Download Documento completo
Document related concepts
Transcript
Universidad de Cádiz Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales Departamento de Biomedicina, Biotecnología y Salud Pública Grupo: BIO219 / Microbiología Aplicada y Genética Molecular Directores: Laureana Rebordinos González e Ismael Cross Pacheco TESIS DE MÁSTER EN GESTIÓN INTEGRAL DEL AGUA Estudio filogenético de la familia de histonas de las ostras Crassostrea angulata y Crassostrea gigas Claudia Isela Granada Moreno Noviembre 2011 Estudio filogenético de la familia de histonas de las ostras Crassostrea angulata y Crassostrea gigas Memoria presentada por CLAUDIA ISELA GRANADA MORENO para la obtención del Título de Máster en Gestión Integral del Agua (Perfil Investigador). Firma del Tesinando Fdo.: Claudia Isela Granada Moreno Puerto Real a 25 de Noviembre del 2011 LAUREANA REBORDINOS GONZÁLEZ, DOCTORA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS E ISMAEL CROSS PACHECO, DOCTOR EN CIENCIAS DEL MAR, como Directores de la Tesis de Máster titulada: “Estudio filogenético de la familia de histonas de las ostras Crassostrea angulata y Crassostrea gigas”, realizada por Claudia Isela Granada Moreno. INFORMAN: que el trabajo presentado en la presente memoria se ha llevado a cabo bajo nuestra dirección en las dependencias del Departamento de Biomedicina, Biotecnología y Salud Pública. Y para que así conste firmamos el presente informe en Puerto Real a 25 de Noviembre del 2011. Firma de los Directores: Fdo.: Laureana Rebordinos González Fdo.: Ismael Cross Pacheco TESIS DEL MÁSTER (PERFIL INVESTIGADOR) EN GESTIÓN INTEGRAL DEL AGUA. 3 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno ÍNDICE 1 2 3 4 RESUMEN ..................................................................................................................... 5 INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 6 2.1 Técnicas de Biología Molecular y Citogenética ................................................................ 9 2.2 Técnicas de Citogenética ................................................................................................. 12 2.3 Filogenética ..................................................................................................................... 12 OBJETIVOS ................................................................................................................. 14 MATERIAL Y MÉTODOS .......................................................................................... 15 4.1 Origen de las muestras ..................................................................................................... 15 4.2 4.2.1 Extracción de ADN .................................................................................................. 15 4.2.2 Electroforesis ............................................................................................................ 15 4.2.3 Amplificación por PCR ............................................................................................ 16 4.2.4 Cuantificación de ADN por espectrometría ............................................................. 17 4.2.5 Clonación y secuenciación ....................................................................................... 17 4.2.6 Análisis de las secuencias ........................................................................................ 20 4.3 5 Técnicas de Citogenética ................................................................................................. 21 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 23 5.1 Biología Molecular .......................................................................................................... 23 5.1.1 Amplificación y purificación de la PCR .................................................................. 23 5.1.2 Clonación de los productos de PCR ......................................................................... 24 5.1.3 Análisis filogenético ................................................................................................. 26 5.2 6 7 8 Técnicas de Biología Molecular ...................................................................................... 15 Citogenética ..................................................................................................................... 34 CONCLUSIONES ........................................................................................................ 38 BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 39 ANEXOS ...................................................................................................................... 42 8.1 Secuencias de los clones del gen H2A ............................................................................ 42 8.2 Secuencias de los clones del gen H2B............................................................................. 44 8.3 Secuencias de los clones del gen H3 ............................................................................... 46 8.4 Secuencias de los clones del gen H4 ............................................................................... 48 Tesis de Máster. 1 Claudia Isela Granada Moreno RESUMEN Crassostrea angulata y Crassostrea gigas son especies de ostras con una gran importancia económica, ya que constituyen dos de las principales especies comercializadas actualmente en Europa. Además, al ser consideradas como biomarcadores del grado de contaminación acuática, el estudio de estas especies es de gran interés para evaluar la calidad ambiental de los ecosistemas acuáticos. Estas especies no han podido ser diferenciadas claramente a nivel taxonómico, ya que aunque tienen una morfología similar, tanto los patrones de distribución como la resistencia a un medio hostil y a enfermedades, son distintos entre ellas. Es por ello que algunos autores las han considerado como especies diferentes. Sin embargo, otros autores las consideran de la misma especie, debido a que no presentan diferencias significativas en ciertos marcadores moleculares. Actualmente las técnicas de Biología Molecular y Citogenética permiten revelar este tipo de enigmas mediante la caracterización de genes conservados. El objetivo principal de este estudio es conocer el estado taxonómico de estas especies, mediante la caracterización molecular y citogenética de los genes conservados de la familia de histonas H2A, H2B, H3 y H4 presentes en estas ostras. En el análisis molecular, tras la obtención de ADN genómico, se amplificaron, clonaron y secuenciaron los genes de la familia de histonas H2A, H2B, H3 y H4 (proteínas muy conservadas a nivel evolutivo en diversos eucariontes). Este análisis no reveló diferencias entre ambas especies, aunque en el caso de las histonas H2A y H2B sí se encontraron diferencias a nivel taxonómico de los clones de ambas especies con respecto a otros moluscos, por lo que podrían tratarse de isoformas de este gen. Se observó que dos secuencias de clones del gen H2A estaban filogenéticamente más alejadas de todos los organismos comparados, lo cual sugiere que se trata de pseudogenes de la histona H2A. En el análisis citogenético mediante la técnica de FISH, se logró mapear los genes H2A, H2B y H4. Se observó que estos genes co-localizan en dos parejas cromosómicas, sugiriendo así a la familia histónica como marcador cromosómico de Crassostrea. 5 Tesis de Máster. 2 Claudia Isela Granada Moreno INTRODUCCIÓN Las ostras son moluscos bivalvos que se distribuyen a nivel global. Tienen poca movilidad, bajo metabolismo y son filtradoras; tienden a acumular compuestos contaminantes, comportándose así como bioindicadores del grado de contaminación ambiental (Rebordinos & Cross, 1999). Estos organismos usan los iones carbonato para la formación de sus conchas, son especialmente sensibles a la acidificación del océano debido al CO2 antropogénico que el océano absorbe continuamente, dicho efecto ha sido recientemente publicado para embriones de la ostra Crassostrea gigas (Gazeau, et. al. 2011). Mediante la Genética de poblaciones se puede determinar la calidad de los ambientes acuáticos, ya que los contaminantes afectan a la constitución genética de una población, produciendo mutaciones génicas o variaciones cromosómicas; para ello la Genética se vale de organismos bioindicadores que presenten un loci polimórfico que permita detectar fácilmente variaciones en frecuencias génicas, o en estructuras multilocus entre poblaciones de áreas contaminadas (Rebordinos & Cross, 2003). Las ostras, en general, muestran una gran variabilidad morfológica que dificulta su identificación a través de caracteres morfológicos, por lo que el empleo de marcadores genéticos es una herramienta útil para su identificación. La caracterización de éstas es de gran interés a nivel biológico y comercial, ya que en todo el mundo se ha extendido el cultivo de estos moluscos con la finalidad de servir de alimento. Crassostrea angulata y Crassostrea gigas son dos especies de moluscos bivalvos sésiles con morfología similar que pertenecen a la familia Ostreidae, que cuenta con alrededor de 20 especies cuyo linaje se muestra a continuación: Dominio: Eucariota Reino: Animalia Subreino: Metazoa Filum: Mollusca Clase: Bivalvia Subclase: Pteriomorphia Orden: Ostreoida Subfamilia: Ostreoidea Familia: Ostreidae Género: Crassostrea 6 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno C. angulata se conoce con el nombre común de ostra portuguesa, fue descrita en 1819 por Lamark. Habita fijada en un sustrato duro de desembocaduras de ríos, estuarios y bahías (Marteil, 1957). Los principales bancos naturales dentro de la península Ibérica se encuentran en la desembocadura de los ríos Guadiana y Guadalquivir (Pascual, 1973; Michinina & Rebordinos 1997), así como en la desembocadura de los ríos Tinto y Odiel (Cross, 1998; Cross & Rebordinos 2003). Cuenta con poblaciones naturales y grandes producciones en las costas de Taiwan (Boudry, et al. 1998). C. gigas o más conocida como ostra japonesa fue descrita en 1793 por Thunberg. Es una especie estuarina. Fue importada de Asia a mediados