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Universidad de Cádiz
Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales
Departamento de Biomedicina, Biotecnología y Salud Pública
Grupo: BIO219 / Microbiología Aplicada y Genética Molecular
Directores: Laureana Rebordinos González e Ismael Cross Pacheco
TESIS DE MÁSTER EN GESTIÓN INTEGRAL DEL AGUA
Estudio filogenético de la familia de
histonas de las ostras Crassostrea
angulata y Crassostrea gigas
Claudia Isela Granada Moreno
Noviembre 2011
Estudio filogenético de la familia de histonas de las ostras
Crassostrea angulata y Crassostrea gigas
Memoria presentada por CLAUDIA ISELA GRANADA MORENO para la obtención del Título de
Máster en Gestión Integral del Agua (Perfil Investigador).
Firma del Tesinando
Fdo.: Claudia Isela Granada Moreno
Puerto Real a 25 de Noviembre del 2011
LAUREANA REBORDINOS GONZÁLEZ, DOCTORA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS E
ISMAEL CROSS PACHECO, DOCTOR EN CIENCIAS DEL MAR, como Directores de la Tesis
de Máster titulada: “Estudio filogenético de la familia de histonas de las ostras Crassostrea angulata
y Crassostrea gigas”, realizada por Claudia Isela Granada Moreno.
INFORMAN: que el trabajo presentado en la presente memoria se ha llevado a cabo bajo nuestra
dirección en las dependencias del Departamento de Biomedicina, Biotecnología y Salud Pública.
Y para que así conste firmamos el presente informe en Puerto Real a 25 de Noviembre del 2011.
Firma de los Directores:
Fdo.: Laureana Rebordinos González
Fdo.: Ismael Cross Pacheco
TESIS DEL MÁSTER (PERFIL INVESTIGADOR) EN GESTIÓN INTEGRAL DEL AGUA.
3
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
ÍNDICE
1
2
3
4
RESUMEN ..................................................................................................................... 5
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 6
2.1 Técnicas de Biología Molecular y Citogenética ................................................................ 9
2.2
Técnicas de Citogenética ................................................................................................. 12
2.3
Filogenética ..................................................................................................................... 12
OBJETIVOS ................................................................................................................. 14
MATERIAL Y MÉTODOS .......................................................................................... 15
4.1 Origen de las muestras ..................................................................................................... 15
4.2
4.2.1
Extracción de ADN .................................................................................................. 15
4.2.2
Electroforesis ............................................................................................................ 15
4.2.3
Amplificación por PCR ............................................................................................ 16
4.2.4
Cuantificación de ADN por espectrometría ............................................................. 17
4.2.5
Clonación y secuenciación ....................................................................................... 17
4.2.6
Análisis de las secuencias ........................................................................................ 20
4.3
5
Técnicas de Citogenética ................................................................................................. 21
RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 23
5.1 Biología Molecular .......................................................................................................... 23
5.1.1
Amplificación y purificación de la PCR .................................................................. 23
5.1.2
Clonación de los productos de PCR ......................................................................... 24
5.1.3
Análisis filogenético ................................................................................................. 26
5.2
6
7
8
Técnicas de Biología Molecular ...................................................................................... 15
Citogenética ..................................................................................................................... 34
CONCLUSIONES ........................................................................................................ 38
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 39
ANEXOS ...................................................................................................................... 42
8.1 Secuencias de los clones del gen H2A ............................................................................ 42
8.2
Secuencias de los clones del gen H2B............................................................................. 44
8.3
Secuencias de los clones del gen H3 ............................................................................... 46
8.4
Secuencias de los clones del gen H4 ............................................................................... 48
Tesis de Máster.
1
Claudia Isela Granada Moreno
RESUMEN
Crassostrea angulata y Crassostrea gigas son especies de ostras con una gran importancia
económica, ya que constituyen dos de las principales especies comercializadas actualmente en
Europa. Además, al ser consideradas como biomarcadores del grado de contaminación acuática,
el estudio de estas especies es de gran interés para evaluar la calidad ambiental de los ecosistemas
acuáticos.
Estas especies no han podido ser diferenciadas claramente a nivel taxonómico, ya que aunque
tienen una morfología similar, tanto los patrones de distribución como la resistencia a un medio
hostil y a enfermedades, son distintos entre ellas. Es por ello que algunos autores las han
considerado como especies diferentes. Sin embargo, otros autores las consideran de la misma
especie, debido a que no presentan diferencias significativas en ciertos marcadores moleculares.
Actualmente las técnicas de Biología Molecular y Citogenética permiten revelar este tipo de
enigmas mediante la caracterización de genes conservados.
El objetivo principal de este estudio es conocer el estado taxonómico de estas especies, mediante
la caracterización molecular y citogenética de los genes conservados de la familia de histonas
H2A, H2B, H3 y H4 presentes en estas ostras.
En el análisis molecular, tras la obtención de ADN genómico, se amplificaron, clonaron y
secuenciaron los genes de la familia de histonas H2A, H2B, H3 y H4 (proteínas muy conservadas
a nivel evolutivo en diversos eucariontes). Este análisis no reveló diferencias entre ambas
especies, aunque en el caso de las histonas H2A y H2B sí se encontraron diferencias a nivel
taxonómico de los clones de ambas especies con respecto a otros moluscos, por lo que podrían
tratarse de isoformas de este gen. Se observó que dos secuencias de clones del gen H2A estaban
filogenéticamente más alejadas de todos los organismos comparados, lo cual sugiere que se trata
de pseudogenes de la histona H2A.
En el análisis citogenético mediante la técnica de FISH, se logró mapear los genes H2A, H2B y
H4. Se observó que estos genes co-localizan en dos parejas cromosómicas, sugiriendo así a la
familia histónica como marcador cromosómico de Crassostrea.
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Tesis de Máster.
2
Claudia Isela Granada Moreno
INTRODUCCIÓN
Las ostras son moluscos bivalvos que se distribuyen a nivel global. Tienen poca movilidad, bajo
metabolismo y son filtradoras; tienden a acumular compuestos contaminantes, comportándose así
como bioindicadores del grado de contaminación ambiental (Rebordinos & Cross, 1999). Estos
organismos usan los iones carbonato para la formación de sus conchas, son especialmente
sensibles a la acidificación del océano debido al CO2 antropogénico que el océano absorbe
continuamente, dicho efecto ha sido recientemente publicado para embriones de la ostra
Crassostrea gigas (Gazeau, et. al. 2011). Mediante la Genética de poblaciones se puede
determinar la calidad de los ambientes acuáticos, ya que los contaminantes afectan a la
constitución genética de una población, produciendo mutaciones génicas o variaciones
cromosómicas; para ello la Genética se vale de organismos bioindicadores que presenten un loci
polimórfico que permita detectar fácilmente variaciones en frecuencias génicas, o en estructuras
multilocus entre poblaciones de áreas contaminadas (Rebordinos & Cross, 2003).
Las ostras, en general, muestran una gran variabilidad morfológica que dificulta su identificación
a través de caracteres morfológicos, por lo que el empleo de marcadores genéticos es una
herramienta útil para su identificación. La caracterización de éstas es de gran interés a nivel
biológico y comercial, ya que en todo el mundo se ha extendido el cultivo de estos moluscos con
la finalidad de servir de alimento.
Crassostrea angulata y Crassostrea gigas son dos especies de moluscos bivalvos sésiles con
morfología similar que pertenecen a la familia Ostreidae, que cuenta con alrededor de 20
especies cuyo linaje se muestra a continuación:
Dominio: Eucariota
Reino: Animalia
Subreino: Metazoa
Filum: Mollusca
Clase: Bivalvia
Subclase: Pteriomorphia
Orden: Ostreoida
Subfamilia: Ostreoidea
Familia: Ostreidae
Género: Crassostrea
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Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
C. angulata se conoce con el nombre común de ostra portuguesa, fue descrita en 1819 por
Lamark. Habita fijada en un sustrato duro de desembocaduras de ríos, estuarios y bahías (Marteil,
1957). Los principales bancos naturales dentro de la península Ibérica se encuentran en la
desembocadura de los ríos Guadiana y Guadalquivir (Pascual, 1973; Michinina & Rebordinos
1997), así como en la desembocadura de los ríos Tinto y Odiel (Cross, 1998; Cross & Rebordinos
2003). Cuenta con poblaciones naturales y grandes producciones en las costas de Taiwan
(Boudry, et al. 1998).
C. gigas o más conocida como ostra japonesa fue descrita en 1793 por Thunberg. Es una especie
estuarina. Fue importada de Asia a mediados de los años 70 con la finalidad de salvaguardar el
mercado de la ostricultura, que decaía debido a una epidemia de iridovirus que casi acaba con
esta especie en las costas de Francia. Posteriormente, se comprobó que esta especie se adaptaba
mucho mejor a las condiciones de cultivo (Grizel & Heral, 1991), obteniéndose un crecimiento
más rápido, por lo cual es considerada como una de las especies marinas de mayor producción
mundial. Este hecho desplazó a la ostra portuguesa de los cultivos, y actualmente sólo se
encuentra en el medio natural. La introducción de C. gigas en la acuicultura ha propiciado el
contacto entre las dos especies, y por tanto la coexistencia de los gametos de ambas en el medio
natural. Este hecho ha provocado la aparición de híbridos en las costas portuguesas, españolas y
marroquíes (Fernandes, 2008).
C. angulata y C. gigas han sido consideradas como especies diferentes debido a su distribución
geográfica, pero en la actualidad hay una fuerte controversia ya que diversos autores (Menzel,
1974; Huvet et al. 2002; López-Flores et al. 2004) las han considerado como la misma especie
debido a que no presentan variaciones significativas en morfología, cariotipos, marcadores
izoenzimáticos y ADN satélite (Cross, 2005). Ambas son de sexos separados con
hermafroditismo secuencial, tienen cromosomas diploides (2n=20) y metacéntricos de pequeño
tamaño.
En ostras, los métodos para identificar especies basados en el análisis del ADN son escasos. Se
han empleado técnicas de análisis de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) para
diferenciar a C. angulata y C. gigas (Boudry et. al. 1998). También se ha secuenciado el gen
ribosomal 5S ADNr, (el cual es usado como marcador genético debido a que es uno de los genes
más específicos que existen en eucariontes) con la misma finalidad de aclarar el estatus
7
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
taxonómico de estas especies (Cross, et. al. 2006), sin embargo estos estudios tampoco revelaron
diferencias génicas entre ambos taxas. No obstante se dio a conocer la presencia del gen snRNA
U2 en el espaciador del gen 5S en ambas especies, lo cual fue la primera evidencia de este tipo de
relación en el genoma de un organismo (Cross & Rebordinos. 2005).
