizados de
órganos.
iv) Procedimiento del enzimoinmunoensayo
•
•
Se separa una alícuota de 1/4 de cada homogeneizado por si se requiere el
aislamiento del virus en cultivo celular.
•
Se trata el resto del homogeneizados con 2% de Tritón X-100 o Nonidet P40 y 2 mM de fenil metil sulfonil fluoruro; se mezcla con suavidad.
•
Se completa el resto de los pasos del procedimiento descrito en la sección
3.c.ii.b.
•
Si la prueba es negativa, se procesan las muestras de órganos guardadas a
4°C para el aislamiento del virus en cultivo celular como se describió en la
sección 3.c.i.
Aislamiento del virus en cultivo celular
Como se describió en la sección 3.c.i de este capítulo.
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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Capítulo 2.1.4. — Viremia primaveral de la carpa
4. VALORACIÓN DE LAS PRUEBAS SEGÚN SU FINALIDAD
En el cuadro 1 se ofrece una lista con los métodos de vigilancia, detección y diagnóstico de la VPC
disponibles en la actualidad. Las denominaciones utilizadas en el cuadro indican: A = se trata del
método recomendado en la actualidad por razones de disponibilidad, utilidad, así como por la
especificidad y sensibilidad de diagnóstico; B = se trata de un método estándar con buena especificidad
y sensibilidad de diagnóstico; C = el método es aplicable en algunas situaciones, pero su aplicación se
ve seriamente limitada por razones de coste, precisión y otros factores que limitan seriamente su
aplicabilidad; y D = el método no se recomienda en la actualidad para ese fin. Aunque no todas las
pruebas incluidas en las categorías A o B se han sometido a estandarización y validación formales
(véase el capítulo 1.1.2), su naturaleza rutinaria y el hecho de que se las haya utilizado sin resultados
dudosos las convierte en aceptables.
Tabla 1. Métodos de vigilancia, detección y diagnóstico del SVC
Vigilancia para declarar la
ausencia de infección
Diagnóstico presuntivo de
la infección o enfermedad
Diagnóstico confirmativo
de la infección o
enfermedad
Síntomas generales
D
B
D
Histopatología de tejidos
y órganos
D
B
C
Aislamiento del SVCV en
cultivo celular
A
A
A
Pruebas basadas en
anticuerpos para detectar
el antígeno del SVCV
(IFAT, ELISA)
D
A
C
MET con tejidos
D
B
C
PCR de extractos de
tejido
C
A
A
NA
C
A
Método
PCR – análisis de
secuencias
IFAT = prueba de inmunofluorescencia indirecta; ELISA = enzimoinmunoensayo;
MET = microscopía electrónica de transmisión; PCR = reacción en cadena de la polimerasa.
NOTA: Recientemente se han descrito cuatro genogrupos de rabdovirus relacionados con los peces
(22): el Genogrupo I (SVCV), Genogrupo II (rabdovirus de la carpa china), Genogrupo III (rabdovirus
de las crías de lucio) y Genogrupo IV (rabdovirus de la tenca). Los anticuerpos dirigidos contra el
SVCV sufren reacciones cruzadas en distintos grados con todos los rabdovirus de los otros tres
grupos. En un análisis adicional, se mostró que el genogrupo del SVCV podía subdividirse en al menos
cuatro sub-genogrupos. La capacidad de confirmación del SVCV basada en resultados de las pruebas
serológicas, como ELISA, IFAT y neutralización de sueros, se apoya en la especificidad de los
anticuerpos usados en las pruebas. Los anticuerpos contra SVCV pueden experimentar reacción
cruzada en distintos grados con todos los rabdovirus de los otros genogrupos de rabdovirus de peces
descritos recientemente (22).
Muchos laboratorios de diagnóstico han tenido dificultades para obtener anticuerpos contra SVCV que
resulten adecuados para ser usados en pruebas serológicas y han optado por utilizar kits disponibles en
el mercado. Para la identificación del SVCV, están disponibles dos kits de prueba comerciales, el kit
ELISA Testline (TestLine, Brno, Czech Republic) y el kit Bio-X IFAT (Bio-X Diagnostics, Jemelle,
Belgium). Hace poco tiempo, ha sido evaluada la especificidad de las pruebas contra aislamientos de
virus de los Genogrupos I, II, III y IV por Dixon & Longshaw (9), quienes hallaron que el ELISA
TestLine, que se utiliza como anticuerpo policlonal de conejo, no era específico y no podía distinguir el
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Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
Capítulo 2.1.4. — Viremia primaveral de la carpa
SVCV de los virus de los otros tres genogrupos. A la inversa, el Bio-X IFAT, en el que se usa un
anticuerpo monoclonal de ratón, resultó ser demasiado específico y sólo podía detectar aislamientos de
SVCV de 1 de los 4 subgrupos de SVCV.
Estos kits de pruebas comerciales pueden aplicarse para diagnósticos presuntivos de la VPC, pero sus
problemas con la especificidad limitan seriamente su aplicación con fines de diagnóstico confirmativo.
Para la identificación confirmativa de la VPC, se recomienda la utilización de la prueba PCR y el
análisis de secuencias de nucleótidos de los productos de la PCR.
5. CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO CONFIRMATIVO
a)
Definición de un caso sospechoso
Un caso sospechoso de la enfermedad SVC se define como la presencia de síntomas clínicos
típicos de la enfermedad en una población de peces susceptibles, o la presencia de histopatología
típica en los cortes de tejidos, o un ECP típico en cultivos celulares sin identificación del agente
causal, o un único resultado positivo de una de las pruebas de diagnóstico descritas anteriormente.
b)
Definición de un caso confirmado
Un caso confirmado se define como un caso sospechoso que ha producido ECP en cultivo celular
con la identificación subsiguiente del agente causal mediante una de las pruebas serológicas o
moleculares descritas con anterioridad, o un segundo resultado positivo de una prueba de
diagnóstico separada e independiente descrita anteriormente.
6. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO/DETECCIÓN PARA DECLARAR LA AUSENCIA DE ENFERMEDAD
El método de vigilancia de poblaciones de peces susceptibles con fines de declaración de ausencia de
VPC es la inoculación de cultivo celular con extractos de tejido (como se describió en la sección 3.c)
para demostrar la ausencia del virus.
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NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la viremia primaveral de la carpa (véase el cuadro
al final de este Manual de animales acuáticos o consúltese la lista actualizada en la página Web de la OIE :
www.oie.int).
Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos 2006
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