de los años 70 con la finalidad de salvaguardar el mercado de la ostricultura, que decaía debido a una epidemia de iridovirus que casi acaba con esta especie en las costas de Francia. Posteriormente, se comprobó que esta especie se adaptaba mucho mejor a las condiciones de cultivo (Grizel & Heral, 1991), obteniéndose un crecimiento más rápido, por lo cual es considerada como una de las especies marinas de mayor producción mundial. Este hecho desplazó a la ostra portuguesa de los cultivos, y actualmente sólo se encuentra en el medio natural. La introducción de C. gigas en la acuicultura ha propiciado el contacto entre las dos especies, y por tanto la coexistencia de los gametos de ambas en el medio natural. Este hecho ha provocado la aparición de híbridos en las costas portuguesas, españolas y marroquíes (Fernandes, 2008). C. angulata y C. gigas han sido consideradas como especies diferentes debido a su distribución geográfica, pero en la actualidad hay una fuerte controversia ya que diversos autores (Menzel, 1974; Huvet et al. 2002; López-Flores et al. 2004) las han considerado como la misma especie debido a que no presentan variaciones significativas en morfología, cariotipos, marcadores izoenzimáticos y ADN satélite (Cross, 2005). Ambas son de sexos separados con hermafroditismo secuencial, tienen cromosomas diploides (2n=20) y metacéntricos de pequeño tamaño. En ostras, los métodos para identificar especies basados en el análisis del ADN son escasos. Se han empleado técnicas de análisis de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) para diferenciar a C. angulata y C. gigas (Boudry et. al. 1998). También se ha secuenciado el gen ribosomal 5S ADNr, (el cual es usado como marcador genético debido a que es uno de los genes más específicos que existen en eucariontes) con la misma finalidad de aclarar el estatus 7 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno taxonómico de estas especies (Cross, et. al. 2006), sin embargo estos estudios tampoco revelaron diferencias génicas entre ambos taxas. No obstante se dio a conocer la presencia del gen snRNA U2 en el espaciador del gen 5S en ambas especies, lo cual fue la primera evidencia de este tipo de relación en el genoma de un organismo (Cross & Rebordinos. 2005). Las histonas son proteínas presentes en el núcleo de todas las células eucariotas. Son el componente principal de la cromatina eucariota y las responsables del empaquetamiento del ADN. Hay varios tipos de histonas, las que forman el nucleosoma son: H2A, H2B, H3 y H4, las cuales se encuentran formando un octámero con dos copias de cada una de éstas; mientras H1 es una histona enlazada al nucleosoma, como se muestra en la Figura 1 (Smith, et. al. 2010; He & Lehming. 2003). Figura 1. Estructura del nucleosoma, mostrando la posición de la familia de histonas (He & Lehming, 2003). En invertebrados los genes de las histonas se organizan en tándem, agrupados en una o más posiciones cromosómicas, por lo que esta organización hace ideal el mapeo cromosómico por FISH. La diferencia en el número y localización cromosómica del cluster de genes de histonas es un buen marcador cromosómico (Carrilho, et. al. 2011). La secuenciación de estos genes permite establecer relaciones filogenéticas entre ostras ya que éstos están muy conservados; tal es el caso de las histonas H3 y la H4 consideradas como las proteínas eucarióticas más conservadas (Bouilly, et. al 2010; Dorrington et. al. 2011). 8 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno Las histonas tienen propiedades antimicrobianas, y esta propiedad ha sido publicada en diversos organismos tanto acuáticos como terrestres. Entre la familia de histonas, la histona H2A es un agente antibacteriano potente, capaz de matar bacterias Gram-positivas en concentraciones micromolares en 30 minutos in vitro (Fernandes, et. al. 2002). Recientemente se conoce que la histona H2B posee actividad antimicrobiana en bacterias Gram-negativas, incluyendo patógenos de humanos como Vibrio parahaemolyticus y Vibrio vulnificus (Seo, et. al. 2010; Seo, et. al. 2011). Para la histona H4 se ha demostrado en C. virginica que también posee actividad antimicrobiana contra las bacterias. E. coli, S. aureus, M. luteus, y V. anguillarum (Dorrington et. al. 2011). 2.1 Técnicas de Biología Molecular y Citogenética El término Biología Molecular se aplica específicamente al estudio de la estructura y función del conjunto de macromoléculas que se encuentran en las células vivas. Mediante técnicas de Biología Molecular se puede conocer la diversidad de los organismos a nivel molecular, entre otras novedosas aplicaciones a diferentes disciplinas. Las técnicas moleculares son útiles para determinar las relaciones evolutivas entre organismos, utilizándose actualmente de forma habitual para distinguir entre individuos. La electroforesis consiste en la migración de partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. Biomoléculas como aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos, poseen un grupo ionizable, y bajo la influencia de un campo eléctrico dichas partículas cargadas migran, ya sea al extremo del cátodo (+) o del ánodo (-), según sea la naturaleza de su carga neta (Wilson & Walker 2006). La PCR es un método de síntesis de ácidos nucleicos in vitro mediante el cual un segmento particular de ADN puede ser replicado de forma específica, obteniendo así millones de copias de este segmento en un tiempo relativamente corto y además con una alta sensibilidad, ya que puede detectar cantidades muy bajas de ADN. Esta técnica requiere que se conozca la secuencia nucleotídica de las regiones que flanquean al gen deseado, ya que para que funcione la PCR es necesario disponer de oligonucleótidos o primers, complementarios de secuencias presentes en el gen o genes de interés (Wilson & Walker 2006). El fragmento de ADN que se quiere amplificar, debe ser desnaturalizado por calor, para que la doble cadena de ADN se separe y el fragmento 9 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno pueda ser copiado, para ello se debe contar con los dos oligonucleótidos que van a hibridar con las hebras opuestas del fragmento a amplificar, para que así la ADN polimerasa alargue los iniciadores usando los fragmentos diana como moldes. Después de un periodo de incubación adecuado, se somete nuevamente a calor, para volver a separar las cadenas; a medida que la temperatura va bajando, los oligonucleótidos van a ir hibridando con las regiones complementarias del ADN, por lo que en cada ciclo aumenta exponencialmente la cantidad de ADN del fragmento a amplificar. Los ciclos de PCR consisten en las siguientes etapas: Desnaturalización por calor del ADN bicatenario. Acoplamiento de oligonucleótidos específicos del ADN diana mediante enfriamiento. Extensión de los oligonucleótidos por una ADN polimerasa termorresistente. Los productos de la extensión de un oligonucleótido pueden servir de molde para el otro iniciador en el siguiente ciclo (Figura 2). Figura 2. Ciclos de PCR. Las enzimas de restricción hidrolizan el ADN, son altamente específicas, ya que atacan sólo a ciertas secuencias de ADN bicatenario. La mayoría de las enzimas realizan el corte en el esqueleto de fosfodiéster del ADN en una posición específica dentro del sitio de reconocimiento, resultando en una rotura del ADN. Estos sitios de reconocimiento y corte se denominan sitios de restricción (Lewin, 2004). Existen enzimas de restricción tipo I, tipo II y tipo III; siendo las más utilizadas las primeras dos. Las de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restricción, a una distancia que varía aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para ADN recombinante. Las de tipo II reconocen secuencias específicas y cortan el ADN bicatenario dentro de estas 10 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno secuencias. Éstas exhiben una simetría binaria alrededor de un punto determinado, a lo que se llama secuencia palíndrome (que tiene la misma secuencia si se lee de 5´ a 3´ ó de 3´ a 5´), por ejemplo, la enzima EcoRI reconoce una secuencia de 6 bases y corta específicamente el sitio: 5’…G▼AATTC…3’ 3’…CTTAA▲G…5’ Los fragmentos de ADN a cada lado del sitio de corte se separan y, como el corte se hace escalonado, los extremos poseen secuencias complementarias de ADN. La complementariedad permite que los extremos cohesivos se unan por emparejamiento de bases. El corte de EcoRI produce siempre los mismos extremos cohesivos aunque las moléculas cortadas sean diferentes (Lewin, 2004). La transformación de células competentes permite la introducción de fragmentos de ADN foráneo (generalmente plásmidos) en la bacteria Escherichia coli, la cual es cultivada en un medio selectivo que permite seleccionar las transformantes (aquellas que contienen el ADN foráneo). Usualmente los plásmidos contienen un gen de resistencia a un antibiótico que permite esta selección. Existen varias cepas de E. coli utilizadas para la clonación, cada una con características particulares según los requerimientos. Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de ADN. Esta absorción es una característica usada eficientemente para determinar su concentración. Cada una de las bases tiene su propio y único espectro de absorción y, por lo tanto, contribuyen de manera diferente a la propiedad total de absorción de UV de una molécula de ADN. La determinación de la pureza del ADN se establece mediante la relación de las lecturas de las absorbancias a 260/280 nm. Es así como una unidad de densidad óptica (DO) a 260 nm equivale a 50 µg/mL de ADN de doble cadena, a 40 µg/mL de ARN y ADN de cadena simple y a 20µg de oligonucleótidos. El rango de absorbancia de 260/280 nm es usado para medir la pureza del ADN. Cuando las mediciones de este rango son cercanas a 1.8 se consideran “aceptables” ya que significa que el ADN está puro. Si el rango es apreciablemente más bajo a lo esperado se puede suponer la presencia de proteínas, fenoles u otros contaminantes que absorben fuertemente cerca de 280 nm. El rango de 230/260 nm es un rango de medición secundaria que también indica la pureza del ADN. Para considerarse puro, esta medición debe ser entre 0.3 y 0.6, si el rango es apreciablemente más bajo esto puede indicar la presencia de contaminantes co-purificados que absorben a 230 nm, como solventes o sales. 