Las histonas son proteínas presentes en el núcleo de todas las células eucariotas. Son el
componente principal de la cromatina eucariota y las responsables del empaquetamiento del
ADN. Hay varios tipos de histonas, las que forman el nucleosoma son: H2A, H2B, H3 y H4, las
cuales se encuentran formando un octámero con dos copias de cada una de éstas; mientras H1 es
una histona enlazada al nucleosoma, como se muestra en la Figura 1 (Smith, et. al. 2010; He &
Lehming. 2003).
Figura 1. Estructura del nucleosoma, mostrando la posición de la familia de histonas (He & Lehming, 2003).
En invertebrados los genes de las histonas se organizan en tándem, agrupados en una o más
posiciones cromosómicas, por lo que esta organización hace ideal el mapeo cromosómico por
FISH. La diferencia en el número y localización cromosómica del cluster de genes de histonas es
un buen marcador cromosómico (Carrilho, et. al. 2011). La secuenciación de estos genes permite
establecer relaciones filogenéticas entre ostras ya que éstos están muy conservados; tal es el caso
de las histonas H3 y la H4 consideradas como las proteínas eucarióticas más conservadas
(Bouilly, et. al 2010; Dorrington et. al. 2011).
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Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
Las histonas tienen propiedades antimicrobianas, y esta propiedad ha sido publicada en diversos
organismos tanto acuáticos como terrestres. Entre la familia de histonas, la histona H2A es un
agente antibacteriano potente, capaz de matar bacterias Gram-positivas en concentraciones
micromolares en 30 minutos in vitro (Fernandes, et. al. 2002). Recientemente se conoce que la
histona H2B posee actividad antimicrobiana en bacterias Gram-negativas, incluyendo patógenos
de humanos como Vibrio parahaemolyticus y Vibrio vulnificus (Seo, et. al. 2010; Seo, et. al.
2011). Para la histona H4 se ha demostrado en C. virginica que también posee actividad
antimicrobiana contra las bacterias. E. coli, S. aureus, M. luteus, y V. anguillarum (Dorrington et.
al. 2011).
2.1
Técnicas de Biología Molecular y Citogenética
El término Biología Molecular se aplica específicamente al estudio de la estructura y función del
conjunto de macromoléculas que se encuentran en las células vivas. Mediante técnicas de
Biología Molecular se puede conocer la diversidad de los organismos a nivel molecular, entre
otras novedosas aplicaciones a diferentes disciplinas. Las técnicas moleculares son útiles para
determinar las relaciones evolutivas entre organismos, utilizándose actualmente de forma habitual
para distinguir entre individuos.
La electroforesis consiste en la migración de partículas cargadas bajo la influencia de un campo
eléctrico. Biomoléculas como aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos,
poseen un grupo ionizable, y bajo la influencia de un campo eléctrico dichas partículas cargadas
migran, ya sea al extremo del cátodo (+) o del ánodo (-), según sea la naturaleza de su carga neta
(Wilson & Walker 2006).
La PCR es un método de síntesis de ácidos nucleicos in vitro mediante el cual un segmento
particular de ADN puede ser replicado de forma específica, obteniendo así millones de copias de
este segmento en un tiempo relativamente corto y además con una alta sensibilidad, ya que puede
detectar cantidades muy bajas de ADN. Esta técnica requiere que se conozca la secuencia
nucleotídica de las regiones que flanquean al gen deseado, ya que para que funcione la PCR es
necesario disponer de oligonucleótidos o primers, complementarios de secuencias presentes en el
gen o genes de interés (Wilson & Walker 2006). El fragmento de ADN que se quiere amplificar,
debe ser desnaturalizado por calor, para que la doble cadena de ADN se separe y el fragmento
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Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
pueda ser copiado, para ello se debe contar con los dos oligonucleótidos que van a hibridar con
las hebras opuestas del fragmento a amplificar, para que así la ADN polimerasa alargue los
iniciadores usando los fragmentos diana como moldes. Después de un periodo de incubación
adecuado, se somete nuevamente a calor, para volver a separar las cadenas; a medida que la
temperatura va bajando,
los oligonucleótidos van a ir hibridando con las regiones
complementarias del ADN, por lo que en cada ciclo aumenta exponencialmente la cantidad de
ADN del fragmento a amplificar. Los ciclos de PCR consisten en las siguientes etapas:

Desnaturalización por calor del ADN bicatenario.

Acoplamiento de oligonucleótidos específicos del ADN diana mediante enfriamiento.

Extensión de los oligonucleótidos por una ADN polimerasa termorresistente.
Los productos de la extensión de un oligonucleótido pueden servir de molde para el otro iniciador
en el siguiente ciclo (Figura 2).
Figura 2. Ciclos de PCR.
Las enzimas de restricción hidrolizan el ADN, son altamente específicas, ya que atacan sólo a
ciertas secuencias de ADN bicatenario. La mayoría de las enzimas realizan el corte en el
esqueleto de fosfodiéster del ADN en una posición específica dentro del sitio de reconocimiento,
resultando en una rotura del ADN. Estos sitios de reconocimiento y corte se denominan sitios de
restricción (Lewin, 2004). Existen enzimas de restricción tipo I, tipo II y tipo III; siendo las más
utilizadas las primeras dos. Las de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restricción, a una
distancia que varía aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para ADN recombinante. Las
de tipo II reconocen secuencias específicas y cortan el ADN bicatenario dentro de estas
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Tesis de Máster.
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secuencias. Éstas exhiben una simetría binaria alrededor de un punto determinado, a lo que se
llama secuencia palíndrome (que tiene la misma secuencia si se lee de 5´ a 3´ ó de 3´ a 5´), por
ejemplo, la enzima EcoRI reconoce una secuencia de 6 bases y corta específicamente el sitio:
5’…G▼AATTC…3’
3’…CTTAA▲G…5’
Los fragmentos de ADN a cada lado del sitio de corte se separan y, como el corte se hace
escalonado, los extremos poseen secuencias complementarias de ADN. La complementariedad
permite que los extremos cohesivos se unan por emparejamiento de bases. El corte de EcoRI
produce siempre los mismos extremos cohesivos aunque las moléculas cortadas sean diferentes
(Lewin, 2004).
La transformación de células competentes permite la introducción de fragmentos de ADN
foráneo (generalmente plásmidos) en la bacteria Escherichia coli, la cual es cultivada en un
medio selectivo que permite seleccionar las transformantes (aquellas que contienen el ADN
foráneo). Usualmente los plásmidos contienen un gen de resistencia a un antibiótico que permite
esta selección. Existen varias cepas de E. coli utilizadas para la clonación, cada una con
características particulares según los requerimientos.
Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases
aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de ADN. Esta absorción es una característica
usada eficientemente para determinar su concentración. Cada una de las bases tiene su propio y
único espectro de absorción y, por lo tanto, contribuyen de manera diferente a la propiedad total
de absorción de UV de una molécula de ADN. La determinación de la pureza del ADN se
establece mediante la relación de las lecturas de las absorbancias a 260/280 nm. Es así como una
unidad de densidad óptica (DO) a 260 nm equivale a 50 µg/mL de ADN de doble cadena, a 40
µg/mL de ARN y ADN de cadena simple y a 20µg de oligonucleótidos. El rango de absorbancia
de 260/280 nm es usado para medir la pureza del ADN. Cuando las mediciones de este rango son
cercanas a 1.8 se consideran “aceptables” ya que significa que el ADN está puro. Si el rango es
apreciablemente más bajo a lo esperado se puede suponer la presencia de proteínas, fenoles u
otros contaminantes que absorben fuertemente cerca de 280 nm. El rango de 230/260 nm es un
rango de medición secundaria que también indica la pureza del ADN. Para considerarse puro,
esta medición debe ser entre 0.3 y 0.6, si el rango es apreciablemente más bajo esto puede indicar
la presencia de contaminantes co-purificados que absorben a 230 nm, como solventes o sales.
11
Tesis de Máster.
2.2
Claudia Isela Granada Moreno
Técnicas de Citogenética
La Citogenética permite un análisis a nivel cromosómico para conocer la morfología de los
cromosomas, así como identificarlos, o inclusive ver la localización cromosómica de fragmentos
específicos de ADN. Al igual que las técnicas de Biología Molecular, mediante un análisis
citogenético también es posible establecer diferencias entre especies.
La técnica Hibridación in situ de Fluorescencia (FISH) es básicamente una técnica de tinción que
se basa en la hibridación o unión específica de una sonda desnaturalizada a aquella secuencia
genómica que presente una perfecta o casi perfecta complementariedad con la misma. Dicha
sonda de ADN es marcada con una sustancia fluorescente, y se requiere de células en metafase
cromosómica o en el núcleo en interfase. Si bien esta técnica tiene una amplia utilidad clínica
también es usada para caracterización de especies (Yao-Shan, 2002).
El mapeo cromosómico de genes mediante la técnica FISH ha demostrado ser una herramienta
rápida y útil en el análisis filogenético de especies (Bouilly, et. al 2010; Carrilho et. al. 2011). En
esta técnica se tiene una buena identificación de los cromosomas y con ella es posible seguir la
pista de un posible reordenamiento cromosómico (Guo et. al. 2007).
2.3
Filogenética
Cuando en un momento de su historia, los organismos sufren un proceso de especiación y
generan especies distintas, sus secuencias comienzan a diverger.
Un análisis filogenético estima la relación que existe entre genes o fragmentos de genes, a través
de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Esta relación evolutiva puede ser ilustrada por
medio de árboles filogenéticos. Para construir un árbol filogenético existen diferentes métodos,
donde se toman en cuenta diversos criterios para relacionar entre sí las secuencias. Estos métodos
están basados en:

Distancia, se calculan distancias entre todos los pares de secuencias y a partir de éstas se
infiere el árbol. Relaciona entre si a un grupo de secuencias a partir de una matriz de
distancias entre todas las secuencias.

Máxima parsimonia, se busca el árbol de menor número de pasos. Busca la topología que
requiera un mínimo número de cambios tratando de deducir qué cambios han debido
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Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
ocurrir en cada topología para justificar la distribución de residuos observada en las
secuencias.

Máximum verosimilitud, consiste en obtener una estimación de la probabilidad de
observar la distribución de residuos en las secuencias para una topología dada. Se basa en
el conocimiento de un modelo evolutivo y una topología. En el modelo usado se pueden
contemplar distintas tasas de evolución para las distintas ramas, así como estimadores
complejos de la distancia.