11 Tesis de Máster. 2.2 Claudia Isela Granada Moreno Técnicas de Citogenética La Citogenética permite un análisis a nivel cromosómico para conocer la morfología de los cromosomas, así como identificarlos, o inclusive ver la localización cromosómica de fragmentos específicos de ADN. Al igual que las técnicas de Biología Molecular, mediante un análisis citogenético también es posible establecer diferencias entre especies. La técnica Hibridación in situ de Fluorescencia (FISH) es básicamente una técnica de tinción que se basa en la hibridación o unión específica de una sonda desnaturalizada a aquella secuencia genómica que presente una perfecta o casi perfecta complementariedad con la misma. Dicha sonda de ADN es marcada con una sustancia fluorescente, y se requiere de células en metafase cromosómica o en el núcleo en interfase. Si bien esta técnica tiene una amplia utilidad clínica también es usada para caracterización de especies (Yao-Shan, 2002). El mapeo cromosómico de genes mediante la técnica FISH ha demostrado ser una herramienta rápida y útil en el análisis filogenético de especies (Bouilly, et. al 2010; Carrilho et. al. 2011). En esta técnica se tiene una buena identificación de los cromosomas y con ella es posible seguir la pista de un posible reordenamiento cromosómico (Guo et. al. 2007). 2.3 Filogenética Cuando en un momento de su historia, los organismos sufren un proceso de especiación y generan especies distintas, sus secuencias comienzan a diverger. Un análisis filogenético estima la relación que existe entre genes o fragmentos de genes, a través de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Esta relación evolutiva puede ser ilustrada por medio de árboles filogenéticos. Para construir un árbol filogenético existen diferentes métodos, donde se toman en cuenta diversos criterios para relacionar entre sí las secuencias. Estos métodos están basados en: Distancia, se calculan distancias entre todos los pares de secuencias y a partir de éstas se infiere el árbol. Relaciona entre si a un grupo de secuencias a partir de una matriz de distancias entre todas las secuencias. Máxima parsimonia, se busca el árbol de menor número de pasos. Busca la topología que requiera un mínimo número de cambios tratando de deducir qué cambios han debido 12 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno ocurrir en cada topología para justificar la distribución de residuos observada en las secuencias. Máximum verosimilitud, consiste en obtener una estimación de la probabilidad de observar la distribución de residuos en las secuencias para una topología dada. Se basa en el conocimiento de un modelo evolutivo y una topología. En el modelo usado se pueden contemplar distintas tasas de evolución para las distintas ramas, así como estimadores complejos de la distancia. De estos tres métodos, los de distancia suelen ser los más empleados en análisis de genes. Se emplean comúnmente los siguientes análisis: El vecino más cercano (Neighbor-Joining). Es uno de los más empleados para la construcción de árboles filogenéticos, debido a que es relativamente rápido y explora todas las posibles topologías del árbol y sus ramas. Es un método de distancia que corrige las distancias para evitar el efecto de las distintas tasas de evolución en las distintas ramas (Saitou & Nei. 1987). Bootstrap. Es un análisis que se basa en realizar pseudo-réplicas del conjunto original de secuencias para cada una de las cuales se reconstruye un árbol a partir de un método dado (por ejemplo, Neighbor-Joining), y posteriormente se estudia el grado de estabilidad de las distintas ramas del árbol. Las pseudo-réplicas se obtienen muestreando aleatoriamente con reemplazamiento de las columnas del alineamiento. Esto produce conjuntos de secuencias alineadas con el mismo número de residuos, pero en las que unas columnas aparecen más de una vez y otras no aparecen. Como cada pseudo-réplica es distinta, el resultado es ligeramente distinto. Cuando se superponen las réplicas, unas partes del árbol aparecen en todas las réplicas o en un número elevado de ellas, lo que significa que están soportadas por un número de residuos estadísticamente significativo, y otras no. Normalmente se utilizan valores del orden de 1000 si se estudian muchas secuencias (Felsenstein, 1985). P-distance. Es un método de distancia, en el cual por cada dos secuencias hay un solo valor de distancia, basado en la fracción de la posición en el que esas secuencias difieren (Salemi & Vandamme, 2003). 13 Tesis de Máster. 3 Claudia Isela Granada Moreno OBJETIVOS: Conocer el estado taxonómico de las ostras Crassostrea angulata y Crassostrea gigas a partir de una caracterización molecular de la familia de histonas: H2A, H2B, H3 y H4 mediante técnicas de Biología Molecular. Localizar en cromosomas algunos genes de la familia de histonas, mediante Hibridación in situ de Fluorescencia (FISH). Buscar marcadores cromosómicos que permitan distinguir entre parejas cromosómicas. 14 Tesis de Máster. 4 4.1 Claudia Isela Granada Moreno MATERIAL Y MÉTODOS Origen de las muestras Los individuos de ambas especies de ostras utilizados en este estudio, proceden de muestras de poblaciones naturales de C. angulata colectadas en Sanlúcar de Barrameda y de individuos de C. gigas cultivados en piscifactorías de Chiclana y Conil; ambos municipios de la provincia de Cádiz. Se usaron individuos pequeños de aproximadamente 2 a 3 cm en ambas especies. 4.2 Técnicas de Biología Molecular 4.2.1 Extracción de ADN El ADN genómico (ADNg) de las ostras fue extraído de manto y branquias, mediante el kit comercial FastDNA® (Q-Biogene) siguiendo el protocolo del fabricante. Este kit hace una lisis celular mediante una combinación de calor, detergencia y fuerza mecánica; en esta lisis el ADN liberado es anclado a una membrana de sílice para poder separarlo de todos los restos celulares y finalmente ser aislado y purificado. El ADNg fue almacenado a -20ºC. La cantidad y calidad de éste se verificó mediante una electroforesis en gel de agarosa y espectrofotometría. 4.2.2 Electroforesis La técnica de electroforesis fue utilizada para visualizar el tamaño, cantidad y calidad del ADN, independientemente de su naturaleza (genómico, plasmídico o un producto de PCR). El porcentaje de agarosa (p/v) utilizado en los geles varió en función del tamaño de los fragmentos visualizados y la separación deseada para éstos, utilizándose generalmente agarosa al 1.5% diluida en tampón TBE al 1X (890 mM Tris, 890 mM Ácido bórico, 20 mM EDTA). En cada carril del gel se cargó 5 μL de H20 libre de nucleasas, 2 μL de Blue 6X loading Dye y 5 μL de ADN total (estas cantidades variaron en función de la concentración de ADN de la muestra), también se incluyó un carril en donde se colocó el marcador de peso molecular HyperLadder™ II. El voltaje utilizado en la electroforesis también varió en función de la naturaleza del ADN y la separación deseada de las bandas. Para revelar los geles se utilizó bromuro de etidio (BrEt) a una concentración de 0.5 μg/μL. Una vez teñidos los geles se observaron en un fotodocumentador bajo luz ultravioleta. 15 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno 4.2.3 Amplificación por PCR Mediante la técnica de PCR se amplificaron los genes correspondientes a cada histona, utilizando los oligonucleótidos mostrados en la Tabla 1. Gen Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de cada gen. Oligonucleótido (Forward) Oligonucleótido (Reverse) H2A CTGCGBAARGGVAACTAYGC GCCTGRATRTTRGGCARHACDCC H2B CTACGTGTACAARGTBCTGAARC GGCRTGYTTRGCMAGYTCMC H3 CGTAAATCCACTGGAGGCAAGG GGATGGCGCACAGGTTGGTGTC H4 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCAC CTCTTGAGGGCGTAGACAACGTCCAT Las condiciones de amplificación para los genes de la familia de histonas fueron las descritas en la Tabla 2. La enzima polimerasa para las reacciones de PCR fue Taq polimerasa® (5U/µL) (Roche). La amplificación se llevó a cabo en un termociclador. Finalmente se verificó la amplificación mediante una electroforesis en gel de agarosa. Tabla 2. Condiciones de PCR. Ciclos 1 35 1 Tiempo Temperatura 5 minutos 94ºC 45 segundos 94ºC 45 segundos 59ºC 1 minuto 72ºC 10 minutos 72ºC Posteriormente se purificaron los productos de PCR obtenidos mediante el kit comercial NuecleoSpin®Extract II (Macherey-Nagel), siguiendo las indicaciones del fabricante para eliminar los oligonucleótidos utilizados, los dNTP, y la ADN polimerasa después de la amplificación. Este kit ancla los productos de la PCR para después de una serie de lavados y centrifugados, remover selectivamente todos los componentes diferentes al ADN, así éste es recuperado de un filtro de sílice tras un lavado con H2O MiliQ estéril. Para verificar el rendimiento de la purificación se midió por espectrofotometría. 16 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno 4.2.4 Cuantificación de ADN por espectrometría Se utilizó el equipo NanoDrop ND-2000c (Thermo Scientific) para determinar la concentración y pureza del ADN. Para ello se utilizó 1 μL de H2O MilliQ, la cual se colocó directamente en el pedestal óptico, en donde al unirlo con el otro pedestal óptico se tenía que formar una columna. A continuación, mediante el programa proporcionado por la casa distribuidora se seleccionó la medición de ADN de cadena doble, seguido por la medición de esta gota de 1 μL la cual fungía como blanco; posteriormente se midieron las muestras utilizando de 1 a 2 μL, siempre y cuando se formara la columna, especificando en el programa el nombre y origen de cada muestra. 4.2.5 Clonación y secuenciación A partir de los productos de PCR purificados se procedió a realizar una reacción de ligación de estos productos con el vector plasmídico pGEM-T Easy vectors System II ® (Promega), proporcionado a partir de un kit de clonación convencional. El mapa de este vector se muestra en la Figura 3, donde se muestra que dicho vector tiene un tamaño de 3015 pares de bases (pb). 17 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno Figura 3. Mapa del vector de clonación pGEM-T. 18 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno La reacción de ligación se llevó a cabo mediante una enzima de tipo ligasa, de acuerdo a la reacción mostrada en la Tabla 3. Tabla 3. Reacción de ligación del gen amplificado con el vector de clonación Reactivo Cantidad (µL) Tampón de rápida ligación para la ligasa ADN T4 (2X) 5 Vector de clonación pGEM-T (50 ng) 1 Producto de PCR 1-3* Ligasa ADN T4(3 U) 1 H2O MiliQ estéril Ajustar a un volumen final de 10 µL *Para conocer la cantidad en µl a agregar se realizó la siguiente operación: ( ) ( ) ( ) Tras una incubación mínima de 1 hora a 4ºC se prosiguió realizando la transformación de la reacción de ligación, mediante las células competentes Escherichia coli cepa JM109 (Promega), en cuyo genotipo (endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk−, mk+), relA1, supE44, Δ( lacproAB), [F′ traD36, proAB, laqIqZΔM15]) hay insertados genes de resistencia a los antibióticos: ampicilina, tetraciclina, kanamicina y cloranfenicol. Posteriormente se realizó una selección de clones positivos (colonias blancas, las más separadas y mejor formadas) a los cuales se les aislaron los plásmidos con el inserto mediante el kit Nucleospin®Plasmid (Macherey-Nagel). Este kit purifica el ADN del plásmido a partir de cultivos bacterianos líquidos de los clones seleccionados. El principio básico de este procedimiento consiste en liberar el plásmido (el cual contiene el gen insertado) de la bacteria E.coli con una lisis alcalina mediante un tampón, para posteriormente con otro tampón crear las condiciones adecuadas para anclar el ADN plasmídico a una membrana de sílice. En dicha membrana se realizan una serie de lavados y centrifugaciones para precipitar proteínas, ADN genómico y restos celulares hasta obtener ADN plasmídico, el cual se somete a una serie de lavados que eliminan contaminantes como sales, metabolitos y macromoléculas celulares, esto a través de un tampón que contiene etanol. Finalmente el ADN plasmídico se disuelve en agua MiliQ estéril. La verificación de la cantidad y calidad de los plásmidos aislados se realizó mediante espectrofotometría. 19 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno Una vez aislado el plásmido se verificó que cada uno de éstos tuviera el inserto, para lo cual se realizó a manera de sondeo, una PCR de la colonia de E.coli que presuntamente tenía el inserto (colonia blanca) utilizando los oligonucléotidos: SP6 Fwd. (3’AAGATATCACAGTGGATTTA5’) y T7 Rev. (3’ATTATGCTGAGTGATATCCCGC5’). Posteriormente se realizó una digestión con la enzima EcoRI con los reactivos mostrados en la Tabla 4. Tabla 4. Reacción de digestión con EcoRI Reactivo Volumen (µL) ADN plasmídico 2.5 Tampón ECORI 2 Agua grado MiliQ estéril 14 Enzima ECORI 1.5 . Para esta reacción se realizó una mezcla por separado con todos los reactivos mencionados excepto el ADN del plásmido, el cual fue colocado directamente en cada tubo de microcentrífuga de 0.5 mL en hielo. Una vez que se realizó la mezcla, éste se mezcló por pipeteo ligero y se colocaron 10 μL de éste en cada tubo con ADN. Posteriormente se incubó a 37ºC por 3 horas para su digestión. La verificación de la digestión se hizo mediante una electroforesis en gel de agarosa. 4.2.6 Análisis de las secuencias Se enviaron a secuenciar los plásmidos aislados con el inserto a la empresa Biomedal S.L. La secuenciación se realizó en ambos sentidos de la cadena de ADN utilizando los oligonucleótidos SP6 Fwd (3’AAGATATCACAGTGGATTTA5’) y T7 Rev (3’ATTATGCTGAGTGATATCCCGC5’). Tras obtener la secuencia del ADN plasmídico de los clones, ésta se visualizó en el programa bioinformático BioEdit Sequence Alignment Editor con la finalidad de buscar el gen insertado dentro de la secuencia completa del plásmido, esto en ambos sentidos de la cadena de ADN (5’3’ y viceversa). En este programa también se visualizó que la calidad de las secuencias fuera la adecuada para realizar los análisis posteriores. A continuación se eligieron sólo aquellas secuencias que mostraran una cadena de ADN en sentido 5’- 3’, para exportarlas en formato FASTA. 20 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno Las secuencias obtenidas fueron separadas por gen (H2A, H2B, H3 y H4) en donde los clones de ambas especies del gen seleccionado fueron alineados mediante el programa ClustalW con secuencias cercanas obtenidas utilizando el programa de bioinformática on line BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool), disponible en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, mediante el cual se seleccionaron las entradas pertenecientes a secuencias de moluscos para poder compararlas con los clones. También se seleccionaron grupos representativos de otros organismos con el mismo fin. A partir del alineamiento de estas secuencias se realizó un análisis filogenético utilizando el programa MEGA versión 5 (Tamura, et. al. 2011), en el cual se construyeron árboles filogenéticos. 4.3 Técnicas de Citogenética Para el mapeo físico de dichas secuencias de ADN se utilizó la técnica de Hibridación in situ de Fluorescencia (FISH) simple y doble. Los individuos elegidos en este estudio fueron tratados con colchicina, durante 8 horas con el fin de detener la mitosis en la metafase, para posteriormente someterlos a un choque hipotónico con KCl (0.44%) y fijarlos en carnoy fresco siguiendo el protocolo descrito por Cross et. al. (2003). Se les extrajeron las branquias ya que es en este tejido donde más células en división hay dentro del organismo. Tras fijar una muestra de éstas en un portaobjetos se procedió a marcar la sonda mediante PCR, a la cual en el caso del marcaje con rodamina solo se agregaba ésta a las condiciones normales de la PCR y para el marcaje con dioxigenina se agregaron dNTP marcados con dioxigenina. Una vez obtenida la sonda y teniendo listas las preparaciones cromosómicas, se realizó la hibridación, para lo cual fue necesario desnaturalizar la sonda y las preparaciones cromosómicas. Primero se desnaturalizaron las preparaciones cromosómicas en una disolución con formamida y tampón de fosfato y sometiéndolas a calor directo (72ºC), tras esto se realizó una serie de lavados en etanol con el fin de deshidratar gradualmente estas preparaciones. 21 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno Posteriormente, se desnaturalizó la sonda, para lo cual fue necesario preparar una disolución de hibridación, como se muestra en la Tabla 5. Las cantidades mostradas en esta tabla son por preparación a observar. El esperma de salmón se utilizó como bloqueador de ADN y fue proporcionado por la marca comercial Sigma®. Tabla 5. Composición de la disolución de hibridación. Reactivo Cantidad H2O MiliQ estéril (se ajusta al volúmen final) Dextran sulfato 3 mg Formamida desionizada 15 µL SSC (20X) (dodecilsulfato sódico) 3 µL SDS 5% (tampón de citrato y cloruro de sodio) 0.9 µL ADN de E.coli (stock a 300 ng/µL) 4 µL Esperma de salmón 1.5 µL Sonda 2-5 µL Volumen final 30 µL Una vez lista la sonda se desnaturalizó por calor (75ºC) y se agregó a las preparaciones, las cuales fueron incubadas durande 12 horas. Pasada la incubación se realizaron una serie de lavados post-hibridación, para finalmente hacer una detección inmunocitoquímica con los anticuerpos: mouse anti-DIG 0.5% (v/v), rabbit anti-mouse-FITC 0.2% (v/v) y goat anti-rabbitFICT 0.1% (v/v). En este procedimiento tras agregar cada anticuerpo se incubó a 37ºC durante 30 minutos y se hizo una serie de lavados y deshidratados. Finalmente tras secarse, la preparación se tiñó con DAPI (4’-6-diamidino-2-phenilindole) e ioduro de propidio y se observó en un microscopio de fluorescencia. 22 Tesis de Máster. 5 5.1 Claudia Isela Granada Moreno RESULTADOS Y DISCUSIÓN Biología Molecular 5.1.1 Amplificación y purificación de la PCR Se obtuvieron productos de PCR para cada uno de los genes analizados, y se cuantificaron mediante espectrofotometría la cantidad y calidad de estos productos, como se muestra en la Tabla 6. Tabla 6. Cuantificación por espectrofotometría de los productos de PCR Muestra PCR- purificado Concentración Absorbancia Absorbancia Género Especie Gen Individuo [µg/mL] a 260/280 a 260/230 Crassostrea angulata H4 1 48.7 1.62 0.93 Crassostrea angulata H4 2 50.4 1.73 0.84 Crassostrea angulata H4 3 60.3 2.01 0.64 Crassostrea angulata H4 4 46.1 1.92 0.5 Crassostrea angulata H2A 1 69.3 1.86 1.01 Crassostrea angulata H2A 2 60.2 1.81 1.06 Crassostrea angulata H2A 3 55 1.76 1 Crassostrea angulata H2A 4 65.5 1.81 0.96 Crassostrea angulata H2B 1 43.1 1.71 0.93 Crassostrea angulata H2B 2 58 1.8 1.09 Crassostrea angulata H2B 3 51.9 1.93 0.9 Crassostrea angulata H2B 4 46.6 1.86 0.94 Crassostrea gigas H2A 1 43.5 1.74 1.66 Crassostrea gigas H2A 2 46 1.87 0.9 Crassostrea gigas H2A 3 61.7 1.85 0.98 Crassostrea gigas H2A 4 55 1.8 94 Crassostrea gigas H2B 1 31.1 1.68 0.6 Crassostrea gigas H2B 2 33.9 1.92 0.57 Crassostrea gigas H2B 3 39.5 1.77 0.24 Crassostrea gigas H2B 4 43.3 1.86 0.72 Crassostrea gigas H4 1 31.2 1.91 0.87 Crassostrea gigas H4 2 32.9 1.83 0.66 Crassostrea gigas H4 3 36.2 1.88 0.56 Crassostrea gigas H4 4 30.7 1.8 0.91 Crassostrea angulata H3 1 46.3 1.92 0.99 Crassostrea angulata H3 2 45.8 1.84 0.99 Crassostrea angulata H3 3 45.1 1.88 0.68 Crassostrea angulata H3 4 44.7 1.83 0.81 Crassostrea gigas H3 1 45.2 1.83 1.07 Crassostrea gigas H3 2 41.2 1.82 0.79 Crassostrea gigas H3 3 44.1 1.9 1.07 Crassostrea gigas H3 4 38.2 1.87 0.48 23 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno 5.1.2 Clonación de los productos de PCR Tras la transformación bacteriana se eligieron los clones positivos (colonias blancas) a los que se les realizó una PCR a partir de las colonias directamente (sin previa extracción de ADN genómico o plasmídico) utilizando los oligonucleótidos SP6 y T7. El tamaño en pb del fragmento fue aproximadamente de 190 pb más el tamaño del inserto, debido a la posición de estos oligonucleótidos