De estos tres métodos, los de distancia suelen ser los más empleados en análisis de genes. Se
emplean comúnmente los siguientes análisis:

El vecino más cercano (Neighbor-Joining). Es uno de los más empleados para la
construcción de árboles filogenéticos, debido a que es relativamente rápido y explora
todas las posibles topologías del árbol y sus ramas. Es un método de distancia que corrige
las distancias para evitar el efecto de las distintas tasas de evolución en las distintas ramas
(Saitou & Nei. 1987).

Bootstrap. Es un análisis que se basa en realizar pseudo-réplicas del conjunto original de
secuencias para cada una de las cuales se reconstruye un árbol a partir de un método dado
(por ejemplo, Neighbor-Joining), y posteriormente se estudia el grado de estabilidad de
las distintas ramas del árbol. Las pseudo-réplicas se obtienen muestreando aleatoriamente
con reemplazamiento de las columnas del alineamiento. Esto produce conjuntos de
secuencias alineadas con el mismo número de residuos, pero en las que unas columnas
aparecen más de una vez y otras no aparecen. Como cada pseudo-réplica es distinta, el
resultado es ligeramente distinto. Cuando se superponen las réplicas, unas partes del árbol
aparecen en todas las réplicas o en un número elevado de ellas, lo que significa que están
soportadas por un número de residuos estadísticamente significativo, y otras no.
Normalmente se utilizan valores del orden de 1000 si se estudian muchas secuencias
(Felsenstein, 1985).

P-distance. Es un método de distancia, en el cual por cada dos secuencias hay un solo
valor de distancia, basado en la fracción de la posición en el que esas secuencias difieren
(Salemi & Vandamme, 2003).
13
Tesis de Máster.
3
Claudia Isela Granada Moreno
OBJETIVOS:

Conocer el estado taxonómico de las ostras Crassostrea angulata y Crassostrea gigas a
partir de una caracterización molecular de la familia de histonas: H2A, H2B, H3 y H4
mediante técnicas de Biología Molecular.

Localizar en cromosomas algunos genes de la familia de histonas, mediante Hibridación
in situ de Fluorescencia (FISH).

Buscar marcadores cromosómicos que permitan distinguir entre parejas cromosómicas.
14
Tesis de Máster.
4
4.1
Claudia Isela Granada Moreno
MATERIAL Y MÉTODOS
Origen de las muestras
Los individuos de ambas especies de ostras utilizados en este estudio, proceden de muestras de
poblaciones naturales de C. angulata colectadas en Sanlúcar de Barrameda y de individuos de C.
gigas cultivados en piscifactorías de Chiclana y Conil; ambos municipios de la provincia de
Cádiz. Se usaron individuos pequeños de aproximadamente 2 a 3 cm en ambas especies.
4.2
Técnicas de Biología Molecular
4.2.1 Extracción de ADN
El ADN genómico (ADNg) de las ostras fue extraído de manto y branquias, mediante el kit
comercial FastDNA® (Q-Biogene) siguiendo el protocolo del fabricante. Este kit hace una lisis
celular mediante una combinación de calor, detergencia y fuerza mecánica; en esta lisis el ADN
liberado es anclado a una membrana de sílice para poder separarlo de todos los restos celulares y
finalmente ser aislado y purificado. El ADNg fue almacenado a -20ºC. La cantidad y calidad de
éste se verificó mediante una electroforesis en gel de agarosa y espectrofotometría.
4.2.2 Electroforesis
La técnica de electroforesis fue utilizada para visualizar el tamaño, cantidad y calidad del ADN,
independientemente de su naturaleza (genómico, plasmídico o un producto de PCR).
El porcentaje de agarosa (p/v) utilizado en los geles varió en función del tamaño de los
fragmentos visualizados y la separación deseada para éstos, utilizándose generalmente agarosa al
1.5% diluida en tampón TBE al 1X (890 mM Tris, 890 mM Ácido bórico, 20 mM EDTA). En
cada carril del gel se cargó 5 μL de H20 libre de nucleasas, 2 μL de Blue 6X loading Dye y 5 μL
de ADN total (estas cantidades variaron en función de la concentración de ADN de la muestra),
también se incluyó un carril en donde se colocó el marcador de peso molecular HyperLadder™
II. El voltaje utilizado en la electroforesis también varió en función de la naturaleza del ADN y la
separación deseada de las bandas. Para revelar los geles se utilizó bromuro de etidio (BrEt) a una
concentración de 0.5 μg/μL. Una vez teñidos los geles se observaron en un fotodocumentador
bajo luz ultravioleta.
15
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
4.2.3 Amplificación por PCR
Mediante la técnica de PCR se amplificaron los genes correspondientes a cada histona, utilizando
los oligonucleótidos mostrados en la Tabla 1.
Gen
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de cada gen.
Oligonucleótido (Forward)
Oligonucleótido (Reverse)
H2A
CTGCGBAARGGVAACTAYGC
GCCTGRATRTTRGGCARHACDCC
H2B
CTACGTGTACAARGTBCTGAARC
GGCRTGYTTRGCMAGYTCMC
H3
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGG
GGATGGCGCACAGGTTGGTGTC
H4
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCAC
CTCTTGAGGGCGTAGACAACGTCCAT
Las condiciones de amplificación para los genes de la familia de histonas fueron las descritas en
la Tabla 2. La enzima polimerasa para las reacciones de PCR fue Taq polimerasa® (5U/µL)
(Roche). La amplificación se llevó a cabo en un termociclador. Finalmente se verificó la
amplificación mediante una electroforesis en gel de agarosa.
Tabla 2. Condiciones de PCR.
Ciclos
1
35
1
Tiempo
Temperatura
5 minutos
94ºC
45 segundos
94ºC
45 segundos
59ºC
1 minuto
72ºC
10 minutos
72ºC
Posteriormente se purificaron los productos de PCR obtenidos mediante el kit comercial
NuecleoSpin®Extract II (Macherey-Nagel), siguiendo las indicaciones del fabricante para
eliminar los oligonucleótidos utilizados, los dNTP, y la ADN polimerasa después de la
amplificación. Este kit ancla los productos de la PCR para después de una serie de lavados y
centrifugados, remover selectivamente todos los componentes diferentes al ADN, así éste es
recuperado de un filtro de sílice tras un lavado con H2O MiliQ estéril. Para verificar el
rendimiento de la purificación se midió por espectrofotometría.
16
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
4.2.4 Cuantificación de ADN por espectrometría
Se utilizó el equipo NanoDrop ND-2000c (Thermo Scientific) para determinar la concentración y
pureza del ADN. Para ello se utilizó 1 μL de H2O MilliQ, la cual se colocó directamente en el
pedestal óptico, en donde al unirlo con el otro pedestal óptico se tenía que formar una columna. A
continuación, mediante el programa proporcionado por la casa distribuidora se seleccionó la
medición de ADN de cadena doble, seguido por la medición de esta gota de 1 μL la cual fungía
como blanco; posteriormente se midieron las muestras utilizando de 1 a 2 μL, siempre y cuando
se formara la columna, especificando en el programa el nombre y origen de cada muestra.
4.2.5 Clonación y secuenciación
A partir de los productos de PCR purificados se procedió a realizar una reacción de ligación de
estos productos con
el vector plasmídico pGEM-T Easy vectors System II ® (Promega),
proporcionado a partir de un kit de clonación convencional. El mapa de este vector se muestra en
la Figura 3, donde se muestra que dicho vector tiene un tamaño de 3015 pares de bases (pb).
17
Tesis de Máster.
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Figura 3. Mapa del vector de clonación pGEM-T.
18
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
La reacción de ligación se llevó a cabo mediante una enzima de tipo ligasa, de acuerdo a la
reacción mostrada en la Tabla 3.
Tabla 3. Reacción de ligación del gen amplificado con el vector de clonación
Reactivo
Cantidad (µL)
Tampón de rápida ligación para la ligasa ADN T4 (2X)
5
Vector de clonación pGEM-T (50 ng)
1
Producto de PCR
1-3*
Ligasa ADN T4(3 U)
1
H2O MiliQ estéril
Ajustar a un volumen final de 10 µL
*Para conocer la cantidad en µl a agregar se realizó la siguiente operación:
(
)
( )
( )
Tras una incubación mínima de 1 hora a 4ºC se prosiguió realizando la transformación de la
reacción de ligación, mediante las células competentes Escherichia coli cepa JM109 (Promega),
en cuyo genotipo (endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk−, mk+), relA1, supE44, Δ( lacproAB), [F′ traD36, proAB, laqIqZΔM15]) hay insertados genes de resistencia a los antibióticos:
ampicilina, tetraciclina, kanamicina y cloranfenicol.
Posteriormente se realizó una selección de clones positivos (colonias blancas, las más separadas y
mejor formadas) a los cuales se les aislaron los plásmidos con el inserto mediante el kit
Nucleospin®Plasmid (Macherey-Nagel). Este kit purifica el ADN del plásmido a partir de
cultivos bacterianos líquidos de los clones seleccionados. El principio básico de este
procedimiento consiste en liberar el plásmido (el cual contiene el gen insertado) de la bacteria
E.coli con una lisis alcalina mediante un tampón, para posteriormente con otro tampón crear las
condiciones adecuadas para anclar el ADN plasmídico a una membrana de sílice. En dicha
membrana se realizan una serie de lavados y centrifugaciones para precipitar proteínas, ADN
genómico y restos celulares hasta obtener ADN plasmídico, el cual se somete a una serie de
lavados que eliminan contaminantes como sales, metabolitos y macromoléculas celulares, esto a
través de un tampón que contiene etanol. Finalmente el ADN plasmídico se disuelve en agua
MiliQ estéril.
La verificación de la cantidad y calidad de los plásmidos aislados se realizó mediante
espectrofotometría.
19
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
Una vez aislado el plásmido se verificó que cada uno de éstos tuviera el inserto, para lo cual se
realizó a manera de sondeo, una PCR de la colonia de E.coli que presuntamente tenía el inserto
(colonia
blanca)
utilizando
los
oligonucléotidos:
SP6
Fwd.
(3’AAGATATCACAGTGGATTTA5’) y T7 Rev. (3’ATTATGCTGAGTGATATCCCGC5’).
Posteriormente se realizó una digestión con la enzima EcoRI con los reactivos mostrados en la
Tabla 4.
Tabla 4. Reacción de digestión con EcoRI
Reactivo
Volumen (µL)
ADN plasmídico
2.5
Tampón ECORI
2
Agua grado MiliQ estéril
14
Enzima ECORI
1.5
.
Para esta reacción se realizó una mezcla por separado con todos los reactivos mencionados
excepto el ADN del plásmido, el cual fue colocado directamente en cada tubo de microcentrífuga
de 0.5 mL en hielo. Una vez que se realizó la mezcla, éste se mezcló por pipeteo ligero y se
colocaron 10 μL de éste en cada tubo con ADN. Posteriormente se incubó a 37ºC por 3 horas
para su digestión. La verificación de la digestión se hizo mediante una electroforesis en gel de
agarosa.
4.2.6 Análisis de las secuencias
Se enviaron a secuenciar los plásmidos aislados con el inserto a la empresa Biomedal S.L. La
secuenciación se realizó en ambos sentidos de la cadena de ADN utilizando los oligonucleótidos
SP6
Fwd
(3’AAGATATCACAGTGGATTTA5’)
y
T7
Rev
(3’ATTATGCTGAGTGATATCCCGC5’).
Tras obtener la secuencia del ADN plasmídico de los clones, ésta se visualizó en el programa
bioinformático BioEdit Sequence Alignment Editor con la finalidad de buscar el gen insertado
dentro de la secuencia completa del plásmido, esto en ambos sentidos de la cadena de ADN (5’3’ y viceversa). En este programa también se visualizó que la calidad de las secuencias fuera la
adecuada para realizar los análisis posteriores. A continuación se eligieron sólo aquellas
secuencias que mostraran una cadena de ADN en sentido 5’- 3’, para exportarlas en formato
FASTA.
20
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
Las secuencias obtenidas fueron separadas por gen (H2A, H2B, H3 y H4) en donde los clones de
ambas especies del gen seleccionado fueron alineados mediante el programa ClustalW con
secuencias cercanas obtenidas utilizando el programa de bioinformática on line BLASTN (Basic
Local Alignment Search Tool), disponible en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, mediante el
cual se seleccionaron las entradas pertenecientes a secuencias de moluscos para poder
compararlas con los clones. También se seleccionaron grupos representativos de otros
organismos con el mismo fin.
A partir del alineamiento de estas secuencias se realizó un análisis filogenético utilizando el
programa MEGA versión 5 (Tamura, et. al. 2011), en el cual se construyeron árboles
filogenéticos.
4.3
Técnicas de Citogenética
Para el mapeo físico de dichas secuencias de ADN se utilizó la técnica de Hibridación in situ de
Fluorescencia (FISH) simple y doble.
Los individuos elegidos en este estudio fueron tratados con colchicina, durante 8 horas con el fin
de detener la mitosis en la metafase, para posteriormente someterlos a un choque hipotónico con
KCl (0.44%) y fijarlos en carnoy fresco siguiendo el protocolo descrito por Cross et. al. (2003).
Se les extrajeron las branquias ya que es en este tejido donde más células en división hay dentro
del organismo. Tras fijar una muestra de éstas en un portaobjetos se procedió a marcar la sonda
mediante PCR, a la cual en el caso del marcaje con rodamina solo se agregaba ésta a las
condiciones normales de la PCR y para el marcaje con dioxigenina se agregaron dNTP marcados
con dioxigenina.
Una vez obtenida la sonda y teniendo listas las preparaciones cromosómicas, se realizó la
hibridación, para lo cual fue necesario desnaturalizar la sonda y las preparaciones cromosómicas.
Primero se desnaturalizaron las preparaciones cromosómicas en una disolución con formamida y
tampón de fosfato y sometiéndolas a calor directo (72ºC), tras esto se realizó una serie de lavados
en etanol con el fin de deshidratar gradualmente estas preparaciones.
21
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
Posteriormente, se desnaturalizó la sonda, para lo cual fue necesario preparar una disolución de
hibridación, como se muestra en la Tabla 5. Las cantidades mostradas en esta tabla son por
preparación a observar. El esperma de salmón se utilizó como bloqueador de ADN y fue
proporcionado por la marca comercial Sigma®.
Tabla 5. Composición de la disolución de hibridación.
Reactivo
Cantidad
H2O MiliQ estéril
(se ajusta al volúmen final)
Dextran sulfato
3 mg
Formamida desionizada
15 µL
SSC (20X) (dodecilsulfato sódico)
3 µL
SDS 5% (tampón de citrato y cloruro de
sodio)
0.9 µL
ADN de E.coli (stock a 300 ng/µL)
4 µL
Esperma de salmón
1.5 µL
Sonda
2-5 µL
Volumen final
30 µL
Una vez lista la sonda se desnaturalizó por calor (75ºC) y se agregó a las preparaciones, las
cuales fueron incubadas durande 12 horas. Pasada la incubación se realizaron una serie de
lavados post-hibridación, para finalmente hacer una detección inmunocitoquímica con los
anticuerpos: mouse anti-DIG 0.5% (v/v), rabbit anti-mouse-FITC 0.2% (v/v) y goat anti-rabbitFICT 0.1% (v/v). En este procedimiento tras agregar cada anticuerpo se incubó a 37ºC durante 30
minutos y se hizo una serie de lavados y deshidratados.
Finalmente tras secarse, la preparación se tiñó con DAPI (4’-6-diamidino-2-phenilindole) e
ioduro de propidio y se observó en un microscopio de fluorescencia.
22
Tesis de Máster.
5
5.1
Claudia Isela Granada Moreno
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Biología Molecular
5.1.1 Amplificación y purificación de la PCR
Se obtuvieron productos de PCR para cada uno de los genes analizados, y se cuantificaron
mediante espectrofotometría la cantidad y calidad de estos productos, como se muestra en la
Tabla 6.
Tabla 6. Cuantificación por espectrofotometría de los productos de PCR
Muestra
PCR- purificado
Concentración Absorbancia Absorbancia
Género
Especie Gen Individuo
[µg/mL]
a 260/280
a 260/230
Crassostrea angulata H4
1
48.7
1.62
0.93
Crassostrea angulata H4
2
50.4
1.73
0.84
Crassostrea angulata H4
3
60.3
2.01
0.64
Crassostrea angulata H4
4
46.1
1.92
0.5
Crassostrea angulata H2A
1
69.3
1.86
1.01
Crassostrea angulata H2A
2
60.2
1.81
1.06
Crassostrea angulata H2A
3
55
1.76
1
Crassostrea angulata H2A
4
65.5
1.81
0.96
Crassostrea angulata H2B
1
43.1
1.71
0.93
Crassostrea angulata H2B
2
58
1.8
1.09
Crassostrea angulata H2B
3
51.9
1.93
0.9
Crassostrea angulata H2B
4
46.6
1.86
0.94
Crassostrea gigas
H2A
1
43.5
1.74
1.66
Crassostrea gigas
H2A
2
46
1.87
0.9
Crassostrea gigas
H2A
3
61.7
1.85
0.98
Crassostrea gigas
H2A
4
55
1.8
94
Crassostrea gigas
H2B
1
31.1
1.68
0.6
Crassostrea gigas
H2B
2
33.9
1.92
0.57
Crassostrea gigas
H2B
3
39.5
1.77
0.24
Crassostrea gigas
H2B
4
43.3
1.86
0.72
Crassostrea gigas
H4
1
31.2
1.91
0.87
Crassostrea gigas
H4
2
32.9
1.83
0.66
Crassostrea gigas
H4
3
36.2
1.88
0.56
Crassostrea gigas
H4
4
30.7
1.8
0.91
Crassostrea angulata H3
1
46.3
1.92
0.99
Crassostrea angulata H3
2
45.8
1.84
0.99
Crassostrea angulata H3
3
45.1
1.88
0.68
Crassostrea angulata H3
4
44.7
1.83
0.81
Crassostrea gigas
H3
1
45.2
1.83
1.07
Crassostrea gigas
H3
2
41.2
1.82
0.79
Crassostrea gigas
H3
3
44.1
1.9
1.07
Crassostrea gigas
H3
4
38.2
1.87
0.48
23
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
5.1.2 Clonación de los productos de PCR
Tras la transformación bacteriana se eligieron los clones positivos (colonias blancas) a los que se
les realizó una PCR a partir de las colonias directamente (sin previa extracción de ADN
genómico o plasmídico) utilizando los oligonucleótidos SP6 y T7. El tamaño en pb del fragmento
fue aproximadamente de 190 pb más el tamaño del inserto, debido a la posición de estos
oligonucleótidos dentro del mapa del vector plasmídico (Figura 3). En la Figura 4 se muestra el
gel de agarosa obtenido de los clones que contenían el inserto. Se utilizó como control negativo
una colonia azul (sin el inserto) y la PCR de colonias se realizó por lotes, pero no a cada una de
las colonias cultivadas.
Figura 4. Identificación del inserto en clones mediante PCR de colonias. Visión general de tamaños esperados
por gen.
Tras cultivar 3 clones por cada uno de los individuos y extraer el plásmido, se les realizó una
digestión con la enzima de restricción EcoRI, en donde solo los clones que presentaban el
fragmento esperado se mandaron a secuenciar. La Figura 5 muestra las imágenes más
representativas de los geles de agarosa donde se observan los fragmentos digeridos por la enzima
de restricción en cada gen.
Figura 5. Digestión con EcoRI de los plásmidos aislados. Visión general de tamaños esperados por gen.
24
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
El tamaño del gen insertado en la mayoría de los clones fue el mostrado en la Tabla 1, aunque
algunos presentaban deleciones e inserciones. El número de clones obtenidos por cada gen se
estimaba en 24, siendo para H3 y H4 ligeramente menor, sin embargo este número es suficiente
para el análisis de las secuencias.
Gen
H2A
H2B
H3
H4
Tabla 7. Resumen de los genes clonados.
Tamaño (pb)
Especie
Clones
C. angulata
12
239
C.gigas
12
C. angulata
12
214
C.gigas
11
C.angulata
10
316
C.gigas
9
C.angulata
12
211
C.gigas
11
Total de clones secuenciados
89
No todas las colonias aisladas tenían el inserto completo o las secuencias obtenidas no eran de
suficiente calidad para considerarlas en el estudio filogenético. Solo 89 clones se tomaron en
cuenta para este estudio. La Tabla 8 muestra dichos clones con su nomenclatura, donde el primer
número refleja a qué individuo pertenecen y el segundo número o letra hace referencia al clon.
Tabla 8. Total de clones utilizados para estudio filogenético.