dentro del mapa del vector plasmídico (Figura 3). En la Figura 4 se muestra el gel de agarosa obtenido de los clones que contenían el inserto. Se utilizó como control negativo una colonia azul (sin el inserto) y la PCR de colonias se realizó por lotes, pero no a cada una de las colonias cultivadas. Figura 4. Identificación del inserto en clones mediante PCR de colonias. Visión general de tamaños esperados por gen. Tras cultivar 3 clones por cada uno de los individuos y extraer el plásmido, se les realizó una digestión con la enzima de restricción EcoRI, en donde solo los clones que presentaban el fragmento esperado se mandaron a secuenciar. La Figura 5 muestra las imágenes más representativas de los geles de agarosa donde se observan los fragmentos digeridos por la enzima de restricción en cada gen. Figura 5. Digestión con EcoRI de los plásmidos aislados. Visión general de tamaños esperados por gen. 24 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno El tamaño del gen insertado en la mayoría de los clones fue el mostrado en la Tabla 1, aunque algunos presentaban deleciones e inserciones. El número de clones obtenidos por cada gen se estimaba en 24, siendo para H3 y H4 ligeramente menor, sin embargo este número es suficiente para el análisis de las secuencias. Gen H2A H2B H3 H4 Tabla 7. Resumen de los genes clonados. Tamaño (pb) Especie Clones C. angulata 12 239 C.gigas 12 C. angulata 12 214 C.gigas 11 C.angulata 10 316 C.gigas 9 C.angulata 12 211 C.gigas 11 Total de clones secuenciados 89 No todas las colonias aisladas tenían el inserto completo o las secuencias obtenidas no eran de suficiente calidad para considerarlas en el estudio filogenético. Solo 89 clones se tomaron en cuenta para este estudio. La Tabla 8 muestra dichos clones con su nomenclatura, donde el primer número refleja a qué individuo pertenecen y el segundo número o letra hace referencia al clon. Tabla 8. Total de clones utilizados para estudio filogenético. Gen Individuo H2A 1 H2A 2 H2A 3 H2A 4 H2B 1 H2B 2 H2B 3 H2B 4 C.angulata C.gigas Nombre del clon 1-1 1b 1-2 1c 1-3 1-3 2-1 2-1 2a 2a 2-3 2c 3-1 3a 3-2 3c 3-3 3-3 4a 4c 4b 4d 4-3 4-3 1-1 1b 1-2 1-2 1-3 1-3 2-1 2-1 2-2 2-3 2-3 3b 3-1 3-2 3-2 3-3 3-3 4-1 4-1 4-2 4-2 4-3 4-3 Gen Individuo H3 1 H3 2 H3 3 H3 4 H4 1 H4 2 H4 3 H4 4 C.angulata C.gigas Nombre del clon 1-1 1-1 1-2 1-3 2a 2e 2-2 2d 3e 3e 3-2 3-3 3d 4a 4-1 4b 4-2 4c 4-3 1-1 1a 1-2a 1b 1-3 1-3 1-2b 2-1 2-2 2-2 2b 3-1 3-1 3-2 3a 3-3 3-3 4-1 4a 4-2 4-2 4c 4-3 25 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno 5.1.3 Análisis filogenético Se obtuvieron 178 secuencias de buena calidad para el análisis bioinformático, las cuales pertenecían a los 89 clones (ambos sentidos de la cadena de ADN). Se realizó un árbol radial para mostrar las diferencias generales entre la familia de histonas. Este árbol consensuado fue inferido utilizando el método del vecino más cercano (Neighbor-Joining) con un bootstrap de 1000 réplicas que sirve para explicar la historia evolutiva de los genes analizados. Este árbol se muestra en la Figura 6, donde la longitud de las ramas refleja la distancia evolutiva, la cual fue inferida utilizando el método p-distance. Este análisis evolutivo se llevó a cabo en MEGA5 (Tamura, et. al. 2011). En este árbol se aprecia a grandes rasgos que no hay un patrón de divergencia específico entre las especies C. angulata (C.a.) ó C.gigas (C.g.) en ninguno de los 4 genes analizados, pero es notable la divergencia de 2 secuencias de C.a. gen H2A, las cuales forman una rama divergente dentro del mismo gen. Las secuencias H2A (sin contar las divergentes), H2B y H4 forman una rama muy uniforme, lo cual indica su cercanía. Para el gen H3 hay pequeñas ramificaciones, lo cual refleja que las secuencias no son tan homologas, como en el caso de los otros genes. 26 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno C.aC. .a H C.a.H3 3.H. .4a .4-2 43d.2d C.g.H3 .3e .H3 C.g -1 3.4 g.H 100 C. .3d .H3 -2 .1 C.g H3 a. C. 89 100 4959 6811 10 1322464 23 89 100 41 99 C.g.H3.1-1 C.g.H 3 -2 . 3 -a2 C.a.H3.3e 3.2 2.2e C.a.H .H33. C.ag.H . C C. C a .a .a.H .H3 .3. H 3 C. 3 . 3. g.H 1- 4b 3.4 1 C.g -3 .H3 .1-3 C 100 Gen H3 -1 C.g.H2B.3-2 C.a.H2B.4-1 C.g.H 2B.2-1 C.a C.a .H2B.1 -3 C. .H2 g.H B.1 2B -2 .13 C.g.H4.2 C.g.H4.3a a H4.1 C.g. .4-3 .H4 2b C.g 4.1a.H C. 7 251 5 3619 33 Gen H4 Gen H2B 82 87 53 3 3249 C. C4.. C.gaC.H .a4 g1.-1 .H -2a .3 C.g.H.H 4.1-3 4H .14-. -1 34a .1 C.a.H4 100 1 --13 -3 4B-..1B 4 .4.1b B.22.H B22B .H H .g H gC.2a H Cg.C .a. C.C 84 14 56 b .3 -2 2B2B.1 3-3 . .H .a .H 2B 2 C C.g .g.H 2B.3C .H 3 C.a .H2B.3C.a -1 .2 1 2B .H 3 .a C 100 12371 1 4 CC.a .gH2B CC C.g. 3 22BB.4-2 ..H a.gH..H .2 -2 2 224 2 . 3 H 2 85 2 2BBB..2-1.42-33 -2 64 2136 1 3416394 C C. .g.H g.H 4 . C.a 4.3-31b .H C.a.H 4.2b 4.3-2 93 C.a.H 4.3-1 C.g.H4 .2-2 74 4742 9 2 0 830 997 C.a.H4.4-2 7 2---2413c C.g.H 44.4-2 ..3 82 C.a H4.H4.4. ..H a . C .a.H C.a C 88 CC..ga.H2 C.a g...HH22A.1 H2 AA. .3-2-1 A. 2-1 4c 3997 19 2A .2 - 3 3 3A. 6313 25 1 302 7653 760 5 Gen H2A 2a A. a 2 . a H2 A g. .H2 2AA.3.4-.32c CC. .a .HH.H 2 2A.1-3 g.H2A ggg.C.a.H2A.1-3 C CC.C C.a.H2A .4 a C.a .H2 A.4C 3 . a 18 C. .H2A .4b a . H 2A .21 -2 .3 2A 1b .H .a 2A. c C g.H A.3 C. .g.H2 C A.1c C.g.H2 Cg.H2 C.g.H2A.4d A.3-3 0.05 54 .a .H H2 a. C. 22207330 100 C Figura 6. Árbol filogenético radial de la familia de histonas de las ostras C. angulata (C.a.) y C. gigas (C.g.). Para conocer la posición taxonómica de los clones, se elaboraron árboles filogenéticos individuales (por gen), en los cuales, además de presentarse las secuencias de los clones, se agregaron otras secuencias del mismo gen pertenecientes a otros moluscos y a 6 especies diferentes. Estas secuencias fueron descargadas del GenBank, para ello solo se tomó en cuenta la fracción del gen homóloga a los clones. 27 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno Las 6 especies utilizadas como comparación en todos los genes se identificaron con un marcador de color para reconocer rápidamente su posición en los árboles. La Tabla 9 muestra sus características. Tabla 9. Especies sutilizadas en los árboles filogenéticos como comparativas. Marcador Nombre científico Nombre común de color Homo sapiens Hombre Mus musculus Ratón Danio rerio Pez cebra Drosophila melanogaster Mosca de la fruta Zea mays Maíz Saccharomyces cerevisiae Levadura de la cerveza Los árboles filogenéticos obtenidos para las secuencias de genes H2A, H2B, H3 y H4 se muestran en las Figuras 7 - 10, respectivamente. La historia evolutiva de todos estos árboles filogenéticos fue inferida usando el método Neighbor-Joining, con una prueba de bootstrap de 1000 réplicas. La distancia evolutiva fue calculada mediante el método p-distance. Todas las posiciones ambiguas fueron retiradas. Estos análisis se realizaron el programa MEGA5 (Tamura, et. al. 2011). En la Figura 7, el árbol obtenido para el gen H2A muestra que excepto dos secuencias, todas las demás se encuentran en un grupo diferenciado respecto al resto de secuencias con las que se han comparado. En este grupo no se aprecian diferencias entre especies de C.angulata ó C.gigas. La presencia de las secuencias de los clones C.a.H2A.3-3 y C.a.H2A.3-3 en una rama diferente respecto a todas las secuencias analizadas, puede deberse a que se trata de pseudogenes. Se ha publicado que la histona H2A y la H1 muestran la mayor diversidad de isoformas de entre los 5 genes de las histonas; además de que la familia H2A cuenta con un gran número de variantes (González-Romero, et. al. 2008). En esta figura también se observa que las secuencias de los clones aparecen en una rama junto a vertebrados y plantas, aunque el valor de bootstrap es pequeño para considerarlo significativo. Esto puede deberse a que en el análisis filogenético se usó una región interna conservada del gen, por lo que futuros análisis con la secuencia completa de dicho gen pueden arrojar otros resultados. 28 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno C.g.H2A.1c 33 9 C.g.H2A.3c 13 C.g.H2A.4d C.a.H2A.2-1 9 38 C.a.H2A.3-2 C.g.H2A.1b 4 12 20 C.a.H2A.1-3 C.a.H2A.4b C.a.H2A.4a 32 C.a.H2A.4-3 97 Cg.H2A.3-3 27 C.a.H2A.1-1 18 41 75 Cg.H2A.1-3 C.g.H2A.2c 61 Cg.H2A.4-3 96 C.g.H2A.3a C.a.H2A.2a C.g.H2A.2a 59 51 C.g.H2A.4c 90 C.a.H2A.3-1 56 65 Cg.H2A.2-1 Sunetta scripta 38 Danio rerio 28 Zea mays 77 Homo sapiens 91 Mus musculus 85 Chlamys farreri Mytilus edulis 39 27 Mytilus californianus 64 97 Solen marginatus Mytilus trossulus 98 94 100 V enerupis philippinarum V enerupis pullastra 84 74 V enerupis decussatus Aplysia californica Drosophila melanogaster Haliotis discus 16 26 Saccharomyces cerevisiae C.a.H2A.3-3 C.a.H2A.2-3 0.05 Figura 7. Árbol filogenético de las secuencias obtenidas del gen H2A. 29 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno En la Figura 8 se muestra que para el gen H2B, al igual que para el H2A hay una clara diferenciación respecto al resto de bivalvos y nuevamente se comparte una rama con secuencias H2B de otros organismos como peces, mamíferos o insectos. Hay una clara la diferenciación de los clones analizados respecto al resto de moluscos. C.a.H2B.1-2 C.g.H2B.2-1 C.g.H2B.1-3 C.a.H2B.4-1 C.a.H2B.1-3 C.g.H2B.3-1 C.a.H2B.4-3 C.a.H2B.2-1 C.g.H2B.3-3 C.a.H2B.1-1 C.a.H2B.3-2 C.g.H2B.4-3 C.a.H2B.3-3 C.g.H2B.2-3 C.g.H2B.1b C.a.H2B.2-3 C.a.H2B.4-2 C.g.H2B.4-1 C.a.H2B.2-2 C.a.H2B.3b C.g.H2B.4-2 C.g.H2B.1-2 C.g.H2B.3-2 Danio rerio Homo sapiens Mus musculus Drosophila melanogaster Zea mays Chlamys farreri Mytilus edulis Mytilus chilensis Mytilus californianus Solen marginatus Venerupis pullastra Venerupis decussatus Venerupis philippinarum Mytilus galloprovincialis Saccharomyces cerevisiae 0.05 Figura 8. Árbol filogenético de las secuencias obtenidas del gen H2B. 30 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno En la Figura 9, se muestra el árbol filogenético propuesto para el gen H3. Este gen presenta menos divergencia en las especies analizadas respecto a la observada para los genes H2A y H2B. La mayoría de los clones analizados se agrupan cerca de otros moluscos bivalvos y compartiendo rama con la secuencia del GenBank de C. virginica, pero 3 clones (C.g.H3.1-3, C.g.H3.4-3 y C.a.H3.1-1) están a una distancia más cercana de los moluscos gasterópodos, mostrándose así, nuevamente la divergencia y variedad evolutiva de los genes histónicos secuenciados. En la Figura 10, se muestra el árbol filogenético propuesto para el gen H4. Los clones se agrupan en dos grupos diferenciados y unidos al resto de moluscos bivalvos (nuevamente incluida C. virginica) sin diferencias claras entre los clones de C. angulata y los de C. gigas. En este caso la divergencia entre grupos es baja y la separación con otros organismos como vertebrados e insectos muestra un nivel muy bajo de bootstrap. 