Gen
Individuo
H2A
1
H2A
2
H2A
3
H2A
4
H2B
1
H2B
2
H2B
3
H2B
4
C.angulata C.gigas
Nombre del clon
1-1
1b
1-2
1c
1-3
1-3
2-1
2-1
2a
2a
2-3
2c
3-1
3a
3-2
3c
3-3
3-3
4a
4c
4b
4d
4-3
4-3
1-1
1b
1-2
1-2
1-3
1-3
2-1
2-1
2-2
2-3
2-3
3b
3-1
3-2
3-2
3-3
3-3
4-1
4-1
4-2
4-2
4-3
4-3
Gen
Individuo
H3
1
H3
2
H3
3
H3
4
H4
1
H4
2
H4
3
H4
4
C.angulata C.gigas
Nombre del clon
1-1
1-1
1-2
1-3
2a
2e
2-2
2d
3e
3e
3-2
3-3
3d
4a
4-1
4b
4-2
4c
4-3
1-1
1a
1-2a
1b
1-3
1-3
1-2b
2-1
2-2
2-2
2b
3-1
3-1
3-2
3a
3-3
3-3
4-1
4a
4-2
4-2
4c
4-3
25
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
5.1.3 Análisis filogenético
Se obtuvieron 178 secuencias de buena calidad para el análisis bioinformático, las cuales
pertenecían a los 89 clones (ambos sentidos de la cadena de ADN).
Se realizó un árbol radial para mostrar las diferencias generales entre la familia de histonas. Este
árbol consensuado fue inferido utilizando el método del vecino más cercano (Neighbor-Joining)
con un bootstrap de 1000 réplicas que sirve para explicar la historia evolutiva de los genes
analizados. Este árbol se muestra en la Figura 6, donde la longitud de las ramas refleja la
distancia evolutiva, la cual fue inferida utilizando el método p-distance. Este análisis evolutivo se
llevó a cabo en MEGA5 (Tamura, et. al. 2011).
En este árbol se aprecia a grandes rasgos que no hay un patrón de divergencia específico entre las
especies C. angulata (C.a.) ó C.gigas (C.g.) en ninguno de los 4 genes analizados, pero es notable
la divergencia de 2 secuencias de C.a. gen H2A, las cuales forman una rama divergente dentro
del mismo gen. Las secuencias H2A (sin contar las divergentes), H2B y H4 forman una rama
muy uniforme, lo cual indica su cercanía. Para el gen H3 hay pequeñas ramificaciones, lo cual
refleja que las secuencias no son tan homologas, como en el caso de los otros genes.
26
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
C.aC. .a
H
C.a.H3
3.H.
.4a
.4-2 43d.2d
C.g.H3
.3e
.H3
C.g
-1
3.4
g.H
100
C.
.3d
.H3
-2
.1
C.g
H3
a.
C.
89
100
4959
6811
10
1322464
23
89
100
41
99
C.g.H3.1-1
C.g.H
3 -2
.
3
-a2
C.a.H3.3e
3.2
2.2e
C.a.H
.H33.
C.ag.H
.
C
C.
C
a
.a .a.H .H3
.3.
H
3
C.
3
.
3.
g.H
1- 4b
3.4
1
C.g
-3
.H3
.1-3
C
100
Gen H3
-1
C.g.H2B.3-2
C.a.H2B.4-1
C.g.H
2B.2-1
C.a
C.a .H2B.1
-3
C. .H2
g.H B.1
2B -2
.13
C.g.H4.2
C.g.H4.3a
a
H4.1
C.g. .4-3
.H4 2b
C.g 4.1a.H
C.
7
251
5
3619
33
Gen H4
Gen H2B
82
87
53
3
3249
C.
C4..
C.gaC.H
.a4
g1.-1
.H
-2a
.3
C.g.H.H
4.1-3
4H
.14-.
-1
34a
.1
C.a.H4
100
1 --13 -3
4B-..1B
4 .4.1b
B.22.H
B22B
.H
H
.g
H
gC.2a
H
Cg.C
.a.
C.C
84
14
56
b
.3 -2
2B2B.1 3-3
.
.H
.a .H 2B 2
C C.g .g.H 2B.3C .H
3
C.a .H2B.3C.a
-1
.2
1
2B
.H
3
.a
C
100 12371 1 4
CC.a
.gH2B
CC
C.g.
3
22BB.4-2
..H
a.gH..H
.2
-2
2 224 2
.
3
H
2
85 2
2BBB..2-1.42-33
-2
64
2136
1
3416394
C
C. .g.H
g.H 4
.
C.a 4.3-31b
.H
C.a.H 4.2b
4.3-2
93
C.a.H
4.3-1
C.g.H4
.2-2
74
4742
9
2
0
830 997
C.a.H4.4-2
7
2---2413c
C.g.H
44.4-2
..3
82
C.a
H4.H4.4.
..H
a
.
C .a.H
C.a
C
88
CC..ga.H2
C.a
g...HH22A.1
H2 AA. .3-2-1
A. 2-1
4c
3997 19
2A
.2
-
3
3
3A.
6313
25
1
302
7653
760
5
Gen H2A
2a
A. a
2
.
a
H2 A
g. .H2 2AA.3.4-.32c
CC. .a .HH.H
2
2A.1-3
g.H2A
ggg.C.a.H2A.1-3
C
CC.C
C.a.H2A
.4
a
C.a
.H2
A.4C
3
.
a
18
C. .H2A
.4b
a
.
H
2A
.21
-2
.3
2A
1b
.H
.a 2A.
c
C
g.H A.3
C. .g.H2
C
A.1c
C.g.H2
Cg.H2
C.g.H2A.4d
A.3-3
0.05
54
.a
.H
H2
a.
C.
22207330
100
C
Figura 6. Árbol filogenético radial de la familia de histonas de las ostras C. angulata (C.a.) y C. gigas (C.g.).
Para conocer la posición taxonómica de los clones, se elaboraron árboles filogenéticos
individuales (por gen), en los cuales, además de presentarse las secuencias de los clones, se
agregaron otras secuencias del mismo gen pertenecientes a otros moluscos y a 6 especies
diferentes. Estas secuencias fueron descargadas del GenBank, para ello solo se tomó en cuenta la
fracción del gen homóloga a los clones.
27
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
Las 6 especies utilizadas como comparación en todos los genes se identificaron con un marcador
de color para reconocer rápidamente su posición en los árboles. La Tabla 9 muestra sus
características.
Tabla 9. Especies sutilizadas en los árboles filogenéticos como comparativas.
Marcador
Nombre científico
Nombre común
de color
Homo sapiens
Hombre
Mus musculus
Ratón
Danio rerio
Pez cebra
Drosophila melanogaster
Mosca de la fruta
Zea mays
Maíz
Saccharomyces cerevisiae
Levadura de la cerveza
Los árboles filogenéticos obtenidos para las secuencias de genes H2A, H2B, H3 y H4 se
muestran en las Figuras 7 - 10, respectivamente. La historia evolutiva de todos estos árboles
filogenéticos fue inferida usando el método Neighbor-Joining, con una prueba de bootstrap de
1000 réplicas. La distancia evolutiva fue calculada mediante el método p-distance. Todas las
posiciones ambiguas fueron retiradas. Estos análisis se realizaron el programa MEGA5 (Tamura,
et. al. 2011).
En la Figura 7, el árbol obtenido para el gen H2A muestra que excepto dos secuencias, todas las
demás se encuentran en un grupo diferenciado respecto al resto de secuencias con las que se han
comparado. En este grupo no se aprecian diferencias entre especies de C.angulata ó C.gigas. La
presencia de las secuencias de los clones C.a.H2A.3-3 y C.a.H2A.3-3 en una rama diferente
respecto a todas las secuencias analizadas, puede deberse a que se trata de pseudogenes. Se ha
publicado que la histona H2A y la H1 muestran la mayor diversidad de isoformas de entre los 5
genes de las histonas; además de que la familia H2A cuenta con un gran número de variantes
(González-Romero, et. al. 2008). En esta figura también se observa que las secuencias de los
clones aparecen en una rama junto a vertebrados y plantas, aunque el valor de bootstrap es
pequeño para considerarlo significativo. Esto puede deberse a que en el análisis filogenético se
usó una región interna conservada del gen, por lo que futuros análisis con la secuencia completa
de dicho gen pueden arrojar otros resultados.
28
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
C.g.H2A.1c
33
9
C.g.H2A.3c
13
C.g.H2A.4d
C.a.H2A.2-1
9
38
C.a.H2A.3-2
C.g.H2A.1b
4
12
20
C.a.H2A.1-3
C.a.H2A.4b
C.a.H2A.4a
32
C.a.H2A.4-3
97
Cg.H2A.3-3
27
C.a.H2A.1-1
18
41 75
Cg.H2A.1-3
C.g.H2A.2c
61
Cg.H2A.4-3
96
C.g.H2A.3a
C.a.H2A.2a
C.g.H2A.2a
59
51
C.g.H2A.4c
90
C.a.H2A.3-1
56
65
Cg.H2A.2-1
Sunetta scripta
38
Danio rerio
28
Zea mays
77
Homo sapiens
91
Mus musculus
85
Chlamys farreri
Mytilus edulis
39
27
Mytilus californianus
64
97
Solen marginatus
Mytilus trossulus
98
94
100
V enerupis philippinarum
V enerupis pullastra
84
74 V enerupis decussatus
Aplysia californica
Drosophila melanogaster
Haliotis discus
16
26
Saccharomyces cerevisiae
C.a.H2A.3-3
C.a.H2A.2-3
0.05
Figura 7. Árbol filogenético de las secuencias obtenidas del gen H2A.
29
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
En la Figura 8 se muestra que para el gen H2B, al igual que para el H2A hay una clara
diferenciación respecto al resto de bivalvos y nuevamente se comparte una rama con secuencias
H2B de otros organismos como peces, mamíferos o insectos. Hay una clara la diferenciación de
los clones analizados respecto al resto de moluscos.