31 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno C.g.H3.3e C.a.H3.2-2 Crassostrea gigas C.a.H3.2d 27 C.g.H3.2e C.a.H3.3e 26 C.a.H3.2a C.g.H3.3-2 100 C.g.H3.4-1 C.a.H3.4a C.a.H3.4d 65 41 C.g.H3.4-2 C.g.H3.3d 59 C.a.H3.1-2 99 76 72 C.a.H3.3-3 Crassostrea virginica C.a.H3.4b Limaria hemphilli Phaxas pellucidus Delectopecten vancouverensis 37 Cryptopecten vesiculosus 67 98 Aequipecten glyptus 48 12 Argopecten nucleus Chlamys rubida 76 Laevichlamys irregularis 100 65 Coralichlamys madreporarum Spathochlamys benedicti 46 Caribachlamys ornata 85 Meretrix lamarcki 96 21 Venerupis galactites Mytilus edulis 11 Solen marginatus 78 22 Mytilus trossulus 100 99 71 Mytilus galloprovincialis Venerupis pullastra Phyllodesmium horridum Zea mays Drosophila melanogaster Raphitoma sp. 27 Bolinus brandaris C.g.H3.1-3 70 68 51 C.g.H3.4-3 C.a.H3.1-1 Crepidula fornicata Danio rerio 45 53 Homo sapiens 56 6 Mus musculus Smaragdia viridis Heterocithara sp 88 28 Mangeliidae sp. 13 Raphitoma rubroapicata 2 Thuridilla neona 100 Thuridilla livida Lienardia sp. Nannodiella ravella 49 25 Cerithiopsis sp. Nassarius festivus 32 Nassarius pullus 87 99 Zeuxis siquijorensis Saccharomyces cerevisiae 0.05 Figura 9. Árbol filogenético de las secuencias obtenidas del gen H3. 32 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno Bathymodiolus thermophilus 99 29 Bathymodiolus azoricus Crepidula fornicata 8 M us musculus Homo sapiens 11 11 Drosophila melanogaster 45 Chlamys farreri 15 Cirsotrema varicosum 5 C.g.H4.2-1 8 Danio rerio 26 10 Z ebina sp. Biomphalaria glabrata 22 Cochlodina laminata 20 Lehmannia valentiana 25 Z ea mays. 45 Crassostrea virginica C.g.H4.1b 23 C.a.H4.3-1 65 C.a.H4.3-2 78 C.g.H4.3-3 C.g.H4.4-3 46 49 C.g.H4.3a C.a.H4.1-2b 41 C.g.H4.1a C.a.H4.2b C.a.H4.4-2 74 C.g.H4.2-2 83 C.a.H4.1-2a C.a.H4.1-3 68 C.g.H4.4a C.a.H4.3-3 64 C.a.H4.4c C.a.H4.2-2 C.g.H4.4-2 86 C.a.H4.1-1 C.a.H4.4-1 C.g.H4.3-1 C.g.H4.1-3 M ytilus edulis Saccharomyces cerevisiae Solen marginatus 59 Venerupis pullastra 77 M ytilus galloprovincialis 49 85 38 41 M ytilus trossulus M ytilus californianus Venerupis decussatus Venerupis philippinarum 54 M ytilus chilensis 0.05 Figura 10. Árbol filogenético de las secuencias obtenidas del gen H4. 33 Tesis de Máster. 5.2 Claudia Isela Granada Moreno Citogenética Las preparaciones cromosómicas para los estudios citogenéticos se realizaron a partir de C. angulata y C. gigas diploides (2n=20 cromosomas). Las sondas elaboradas a partir de reacciones de PCR marcadas con dioxigenina (dig) y rodamina (rod) se muestran en la Figura 11, utilizándose como control una reacción de PCR amplificando los mismos genes pero sin los marcadores, ya que la PCR que contiene la sonda es ligeramente mayor a la normal. Para la sonda H2A-H2B se realizó una PCR con los oligonucleótidos H2A Fwd y H2B Fwd, y el fragmento esperado es de aproximadamente 1000 pb. Figura 11. Marcaje de sondas utilizadas en la FISH. Tras la observación al microscopio de fluorescencia se buscaron placas metafásicas donde los cromosomas estuvieran lo suficientemente separados para poder distinguir la sonda. La sonda marcada con dioxigenina presenta un color verde, y la marcada con rodamina rojo, por lo que las señales en estos colores (o la combinación de ambos, en el caso de la doble hibridación) dentro de las parejas cromosómicas señalan la hibridación del gen marcado. La FISH simple de los genes H2A-H2B marcada con dioxigenina mostrada en la Figura 12 se realizó sobre una preparación cromosómica de C. gigas, donde se muestra en verde las señales de esta sonda, indicando su ubicación en 2 parejas cromosómicas. Las flechas indican los cromosomas con señal. 34 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno Figura 12. FISH sobre preparación cromosómica de C.gigas. Hibridación del gen H2A-H2B marcados con dioxigenina La FISH doble es mostrada en la Figura 13, revelando que hay hibridación y ambas sondas colocalizan en las mismas parejas cromosómicas. Las flechas indican los cromosomas con señal. Figura 13. FISH doble sobre preparación cromosómica de C.gigas. Hibridación de los genes H2A-H2B marcado con dioxigenina y H4 marcado con rodamina. 35 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno La co-localización mediante FISH doble permitió confirmar la localización de los 4 genes histónicos que conforman el nucleosoma (H2A, H2B, H3 y H4) en el mismo cluster dentro de dos parejas cromosómicas diferentes, ya que previamente, dentro del grupo de investigación BIO219 de la Universidad de Cádiz, se habían realizado hibridaciones dobles de los genes H3 y H4 demostrando que éstos también co-localizan ( Figura 14). Así el trabajo en esta tesis de Máster complementa la investigación previa que el grupo ha realizado con respecto a la caracterización de la familia de histonas de C. angulata y C. gigas. Figura 14. FISH doble de los genes H3-H4 sobre preparaciones cromosómicas de C. angulata (a) y C. gigas (b) (Cross & Rebordinos, sin publicar). Los resultados obtenidos en este trabajo también comprueban que la familia multigénica de histonas está localizada junto a otra familia multigénica, la ribosómica; ya que previamente en este grupo de investigación se habían realizado hibridaciones triples entre la familia de histonas y la ribosómica mayores y menores (Cross, et. al. 2003b). En este trabajo se observó que ninguna familia co-localizaba ( Figura 15) permitiendo localizar por primera vez en ostras las histonas y los genes 5S y 18S de la familia génica ribosómica. Los resultados mostraron que se encuentran en posiciones 36 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno diferentes respecto a ambos genes; por lo que cinco parejas de cromosomas pueden ser inequívocamente identificadas mediante estos marcadores cromosómicos con vistas a la elaboración de mapas genéticos. Figura 15. FISH triple de los genes H4, 18S y 5S sobre preparaciones cromosómicas de C. angulata (a) y C. gigas (b) (Cross, et. al. 2003b). En ninguna hibridación se encontraron diferencias de localización de los genes mapeados entre las especies estudiadas. 37 Tesis de Máster. 6 Claudia Isela Granada Moreno CONCLUSIONES 1. La caracterización de la familia de histonas H2A, H2B, H3 y H4 muestra que las secuencias de los clones obtenidos en la mayoría de los casos de estudio son muy cercanas entre sí y no reflejan una divergencia entre especies. 2. Las secuencias de los clones C.a.H2A 2-3 y C.a.H2A 2-3 son muy lejanas al resto de los clones e incluso a otras secuencias referenciadas, debido a que presentan importantes deleciones e inserciones internas; y por ello pueden tratarse de pseudogenes de la histona H2A. 3. En cuanto a la posición taxonómica de las secuencias analizadas, con respecto a otros moluscos, ésta no siempre fue cercana, ya que en el caso de las secuencias del gen H2A y H2B se encontró a los moluscos más alejados que otros grupos externos utilizados para comparación, lo cual puede deberse a que la variedad de gen encontrado es cercana a estos grupos, pero para ello debe hacerse un análisis bioinformático más extenso. 4. Se logró localizar los genes H2A, H2B y H4 en los cromosomas. Estos genes se encontraron co-localizados, por lo que los genes que codifican para estas enzimas están en el mismo sitio. 5. Se encontró que los genes H2A, H2B y H4 pueden ser utilizados como marcadores cromosómicos, ya que co-localizan en dos parejas cromosómicas. 38 Tesis de Máster. 7 Claudia Isela Granada Moreno BIBLIOGRAFÍA 1. Boudry P., Heurtebise S., Collet B., Conette F. y Gérard A. (2003). Mitochondrial and nuclear DNA sequence variation of presumed Crassostrea gigas and Crassostrea angulata specimens: a new oyster species in Hong Kong?. Aquaculture, 228: 15-25. 2. Boudry P., Heurtebise S., Collet B., Conette F., & Gérad A. (1998). Differentiation between populations of the Portuguese oyster, Crassostrea angulata (Lamark) and the Pacific oyster, Crassostrea gigas (Thunberg), revealed by mtDNA RFLP analysis. Journal of Experimental marine Biology and Ecology, 226: 279-291. 3. Bouilly K., Chaves R., Fernandes M. & Guedes-Pinto H. (2010). Histone H3 gene in the Pacific oyster, Crassostrea gigas Thunberg, 1793: molecular and cytogenetic characterisations. Comparative Cytogenetics, 4 (2): 111-121. 4. Carrilho J., Pérez-García C., Leitao A., Malheiro E. & Pasantes J. (2011). Cytogenetic characterization and mapping of rDNAs, core histone genes and telomeric sequences in Venerupis aurea and Tapes rhomboides (Bivalvia: Veneridae). Genetica, 139:823–831. 5. Cross I. & Rebordinos L. (2003a). Effect of marine contamination on the genetic population structure of the bivalve Crassostrea angulata. Ciencias Marinas, 29: 239-250. 6. Cross I, Vega L. & Rebordinos L. (2003b). Nucleolar organizing regions in Crassostrea angulata: chromosomal location and polymorphism. Genetica, 119: 65-74. 7. Cross I. & Rebordinos L. (2005). 5S rDNA and U2 snRNA are linked in the genome of Crassostrea angulata and Crassostrea gigas oysters: does the (CT)n·(GA)n microsatellite stabilize this novel linkage of large tandem arrays?. Genome,48: 1116-1119. 8. Cross I. (1998). Estructura Genética de poblaciones naturales de Crassostrea angulata en las costas del suroeste de la Península Ibérica. Tesis de licenciatura. En departamento de Bioquímica, Biología Molecular, Microbiología, Medicina Preventiva, Salud Pública, Fisiología y Genética. Universidad de Cádiz. 