C.a.H2B.1-2
C.g.H2B.2-1
C.g.H2B.1-3
C.a.H2B.4-1
C.a.H2B.1-3
C.g.H2B.3-1
C.a.H2B.4-3
C.a.H2B.2-1
C.g.H2B.3-3
C.a.H2B.1-1
C.a.H2B.3-2
C.g.H2B.4-3
C.a.H2B.3-3
C.g.H2B.2-3
C.g.H2B.1b
C.a.H2B.2-3
C.a.H2B.4-2
C.g.H2B.4-1
C.a.H2B.2-2
C.a.H2B.3b
C.g.H2B.4-2
C.g.H2B.1-2
C.g.H2B.3-2
Danio rerio
Homo sapiens
Mus musculus
Drosophila melanogaster
Zea mays
Chlamys farreri
Mytilus edulis
Mytilus chilensis
Mytilus californianus
Solen marginatus
Venerupis pullastra
Venerupis decussatus
Venerupis philippinarum
Mytilus galloprovincialis
Saccharomyces cerevisiae
0.05
Figura 8. Árbol filogenético de las secuencias obtenidas del gen H2B.
30
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
En la Figura 9, se muestra el árbol filogenético propuesto para el gen H3. Este gen presenta
menos divergencia en las especies analizadas respecto a la observada para los genes H2A y H2B.
La mayoría de los clones analizados se agrupan cerca de otros moluscos bivalvos y compartiendo
rama con la secuencia del GenBank de C. virginica, pero 3 clones (C.g.H3.1-3, C.g.H3.4-3 y
C.a.H3.1-1) están a una distancia más cercana de los moluscos gasterópodos, mostrándose así,
nuevamente la divergencia y variedad evolutiva de los genes histónicos secuenciados.
En la Figura 10, se muestra el árbol filogenético propuesto para el gen H4. Los clones se agrupan
en dos grupos diferenciados y unidos al resto de moluscos bivalvos (nuevamente incluida C.
virginica) sin diferencias claras entre los clones de C. angulata y los de C. gigas. En este caso la
divergencia entre grupos es baja y la separación con otros organismos como vertebrados e
insectos muestra un nivel muy bajo de bootstrap.
31
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
C.g.H3.3e
C.a.H3.2-2
Crassostrea gigas
C.a.H3.2d
27
C.g.H3.2e
C.a.H3.3e
26
C.a.H3.2a
C.g.H3.3-2
100
C.g.H3.4-1
C.a.H3.4a
C.a.H3.4d
65
41
C.g.H3.4-2
C.g.H3.3d
59
C.a.H3.1-2
99
76
72
C.a.H3.3-3
Crassostrea virginica
C.a.H3.4b
Limaria hemphilli
Phaxas pellucidus
Delectopecten vancouverensis
37
Cryptopecten vesiculosus
67
98
Aequipecten glyptus
48
12
Argopecten nucleus
Chlamys rubida
76
Laevichlamys irregularis
100
65
Coralichlamys madreporarum
Spathochlamys benedicti
46
Caribachlamys ornata
85
Meretrix lamarcki
96
21
Venerupis galactites
Mytilus edulis
11
Solen marginatus
78
22
Mytilus trossulus
100
99
71
Mytilus galloprovincialis
Venerupis pullastra
Phyllodesmium horridum
Zea mays
Drosophila melanogaster
Raphitoma sp.
27
Bolinus brandaris
C.g.H3.1-3
70
68
51
C.g.H3.4-3
C.a.H3.1-1
Crepidula fornicata
Danio rerio
45
53
Homo sapiens
56
6
Mus musculus
Smaragdia viridis
Heterocithara sp
88
28
Mangeliidae sp.
13
Raphitoma rubroapicata
2
Thuridilla neona
100
Thuridilla livida
Lienardia sp.
Nannodiella ravella
49
25
Cerithiopsis sp.
Nassarius festivus
32
Nassarius pullus
87
99
Zeuxis siquijorensis
Saccharomyces cerevisiae
0.05
Figura 9. Árbol filogenético de las secuencias obtenidas del gen H3.
32
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
Bathymodiolus thermophilus
99
29
Bathymodiolus azoricus
Crepidula fornicata
8
M us musculus
Homo sapiens
11
11
Drosophila melanogaster
45
Chlamys farreri
15
Cirsotrema varicosum
5
C.g.H4.2-1
8
Danio rerio
26
10
Z ebina sp.
Biomphalaria glabrata
22
Cochlodina laminata
20
Lehmannia valentiana
25
Z ea mays.
45
Crassostrea virginica
C.g.H4.1b
23
C.a.H4.3-1
65
C.a.H4.3-2
78
C.g.H4.3-3
C.g.H4.4-3
46
49
C.g.H4.3a
C.a.H4.1-2b
41
C.g.H4.1a
C.a.H4.2b
C.a.H4.4-2
74
C.g.H4.2-2
83
C.a.H4.1-2a
C.a.H4.1-3
68
C.g.H4.4a
C.a.H4.3-3
64
C.a.H4.4c
C.a.H4.2-2
C.g.H4.4-2
86
C.a.H4.1-1
C.a.H4.4-1
C.g.H4.3-1
C.g.H4.1-3
M ytilus edulis
Saccharomyces cerevisiae
Solen marginatus
59
Venerupis pullastra
77
M ytilus galloprovincialis
49
85
38
41
M ytilus trossulus
M ytilus californianus
Venerupis decussatus
Venerupis philippinarum
54
M ytilus chilensis
0.05
Figura 10. Árbol filogenético de las secuencias obtenidas del gen H4.
33
Tesis de Máster.
5.2
Claudia Isela Granada Moreno
Citogenética
Las preparaciones cromosómicas para los estudios citogenéticos se realizaron a partir de C.
angulata y C. gigas diploides (2n=20 cromosomas).
Las sondas elaboradas a partir de reacciones de PCR marcadas con dioxigenina (dig) y rodamina
(rod) se muestran en la Figura 11, utilizándose como control una reacción de PCR amplificando
los mismos genes pero sin los marcadores, ya que la PCR que contiene la sonda es ligeramente
mayor a la normal. Para la sonda H2A-H2B se realizó una PCR con los oligonucleótidos H2A
Fwd y H2B Fwd, y el fragmento esperado es de aproximadamente 1000 pb.
Figura 11. Marcaje de sondas utilizadas en la FISH.
Tras la observación al microscopio de fluorescencia se buscaron placas metafásicas donde los
cromosomas estuvieran lo suficientemente separados para poder distinguir la sonda. La sonda
marcada con dioxigenina presenta un color verde, y la marcada con rodamina rojo, por lo que las
señales en estos colores (o la combinación de ambos, en el caso de la doble hibridación) dentro
de las parejas cromosómicas señalan la hibridación del gen marcado.
La FISH simple de los genes H2A-H2B marcada con dioxigenina mostrada en la Figura 12 se
realizó sobre una preparación cromosómica de C. gigas, donde se muestra en verde las señales de
esta sonda, indicando su ubicación en 2 parejas cromosómicas. Las flechas indican los
cromosomas con señal.
34
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
Figura 12. FISH sobre preparación cromosómica de C.gigas. Hibridación del gen H2A-H2B marcados con
dioxigenina
La FISH doble es mostrada en la Figura 13, revelando que hay hibridación y ambas sondas colocalizan en las mismas parejas cromosómicas. Las flechas indican los cromosomas con señal.
Figura 13. FISH doble sobre preparación cromosómica de C.gigas. Hibridación de los genes H2A-H2B
marcado con dioxigenina y H4 marcado con rodamina.
35
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
La co-localización mediante FISH doble permitió confirmar la localización de los 4 genes
histónicos que conforman el nucleosoma (H2A, H2B, H3 y H4) en el mismo cluster dentro de
dos parejas cromosómicas diferentes, ya que previamente, dentro del grupo de investigación
BIO219 de la Universidad de Cádiz, se habían realizado hibridaciones dobles de los genes H3 y
H4 demostrando que éstos también co-localizan (
Figura 14). Así el trabajo en esta tesis de Máster complementa la investigación previa que el
grupo ha realizado con respecto a la caracterización de la familia de histonas de C. angulata y C.
gigas.
Figura 14. FISH doble de los genes H3-H4 sobre preparaciones cromosómicas de C. angulata (a) y C. gigas (b)
(Cross & Rebordinos, sin publicar).
Los resultados obtenidos en este trabajo también comprueban que la familia multigénica de
histonas está localizada junto a otra familia multigénica, la ribosómica; ya que previamente en
este grupo de investigación se habían realizado hibridaciones triples entre la familia de histonas y
la ribosómica mayores y menores (Cross, et. al. 2003b). En este trabajo se observó que ninguna
familia co-localizaba (
Figura 15) permitiendo localizar por primera vez en ostras las histonas y los genes 5S y 18S de
la familia génica ribosómica. Los resultados mostraron que se encuentran en posiciones
36
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
diferentes respecto a ambos genes; por lo que cinco parejas de cromosomas pueden ser
inequívocamente identificadas mediante estos marcadores cromosómicos con vistas a la
elaboración de mapas genéticos.
Figura 15. FISH triple de los genes H4, 18S y 5S sobre preparaciones cromosómicas de C. angulata (a) y C.
gigas (b) (Cross, et. al. 2003b).
En ninguna hibridación se encontraron diferencias de localización de los genes mapeados entre
las especies estudiadas.
37
Tesis de Máster.
6
Claudia Isela Granada Moreno
CONCLUSIONES
1. La caracterización de la familia de histonas H2A, H2B, H3 y H4 muestra que las
secuencias de los clones obtenidos en la mayoría de los casos de estudio son muy
cercanas entre sí y no reflejan una divergencia entre especies.
2. Las secuencias de los clones C.a.H2A 2-3 y C.a.H2A 2-3 son muy lejanas al resto de los
clones e incluso a otras secuencias referenciadas, debido a que presentan importantes
deleciones e inserciones internas; y por ello pueden tratarse de pseudogenes de la histona
H2A.
3. En cuanto a la posición taxonómica de las secuencias analizadas, con respecto a otros
moluscos, ésta no siempre fue cercana, ya que en el caso de las secuencias del gen H2A y
H2B se encontró a los moluscos más alejados que otros grupos externos utilizados para
comparación, lo cual puede deberse a que la variedad de gen encontrado es cercana a
estos grupos, pero para ello debe hacerse un análisis bioinformático más extenso.
4. Se logró localizar los genes H2A, H2B y H4 en los cromosomas. Estos genes se
encontraron co-localizados, por lo que los genes que codifican para estas enzimas están en
el mismo sitio.
5. Se encontró que los genes H2A, H2B y H4 pueden ser utilizados como marcadores
cromosómicos, ya que co-localizan en dos parejas cromosómicas.
38
Tesis de Máster.
7
Claudia Isela Granada Moreno
BIBLIOGRAFÍA
1. Boudry P., Heurtebise S., Collet B., Conette F. y Gérard A. (2003). Mitochondrial and
nuclear DNA sequence variation of presumed Crassostrea gigas and Crassostrea angulata
specimens: a new oyster species in Hong Kong?. Aquaculture, 228: 15-25.