122 pp. 9. Cross I. (2005). Caracterización poblacional y Citogenética de Crassostrea angulata: Análisis molecular del ADNr 5S en ostereidos. Tesis doctoral. Universidad de Cádiz. 89 pp. 10. Cross I., Rebordinos L. & Diaz E. (2006). Species Identification of Crassostrea and Ostrea Oysters by Polymerase Chain Reaction Amplification of the 5S rRNA Gene. Journal of AOAC International, 89 (1): 144 – 148. 11. Dorrington T., Villamil L. & Gómez-Chiarri M. (2011). Upregulation in response to infection and antibacterial activity of oyster histone H4. Fish & Shellfish Immunology, 30: 94-101. 12. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: an aprproach using the bootstrap. Evolution, 39 (4): 783-791. 13. Fernandes J., Kemp G., Molle M. & Smith V. (2002). Anti-microbial properties of histone H2A from skin secretions of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Biochem. J., 368: 611– 620. 39 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno 14. Fernandes T. (2008). Determinación de hibridación natural entre Crassostrea angulata (Lamarck, 1819) y Crassostrea gigas (Thunberg, 1793), en poblaciones naturales del Sudoeste de la Península Ibérica. Tesis de Máster, Universidad de Cádiz, Cádiz. 15. Gazeau F., Gattuso J-P., Greaves M., Elderfield H., Peene J., Heip C. & Middelburg J. (2011). Effect of Carbonate Chemistry Alteration on the Early Embryonic Development of the Pacific Oyster (Crassostrea gigas). PLoS ONE, 6(8): e23010. 16. González-Romero R.,Ausió J., Méndez J. & Eirín-López J. (2008). Early Evolution of Histone Genes: Prevalence of an “Orphon” H1 Linage in Protostomen and Birth-and-Death Process in the H2A Family. J.Mol. Evol, 66: 505-518. 17. Grizel, H. & Heral, M. (1991). Introduction into France of the Japanese oyster (Crassostrea gigas). J. Conseilt. Int. l’Exploration. Mer., 47: 399-403. 18. Guo X., Wang Y. & Xu Z. (2007). Genomic analyses using fluorescence in situ hybridization. In: Liu Z (ed) Aquaculture genome technologies. Blackwell Publishing, Oxford, pp 289–311. 19. He H. & Lehming N. (2003). Review: Global effects of histone modifications. Briefings In Functional Genomics And Proteomics, 2 (3): 234–243. 20. Huvet A., Gerard A., Ledu C., Phelipot P., Heurtebise S. y Boudry P. (2002). Is fertility of hybrids enough to conclude that the two oysters Crassostrea gigas and Crassostrea angulate are the same specie?. Acuatic Living Resources, 15: 45-52. 21. Lewin B. (2004). Genes VIII. Pearson Prentice Hall. United States of America.1027 pp. 22. López-Flores I., De La Herrán R., Garrido-Ramos M., Boudry P., Ruiz-Rejón C., y RuizRejon M. (2004). The molecular phylogeny of oysters based on satellite DNA related to transposons. Gene, 339: 181-188. 23. Marteil L. (1957). L´huitre portugaise en Bretagne. Revie Travails Institut Peches Maritimes, 21: 377 - 400. 24. Menzel R. (1974). Portuguese and Japanese oysters are the same species. J. Fish. Res. Board Can., 31: 453-456. 25. Michinina S. & Rebordinos L. (1997). Genetic differentiation in marine and estuarine natural populations of Crassostrea angulata. Marine Ecology Progress Series, 154: 167-174. 26. Pascual E. (1973). Bases para el cultivo del ostión Crassostrea angulata (Lmk), en el sudoeste español: reproducción, contenido en metales y sistemas de explotación. Universidad de Sevilla, Sevilla. 27. Rebordinos L & Cross I. (1999). The use of genetic markers in the study of marine natural populations. Boletín del Instituto Español de Oceanografía, 15: 363-372. 28. Saitou N. & Nei M. (1987). The Neighbor-joining Method: A New method for Reconstructing Phylogenetic Trees. Mol. Biol. Evol, 4 (4): 406-425. 29. Salemi M. & Vandamme A. (2003). The Phylogenetic Handbook: A Practical Approach to DNA and protein Phylogeny. Cambridge University Press.406 pp. 30. Seo J-K, Stephenson J. & Noga E. (2011). Multiple antibacterial histone H2B proteins are expressed in tissues of American oyster. Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 158: 223–229. 40 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno 31. Seo J-K., Stephenson J., Crawford J., Stone K. & Noga E. (2010). American Oyster, Crassostrea virginica, Expresses a Potent Antibacterial Histone H2 Protein. Mar Biotechnol, 12: 543–551. 32. Smith V., Desbois A. & Dyrynda E. (2010). Review: Conventional and Unconventional Antimicrobials from Fish, Marine Invertebrates and Micro-algae. Mar. Drugs, 8: 1213-1262. 33. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, and Kumar S (2011) MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution. 34. Wilson K. & Walker J. (2006). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. 6 ª edición. Cambridge University Press. Cambridge, Inglaterra. 35. Yao-Shan F. (2002). Molecular Cytogenetics, Protocols and Applications. Humana Press. 411 pp. 41 Tesis de Máster. 8 8.1 Claudia Isela Granada Moreno ANEXOS Secuencias de los clones del gen H2A >C.a.H2A.1-1 CTGCGTAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGAGTGTTGCCCAACATCCAGGC >C.a.H2A.1-2 CTGCGGAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA TCCCCCGTCACCTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGC >C.a.H2A.1-3 CTGCGGAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGTGTTTTGCCTAACATCCAGGC >C.a.H2A.2-1 CTGCGGAAGGGGAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGAGTTCTGCCCAACATTCAGGC >C.a.H2A.2a CTGCGCAAAGGCAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA TCCCCCGTCACCTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGCGTGACC ATCGCCCAGGGTGGAGTGCTGCCTAACATTCAGGC >C.a.H2A.2-3 CTGCGCAAGGGAAACTATGCACCTGGAAAACAAAACAAGGCTAGGTCCACCATCAATTCAAAGACAA TTATTCACGTATGCATTACAGACACCAATATCTAGCTACCAGTAGCACTGACTCAAAAAATGTGATCTA CCTAGTAACGGTGGCTTTTTACTGAGAAAATTAGTGGCTTGCTGGCAACATATGTGGTGTGTTGCCTAA TATCCAGGC >C.a.H2A.3-1 CTGCGGAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA TCCCCCGTCACCTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGCGTGACC ATCGCCCAGGGTGGCGTACTGCCCAACATCCAGGC >C.a.H2A.3-2 CTGCGGAAGGGGAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGCGACAACAAGAAAACCAGAATC ATCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACC ATCGCACAGGGTGGCGTTCTGCCCAACATTCAGGC >C.a.H2A.3-3 CTGCGGAAAGGCAACTACGCATTGTGGAAAAACTACTTCCGCCGGAACTTCTGCAACCTTCCAATTCAC GAGGATTGTAACGCCACGCGAGATTTGGCGTATCTCGAGAGAAAGGGCCATATCAAGATCGGGGACTA TGATGTTTTGATCGATATATTTAGAAAGATTGACGAAAGGGCCATCCAGTATATTGAAAAGAAAACGT CAGACATCAAGGCGGTCGGCAAAGGTCGGAGTTTTGCCCAACATCCAGGC >C.a.H2A.4a CTGCGTAAGGGAAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGCGTGTTGCCCAATATTCAGGC 42 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno >C.a.H2A.4b CTGCGGAAGGGAAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGCGTTTTGCCCAACATCCAGGC >C.a.H2A.4-3 CTGCGTAAGGGAAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGCGTGTTGCCCAATATTCAGGC >C.g.H2A.1b CTGCGGAAGGGGAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGCGTTCTGCCTAATATCCAGGC >C.g.H2A.1c CTGCGGAAGGGGAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGTGTATTGCCTAACATTCAGGC >Cg.H2A.1-3 CTGCGCAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGAGTGTTGCCCAACATCCAGGC >Cg.H2A.2-1 CTGCGCAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA TCCCCCGTCACCTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGCGTGACC ATCGCCCAGGGTGGCGTTCTGCCCAATATCCAGGC >C.g.H2A.2a CTGCGGAAGGGGAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA TCCCCCGTCACCCGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACC ATCGCCCAGGGTGGTGTTCTGCCTAACATTCAGGC >C.g.H2A.2c CTGCGTAAAGGCAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCACACAGGGTGGAGTGCTGCCTAATATCCAGGC >C.g.H2A.3a CTGCGTAAGGGCAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGTGTGCTGCCTAATATCCAGGC >C.g.H2A.3c CTGCGGAAGGGGAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGCGTATTGCCCAATATTCAGGC >Cg.H2A.3-3 CTGCGTAAGGGGAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGTGTGTTGCCCAACATCCAGGC 43 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno >C.g.H2A.4c CTGCGCAAGGGGAACTACGCCGAGAGAGTCGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCCGTTCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAAAAGACCAGAATCA TCCCCCGTCACCTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGCGTGACC ATCGCCCAGGGTGGTGTATTGCCTAATATCCAGGC >C.g.H2A.4d CTGCGCAAGGGGAACTATGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCAGTGTATCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCGCAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGTGTTTTGCCCAACATTCAGGC >Cg.H2A.4-3 CTGCGGAAAGGCAACTACGCCGAGAGAGTGGGAGCCGGTGCCCCTGTGTACCTGGCCGCTGTCCTTGA GTACTTGGCCGCTGAAGTGTTGGAGTTGGCAGGCAACGCAGCCCGTGACAACAAGAAAACCAGAATCA TCCCCCGTCATCTGCAGCTTGCTATCCACAACGACGAGGAGTTGAACAAACTTCTGTCCGGTGTGACCA TCGCACAGGGTGGAGTACTGCCCAACATCCAGGC 8.2 Secuencias de los clones del gen H2B >C.a.H2B.1-1 CTACGTGTACAAGGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTTGCT AAGCACGCC >C.a.H2B.1-2 CTACGTGTACAAAGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTTGCC AAACATGCC >C.a.H2B.1-3 CTACGTGTACAAGGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCCA AACATGCC >C.a.H2B.2-1 CTACGTGTACAAAGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTGGCC AAACACGCC >C.a.H2B.2-2 CTACGTGTACAAGGTGCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCCA AACACGCC >C.a.H2B.2-3 CTACGTGTACAAGGTGCTGAAACAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCTA AACACGCC >C.a.H2B.3b CTACGTGTACAAGGTGCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCGGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTGGCC AAACATGCC 44 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno >C.a.H2B.3-2 CTACGTGTACAAGGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTGGCC AAACACGCC >C.a.H2B.3-3 CTACGTGTACAAGGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTGGCC AAACACGCC >C.a.H2B.4-1 CTACGTGTACAAAGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCCA AACATGCC >C.a.H2B.4-2 CTACGTGTACAAAGTGCTGAAACAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTGGCC AAACACGCC >C.a.H2B.4-3 CTACGTGTACAAGGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAGCTGGCC AAGCACGCC >C.g.H2B.1b CTACGTGTACAAGGTTCTGAAACAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAGCTGGCC AAGCATGCC >C.g.H2B.1-2 CTACGTGTACAAAGTGCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAGCTGGCC AAACATGCC >C.g.H2B.1-3 CTACGTGTACAAAGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTGGCC AAACATGCC >C.g.H2B.2-1 CTACGTGTACAAAGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCCA AACATGCC >C.g.H2B.2-3 CTACGTGTACAAGGTTCTGAAACAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGAACTGGCTA AACACGCC >C.g.H2B.3-1 CTACGTGTACAAGGTCCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAACTTGCCA AACACGCC 45 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno >C.g.H2B.3-2 CTACGTGTACAAAGTGCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATTGCCGCTGAGGCCTCCCGTCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGCCTTCTCCTGCCGGGTGAACTTGCC AAACACGCC >C.g.H2B.3-3 CTACGTGTACAAAGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAGCTTGCT AAACATGCC >C.g.H2B.4-1 CTACGTGTACAAAGTGCTGAAACAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGTGAGCTTGCCA AACACGCC >C.g.H2B.4-2 CTACGTGTACAAAGTGCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTGGCC AAACACGCC >C.g.H2B.4-3 CTACGTGTACAAGGTTCTGAAGCAGGTGCACCCTGACACTGGAGTTTCCAGCAAGGCCATGAGCATCA TGAATTCTTTCGTCAATGACATCTTCGAGAGAATCGCCGCCGAGGCTTCCCGCCTGGCCCACTACAACA AACGCTCAACCATCACCAGCAGAGAAATCCAGACTGCAGTCCGTCTTCTCCTGCCCGGGGAACTTGCC AAGCACGCC 8.3 Secuencias de los clones del gen H3 >C.a.H3.1-1 CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCCAGGAAGCAGCTGGCGACCAAAGCTGCCCGCAAGAGCGCCC CGGCCACCGGCGGCGTGAAGAAGCCCCACCGTTACAGGCCCGGTACCGTGGCTCTGAGAGAGATCCGC CGCTACCAGAAGTCCACCGAGCTGCTCATCCGAAAGCTGCCCTTCCAGCGCCTGGTCAGGGAGATCGC TCAGGACTTCAAGACCGACCTGCGCTTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTTTGCAGGAGGCTAGTGAGG CCTACCTGGTCGGCCTGTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.a.H3.1-2 CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCAGCCCGTAAGAGCGCTCCAGTAACTGGTGGCGTCAAGAAACCCCA CAGATACAGGCCAGGAACCGTCGCTCTTCGTGAGATCAGGAGATACCAGAAAAGCACAGAGCTGCTG ATCAGGAAACTGCCATTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCTCAGGACTTCAAGACCGACCTGCGTTTC CAGAGTTCAGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGCCTACCTTGTCGGACTCTTTGAGGACAC CAACCTGTGCGCCATCC >C.a.H3.2a CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.a.H3.2-2 CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC 46 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno >C.a.H3.2d CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.a.H3.3e CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.a.H3.3-3 CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCCACCAAGGCAGCCCGTAAGAGCGCTCC AGCAACTGGTGGCGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCAGGAACCGTCGCTCTTCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAAAGCACAGAGCTGCTGATCAGGAAACTGCCATTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT CAGGACTTCAAGACCGACCTGCGTTTCCAGAGTTCAGCCGTCATAGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC CTACCTTGTCGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.a.H3.4a CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC AGCCACTGGGGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGG AGATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGC TCAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAG CTTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.a.H3.4b CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCAGGAACCGTCGCTCTTCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAGAGCACAGAACTTCTCATCAGGAAACTTCCCTTCCAGCGCCTGGTCCGTGAGATTGCC CAGGATTTCAAGACCGACCTGAGATTCCAGAGTGCAGCCATTGGGGCCTTACAAGAGGCCAGTGAAGC TTACCTGGTCGGTCTGTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.a.H3.4d CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC AGCCACTGGGGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGG AGATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGC TCAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAG CTTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.g.H3.1-1 CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCCCCCAGAAAGCAGCTGGCGACCAAAGCCGCCCGTAAGAGCGCCC CGGCCACCGGCGGAGTGAAGAAGCCTCACCGTTACAGGCCCGGTACCGTGGCTCTGCGAGAGATCCGT CGCTACCAGAAATCCACGGAGCTGCTGATCCGCAAGCTGCCCTTCCAGCGCCTCGTGAGGGAGATCGC TCAGGACTTCAAGACCGACCTACGCTTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCCCTGCAGGAGTCCAGCGAAG CTTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.g.H3.1-3 CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCCCCCAGAAAGCAGCTGGCGACCAAAGCCGCCCGTAAGAGCGCCC CGGCCACCGGCGGAGTGAAGAAGCCTCACCGTTACAGGCCCGGTACCGTGGCTCTGCGAGAGATCCGT CGCTACCAGAAATCCACGGAGCTGCTGATCCGCAAGCTGCCCTTCCAGCGCCTCGTGAGGGAGATCGC TCAGGACTTCAAGACCGACCTACGCTTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCCCTGCAGGAGTCCAGCGAAG CTTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.g.H3.2e CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC 47 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno >C.g.H3.3e CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCAACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.g.H3.3-2 CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.g.H3.3d CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCCACTAAGGCAGCCCGTAAGAGCGCTCC AGCAACTGGTGGCGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCAGGAACCGTCGCTCTTCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAAAGCACAGAGCTGCTGATCAGGAAACTGCCATTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT CAGGACTTCAAGACCGACCTGCGTTTCCAGAGTTCAGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.g.H3.4-1 CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCACCCC TGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.g.H3.4-2 CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCTCCACGTAAACAACTGGCTACCAAGGCCGCCCGTAAGAGCGCCCC AGCCACTGGTGGAGTCAAGAAACCCCACAGATACAGGCCCGGAACCGTCGCTCTCCGTGAGATCAGGA GATACCAGAAAAGCACAGAGTTGCTCATCAGGAAATTGCCCTTCCAGCGTCTGGTCCGTGAGATTGCT CAGGACTTCAAGACTGATCTGCGATTCCAGAGCTCCGCCCTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAGC TTACCTTGTTGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC >C.g.H3.4-3 CGTAAATCCACTGGAGGCAAGGCCCCCAGAAAGCAGCTGGCGACCAAAGCCGCCCGTAAGAGCGCCC CGGCCACCGGCGGAGTGAAGAAGCCCCACCGTTATAGGCCCGGTACCGTGGCTCTGAGAGAGATCCGT CGCTACCAGAAGTCCACCGAGCTGCTCATCCGCAAGCTGCCCTTCCAGCGCCTGGTCAGGGAGATCGC TCTGGACTTCAAGACCGACCTGCGTTTCCAGAGTTCAGCCGTCATGGCTCTCCAGGAAGCCAGCGAAG CCTACCTTGTCGGACTCTTTGAGGACACCAACCTGTGCGCCATCC 8.4 Secuencias de los clones del gen H4 >C.a.H4.1-1 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GATGCAGTCACATACACAGAGCATGCCAAGAGAAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.a.H4.1-2a TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTAGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GATGCAGTCACATACACAGAGCATGCCAAGAGAAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.a.H4.1-3 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTAGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GATGCAGTCACATACACAGAGCATGCCAAGAGAAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG 48 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno >C.a.H4.1-2b TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT GACGCTGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.a.H4.2-2 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GATGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.a.H4.2b TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT GACGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.a.H4.3-1 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT GACGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.a.H4.3-2 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT GACGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.a.H4.3-3 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GATGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.a.H4.4-1 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GACGCAGTCACATACACAGAGCACGCTAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTAGCCCTC AAGAG >C.a.H4.4-2 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACTAAGCCCGCCATCCGTCGTCTAGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GATGCAGTCACATACACAGAGCATGCCAAGAGAAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.a.H4.4c TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GACGCAGTCACATACACAGAGCACGCTAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTAGCCCTC AAGAG >C.g.H4.1a TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT GACGCTGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.g.H4.1b TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT GACGCTGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCTC AAGAG 49 Tesis de Máster. Claudia Isela Granada Moreno >C.g.H4.1-3 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GATGCAGTCACATACACAGAGCATGCCAAGAGAAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.g.H4.2-1 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAACCCGCCATCCGCCGTCTGGCTCGCCGTGGCGGAGTGAAG CGTATCTCTGGTCTGATCTACGAGGAGACTCGTGGGGTGTTGAAGGTTTTCCTTGAGAACGTCATCCGT GACGCTGTCACATACACAGAGCACGCTAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.g.H4.2-2 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GATGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.g.H4.3-1 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GATGCAGTCACATACACAGAGCATGTCAAGAGAAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.g.H4.3a TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT GACGCTGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.g.H4.3-3 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT GACGCTGTCACATACACAGAGCACGCCTAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.g.H4.4a TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GACGCTGTCACATACACAGAGCATGCCAAGAGAAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.g.H4.4-2 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCTGCCATCCGTCGTCTTGCACGTAGAGGTGGAGTTAAA CGTATCTCTGGACTCATCTACGAGGAAACCCGTGGTGTCTTGAAAGTCTTCCTCGAGAACGTCATCCGT GATGCAGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG >C.g.H4.4-3 TGAGAGATAACATCCAGGGTATCACCAAGCCCGCCATCCGTCGTCTTGCACGCAGAGGTGGAGTCAAA CGTATCTCCGGACTCATCTACGAGGAGACCCGTGGTGTCCTGAAGGTGTTCCTTGAGAACGTCATCCGT GACGCTGTCACATACACAGAGCACGCCAAGAGGAAGACCGTCACAGCCATGGACGTTGTCTACGCCCT CAAGAG 50