2. Boudry P., Heurtebise S., Collet B., Conette F., & Gérad A. (1998). Differentiation between
populations of the Portuguese oyster, Crassostrea angulata (Lamark) and the Pacific oyster,
Crassostrea gigas (Thunberg), revealed by mtDNA RFLP analysis. Journal of Experimental
marine Biology and Ecology, 226: 279-291.
3. Bouilly K., Chaves R., Fernandes M. & Guedes-Pinto H. (2010). Histone H3 gene in the
Pacific oyster, Crassostrea gigas Thunberg, 1793: molecular and cytogenetic
characterisations. Comparative Cytogenetics, 4 (2): 111-121.
4. Carrilho J., Pérez-García C., Leitao A., Malheiro E. & Pasantes J. (2011). Cytogenetic
characterization and mapping of rDNAs, core histone genes and telomeric sequences in
Venerupis aurea and Tapes rhomboides (Bivalvia: Veneridae). Genetica, 139:823–831.
5. Cross I. & Rebordinos L. (2003a). Effect of marine contamination on the genetic population
structure of the bivalve Crassostrea angulata. Ciencias Marinas, 29: 239-250.
6. Cross I, Vega L. & Rebordinos L. (2003b). Nucleolar organizing regions in Crassostrea
angulata: chromosomal location and polymorphism. Genetica, 119: 65-74.
7. Cross I. & Rebordinos L. (2005). 5S rDNA and U2 snRNA are linked in the genome of
Crassostrea angulata and Crassostrea gigas oysters: does the (CT)n·(GA)n microsatellite
stabilize this novel linkage of large tandem arrays?. Genome,48: 1116-1119.
8. Cross I. (1998). Estructura Genética de poblaciones naturales de Crassostrea angulata en las
costas del suroeste de la Península Ibérica. Tesis de licenciatura. En departamento de
Bioquímica, Biología Molecular, Microbiología, Medicina Preventiva, Salud Pública,
Fisiología y Genética. Universidad de Cádiz. 122 pp.
9. Cross I. (2005). Caracterización poblacional y Citogenética de Crassostrea angulata:
Análisis molecular del ADNr 5S en ostereidos. Tesis doctoral. Universidad de Cádiz. 89 pp.
10. Cross I., Rebordinos L. & Diaz E. (2006). Species Identification of Crassostrea and Ostrea
Oysters by Polymerase Chain Reaction Amplification of the 5S rRNA Gene. Journal of
AOAC International, 89 (1): 144 – 148.
11. Dorrington T., Villamil L. & Gómez-Chiarri M. (2011). Upregulation in response to
infection and antibacterial activity of oyster histone H4. Fish & Shellfish Immunology, 30:
94-101.
12. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: an aprproach using the bootstrap.
Evolution, 39 (4): 783-791.
13. Fernandes J., Kemp G., Molle M. & Smith V. (2002). Anti-microbial properties of histone
H2A from skin secretions of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Biochem. J., 368: 611–
620.
39
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
14. Fernandes T. (2008). Determinación de hibridación natural entre Crassostrea angulata
(Lamarck, 1819) y Crassostrea gigas (Thunberg, 1793), en poblaciones naturales del
Sudoeste de la Península Ibérica. Tesis de Máster, Universidad de Cádiz, Cádiz.
15. Gazeau F., Gattuso J-P., Greaves M., Elderfield H., Peene J., Heip C. & Middelburg J.
(2011). Effect of Carbonate Chemistry Alteration on the Early Embryonic Development of
the Pacific Oyster (Crassostrea gigas). PLoS ONE, 6(8): e23010.
16. González-Romero R.,Ausió J., Méndez J. & Eirín-López J. (2008). Early Evolution of
Histone Genes: Prevalence of an “Orphon” H1 Linage in Protostomen and Birth-and-Death
Process in the H2A Family. J.Mol. Evol, 66: 505-518.
17. Grizel, H. & Heral, M. (1991). Introduction into France of the Japanese oyster (Crassostrea
gigas). J. Conseilt. Int. l’Exploration. Mer., 47: 399-403.
18. Guo X., Wang Y. & Xu Z. (2007). Genomic analyses using fluorescence in situ
hybridization. In: Liu Z (ed) Aquaculture genome technologies. Blackwell Publishing,
Oxford, pp 289–311.
19. He H. & Lehming N. (2003). Review: Global effects of histone modifications. Briefings In
Functional Genomics And Proteomics, 2 (3): 234–243.
20. Huvet A., Gerard A., Ledu C., Phelipot P., Heurtebise S. y Boudry P. (2002). Is fertility of
hybrids enough to conclude that the two oysters Crassostrea gigas and Crassostrea angulate
are the same specie?. Acuatic Living Resources, 15: 45-52.
21. Lewin B. (2004). Genes VIII. Pearson Prentice Hall. United States of America.1027 pp.
22. López-Flores I., De La Herrán R., Garrido-Ramos M., Boudry P., Ruiz-Rejón C., y RuizRejon M. (2004). The molecular phylogeny of oysters based on satellite DNA related to
transposons. Gene, 339: 181-188.
23. Marteil L. (1957). L´huitre portugaise en Bretagne. Revie Travails Institut Peches Maritimes,
21: 377 - 400.
24. Menzel R. (1974). Portuguese and Japanese oysters are the same species. J. Fish. Res. Board
Can., 31: 453-456.
25. Michinina S. & Rebordinos L. (1997). Genetic differentiation in marine and estuarine natural
populations of Crassostrea angulata. Marine Ecology Progress Series, 154: 167-174.
26. Pascual E. (1973). Bases para el cultivo del ostión Crassostrea angulata (Lmk), en el
sudoeste español: reproducción, contenido en metales y sistemas de explotación. Universidad
de Sevilla, Sevilla.
27. Rebordinos L & Cross I. (1999). The use of genetic markers in the study of marine natural
populations. Boletín del Instituto Español de Oceanografía, 15: 363-372.
28. Saitou N. & Nei M. (1987). The Neighbor-joining Method: A New method for
Reconstructing Phylogenetic Trees. Mol. Biol. Evol, 4 (4): 406-425.
29. Salemi M. & Vandamme A. (2003). The Phylogenetic Handbook: A Practical Approach to
DNA and protein Phylogeny. Cambridge University Press.406 pp.
30. Seo J-K, Stephenson J. & Noga E. (2011). Multiple antibacterial histone H2B proteins are
expressed in tissues of American oyster. Comparative Biochemistry and Physiology Part B,
158: 223–229.
40
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
31. Seo J-K., Stephenson J., Crawford J., Stone K. & Noga E. (2010). American Oyster,
Crassostrea virginica, Expresses a Potent Antibacterial Histone H2 Protein. Mar
Biotechnol, 12: 543–551.
32. Smith V., Desbois A. & Dyrynda E. (2010). Review: Conventional and Unconventional
Antimicrobials from Fish, Marine Invertebrates and Micro-algae. Mar. Drugs, 8: 1213-1262.
33. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, and Kumar S (2011) MEGA5:
Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary
Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution.
34. Wilson K. & Walker J. (2006). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular
Biology. 6 ª edición. Cambridge University Press. Cambridge, Inglaterra.
35. Yao-Shan F. (2002). Molecular Cytogenetics, Protocols and Applications. Humana Press.
411 pp.
41
Tesis de Máster.
8
8.1
Claudia Isela Granada Moreno
ANEXOS
Secuencias de los clones del gen H2A
>C.a.H2A.1-1
CTGCGTAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGAGTGTTGCCCAACATCCAGGC
>C.a.H2A.1-2
CTGCGGAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA
TCCCCCGTCACCTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGC
>C.a.H2A.1-3
CTGCGGAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGTGTTTTGCCTAACATCCAGGC
>C.a.H2A.2-1
CTGCGGAAGGGGAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGAGTTCTGCCCAACATTCAGGC
>C.a.H2A.2a
CTGCGCAAAGGCAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA
TCCCCCGTCACCTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGCGTGACC
ATCGCCCAGGGTGGAGTGCTGCCTAACATTCAGGC
>C.a.H2A.2-3
CTGCGCAAGGGAAACTATGCACCTGGAAAACAAAACAAGGCTAGGTCCACCATCAATTCAAAGACAA
TTATTCACGTATGCATTACAGACACCAATATCTAGCTACCAGTAGCACTGACTCAAAAAATGTGATCTA
CCTAGTAACGGTGGCTTTTTACTGAGAAAATTAGTGGCTTGCTGGCAACATATGTGGTGTGTTGCCTAA
TATCCAGGC
>C.a.H2A.3-1
CTGCGGAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA
TCCCCCGTCACCTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGCGTGACC
ATCGCCCAGGGTGGCGTACTGCCCAACATCCAGGC
>C.a.H2A.3-2
CTGCGGAAGGGGAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGCGACAACAAGAAAACCAGAATC
ATCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACC
ATCGCACAGGGTGGCGTTCTGCCCAACATTCAGGC
>C.a.H2A.3-3
CTGCGGAAAGGCAACTACGCATTGTGGAAAAACTACTTCCGCCGGAACTTCTGCAACCTTCCAATTCAC
GAGGATTGTAACGCCACGCGAGATTTGGCGTATCTCGAGAGAAAGGGCCATATCAAGATCGGGGACTA
TGATGTTTTGATCGATATATTTAGAAAGATTGACGAAAGGGCCATCCAGTATATTGAAAAGAAAACGT
CAGACATCAAGGCGGTCGGCAAAGGTCGGAGTTTTGCCCAACATCCAGGC
>C.a.H2A.4a
CTGCGTAAGGGAAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGCGTGTTGCCCAATATTCAGGC
42
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
>C.a.H2A.4b
CTGCGGAAGGGAAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGCGTTTTGCCCAACATCCAGGC
>C.a.H2A.4-3
CTGCGTAAGGGAAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGCGTGTTGCCCAATATTCAGGC
>C.g.H2A.1b
CTGCGGAAGGGGAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGCGTTCTGCCTAATATCCAGGC
>C.g.H2A.1c
CTGCGGAAGGGGAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGTGTATTGCCTAACATTCAGGC
>Cg.H2A.1-3
CTGCGCAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGAGTGTTGCCCAACATCCAGGC
>Cg.H2A.2-1
CTGCGCAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA
TCCCCCGTCACCTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGCGTGACC
ATCGCCCAGGGTGGCGTTCTGCCCAATATCCAGGC
>C.g.H2A.2a
CTGCGGAAGGGGAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA
TCCCCCGTCACCCGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACC
ATCGCCCAGGGTGGTGTTCTGCCTAACATTCAGGC
>C.g.H2A.2c
CTGCGTAAAGGCAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCACACAGGGTGGAGTGCTGCCTAATATCCAGGC
>C.g.H2A.3a
CTGCGTAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGTGTGCTGCCTAATATCCAGGC
>C.g.H2A.3c
CTGCGGAAGGGGAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGCGTATTGCCCAATATTCAGGC
>Cg.H2A.3-3
CTGCGTAAGGGGAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGTGTGTTGCCCAACATCCAGGC
43
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
>C.g.H2A.4c
CTGCGCAAGGGGAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA
TCCCCCGTCACCTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGCGTGACC
ATCGCCCAGGGTGGTGTATTGCCTAATATCCAGGC
>C.g.H2A.4d
CTGCGCAAGGGGAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGTGTTTTGCCCAACATTCAGGC
>Cg.H2A.4-3
CTGCGGAAAGGCAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCTGTCCTTGA
GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA
TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCACAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA
TCGCACAGGGTGGAGTACTGCCCAACATCCAGGC
8.2
Secuencias de los clones del gen H2B
>C.a.H2B.1-1
CTACGTGTACAAGGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTTGCT
AAGCACGCC
>C.a.H2B.1-2
CTACGTGTACAAAGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTTGCC
AAACATGCC
>C.a.H2B.1-3
CTACGTGTACAAGGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCCA
AACATGCC
>C.a.H2B.2-1
CTACGTGTACAAAGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTGGCC
AAACACGCC
>C.a.H2B.2-2
CTACGTGTACAAGGTGCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCCA
AACACGCC
>C.a.H2B.2-3
CTACGTGTACAAGGTGCTGAAACAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCTA
AACACGCC
>C.a.H2B.3b
CTACGTGTACAAGGTGCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCGGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTGGCC
AAACATGCC
44
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
>C.a.H2B.3-2
CTACGTGTACAAGGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTGGCC
AAACACGCC
>C.a.H2B.3-3
CTACGTGTACAAGGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTGGCC
AAACACGCC
>C.a.H2B.4-1
CTACGTGTACAAAGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCCA
AACATGCC
>C.a.H2B.4-2
CTACGTGTACAAAGTGCTGAAACAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTGGCC
AAACACGCC
>C.a.H2B.4-3
CTACGTGTACAAGGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAGCTGGCC
AAGCACGCC
>C.g.H2B.1b
CTACGTGTACAAGGTTCTGAAACAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAGCTGGCC
AAGCATGCC
>C.g.H2B.1-2
CTACGTGTACAAAGTGCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAGCTGGCC
AAACATGCC
>C.g.H2B.1-3
CTACGTGTACAAAGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTGGCC
AAACATGCC
>C.g.H2B.2-1
CTACGTGTACAAAGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCCA
AACATGCC
>C.g.H2B.2-3
CTACGTGTACAAGGTTCTGAAACAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGAACTGGCTA
AACACGCC
>C.g.H2B.3-1
CTACGTGTACAAGGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCCA
AACACGCC
45
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
>C.g.H2B.3-2
CTACGTGTACAAAGTGCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATTGCCGCTGAGGCCTCCCGTCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGCCTTCTCCTGCCGGGTGAACTTGCC
AAACACGCC
>C.g.H2B.3-3
CTACGTGTACAAAGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAGCTTGCT
AAACATGCC
>C.g.H2B.4-1
CTACGTGTACAAAGTGCTGAAACAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAGCTTGCCA
AACACGCC
>C.g.H2B.4-2
CTACGTGTACAAAGTGCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTGGCC
AAACACGCC
>C.g.H2B.4-3
CTACGTGTACAAGGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA
TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA
AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTTGCC
AAGCACGCC
8.3
Secuencias de los clones del gen H3
>C.a.H3.1-1
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCCAGGAAGCAGCTGGCGACCAAAGCTGCCCGCAAGAGCGCCC
CGGCCACCGGCGGCGTGAAGAAGCCCCACCGTTACAGGCCCGGTACCGTGGCTCTGAGAGAGATCCGC
CGCTACCAGAAGTCCACCGAGCTGCTCATCCGAAAGCTGCCCTTCCAGCGCCTGGTCAGGGAGATCGC
TCAGGACTTCAAGACCGACCTGCGCTTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTTTGCAGGAGGCTAGTGAGG
CCTACCTGGTCGGCCTGTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.a.H3.1-2
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCAGCCCGTAAGAGCGCTCCAGTAACTGGTGGCGTCAAGAAACCCCA
CAGATACAGGCCAGGAACCGTCGCTCTTCGTGAGATCAGGAGATACCAGAAAAGCACAGAGCTGCTG
ATCAGGAAACTGCCATTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCTCAGGACTTCAAGACCGACCTGCGTTTC
CAGAGTTCAGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGCCTACCTTGTCGGACTCTTTGAGGACAC
CAACCTGTGCGCCATCC
>C.a.H3.2a
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC
AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT
CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC
TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.a.H3.2-2
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC
AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT
CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC
TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
46
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
>C.a.H3.2d
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC
AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT
CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC
TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.a.H3.3e
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC
AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT
CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC
TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.a.H3.3-3
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCCACCAAGGCAGCCCGTAAGAGCGCTCC
AGCAACTGGTGGCGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCAGGAACCGTCGCTCTTCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAAAGCACAGAGCTGCTGATCAGGAAACTGCCATTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT
CAGGACTTCAAGACCGACCTGCGTTTCCAGAGTTCAGCCGTCATAGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC
CTACCTTGTCGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.a.H3.4a
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC
AGCCACTGGGGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGG
AGATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGC
TCAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAG
CTTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.a.H3.4b
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC
AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCAGGAACCGTCGCTCTTCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAGAGCACAGAACTTCTCATCAGGAAACTTCCCTTCCAGCGCCTGGTCCGTGAGATTGCC
CAGGATTTCAAGACCGACCTGAGATTCCAGAGTGCAGCCATTGGGGCCTTACAAGAGGCCAGTGAAGC
TTACCTGGTCGGTCTGTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.a.H3.4d
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC
AGCCACTGGGGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGG
AGATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGC
TCAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAG
CTTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.g.H3.1-1
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCCCCCAGAAAGCAGCTGGCGACCAAAGCCGCCCGTAAGAGCGCCC
CGGCCACCGGCGGAGTGAAGAAGCCTCACCGTTACAGGCCCGGTACCGTGGCTCTGCGAGAGATCCGT
CGCTACCAGAAATCCACGGAGCTGCTGATCCGCAAGCTGCCCTTCCAGCGCCTCGTGAGGGAGATCGC
TCAGGACTTCAAGACCGACCTACGCTTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCCCTGCAGGAGTCCAGCGAAG
CTTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.g.H3.1-3
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCCCCCAGAAAGCAGCTGGCGACCAAAGCCGCCCGTAAGAGCGCCC
CGGCCACCGGCGGAGTGAAGAAGCCTCACCGTTACAGGCCCGGTACCGTGGCTCTGCGAGAGATCCGT
CGCTACCAGAAATCCACGGAGCTGCTGATCCGCAAGCTGCCCTTCCAGCGCCTCGTGAGGGAGATCGC
TCAGGACTTCAAGACCGACCTACGCTTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCCCTGCAGGAGTCCAGCGAAG
CTTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.g.H3.2e
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC
AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT
CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC
TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
47
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
>C.g.H3.3e
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC
AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCAACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT
CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC
TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.g.H3.3-2
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC
AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT
CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC
TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.g.H3.3d
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCCACTAAGGCAGCCCGTAAGAGCGCTCC
AGCAACTGGTGGCGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCAGGAACCGTCGCTCTTCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAAAGCACAGAGCTGCTGATCAGGAAACTGCCATTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT
CAGGACTTCAAGACCGACCTGCGTTTCCAGAGTTCAGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC
TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.g.H3.4-1
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCACCCC
TGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT
CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC
TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.g.H3.4-2
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC
AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA
GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT
CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCCTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC
TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
>C.g.H3.4-3
CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCCCCCAGAAAGCAGCTGGCGACCAAAGCCGCCCGTAAGAGCGCCC
CGGCCACCGGCGGAGTGAAGAAGCCCCACCGTTATAGGCCCGGTACCGTGGCTCTGAGAGAGATCCGT
CGCTACCAGAAGTCCACCGAGCTGCTCATCCGCAAGCTGCCCTTCCAGCGCCTGGTCAGGGAGATCGC
TCTGGACTTCAAGACCGACCTGCGTTTCCAGAGTTCAGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAG
CCTACCTTGTCGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC
8.4
Secuencias de los clones del gen H4
>C.a.H4.1-1
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA
CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT
GATGCAGTCACATACACAGAGCATGCCAAGAGAAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT
CAAGAG
>C.a.H4.1-2a
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTAGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA
CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT
GATGCAGTCACATACACAGAGCATGCCAAGAGAAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT
CAAGAG
>C.a.H4.1-3
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTAGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA
CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT
GATGCAGTCACATACACAGAGCATGCCAAGAGAAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT
CAAGAG
48
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
>C.a.H4.1-2b
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA
CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT
GACGCTGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT
CAAGAG
>C.a.H4.2-2
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA
CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT
GATGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT
CAAGAG
>C.a.H4.2b
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA
CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT
GACGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT
CAAGAG
>C.a.H4.3-1
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA
CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT
GACGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT
CAAGAG
>C.a.H4.3-2
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA
CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT
GACGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT
CAAGAG
>C.a.H4.3-3
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA
CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT
GATGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT
CAAGAG
>C.a.H4.4-1
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA
CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT
GACGCAGTCACATACACAGAGCACGCTAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTAGCCCTC
AAGAG
>C.a.H4.4-2
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACTAAGCCCGCCATCCGTCGTCTAGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA
CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT
GATGCAGTCACATACACAGAGCATGCCAAGAGAAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT
CAAGAG
>C.a.H4.4c
TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA
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>C.g.H4.1a
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>C.g.H4.1b
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49
Tesis de Máster.
Claudia Isela Granada Moreno
>C.g.H4.1-3
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>C.g.H4.2-1
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>C.g.H4.2-2
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>C.g.H4.3-3
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>C.g.H4.4a
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>C.g.H4.4-2
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>C.g.H4.4-3
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50